CNEA-Z73

REPUBLlCA ARGENTINA

COMISION NACIONAL DE ENERGIA ATOMICA

=

ESTUDIO DEL METABOLISMO DE PROTEINAS PLASMATICAS MARCADAS CON YODO RADIACTIVO pOI

v.

Peeorini,

o.

Degrossi, A. íllireri, A. F. de Suarez

BUENOS AIRES

1970

y A. E. A. Mina

RADIOISOTOPOS - APLICACIONES (TRAZADORES)

621.039.85 PROTEINAS

547.96

COMISION NACIONAL DE ENERGIA ATOMICA DEPENDIENTE DE LA PRESIDENCIA DE LA NACION

ESTUDIO DEL METABOLISMO DE PROTEINAS PLASMATICAS MARCADAS CON YODO RADIACTIVO *

v. Pecorini', o. Degrossi',

A. Olivari', A. F. de Suárez' yA. E. A. Mina'

RESUMEN Se ha hecho un estudio comparativo del comportamiento metabólico de seroalbúmina y gamma globulinas marcadas con P 2 5 e p 31 en la Comisión Nacional de Energía Atómica y proteínas similares enviadas por el Organismo Internacional de Energía Atómica de Viena. En todos los casos se realizó el control de homogeneidad de la proteína mediante pruebas físico-químicas antes y después de la marcación con yodo radiactivo. A pesar de que las pruebas físico-químicas en algunos casos fueron satisfactorias, fue la experiencia biológica la que determinó la calidad del material proteico.

SUMMARY A comparative study of the metabolic behaviour of 125 1 RISA and 131 1 gamma globulin labelled in the laborarories of CNEA and similar proteins labelled with 115 1 sent from AlEA, Vienna, was rnade , In every case, the homogeneity of the protein was checked by physical and chemical methods before and afrer their labeling wirh radioactive iodine , Although physico chemical proofs were found ro be satisfactory in some cases, the qual iry of the proteic material was determined by biological experiments.

• Cornis ióa Nacional de Energia Atómica Realizado con el apoyo del OLEA a traves del contrato de Investigación RB/381

*

4 INTRODUCCION Las proteínas radioyodadas "in vitro" son consideradas dentro de las posibilidades actuales, como el material más adecuado para el estudio del metabolismo proteico. A pesar de ello, .se han hecho objeciones en lo que respecta a la comparación de los resultados obtenidos por los distintos investigadores, aceptándose que la diversidad de valores se debe principalmente a tres factores fundamentales: a) la materia prima utilizada para la marcación; b) los métodos de marcación empleados y c) el tiempo y la forma en que es almacenado el producto antes de su utilización. El presente trabajo sobre normalización de técnicas de preparación y estudios cinéticos de proteínas radioyodadas fue realizado con un subsidio del Organismo Internacional de Energía Atómica (Nº 381) ~ En él se presentan los resultados obtenidos de un estudio comparativo del comporr arni enro metabólico de seroalbúmina y gamma globulina marcadas con ¡125 y ¡l31 en la CNEA y proteínas similares enviadas por el OlEA.

MATERIAL Y METODOS A - Se empleó material de dos procedencias distintas: sero albúmina y gamma globulina marcadas localmente con 1 1 3 1 Y 1 1 2 '5 . B - Las proteínas locales fueron: albúmina de los laboratorios J3eh'l'in~ werke y fracción gamma globulina G obtenida por pur ificación de los preparados comerciales Behringwerke y Dark, con resina DEA.E Sephadex A-50.

MARCACION Se hizo de acuerdo al método de Mc Farlane y col. (1) (2) Y (3) con una yodinización de un átomo de yodo por molécula de proteína.

OBTENGON DE GAMMA GLOBULINA G PURA

(4)

Los preparados comerciales de gamma globulina se pusieron en contacto en respectivos pasajes con la resina de intercambio ani ónic a DEAE celulosa y se eluye con una solución tampón de fosfato O,OlM pH En éstas condiciones la fracción gamma G no es absorbida por la resina y se recupera por filtración sobre un buchner o por centrifugación.

qs.

5 CONTROLES

Se realizaron controles de esterilidad, pirógenos y de pureza que comprenden: a) control de yodo libre en los preparados de proteína marcada, por cromatografía en papel y placa delgada (5) . b) homogeneidad de la molécula proteica por electroforesis en papel, gel de poliacrilamida (6), acerato de celulosa (Cellogel) (7) e in-

munoelectroforesis (8) . e) evaluación de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial (9).

METOOOLOGIA

Se procedió en cada sujete en estudio a: 1) Bloqueo de la tiroides con Lugol.

2) Inyección de 10- 20 ¡Lei de 1 125 proteína.

