UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR AREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADEMICO DE INGENIERIA EN PESQUERIAS

TESIS EVALUACION IN VIVO DE UNA DIETA INCLUIDA CON ENSILADO DE CALAMAR PARA CAMARON BLANCO (Litopenaeus vannamei)

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE INGENIERO EN PESQUERIAS PRESENTA:

IGNACIO EDEN MARQUEZ CALDERON DIRECTORA DE TESIS: DRA. MAURILIA ROJAS CONTRERAS

LA PAZ, B.C.S., NOVIEMBRE DEL 2011

Resumen Los camarones son importantes en la nutrición humana por ser una buena fuente de proteína además de su exquisito sabor. Su demanda ha propiciado un aumento en la producción de larva y en el número de granjas camaronícolas. Como consecuencia se está requiriendo alimento balanceado que cubra los requerimientos nutricionales de los organismos. El mayor costo de los ingredientes es la proteína, por lo que se requieren fuentes nuevas para un desarrollo óptimo y de bajo costo. En el presente trabajo se probó un alimento elaborado con ensilado de calamar Dosidicus gigas como fuente de proteína en sustitución de la harina de pescado. Este ensilado fue elaborado con bacterias acido lácticas (BAL) previamente caracterizadas por su potencial probiótico para camarón blanco Litopenaeus vannamei. El alimento control fue elaborado con harina de pescado en lugar del ensilado. El análisis proximal del ensilado de calamar mostró un 65.67±0.48% de proteína, 4.41±0.16% lípidos, 4.78±0.10% cenizas y 23.60±0.12 de humedad. La carga microbiana del ensilado fue de 7.5x107 UFC/ml de BAL. El ensilado liofilizado presentó una carga microbiana de 7.5x104 UFC/ml de BAL. Los alimentos control (HP) y el experimental (EC) presentaron una composición proximal de 31.01±0.619% y 35.16±0.20% de proteína, 16.44±0.35% y 15.40±0.14% de grasa, 2.79±0.036% y 5.34±0.113% de cenizas y un pH de 6.28 y 4.80 respectivamente, y sin presencia de BAL. El Ensayo in vivo fue llevado a cabo en tanques de 100 L, por sextuplicado, utilizando agua filtrada con filtros de hasta 1 micra, pasada por luz U.V. con aireación y calentadores, con 30 camarones en un rango de peso de 0.2-0.3g por tanque. El bioensayo de crecimiento tuvo una duración de 8 semanas. Al final de experimento, el peso promedio de los camarones fue de 2.68±1.32g en el tratamiento EC y 2.643±1.38g en el HP. La ganancia en peso fue de 2.43±1.32g para EC mientras que para HP fue de 2.39±1.38 g. Estadísticamente no hubo diferencias significativas entre los dos tratamientos (P=0.35). El factor de conversión alimenticia (FCA) fue de 1.86±0.20 (g) para EC y 1.85±0.25 (g) para HP. La pérdida de materia seca (PMS) para EC fue de 38.31±0.29% y para HP fue de 18.26±0.36%. La retención de materia seca (RMS) fue de 61.60±0.31% para EC mientras que por el tratamiento HP fue de 80.11±1.60%. Los análisis estadísticos aplicados a los

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factores ambientales mostraron que dichos factores pudieron repercutir los resultados estadísticos finales, dándole prioridad a la temperatura en la que no existió varianza entre tratamientos con P=0.594, sin embargo los días 22 y 23 se incrementó hasta 36°C en el tratamiento EC, sometiendo a estrés a los organismos y produciendo la muerte de 4 organismos. La salinidad no tuvo diferencias entre ambos tratamientos con P=0.354. El análisis estadístico del oxígeno disuelto en el agua mostro diferencias significativas entre ambos tratamientos con P=0.0029. Se sugiere que esta falta de oxígeno repercutió directamente en el crecimiento de los camarones, reflejado en el análisis estadístico final. Los resultados demostraron que el alimento EC tuvo una RMS baja además de un pH muy ácido, por lo que no se pudo comparar con el control. Sin embargo a pesar de dichos efectos adversos, el FCA del tratamiento EC fue ligeramente más alto, por lo que se puede concluir que bajo condiciones homogéneas el tratamiento EC permitirá un incremento de peso mayor que el tratamiento HP.

