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TRABAJOS ORIGINALES

COLESTEROL - LDL: ¿DETERMINACION QUIMICA, FORMULA DE FRIEDEWALD O ANALISIS DE REGRESION? Bqs. Gabriela D’Isa1, Carla Chilelli2, Giselle Areny3, Carolina Zacharzewski4

RESUMEN

ABSTRACT

La elevación del colesterol de la lipoproteína de baja densidad (C-LDL) es una de las principales causas de riesgo cardiovascular. Pese a la existencia de métodos analíticos para medir la concentración de C-LDL, el uso de la fórmula de Friedewald permite estimar su valor a partir de los valores de colesterol, triglicéridos y colesterol de la lipoproteína de alta densidad (C-HDL). Nuestro objetivo fue el evaluar la validez de la utilización de la fórmula, comparándola con la medida directa del C-LDL y el análisis de regresión múltiple a partir de datos de muestras de pacientes pediátricos. Se realizo un análisis de regresión lineal múltiple. La ecuación de regresión obtenida fue: C-LDL= -1,5988 + (0,845168*CT)(0,0966192*TG)-(0,80157*C-HDL)+ (1,13943*sexo). Este modelo resulta satisfactorio (p-valor < 0,00001) ya que explica el 95,43% del comportamiento de las C-LDL con un valor de R2 = 0,9543. Los valores de C-LDL predichos con la ecuación de regresión presentaron un valor 97,26 ± 35,57 mg/dl, no mostrando diferencias significativas (p-valor=0,981) con los valores hallados con el método homogéneo 97,47 ± 36,55 mg/dl lo que permitiría su aplicación en nuestro laboratorio.

High low-density lipoprotein (LDL) cholesterol levels is one of the main causes of cardiovascular risk. Although different analytical methods exist, the Friedewald formula allows to estimate LDL based on total cholesterol, triglyceride, and high-density lipoprotein (HDL) cholesterol levels. Our aim was to evaluate the validity of the formula comparing it to direct LDL-cholesterol measurement using multiple linear regression analysis of the data of samples of pediatric patients. Performing multiple regression analysis, the regression equation obtained was: LDL cholesterol =-1.5988+(0.845168*CT)(0.0966192*TG)-(0.80157*HDL cholesterol)+(1.13943*sex). The model proved to be satisfactory (p-value < 0.00001) as it confirmed 95.43% of the LDL cholesterol levels with an R2 value = 0.9543. The LDL cholesterol levels predicted by regression equation were 97.26 ± 35.57 mg/dl, not showing significant differences (p-value=0.981) compared with levels found using the homogeneous method (97.47 ± 36.55 mg/dl) allowing its use in our laboratory.

Palabras Clave: C-LDL, Regresión lineal múltiple, Fórmula de Friedewald.

Key words: LDL cholesterol, multiple linear regression, Friedewald formula. Medicina Infantil 2013; XX: 234 - 238.

Medicina Infantil 2013; XX: 234 - 238.

INTRODUCCION El estudio del perfil lipídico incluye la medición en el plasma del colesterol total (CT), el colesterol unido a las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), el colesterol unido a las lipoproteínas de baja densidad (C-LDL), el colesterol unido a las lipoproteínas de alta densidad (C-HDL), además de los triglicéridos (TG). Las investigaciones experimenta1. Consultor Responsable Área Química Clínica, Laboratorio Central. 2. Agregada Área Química Clínica, Laboratorio Central. 3. Becaria Área Química Clínica, Laboratorio Central. Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan. 4. Magister en Estadística Cátedra de Bioestadística. Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales Universidad Nacional de Misiones (UNaM). Recibido: 12/06/2013 — Aceptado: 24/07/2013 Correspondencia: Gabriela D’Isa - [email protected] 011-4293-7772

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les, epidemiológicas y genéticas han indicado que la elevación del C-LDL es una de las principales causas de riesgo para la enfermedad cardiovascular1-4 y ensayos clínicos recientes han demostrado que los tratamientos que reducen su concentración también reducen el riesgo de la misma 2-4. Por este motivo, en el Adult treatment Panel: tercer reporte (ATP III) el objetivo primario de los tratamientos hipocolesterolemiantes sigue siendo la reducción del C-LDL2-5. A pesar de que en la actualidad se disponen de métodos de determinación directa de las concentraciones de C-LDL, el uso de la fórmula introducida por Friedewald y col.6 permite estimar el valor de las LDL a partir de los valores plasmáticos de CT, TG y C-HDL fundamentándose para ello en que la mayoría