Yde

15-30 ¡Leí de 1 1 3 1 unidos a la

3) Extracción de muestras de sangre coa jeringa hepariai zada a los 15 minutos de la inyección y luego diariamente de 9 á 10 días hasta 30 días según la metodología empleada. 4) Recolección de orina por períodoe de 24 horas. 5) Selección de 37 testigos normales entre estudiantes de la Universidad local y pacientes que se presentaron a la consulta por problemas banales.

ANALISIS DE LOS DATOS

El método utilizado para .el estudio de los datos fue el de Campbell y col. (10) modificado por Pearson y col. (11) que permite obtener los siguientes valores: 1) Volumen plasmático cm 3 de plasma

2) Compartimiento plasmático: cantidad de proteína en el plasma (pool de albúmina intraplasmático)

6 3) Compartimiento total: cantidad total de proteína (pool total) 4) Tasa de recam bio: (FCR) porcentaje del comportamiento plasmático que se renu eva por unidad de, tiempo 5) Grado de degradación: cantidad de proteína que se metaboliza por unidad de tiempo (turn-over) (recambio de proteína) 6) EVM/IVM: relación en ere el contenido de albúmina intra y extra vascular. Con el objeto de conocer el grado de homogeneidad metabólica desde el punto de vista biológico se estableció en cada caso la relación entre el Fd (FCR diario) y el Fa (FCR promedio) como porciento de este último.

ESTUDIO ESTADISTICa Se determinó para cada grupo estudiado la media.aritmérica (x), la variancia (s2), la desviación standard (s) y el error standard (E). Como el objeto fundamental de la experiencia era comparar el comportamiento metabólico de las proteínas enviadas por el OlEA Y las marcadas localmente, el estudio estadístico se efectuó utilizando el test de la diferencia entre dos muestras, aceptándose que ésta era significativa para un p 0.05 (distribución "e" de Student según las tablas de Fisher y Yates (12). Se determinó la media aritmética de la diferencia (d), su variancia s2) d y su desviación standard (s d).

RESULTADOS A . Controles

1) Yodo libre¡ el porcentaje de yodo libre en todas las partidas marcadas localmente ya sea de seroalbúmina o de gamma globulina osciló entre 0.14 y 1.6 %.. Valores similares se obtuvieron con la seroalbúmina de la OlEA, no así en el caso de la gamma globulina cuyos valores alcanzaron hasta el 6,95 %. 2) Pureza de las proteínas utilizadas:

Albúmina. En electroforesis sobre papel tanto la albúmina local como la del OlEA, se encontró una banda homogenea. En gel de pol iacrilamida la local presentaba una banda homogene a, La del OlEA

7

además de Ia.banda correspondiente a la gamma 7 S se observaron dos bandas accesorias en la posición albúmina y post albúmina. B • Estudio me tab álic o

Estudios efectuados con la metodología de Pearson y col. 1) El cuadro I muestra los valores de los estudios comparativos con seroalbúmina 1 1 2 5 del OlEA y seroalbúmina I 125 local. 2) El cuadro 11 muestra los valores de los estudios comparativos con gamma globulina 11 2 5 del OlEA y gamma globulina 11 3 1 local. 3) Los cuadros III y IV muestran los patrones obtenidos con seroalbúmina 11 2 5 11 3 1 locales. 4) En el cuadro V se observan los resultados obtenidos con ocho voluntarios en los que se efectuaron estudios de larga duración. Estudios efectuados con la metodología de Campbell y col. (10).

CONCLUSIONES 1) Las preparaciones proteicas marcadas con radioyodo enviadas por el OlEA Y las preparadas localmente presentan diferente comportamiento metabólico. 2) Las preparaciones de albúminas muestran un aceptable comportamiento presentado valores normales para los parámetros del metabolismo proteico que concuerdan con los referidos por otros autores. 3) Las preparaciones de gamma globulina utilizadas para comparar con las enviadas por el OlEA y las preparadas localmente presentan un comportamiento anormal y no eran adecuadas para estudios metabólicos. 4) Los resultados obtenidos con electroforesis en papel, gel de po liacrilamida, cellogel, etc ., sugieren la necesidad de establecer métodos físico-químico adecuados para controlar la calidad de las proteínas antes y después de su marcación. Hasta el momento actual, el control del comportamiento biológico aparece, sin embargo como el método más eficaz para asegurar la calidad del material proteico.