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Dedicatoria

A DIOS Que me ha permitido el milagro maravilloso de la vida y enseñarme el camino correcto, guiándome y fortaleciéndome cada día con su Santo Espíritu.

A MIS PADRES IGNACIO MARQUEZ JUAREZ, ALEIDA MARTINA CALDERON GARIBALDI. Que siempre han estado conmigo en aciertos y equivocaciones. Gracias por su apoyo y sus consejos, por la motivación que me han dado y que me ha permitido ser una persona de bien, pero más que nada, por brindarme su amor.

A MIS HERMANOS MARIO

ALBERTO

MARQUEZ

CALDERON,

DIANA

ANAHIS

CALDERON. Gracias por su apoyo y sobre todo… Gracias por formar parte de mi familia

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MARQUEZ

Agradecimientos Agradezco a la Doctora Maurilia Rojas Contreras por brindarme la oportunidad de realizar mi tesis así como su asesoría y apoyo. Al Doctor Marco Antonio Cadena Roa por apoyarme con sus ideas y por enseñarme el funcionamiento de las instalaciones del laboratorio húmedo de Pichilingue. Al comité revisor de mi tesis, formado por la Dra. Maurilia Rojas Contreras, Dr. Marco Antonio Cadena Roa y Dr. Carlos Rangel Davalos. Agradezco al M.C. Ernesto Goytortua por aportarme sus conocimientos y por apoyarme en la elaboración de los alimentos en el Laboratorio de Nutrición Acuícola del CIBNOR. Agradezco a la Empresa Acuacultura Mahr por apoyarme con los organismos que se utilizaron en los experimentos de este trabajo. Agradezco al Doctor Alfredo Flores Irigollen por compartir conmigo sus conocimientos y por apoyarme en los análisis estadísticos realizados en esta tesis. A Diana Arce mi Biskocha por haber estado a mi lado este tiempo, apoyándome de diferentes maneras para concluir esta etapa de mi vida. A la IBQ Alejandra Cosió Castro por su apoyo en el laboratorio y por haber creído en mí echándome porras. A la Universidad Autónoma de Baja California Sur por permitirme realizar mis estudios de licenciatura. Finalmente, gracias a mi familia mis padres, mis hermanos, mis abuelos por su enorme cariño y apoyo brindado y a todas las personas que contribuyeron para que este trabajo llegaran a su término.

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Índice General Resumen Dedicatoria Agradecimientos Índice de tablas Índice de figuras 1. Introducción 1.1. Acuicultura del camarón 1.2. Bacterias probióticas

2. Antecedentes 2.1. Acuacultura del camarón blanco 2.2. Morfología 2.3. Nutrición para el desarrollo acuícola 2.4. Digestibilidad del camarón blanco 2.5. Ensilados como alternativa para el aprovechamiento de materia prima 2.6. Tipos de ensilados 2.7. Uso de probióticos 2.8. Bacterias acido lácticas (BAL) reconocidas 2.9. Alimentos balanceados 2.10. Calamar gigante (Dosidicus gigas)

3.Justificación 4. Hipótesis 5. Objetivos 5.1. Objetivo general 5.2. Objetivos particulares

6. Materiales y métodos 6.1. Reactivación y cultivo de la cepa TD23 6.2. Elaboración del ensilado 6.3. Cuenta de bacterias acido lácticas (BAL) 6.4. Determinación de pH y acidez titulable 6.5. Análisis bromatológico del ensilado 6.5.1. Determinación de humedad 6.5.2. Determinación de cenizas 6.5.3. Determinación de grasas por el método de Soxhlet 6.5.4. Determinación de proteína 6.6. Liofilización del ensilado de calamar 6.7. Cuenta de BAL, mesófilos aerobios y coliformes en el ensilado liofilizado 6.8. Preparación del alimento 6.9. Análisis bromatológico del alimento

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I II III VI VII 9 9 11 13 13 14 15 16 18 18 19 19 20 22 23 25 25 25 25 26 26 26 27 27 29 29 29 30 31 33 33 34 35

6.10. Evaluación In vivo del ensilado de calamar como fuente de proteína en camarones adultos 6.11. Determinación de pH 6.12. Estabilidad en el agua

7. Resultados 7.1. Características físicas y microbiológicas del ensilado de calamar fresco 7.2. Análisis bromatológico al ensilado de calamar 7.3. Características microbiológicas del ensilado de calamar liofilizado 7.4. Análisis bromatológicos de alimentos balanceados 7.5. Características físicas de los alimentos balanceados EC y HP 7.6. Análisis estadísticos del experimento in vivo donde se evaluaron las dietas EC y HP 7.7. Análisis de varianza de parámetros ambientales

8. Discusión 9.Conclusiones 10.Recomendaciones 11. Bibliografía

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Índice de tablas Paginas Tabla 1

Programa del destilador (Buchi Destillation Unit B-324).