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de los triglicéridos plasmáticos son transportados por las VLDL y la concentración de colesterol de las VLDL se corresponde a un quinto del valor de TG. La aplicación de esta fórmula sólo es válida mientras la concentración de triglicéridos no exceda de 200 mg/dl ya que pierde concordancia según aumenta el valor de triglicéridos y además podría no cumplir con el actual requerimiento de calidad para el C-LDL de un 12% de error. Sin embargo, el bajo costo y sencillez de cálculo han favorecido su uso7-9. OBJETIVO Nuestro objetivo fue evaluar la validez de la utilización de la fórmula para la determinación del C-LDL, comparándola con la medida directa del C-LDL y el análisis de regresión múltiple a partir de datos de muestras de pacientes pediátricos de nuestra institución y evaluar si se puede generalizar o verificar una fórmula, dado que cada laboratorio maneja incertidumbres metodológicas propias. MATERIALES Y METODOS Población: Se procesaron en total 1051 datos de pacientes pediátricos que concurrieron como pacientes ambulatorios al Laboratorio Central del Hospital Garrahan en el primer semestre del año 2009. Los datos corresponden a un 52% de niñas y a un 48% de niños, con edades comprendidas entre 2 meses y 21 años (mediana: 147 meses). No se requirió consentimiento informado previo según la declaración de Helsinki, porque se utilizaron datos de pacientes atendidos en el laboratorio. Métodos Se utilizó un autoanalizador Roche-Hitachi 911 para las determinaciones analíticas, que se realizaron en muestras de plasma heparinizado con heparina de litio obtenidas por punción venosa previo ayuno de 12 horas. Los métodos utilizados en las determinaciones analíticas fueron para el colesterol: método colorimétrico-enzimático CHOD-PAP, para los triglicéridos: método enzimático- colorimétrico GPO-PAP, para el C-HDL: método enzimático - colorimétrico homogéneo HDL-plus 3 generación y para el CLDL: método enzimático - colorimétrico homogéneo LDL-plus 2 generación (Roche-Diagnostics). Los métodos se controlaron diariamente con dos niveles de control de calidad interno (Precinorm). Precipath, y Precipath HDL de Roche Diagnostics) y el error sistemático de los mismos se evaluó a partir de la participación en programas de control de calidad externos (Riqas-Cromoión, PEEC- Fundación Bioquímica Argentina, y Progba- CEMIC). Todos los métodos cumplen con los requerimientos de calidad según Variabilidad Biológica, establecidos por el laboratorio.

ANALISIS ESTADISTICO Los resultados de las variables analizadas se expresaron como media aritmética ± desvío estándar. A la variable cualitativa nominal sexo se le asignó el 0 o 1 según fuera femenino o masculino, respectivamente. Se utilizó la prueba de Kolmogoroff-Smirnoff para verificar la distribución normal de las variables. Se utilizó la prueba no paramétrica de Wilcoxon, para datos pareados, para la comparación de las variables que no seguían una distribución normal. Con el fin de encontrar una ecuación que permitiera estimar el valor de C-LDL se ajustó un modelo de Regresión lineal múltiple utilizando como variables predictoras a las variables CT, TG, C-HDL, edad y sexo de los pacientes. Se eliminaron del modelo las variables no significativas (p-valor > 0,05) y con el nuevo modelo ajustado, se evaluaron los residuos a fin de comprobar el cumplimiento de los supuestos. El modelo fue ajustado con un 80% (n=850) de los datos disponibles y se reservó el 20% (n=201) restante para validar el mismo 10-12. RESULTADOS La edad promedio de los pacientes fue de 141 ± 56 meses, el 52% correspondió al sexo femenino (436 pacientes) y un 48% al sexo masculino (405 pacientes). Al sexo femenino (Clase I) se le asignó valor = 0 y al sexo masculino (Clase II) valor = .1 Los valores de los analitos medidos fueron CT= 169,69 ± 47,27 mg/dl; TG: 103,92 ± 70,42 mg/dl; C-HDL: 45,49 ± 12,63 mg/dl; C-LDL 95,85 ± 36,4 mg/dl. Para C-LDL por fórmula de Friedewald se obtuvo un valor medio de 103,4 ± 40,5 mg/dl. (Tabla 1). Cabe aclarar que dichos analitos cumplen con los requerimientos de calidad analítica recomendados por la NCEP (ATP III) y los de Variabilidad Biológica deseable. Los valores de C-LDL calculados por fórmula fueron significativamente (p-valor < 0,0001) mayores que los obtenidos mediante el método homogéneo. (Figura 1). La sobreestimación, en promedio, representó un 7,88% respecto al valor medio de las C-LDL cuantificado por el método homogéneo. Sin embargo, este “promedio”, resulta de una amplia distribución de valores, tanto de sobreestimaciones (máximo 124%) como de subestimaciones (- 87%). La distribución de estas diferencias expresadas en% respecto al valor de C-LDL medido, se observan en la Figura 2. Con el objeto de estimar el valor del C-LDL a partir de la cuantificación del colesterol, triglicéridos, C-HDL, edad y sexo de los pacientes, se realizó un análisis de regresión lineal múltiple. Para ajustar el modelo, se realizó en primer lugar, un análisis de regresión múltiple de los datos, habiendo eliminado valores extremos, puntos influyentes y residuos atípicos. Con este análisis, se obtuvo