8 BIBLIOGRAFIA

1. Mc FARLANE, A. S. yBIOCHEM,

J.; 62,

135 (1965) .-

2. Mc FARLANE, A. S.; Nature , Lond. 182, 53 (1953).3. Mc F ARLANE, A. S.; In rnet abo lic of plasma proteins (Munro, H. N., Allíson, J. B. Eds. Academíc Press, N. Y. 297 (1963) .4. Purífícation of large quantitíes of 7 S Globulins Separarion, Manual Sephade x 2 (1968) .5. MITTA, A. E. A.; CAMIN, L. L. Y de TROPAREVSKY, M. L. P. Radíochemíca Acta,2, 111 (1966).6. DAVIS,

J.

B. Y ANN, N. Y. Acad. Scí. 121,404 (1964).-

7. KOHN, J. CelluIose Acerare Elecrrophor es is and Inmunochromatographíc and Electrophores is Techníques. Ivor Srnith, Pitman Press. England (1960) .8. SCHEIDEGGER, 105 (1964).-

J. J.

Int, Arch, Allergy an-d Appl. Inmunology, 7,

9. MANCINI, G.; VAERMAN, J. c., CARBONARA, Q. O. y HEREMANS, J. S. Protides of Bíol. Fluíds. Breges (1963) EIsí vier. Amsterdam 370 (1964) .10. CAMPBELL, R. M.; CUTHBERSON, D. P.; MATHEWS, C. M. y Mc FARLANE, A. S. Inr, J. Appl. Radíoísotopes. 1., 66 (1956).11. PEARSON, J. D.; VEAl,.L,.N. VETTER, H. (FELLINGER, K. HOFFER, R) Radioakt Isotopl in and Forsch, vol. 3 Strohlembchandl Urban Schwartzemberg, Munchen, Berlin 290 (1958) .12. FISHER, R. A. Y YATES, F. Tablas estadísticas para investigadores científicos. Ed, Aguílar S. A. de Ediciones. Madrid (1954) .-

9

CUADRO ESTUDIOS COMPARATIVOS CON RISA 1251 DE lAEA Y RISA 1311 DE PRODUCCION LOCAL INYEce

Y

FMTJDA

18

S54

36,?l5

7M2

3e,17

20'21

¡BATO! f2

& I LDCAL

35,í5

X 52

3,72

4,01

4,45

3,92

tgel

4,00

26.21

b3.70

3,94

'1,

Ka:"

R:Rui\> 'l1.RN OlER !lATE EVM 'l. grl di. ¡"-/dl kg IVM

7.74

998

7,65

8,'57

0.171

\.17

113.00 7,'26

270

?,:/j

830

o,'fi>

1,18

M.76

1.66

1'2,45

7,57

6.51

0,175

1,~

77,47

1,51

5,27

798

6,'8

0.1'21

1,~

74,01

1,21

11,'21

8,71

6,~

0'{Jl

\,'2'2

74,3~

1,'2'2

6,'5

111'2

905

o lit>

1,19

79,'20

1,55

5,71

9qq

791

01:55

~35

74.35

1,46

2,6'2

1197

8,90

o,rn

148

176,Q'2

1,;1)

9.t'.O

gas

rz,41

0,167 \02

113,30

1,5'2

6,39

1'~

13.55

0,!87.

Ga,i'6

1,58

3.11

gro

6,1&

0,142 W

66,17

1,52

5,47

12.:l6

I\.~

0,101

93.C6

1,4'2

5.17

9,43

8,78

o.IM 093

91,92

1,/10

6.~

1'2.'29

11.~

o.m 0,77

79,60

1,40

5,07

9eo

7,70

o,l!t

1.07

7M5 l,!I:l 6,22

11,70

915

o,~

096

I

1,13

0,87

AlEA

37.gI¡

1,60

7.81

8.00

ace

0,142

tilo

LOCAL

36,'2ll

1,54

~:ZO

9,34

0,164

115

AlfA

0.09

11&1

4.0ll

o.~

0.05

IDCAL

1909 24,05

10,87 o.QS

0.09

2,~

4.1'2

.10.85

QCXXl5

0.1.3

AlEA

4.36

o.~

3.44

o.'ll

1,02

a0'2

o.Oll

LOCAL

4.QO

1.61

'2.03

'2.'20

o.O'Z

0.'21\

5

Pm = 0,05

4.67

40,~

2264 34,56

i IAfA ""r

ed:ld: ZOd. ¡

lb15

U,-l

9!:tot

112.19 4,73

72.97. 34.99

; 1!>I\1C\\12

I

47,~

161?:O 36,eo

: IAfA "'!

