Composición General del Medio de Cultivo. • Sales: CaCl2, NaHPO3, MnSO4, SnCl2, etc).

• Aminoácidos: Ala, Val, leu, aAsp, Gly… • Vitaminas (Biotina, ác. Fólico, pantotenato de sodio, riboflavina. • Otros Componentes (glucosa, ác. Linoléico, rojo de fenol, timidina).

1. Suero o substitutos del suero. 2. L-Glutamina.

3. Antibióticos. 4. Factores de crecimiento adicionales.

* hormonas, anticuerpos, el medio no debe estar suplementado.

Mezclas de Sales Basales. Solución Salina Equilibrada o Buffer (BSS) en el cultivo de células y tejido. En 1885, Sydney Ringer desarrolló una solución de sales inorgánicas para mantener la contractilidad del tejido cardiaco de mamífero. Una solución de sal menos específica fue diseñada por Tyrode para su uso en el trabajo con células primarias de mamífero. Solución de sal de Tyrode , fluido aceptado para la dilución de componentes proteicos. La función actual de la solución de sal equilibrada (buffer) en el cultivo celular es multifacética y puede dividirse en cuatro funciones principales.

• Fluido de irrigación, transporte y diluyente, mantiene el equilibrio osmótico intra y extracelulares. • Proporciona a las células ciertos iones inorgánicos esenciales para el metabolismo normal célular. • Combinado con hidrato de carbono (glucosa), fuente de energía principal para el metabolismo celular.

• Ofrece sistema de tamponamiento para mantener el medio en el intervalo de pH fisiológico (7.2 a 7.6). Contienen un requisito básico para cinco iones: Ca, Mg, K, Na, ion PO4.

Solución buffer: NaH2PO4 , Na2HPO4, 0.1 mM

Nombre El fosfato de Dulbecco tamponada con solución salina (D-PBS).

Bicarbonato de sodio

No contiene

Cambio de pH durante filtración

Menos susceptible

Glucosa

Con y sin

1.0 M, pH 7.4 (25 °C) Sales equilibradas de Earle (EBSS)

2,2 g / L

Sales equilibradas de Hanks (HBSS)

0,35 g / L

Pueden requerir 1,0 mg / L el ajuste después de la filtración.

Medio de Cultivo Utilizados para el cultivo celular. Tienen una formulación específica. Medio de Eagle medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM),

Medio basal de Eagle (BME)

DMEM original

Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM),

4X [aminoácidos y vitaminas] 1000 mg / L glucosa

4500 mg / L glucosa óptimo

Ver dif. medios Ver medio Williams

Medios de Cultivo

DMEM. DMEM/F12. Ham’s F-10 y F-12. Medio 199. MEM. RPMI 1640.

Temperatura 37oC Humedad Gas: CO2

¿pH?

Estabilización del pH en el Medio de Cultivo. Si [CO2 ]

, el pH

CO2 + H2O

.



[ ]

H2CO3  HCO3- + H+ +

CO3=

pH Lo cual es neutralizado por una elevada [NaHCO3].

específica p/c medio.

El balance ácido-base es mantenido por NaHCO3, buffer y componente nutricional.

pH opt. =7.4. Sistema buffer dentro del medio de cultivo.

NaHCO3 disociado y CO2. Depende del CO2 atm.

NaHCO3 + H2O



Na+ + HCO3- + H2O.

Na+ + H2CO3 + OH-



Na+ + H2O + CO2 + OH-.

Cuando la presión parcial del CO2 es baja, el equilibrio

, el medio [OH- ] y se torna básico.

Incubadora entrada de CO2. La capacidad buffer del sistema : H+ + HCO3  H2CO2  CO2 + H2O. una elevada concentración de OH- causa OH- + H2CO2  HCO3 + H2O.

pK

.

H2CO3  HCO3- + H+

6.37, 6.35*

HCO3  CO3- + H+

10.33* *Valor termodinámico

Medio conteniendo Suero. Es el suplementó más frecuente. Razones:

 Algunas células sólo proliferan al adicionarle suero.  Provee biodisponibilidad de hormonas.  Incrementa la capacidad buffer del medio.  El medio extracelular óptimo a las células. El suero es una mezcla compleja y heterógenea de proteínas, hormonas, factores de crecimiento, iones y otros componentes no definidos. Medio no definido, suero varía de lote a lote. Medios definidos , sin suero pero con apropiados suplementos. Diferentes animales. Rebaños. Razas. Países.

1. Suero de ternera. 2. Suero de ternera donante (ternera hasta de 8 meses). 3. Suero de ternera fetal (terneras fetales, por cardiopuntura).