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Tabla 2

Ingredientes de los alimentos para camarón formulados.

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Tabla 3

Características físicas y microbiológicas del ensilado biológico de calamar fresco.

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Tabla 4

Composición química proximal del ensilado biológico de calamar con la bacteria probiótica TD23 en base seca y en base húmeda.

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Tabla 5

UFC/ml de ensilado de calamar liofilizado.

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Tabla 6

Características físicas de alimentos de ensilado biológico de calamar y alimento control a partir de harina de pescado.

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Tabla 7

Características físicas de los alimentos a partir de ensilado biológico de calamar y alimento control a partir de harina de pescado.

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Tabla 8

Resultados estadísticos de la evaluación de las dietas con ensilado de calamar y el control en camarón blanco Litopenaeus vannamei.

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Tabla 9

Análisis de varianza de alimentos EC y HP.

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Tabla 10

Análisis de homogeneidad de varianzas de alimentos EC y HP.

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Tabla 11

Análisis de varianza de temperaturas de alimentos EC y HP.

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Tabla 12

Análisis de varianza de oxigeno de alimentos EC y HP.

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Tabla 13

Análisis de varianza de salinidad de alimentos EC y HP.

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Índice de figuras Paginas Figura 1

Anatomía del camarón blanco.

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Figura 2

Musco de calamar previamente desinfectado y limpiado.

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Figura 3

Determinación del pH usando el potenciómetro.

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Figura 4

Determinación de acidez titulable.

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Figura 5

Mufla (Thermolyne Type 1400 Furnace), desecador y pinzas empleados

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para la determinación de cenizas. Figura 6

Extractor de éter de petróleo (Buchi Extraction Sistem B-811) empleado

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para determinación de grasas. Figura 7

Digestor de kjeldahl (Buchi Digestion Unit K-424) (A), purificador de

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gases (Buchi Scrubber B-414) (B) y destilador (Buchi Destillation Unit B-324) (C). Figura 8

Estanques de engorda en unidad Pichilingue.

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Figura 9

Estanque y alimento balanceado con camarones de tratamiento EC.

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Figura 10

Estanque y alimento balanceado con camarones de tratamiento HP.

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Figura 11

Alimentos balanceados EC y HP en agua destilada.

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Figura 12

Lactobacillus plantarum TD23 utilizada para la elaboración del ensilado.

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Figura 13

Distribución normal de pesos iníciales del alimento control HP.

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Figura 14

Distribución normal de pesos iníciales del alimento EC.

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Figura 15

Distribución normal de pesos iníciales de los alimentos HP Y EC.

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Figura 16

Análisis de varianza de alimento EC y HP.

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Figura 17

Probabilidad normal de pesos finales de alimentos EC y HP.

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Figura 18

Análisis de varianza de temperaturas de alimentos EC y HP.

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Figura 19

Análisis de varianza de oxigeno de alimento EC y HP.

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Figura 20

Análisis de varianza de salinidad de alimento EC y HP.