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TABLA 1: DATOS DE MEDIA, DESVIO ESTANDAR, VALORES MINIMOS Y MAXIMOS PARA LAS VARIABLES INDEPENDIENTES CT, TG, C-HDL, C- LDL Y EDAD DE LOS PACIENTES PEDIÁTRICOS AMBULATORIOS. Analito

Media

Desvío estándar

Valor mínimo

Valor máximo

CT (mg/dl)

169.69

47.27

71

603

C-HDL (mg/dl)

45.34

12.63

10

115

TG (mg/dl)

103.92

70.72

21

909

C-LDL (medido) (mg/dl)

95.82

36.4

22

463

C-LDL (calculado) (mg/dl)

103.4

40.5

31.4

292.6

Edad (meses)

141

56

2

260

Gráfico de Cajas y Bigotes 200 mg/dl

100 mg/dl

0 mg/dl

C-LDL medido

C-LDL calculado

Figura 1: Gráfico de Cajas y bigotes de la Concentración de CLDL plasmática obtenida por el método enzimático-homogéneo y la calculada por la fórmula de Friedewald.

F recuencia

Histograma

120 100 80 60

Al ajustar el modelo se halló que la variable independiente “edad” resultó no significativa (p-valor = 0,134), por lo que al eliminar dicha variable y volver a ajustar el modelo, la ecuación de regresión obtenida fue: C-LDL= -1, 5988 + (0, 845168*CT) - (0, 0966192*TG) - (0, 80157*C-HDL) + (1, 13943* sexo) El modelo ajustado resultó satisfactorio (F = 4.438, p-valor < 0,00001) ya que las variables independientes elegidas explicaron el 95,43% del comportamiento de las LDL-C con un valor de R2 (coeficiente de determinación) = 0,9543. A continuación, previo análisis de los residuos, se validó el modelo ajustado, aplicando dicho modelo al grupo de datos (n=201) reservado para tal fin, obteniéndose los valores de C-LDL predichos por la ecuación de regresión. La Figura 3 muestra la correlación entre los valores medidos por el método homogéneo (abscisa) y los valores predichos por la ecuación de regresión (ordenada).

40 20

Gráfico del Modelo Ajustado

0

300 C - LDL predicho (mg/dl)

-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 % de (C -LDL medido – C-LDL calculado) Figura 2: Distribución de los valores de sobreestimación de la concentración de C-LDL plasmática a partir de la fórmula de Friedewald.

el estadístico R2 igual a 96,9741%. El estadístico R2 indica que el modelo explica un 96.9741% de la variabilidad en C-LDL. Por lo tanto, está limitado a ser utilizado en el rango de las variables que le dieron origen (es decir no más allá de los valores mínimos y máximos utilizados). Por ello se decidió ajustar sin eliminar los valores extremos, ni valores atípicos; siendo el estadístico R2 de 95.4353%. El modelo pasa de tener un valor de R2 de 96,9 a 95,4, es decir se pierde un poco de capacidad de predicción (1,5%), pero se gana en que se lo puede aplicar a un rango más amplio de valores tanto para las variables predictoras (CT, TG, C-HDL), como para la variable respuesta (C-LDL).

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250 200 150 100 50 0 0

50

100

150

200

250

300

C - LDL medido (mg/dl) Coeficiente de correlación r= 0,973 (p -valor < 0,00001). Figura 3: Gráfico de Cajas y bigotes de la Concentración de CLDL plasmática obtenida por el método enzimático-homogéneo y la calculada por la fórmula de Friedewald.

Los valores de C-LDL estimados o predichos con esta ecuación de regresión presentaron un va-

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lor promedio 97,26 ± 35,57 mg/dl, no mostrando diferencias significativas (p-valor=0,981) con los valores hallados para las mismas muestras con el método homogéneo 97,47 ± 36,55 mg/dl. En la Figura 4 se observan los valores hallados para C-LDL en los dos casos mencionados en el párrafo anterior.

Gráfico de Cajas y Bigotes 300 250 mg/dl

200 150 100 50 0 C -LDL medido

C -LDL predicho

Figura 4: Gráfico de cajas y bigotes para los valores de C-LDL estimados o predichos con la ecuación de regresión y los valores hallados para las mismas muestras determinados analíticamente.