4. Suero de caballo (edad desconocida).

5. Suero de mono (mono verde). 6. Suero de cordero (< 6 meses).

8. Suero Humano (adultos). 7. Suero de pollo (sacrificados).

9. Suero de porcino

El Suero Fetal de Bovino (SFB) es el suplemento de crecimiento más empleado para el medio de cultivo celular, Contiene un alto contenido de factores que promueven el crecimiento, ya sean definidos o no definidos , los cuales satisfacen los requerimientos metabólicos para el cultivo celular.

SFB Producto. Sterile-filtered, suitable for cell culture .

Origin Treatment Hemoglobin Hemoglobin, ≤25 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Charcoal Hemoglobin, Stripped ≤20 mg/dL Dialyzed by ultrafiltration Hemoglobin, against 0.15 M ≤20 mg/dL NaCl

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum. Australia origin, USDA approved. Australia Fetal Bovine Serum.

Endotoxin

New Zealand

Fetal Bovine Serum. USA origin, Charcoal Stripped.

USA

Fetal Bovine Serum USA origin, Dialyzed by ultrafiltration against 0.15 M NaCl, sterile-filtered.

USA

Fetal Bovine Serum USA origin, Heat Inactivated, sterileHeat filtered, suitable for cell culture, suitable for insect cell USA Inactivated culture

≤10 EU/mL endotoxin

Hemoglobin, ≤20 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum USA origin, γ-irradiated by SERTAIN® process.

USA

Fetal Bovine Serum.

USA

Hemoglobin, ≤25 mg/dL

≤25 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum . suitable for cell culture, suitable for hybridoma .

USA

Hemoglobin, ≤20 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Fetal Bovine Serum USDA approved countries.

nonUSA

Hemoglobin, ≤25 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Hemoglobin, ≤25 mg/dL

≤10 EU/mL endotoxin

Hemoglobin, ≤10 EU/mL

≤25 mg/dL endotoxin

Fetal Bovine Serum USDA. Fetal Bovine Serum non-USA origin, from USDA approved countries, Heat Inactivated.

non- Heat USA Inactivated

Suero inactivado, incubado a 56º C, 30’.

¿Suero correcto?

Tipo celular Experimento

Otros Suplementos Albúmina Proteínas de Transporte. Aminoácidos y Vitaminas. Factores de adhesión. Factores de Crecimiento y Citocinas.

Hormonas. Antibióticos.

Preparación y Esterilización del medio de cultivo

Ver medio Williams

Tanque de Gas Nitrógeno

Tanque depósito del líquido a esterilizar

Membranas para esterilizar

Solución Estéril

Líneas celulares La Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Líneas celulares de una variedad de fuentes animales: • Mamíferos, • Anfibios • Peces • Insectos. Humanas. Ratón.

Cáncer.

Medio de Cultivo libre de Suero, claramente definido. Al elegir (contenidos individuales del suero), frec. cant.

fluctúan en cal, y

Esto es importante cuando los experimentos son de tiempo prolongado.

Sueros: Riesgo de contaminación microbial. Algunos medios con suero deben esterilizarse. Economía. El cambio a medio libre de suero, no debe ser abrupto.

Medio Definido: se conoce la concentración de todos los componentes.

Cultivo Celular en el laboratorio. 1) Accesorios necesarios, instrumentos, etc. 2) Esterilidad en campana de flujo laminar. 3) Proveer a las células para un periodo de cultivo. 4) Preparado para experimentos en cultivo celular. Alrededores adecuados:  Cuarto de cultivo.  Campana de flujo laminar e incubadora.  Preparación de medios de cultivo cuidadosa y críticamente. Considerar: oRiesgo de movimiento. oSin tráfico de personal. oDistancias cortas entre unidades individuales. oSuficiente espacio para moverse.

Seguridad en el Cultivo Celular. Reglas de seguridad y precaución (DNA, material patógeno, substancias radiactivas, carcinógenos, corrosivos, etc.)  Prohibido: fumar, beber y comer.  Ropa adecuada para protección, (bata algodón, gorros y guantes).  Prohibido pipetear con la boca, utilizar pipeteadores o perillas estériles.  Posibles peligros deben ser dados a conocer a los compañeros.  Lavar manos entre descanso y descanso.  Limpieza escrupulosa es proporcional a buenos resultados en el cultivo.  Laboratorio limpio (piso, paredes, equipos, baños , gavetas, etc.).

 Cerrar llaves de gas al finaliza el trabajo.  Limpiar regularmente: baños maría, incubadoras y campana de flujo.  Entrada al cuarto de cultivo, sólo personal autorizado.  Limitar el acceso de visitas.