edad: 34d. i

~r¡m.I 92 8757

1,3J

4.48

10.48

g,18

0.1,º

1,05

11

1479

33,84

3.94 58,77

1.33

?l.54

10.70

6.'2!l

0,14?l

1.51

1'2

2169

36,76

4.12

0036

1.53

4.14

10.79

9.64-

0,163

tia

14 16M 37,01

3,55 59,78

1,31

2.75

8.70

5.'20

0.114

1.70

15

2110

3.92 82,71

1,W

4,?B

9.47

7,8"~

0.122

1.74

17

3450 37.66

3.45 117.99

1.'29

7.,47

6.52

7,00

0.Cf.4

1.30

25

2373 40.15

3,77

1,60

13,70

8,45

7,fi!J

0,137

1.18

ESTUDIO ESTADISTICO

32,76

3,00

00.46

X

37,55

1.48

4.80

9.71

9.36

0.143

1.'0

S2

16.115

o.O'J7

9.6'25

3.65

9.~

0,011

0.07

s

4.11

0,19

3.11

1.91

3.13

0,1

0.26

12 CUADRO

IV

ESTUDIOS EFECTUADOS CON RISA 13\ DE PRODUCCION LOCAL

i

PlA5MAT1CO

mI

5

INA PLASf.1ATICA

mil kg. 19r/1OOm1 er.tol.

Uo_l

~

R:l?uJp TURN

'1,

'l.

CMR~TE

gf Idia erldIkg.

EVM

TVM

4~

156,42

1,67

2.~7

10.00 16.n

0,182

1.77

5 2934 42.52 4,1,4

1~.27

1.89

'2,'iJ!

8.20 10.68

0.154

1.00

8 2180 33,28

8{OO

1.'25

5.18

(),89

8~

0,1!ti

1.33

2797 41,63

3,97 108,26

1.60

3.65

8J3

9.45

o.l'&)

1.~

10 1942 29.4'2

4,02 83,89

1.27

3.4-8

10.05

0,&1

0.133

1,02

4

9

3555 38,78

3.76

04,91 .3.94-

60,12

1.36

3.T7

9,10

5,47

O.rl5

1.2)

1'2 214?l

sa:

4,12

05.29

1,51

4,00

fJ~

5.5:'

0.145

1.00

14 165'2

?;'7,OO

3,55

59,71

L~I

2,'29

7;00

4.72

0.102

1;82

15 2174

3~~

3,92

B5.'lZ

1,32

3.B6

ajO

7.14

0.111

1.50

17

3272 35.72

~4S

m,oo

1.72

L91

6.~-

7.31

0.C1!fJ

1.53

1~

~89

47.YJ

4.73 113.!X.#

'2.16

2.~

7.35

6.~

olEó

1,18

10

1659

3253

461

77.47

1.5'2

5.2J

7.~

6.16

0,1'2

1,58

'lB

264'9

4~

3.71

9a2b

1.52

7.YJ

Qt!ti

qsg

o~

091

to 1854. 36.35 4,01 74.:6

1Aff

2fiZ

11.97

8.00

o.m

1,48

4.45 fB.!íl . l52 6.!J9

11.915

1~

o.m

113

11

31

1526

2S't6 34.31

35 16M

~

3.92 66.17

1.52

~.47

l'2.~

8.~

0.191 . oS7

36 2'264

34.56

4,05 91,92

vtO

6.50

1'2.29

11,30

o.m

0.77

'!)7

1981

33.70

3.94 7M5

1,~

6,'l'2

11,'73

915

o~

098

X

36,15

~50

418 .

9.~

9,00

0.145

1.Y>

52

lB,40

0.00

2.93

3,48

7,96

o{Jm 0.12

s

4.29

0.24

l.1

1,86

2.82

D.O~

ESTUO10

ESTADrsnco

,

Q34~

52

M

Locall,n --- -

56 F

SS F

.-1 - -

-

53

23

43.0 Local 1 125

[131

1942

Locall l !! 20 66.0 - . Localll n Local

2727

Locall DI

35.41 22.49 4.74

SI S

j(

33.84

34.91

30.71

29.42

41.63

33.28

36.96

1479

1526

2027

2180

2772

Local 1111

.~

21 75.0

-.

F 23 65.5 --" 54 M 21 67.5

1---

3.94

3.94

4:32

4.32

3.97

3.76

3.98

367

81.99

58.27

60.12

8757

83.39

108.26

,

110.33

92.15

1.40 0.017 0.13

1.36

1.40

1.33

1.26

1.60

1.25

1.47

1.56

9.39 1.51 1.22

10.07

7.63

9.68

9.03

8.06

11.52

8.67

10.51

Locall l Z5 42.56

zsu

PARTIDA

V.

1.780

3.676

5 2- 1

2.261

2.261

2.252 1.555 6.960

0.522

0.679 2.901

0.437

0.437

1079 3.084

0.241

0.577

5 1-2

lorinal

¡

0.601

0.390

0.213

0274

0.274