Modelos Celulares para Estudios de Toxicidad y Metabolismo de Xenobióticos

Xenobióticos Xenobióticos

1

TOXINAS Intrínsecas

Efecto en todos los individuos expuestos Efecto dosis-dependiente Efecto predecible en animales

Idiosincrásicas Efecto solo en algunos individuos No dosis-dependiente:hipersensibilidad Dosis-dependiente: idiosincrasia metabólica Polimorfismo genético Inducción de los CYPs

Efecto No predecible en animales

Clasificación mecanística de las TOXINAS

Activas

Son tóxicas per se y no requieren ser biotransformadas para ejercer su efecto tóxico. Efecto dosis-dependiente en los individuos expuestos

Latentes

Requieren ser biotransformadas para ejercer su efecto tóxico.

2

XENOBIOTICO Metabolito estable

BIOTRANSFORMACION Reacciones Fase II

Estrés oxidativo Generación de ROS

Reacciones Fase I

Metabolito reactivo

Peroxidación lipídica

Alteración de la homeostasis del Ca2+

Deplección de GSH

Unión covalente

ATP Inactivación de biomoléculas

Detoxificación Alteraciones metabólicas

ELIMINACION

APOPTOSIS NECROSIS

RESPUESTA INMUNE

"... un determinado experimento no se realizará realizará en animales, si existe otro mé método disponible que sea razonable, realizable y cientí científicamente satisfactorio para obtener los mismos resultados y que no requiera el uso de animales...” animales...” “.... se utilizará utilizará el mínimo nú número de animales y aquel procedimiento que produzca el mí mínimo y menos prolongado dolor y sufrimiento...” ...” Parlamento Europeo (Directiva 86/609/CEE)

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Ventajas de los Modelo In Vitro Ø Se evitan interferencias de la respuesta del organismo Ø Versatilidad en el diseño experimental Ø Ahorro de tiempo y coste económico Ø Posibilidad de automatización, robotización, miniaturización Ø Necesidad de poca cantidad de producto en estudio Ø Se puede utilizar material biológico humano Ø Reducción del número de animales

Inconvenientes de los Modelo In Vitro Ø Simplicidad: Información a veces parcial Ø Dificultad de interpretación de los resultados Ø Dificultad para extrapolar al hombre Ø No sustituyen del todo los ensayos in vivo Ø No se pueden detectar efectos secundarios Ø Necesidad de validación formal Ø Todavía no están aceptados legalmente, ni incorporados en los protocolos oficiales para el registro de nuevos fármacos

4

2-3 g de tejido

25 x 106 células 1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

7

8 9 10 11 12

A

A

B C

B

D

35

C

E

D

G

F H

190

1.000

Evaluación del riesgo de toxicidad Î Productos que se desarrollan para el uso o consumo humano (aditivos alimentarios, cosméticos, medicamentos, biomateriales, etc.) Î Clasificación y etiquetaje de productos químicos (disolventes,detergentes, etc) Î Medioambiente: Ecotoxicología (plaguicidas, metales pesados, etc)

5

Estudios de toxicidad Xenobióticos

Xenobióticos

Medicamentos

Fases en el desarrollo de un nuevo medicamento Fase Preclínica •Fase Química

•Fase biológica en animales • Metabolismo • Toxicología • Farmacocinética Molecula candidata • Actividad farmacológica

SEGURIDAD Balance

BENEFICIO Terapeú Terapeútico

entre

RIESGO Tóxico

Fase Clínica Fase I: Voluntarios Fase II: Ensayo clí clínico Fase III: Estudios multicé multicéntricos Fase IV: Registro y comercializació comercialización

6

Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro

Elección de un modelo biológico adecuado Evaluación de los parámetros adecuados para estudiar los efectos tóxicos

Correcta interpretación de los resultados: Valor predictivo del modelo y extrapolación in vitro - in vivo

Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro

Organismo entero Perfusión de órganos Cultivo de órganos/slices Cultivos primarios Líneas celulares Homogenados de tejidos Fracciones subcelulares Enzimas purificados

Relevancia

Complejidad

Elección de un modelo biológico adecuado

7

Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro

Elección de un modelo biológico: Cultivos celulares Cultivos Primarios Líneas celulares Líneas celulares manipuladas geneticamente Co-cultivos Cultivos organotípicos Cultivos Primarios Aquellos formados por células derivadas directamente del tejido u órgano donante. Pueden ser proliferantes (fibroblastos, etc) o no proliferantes (hepatocitos)

A

B

C

D

8

Cultivos de Células de Sistema Nervioso Humano para Estudios de Fármaco-Toxicología

Neuronas

Astrocitos

Oligodendrocitos

Cél. de Schwann

Microglí Microglía

Cél.Cromafines

9

Líneas Celulares Contínuas Caracterí Características: Células inmortales Transformadas mediante virus, etc o de origen tumoral Heteroploides Estabilidad fenotípica

Ventajas:

Manejo fácil Comercializadas en las colecciones de células (ECACC, ATCC)

Inconvenientes: Pérdida de funciones diferenciadas

Células manipuladas genéticamente Expresión de un gen de interés

É

Integració Integración en el genoma de un gen de interé interés mediante retrovirus Inmortalización de los hepatocitos Expresión de isoenzimas del citocromo P450 (CYP) Expresión de otros genes de interés

É

Expresió Expresión transitoria de un gen de interé interés mediante adenovirus

10

Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro

Evaluación de los parámetros adecuados para estudiar los efectos tóxicos

Estudios de citotoxicidad general: general

Efectos sobre funciones vitales de la células.

Toxicidad órganorgano-especí específica: Efectos sobre funciones diferenciadas de las células del órgano diana.