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VIII

1. Introducción. 1.1. Acuicultura del camarón. El cultivo de camarón en México se inició en los setentas, basado en dos modelos técnicos de desarrollo: el cultivo semi-intensivo y otro con el objeto de obtener una tecnología intensiva. En México la mayoría de las costas son apropiadas para el cultivo del camarón. Muchas de las áreas costeras del país cuentan con estuarios y lagunas costeras extensas con abundante reclutamiento de post-larvas salvajes. En Sinaloa se concentra el 82.64% de la superficie total de estanques del país (Cortes, J., 1993). De acuerdo al anuario estadístico de pesca 2009 con correcciones a este el 14 de diciembre del 2010, en México el volumen de la producción acuícola en peso vivo y en modalidad de cultivo del camarón fue de 133,282 toneladas. Así mismo se tuvo una producción pesquera nacional de 196,456 toneladas. La participación acuícola en la producción pesquera nacional en peso vivo por especie fue de un 67.84% y la participación de la acuacultura en el valor de la producción pesquera nacional, fue de $5,346,161 de pesos y el valor de la producción nacional en miles de pesos fue de $8,005,070 con una participación del 66.78%. La participación de la acuacultura de baja california sur en el volumen de la producción pesquera nacional en peso vivo según litoral y volumen es de 3,263 toneladas, con un valor de la producción en miles de pesos de $127,014 (Anuario estadístico de pesca., 2009). Por ser la acuacultura una buena fuente de ingresos, se le ha dedicado un amplio estudio relacionado con los diferentes estadios, parámetros ambientales óptimos para su desarrollo y requerimientos nutricionales entre otros. En los camarones los requerimientos nutricionales varían en las diferentes etapas de vida. En la etapa de zoea y mysis, las larvas se alimentan de plancton. Las post-larvas, al tener comportamiento demersal, son detritívoras, mientras que el hábito alimenticio de los juveniles inicialmente de tipo omnívoro, cambia posteriormente a carnívoro y ellos consumen macro invertebrados de

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movimientos lentos. Los camarones adultos son consumidores oportunistas pero parece ser que prefieren alimentos de origen animal en lugar de origen vegetal (Martínez, L., 1999)

Uno de los factores limitantes en la acuacultura es la obtención y producción de alimentos que cubran todos los requerimientos para la especie de cultivo y que resulten costeables (Torrentera, B., 1987). En general, la calidad de los alimentos utilizados en la camaronicultura depende de las condiciones de manufactura y de la calidad de la materia prima utilizada.

La composición de las harinas utilizadas en la formulación de alimentos, varían ampliamente en su análisis de acuerdo a la naturaleza de la materia prima y a los procesos y cuidados de elaboración de la dieta, estas harinas son ricas en ácidos grasos poli insaturados, susceptibles de sufrir deterioro, no solo sobre la calidad de la proteína, sino también sobre la concentración de aminoácidos esenciales (De la Higuera, M., 1985). La harina de pescado sirve también como atractante y es altamente palatable y digestible para el camarón. Generalmente contiene alrededor de 60% de proteína. En dietas comerciales, el nivel de inclusión de harina de pescado varia de un 10 a 40% (Akiyama, D., 1989). En el caso de las dietas para L. Vannamei, los niveles por debajo de un 20% pueden ocasionar una depresión del crecimiento y no hay balance energético. La harina de calamar es posiblemente el mejor ingrediente para dieta de camarón. Sin embargo, es muy costoso (Akiyama, D., 1989) en algunas regiones del mundo. Al calamar se le ha identificado un péptido como factor de crecimiento, incrementando la eficiencia alimenticia del camarón. La harina de calamar, como todos los productos marinos, provee la proteína en las dietas para la camaronicultura (Akiyama, D., et al. 1991). “la harina del calamar contiene aproximadamente 40% de proteína y 5% de lípidos. El nivel de esta harina en las dietas comerciales oscila entre 2 y 10%. No existen limitaciones nutricionales para el uso de esta harina, sin embargo su uso es limitado por su precio y disponibilidad (Akiyama, D., et al. 1991).

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El problema de la sanidad acuícola es el más devastador y de mayor impacto para el camarón de cultivo, teniendo efectos socioeconómicos profundos en países donde esta actividad es significativa, por lo tanto la sustentabilidad de la misma, depende enormemente de la prevención y control de enfermedades. Existen tratamientos específicos para las enfermedades virales sin embargo los invertebrados son incapaces de generar memoria específica contra patógenos, por lo que es necesario desarrollar estrategias para prevenir las enfermedades infecciosas. Las enfermedades virales y bacterianas han afectado en gran escala los cultivos de camarón en todo el mundo, provocando grandes pérdidas económicas. Para prevenir infecciones producidas por el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) y la bacteria Vibrio harveyi en el cultivo de peneidos, se han utilizado inmuno estimulantes de diferente composición química como lipopolisacáridos (LPS), péptidoglucanos, beta-glucanos y pigmentos carotenoides, cuya función principal es activar los sistemas de biodefensa en peneidos, (Camilo, P., 2006).