Los valores predichos estimados por la ecuación de regresión resultaron, en promedio, un 0,21% inferiores (subestimación) a los medidos por método homogéneo. En la Figura 5 se muestra la distribución de las diferencias expresadas en% respecto al valor de C-LDL medido. Como puede observarse, en este caso el “promedio” se halla desplazado hacia la izquierda en relación de la Figura 1 y centrado próximo a 0, con valores mínimos de 35% de subestimación y máximo de 65% de sobreestimación. Histograma 20

Frecuencia

16 12 8 4 0 -40

-20

0

20

40

60

80

% de (C - LDL predicho – C - LDL medido) Figura 5: Distribución de las diferencias expresadas en % respecto al valor de C-LDL medida.

DISCUSION Las concentraciones de C-LDL pueden determinarse usando la fórmula de Friedewald. El requisito que convencionalmente se acepta para su

aplicación es que la concentración de triglicéridos en el plasma sea < 400 mg/dL6. Los resultados del presente estudio confirman que a pesar de cumplirse con esta condición la fórmula de Friedewald posee inconsistencias ya que sobreestima el valor de las C-LDL. Los valores de C-LDL calculados por fórmula fueron significativamente mayores (p-valor < 0,0001) que los obtenidos mediante el método homogéneo. La sobreestimación, en promedio, representó un 7,88% respecto al valor medio de las LDL cuantificadas por el método enzimático colorimétrico homogéneo. Sin embargo este “promedio”, resulta de una amplia distribución de valores, tanto de sobreestimaciones (máx. 124%) como de subestimaciones (-87%). Las causas de error en el estimado de Friedewald, estudiadas en detalle, incluyen a las mismas lipoproteínas, surfactantes, cationes divalentes, carbohidratos y lectinas, muchas de ellas difíciles de controlar o de eliminar 13,14. Por otro lado, la fórmula de Friedewald es un estimado del colesterol de las C-LDL, con una pequeña cantidad variable de lipoproteínas de densidad intermedia o C-IDL15, a esto hay que añadir los errores analíticos propios de las determinaciones de CT, C-HDL y TG. Algunos grupos de trabajo siguen usando las concentraciones de C-LDL estimadas por la fórmula de Friedewald aún reconociendo los errores que posee 16-19, lo que ha promovido intentos por corregirla20. En este sentido ya han sido propuestas fórmulas alternativas algo más complejas que la de Friedewald a partir de las concentraciones de colesterol total, HDL y triglicéridos, sin embargo, éstas no han sido usadas rutinariamente. Cabe aclarar que este modelo de regresión lineal múltiple no puede extrapolarse a condiciones diferentes a las que le dieron origen. Por lo tanto debería ser reevaluado al modificarse alguna de sus variables. (equipamiento, método, y población). La fórmula propuesta podría ser utilizada cuando no existiese la posibilidad de realizar la determinación de C-LDL por el método homogéneo. CONCLUSION A pesar de que el análisis de regresión propuesto aquí posee, al igual que la fórmula de Friedewald, los errores analíticos individuales de las determinaciones de CT, C-HDL y TG, demostró que sus estimados no se diferenciaron estadísticamente de los obtenidos con los métodos directos. El modelo fue ajustado incluyendo los valores extremos de CT, TG y de C-HDL por lo cual la fórmula se puede extrapolar a valores superiores a 400 mg/dl de TG. La fácil aplicación y bajo costo, permitiría su aplicación en nuestro laboratorio en las condiciones en que se realizó el trabajo (equipo y población).

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ANEXO A continuación se detallan los requerimientos analíticos: coeficiente de variación (CV%), Sesgo (Bias%) y Error Total (ETa%) propuestos por la NCEP (ATP III) y los criterios de calidad según Variabilidad Biológica para los analitos: CT, TG, CHDL y C-LDL21-25. El criterio de calidad según Variabilidad Biológica es el Deseable excepto para TG que se usa el óptimo En condiciones de estabilidad y control de los métodos, se evaluaron las incertidumbres individuales de cada uno de los analitos implicados y la incertidumbre asociada a la fórmula de Friedewald26-31. Según la teoría de propagación de errores la incertidumbre de una fórmula es la raíz cuadrada de la suma cuadrática de las incertidumbres expandidas de sus componentes. Si se aplica el cálculo de incertidumbre a la Fórmula de Friedewald: UÊ À“Տ>Ê`iÊÀˆi`iÜ>`\Ê C-LDL = CT – C-HDL – (TG/5). UÊ À“Տ>Ê«œÀÊ,i}Àiȝ˜\Ê C-LDL=-1,5988+ (0,845168*CT)(0,0966192*TG)-(0,80157*CHDL)+(1,13943*SEXO). UÊ 1Ê ‡ Ê«œÀÊvÀ“Տ>ÊrÊ 3U2 CT+ U2C-HDL + U2 TG. UÊ 1Ê ‡ Ê«œÀÊvÀ“Տ>rÊ3 4.6%2+ 8.9%2+7.9%2. UÊ 1Ê ‡ Ê«œÀÊvÀ“Տ>rÊ£Ó°n¯°

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