Mecanismos moleculares de toxicidad

Fármacos Xenobióticos

24-72 h

HEPATOCITOS EN CULTIVO

VIABILIDAD

FUNCIONES BIOQUÍMICAS

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Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Estudios de citotoxicidad general: general Alteraciones de las funciones vitales de la células.

Criterios: Criterios Ensayos de viabilidad celular (MTT, RN, LDH, GOT, GPT, ATP, etc) Modelos: Lineas celulares y cultivos primarios Objetivo: Determinar la máxima concentración no tóxica

A

100 75 50 25

IC10 IC50 0 100

250

500

1000

Concentration (µM)

-log(Viability) (% of control)

Viability (% of control)

(MCNT), y las IC10 e IC50

6

B

4 2 0 -2 -4

IC50

IC10

-3

-2

-6 -4

-1

logit(Concentration) (µM)

12

Los IC’s, parámetros de comparación relativa

110 100

100 % viable

% del Control

90 80 70 60

< 5 % viable

50 40 30 20 10

IC10

IC50

0

Concentración

13

1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9

o. origen=.3060 pendiente=.9320 r ²=.7434

log(Human lethal concentration)

log(Human lethal concentration)

Relación entre la toxicidad in vitro y la in vivo 1 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9

o. origen=.4523 pendiente=.8848 r ²=.7745

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1

log (Rat Hepatocytes IC50)

log (HepG2 IC50)

Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Estudios de toxicidad órgano-específica: fica Alteraciones de funciones diferenciadas del órgano diana a concentraciones que no comprometen la viabilidad celular.

Criterios: Criterios Evaluación de funciones diferenciadas a

concentraciones sub-citotóxicas (⊆MCNT o IC10)

Modelos: Cultivos primarios Objetivo: Determinar efecto tóxico y mecanismo de toxicidad

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Tipos celulares Hígado Sistema nervioso Musculo liso y estriado Células de la piel Riñón Páncreas Pulmón Células oculares Células vasculares Células óseas Células sanguíneas Intestino Otros tejidos

Estudios sobre los tejidos/órganos diana Biotransformación. Efectos beneficiosos o tóxicos a nivel celular o molecular sobre funciones celulares específicas. Biocompatibilidad. Irritación/corrosividad. Acción farmacológica. Carcinogénesis/mutagénesis.

Cultivo de células de diferentes tejidos humanas y de especies animales

Modelos celulares de origen humano Estudios In Vitro predictivo para el hombre

Los modelos celulares de origen humano están llamados a desempeñar un papel puente entre los ensayos preclínicos en animales y los ensayos clínicos en el ser humano

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Cultivo de Células Humanas

Experimentación Animal

Ayuda para la selección de la especie animal más adecuada para los estudios pre-clínicos

In Vitro In vivo Estudios pre-clínicos a nivel fisiológico que requieren el organismo entero.

Permite obtener resultados a nivel bioquímico, metabólico y funcional muy predictivos para el hombre.

In vivo Ensayos Clínicos

Diseño experimental para evaluar la toxicidad in vitro Correcta interpretació interpretación de los resultados: Valor predictivo del modelomodelo-Riesgo de toxicidad Relevancia del efecto observado Reversibilidad del efecto tóxico observado Diferencia de sensibilidad interespecies Aspectos farmacociné farmacocinéticos del compuesto Diferencias en el metabolismo interespecies

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RIESGO DE TOXICIDAD RT =Concentración Plasmática /IC50 Pico en plasma tras administración terapéutica

RIESGO DE TOXICIDAD RT =Con. Plasmática/IC50 Viabilidad

Buprenorfina

Conc. Plasmática (mM)

LDH (IC50)

RT

0.7-1.7 x 10-5

0.1

0.7-1.7 x 10-4

Morfina

3 x 10-4

Heroína

6 x 10-2 --3x

Metadona

4.5

6.6 x 10-5

3.1

1.3 x 10-2 ---

10-3

9.7 x

2 x 10-3 5 x 10-2

3.9

1 x 10-4

0.65

4 x 10-3

Sínt. Albúmina (IC50) 2.1 x 10-2

3.3-8.1 x 10-3

10-1

3.9 x 10-4

9.6 x 10-1

7.8 x 10-2 ---

7.7 x

3.1 x 10-3

10-4

5.1 x 10-4 1.3 x 10-2

3.1 x 10-1

1.5 x 10-4

5.6 x 10-3

6.2 x 10-3

RT

---

---

---

Meperidina

Funcionalidad

6.5 x 10-3 1.6 x 10-1

1.8 x 10-2 7.1 x 10-1

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ESTUDIOS DE REVERSIBILIDAD IN VITRO

Estudio de la hepatotoxicidad in vitro 3) Extrapolación In vitro-In vivo / Evaluacion del riesgo

Ø

Relevancia de la función metabólica alterada

Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

Reversibilidad del efecto Mecanismos de toxicidad implicados Interacción con otros fármacos Identificación de los CYPs implicados en el metabolismo Induccion/inhibicion del CYP ¿Participan en el metabolismo CYPS con polimorfismo genetico? Evaluación del riesgo de hepatotoxicidad

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Aplicaciones de los Modelo In Vitro • • • • • • • • • • •

Clasificación y etiquetado de sustancias químicas Biocompatibilidad de materiales Carcinogénesis y mutagénesis Test de irritación ocular y cutánea Fototoxicidad Toxicología del desarrollo Toxicidad órgano-específica Toxicidad a nivel sistémico Mecanismos moleculares de toxicidad Metabolismo y toxicidad de fármacos Evaluación de interacciones entre fármacos

• Ecotoxicología

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