1.2. Bacterias probióticas.

En la actualidad muchos alimentos son adicionados con bacterias benéficas para el desarrollo óptimo de los organismos destinados al consumo humano, para la obtención de un producto de calidad sano, saludable con características organolépticas adecuadas a la naturaleza del organismo y sabroso. Las

bacterias del género Lactobacillus son Gram

positivas, no esporuladas, son células en forma de bacilos, algunos son muy largos mientras que otros son cocobacilos, aparecen solos o en cadenas pequeñas o grandes, anaerobios facultativos; casi todas las especies son inmóviles; mesófilas (pero algunas son psicrófilas) pueden ser homo o heterofermentativas. Se encuentran en fuentes vegetales, en la leche, la carne y en el sistema digestivo. Muchas se utilizan en el bioprocesamiento de alimentos y algunas se usan como probióticos (De las Cagigas, A., 2002).

Los probióticos estimulan las funciones protectoras del sistema digestivo. Son también conocidos como bioterapéuticos, bioprotectores o bioprofilácticos y se utilizan para

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prevenir las infecciones entéricas y gastrointestinales. Para que un microorganismo pueda realizar esta función de protección tiene que cumplir los postulados de Huchetson: ser habitante normal del intestino, tener un tiempo corto de reproducción, ser capaz de producir compuestos antimicrobianos y ser estable durante el proceso de producción, comercialización y distribución para que pueda llegar vivo al intestino. Es importante que estos microorganismos puedan ser capaces de atravesar la barrera gástrica para poder multiplicarse y colonizar el intestino (Bibek, R., et al. 2010). El efecto protector de estos microorganismos se realiza mediante 2 mecanismos: el antagonismo que impide la multiplicación de los patógenos y la producción de toxinas que imposibilitan su acción patogénica. Este antagonismo está dado por la competencia por los nutrientes o los sitios de adhesión. Mediante la inmunomodulación protegen al huésped de las infecciones, induciendo a un aumento de la producción de inmunoglobulinas, aumento de la activación de las células mononucleares y de los linfocitos (Bibek, R., et al. 2010). Las bacterias ácido lácticas utilizan varios azúcares como la glucosa y la lactosa para la producción de ácido acético mediante la fermentación. Algunas bacterias conocidas como anaerobias facultativas y otras como anaeróbicas obligadas, pueden colonizar transitoriamente el intestino y sobrevivir durante el tránsito intestinal; además por su adhesión al epitelio, modifican la respuesta inmune local del hospedero (De las Cagigas, A., 2002).

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2. Antecedentes. 2.1. Acuacultura del camarón blanco. No todas las especies de camarón tienen un mismo valor comercial, el precio depende de varios factores, pero principalmente del tamaño y aspecto. Los camarones blancos y cristalinos tienen un mayor precio en el mercado que los camarones pigmentados. Cuando se ponen en la balanza todos los aspectos anteriores, se está en condición de seleccionar la o las especies que mejor convienen para la situación particular que se va a manejar. El camarón blanco es la especie más cultivada en el hemisferio occidental siendo nativa de la cosa oeste del pacifico, con una distribución geográfica desde Sonora, el Golfo de California, México hasta Perú en Sudamérica (Martínez, L., 1999). El mercado del camarón domestico, el valor del producto con cascara y sin cabeza comienza a disminuir de acuerdo a los tamaños, sin embargo las ventas continúan estables para los tamaños mayores. De acuerdo a la situación de la oferta actual, las remesas de camarón domestico abril del 2010 fueron 1,181 millones y se incrementaron en abril del 2011 a 1,542 millones de toneladas (peso sin cabeza), un 5.8% sobre el mismo periodo en 2010. La importación de camarón se encuentra mucho más alta con respecto al año anterior, a pesar de la producción de camarón mexicano. 2011 promete ser un año de transición. Se prevé que los altos costos del camarón provocaran una mayor producción en todas partes tanto en primavera como en verano (Panorama acuícola magazine., 2011).La producción acuícola en peso vivo y en modalidad de cultivo del camarón fue de 133,282 toneladas (Anuario estadístico de pesca., 2009). El camarón blanco puede alcanzar una talla comercial de unos 20g en un tiempo de 4 a 6 meses a partir de post-larva de 5 a 15 días de edad, cuando se manejan densidades de 50,000 a 75,000 organismos por hectárea, la supervivencia que se ha reportado en cultivo larvario oscila entre 60 y 80%. Tolera amplios rangos de temperatura de 25 a 30°C, se desarrolla en amplios rangos de salinidad e inclusive

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ha llegado a cultivarse

experimentalmente en agua dulce (Scarpa, J., 1998). Una tasa de fecundidad aceptable en promedio es de 180,000 nauplios por hembra (Aguirre, H., 1998). 2.2. Morfología. Como miembros de los crustáceos, los camarones son artrópodos mandibulados con apéndices birrameados articulados, con dos pares de anténulas, caparazón, branquias. El cuerpo de los camarones se divide en tres regiones: cefalotórax, abdomen y telson. Los apéndices del cefalotórax son las anténulas, mandíbulas, maxilas, maxilipedos y pereopodos; El abdomen está formado por seis segmentos y seis pares de apéndices llamados pleopodos, cuya función es natatoria. En particular la familia Penaeidae, se caracteriza por tener el cuerpo poco a considerablemente comprimido, rostro por lo general bien desarrollado y comprimido, lateralmente cerrado; pedúnculos oculares moderados a muy alargados, anténulas con dos flagelos. La mayoría de los órganos de los camarones, se encuentran en la región del cefalotórax. El cerebro es trilobulado, presente en un ganglio supra esofágico. El sistema nervioso es ventral en el tórax y en el abdomen, con los ganglios metamerizados. El corazón es ventral y se conecta directamente con el hemoceloma a través de las arterias abdominales, ventral y dorsal. El sistema digestivo se compone de boca, estomago, y hepatopáncreas situados en el cefalotórax; un intestino, una glándula intestinal en el abdomen y el ano situado ventralmente donde comienza el telson (Martínez, L., 1999).

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Figura 1. Anatomía del camarón blanco Litopenaeus vannamei (FAO, 2011) Para el desarrollo óptimo del camarón en cultivo, se requiere de compuestos químicos vitales en forma de alimento, el cual transforma en energía y finalmente en biomasa. La elaboración de alimentos balanceados es el renglón que mayor costo genera en los sistemas de producción semi-intensivo e intensivo, pudiendo llegar a representar hasta el 60% del costo total. 2.3. Nutrición para el desarrollo acuícola. Proteínas. Debido a la escasez y a la importancia que tienen como nutrimento las proteínas, se han convertido actualmente en el principal foco de atención de la mayoría de los tecnólogos de alimentos en el mundo. Estas sustancias desempeñan funciones biológicas en el organismo entre las que se cuentan principalmente la regeneración y la formación de tejidos, la síntesis de enzimas, anticuerpos y hormonas (Badui, S., 1993).Las proteínas poseen diversas funciones biológicas y se clasifican de acuerdo a su función. Las enzimas presentan la clase más amplia, las cuales poseen extraordinaria potencia catalítica catalizadores fabricados por el hombre (Lehninger, A., 1982).

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mucho más que los

Carbohidratos Estos son la fuente más abundantes y barata de energía. Los provenientes de las especies del reino vegetal son más variados y abundantes que los de reino animal. La estructura química de los hidratos de carbono determina su funcionalidad y sus características repercuten de diferente manera en los alimentos, principalmente en el sabor, la viscosidad, la estructura y olor. Es decir las propiedades de los alimentos tanto naturales como procesados dependen del tipo de carbohidrato que contenga y de las reacciones en que estos intervienen (Badui, S., 1993). Lípidos Estos desempeñan muchas funciones en los tejidos; además de que son una fuente de energía importante (cada gramo genera 9Kcal), muchos de ellos cumplen una actividad biológica; por ejemplo, unos son parte estructural de las membranas celulares y de los sistemas de transporte de diversos nutrientes. Las grasas y aceites son los principales lípidos que se encuentran en los alimentos contribuyendo a la textura y en general a las propiedades sensoriales del producto (Badui, S., 1993). 2.4. Digestibilidad del camarón blanco. La digestión de un alimento depende de la anatomía y fisiología del organismo. Dentro de las funciones del tracto digestivo se tienen las de ingestión, transporte de nutrientes, digestión mecánica, hidrolisis química y bioquímica, la absorción celular, el almacenamiento de los nutrientes y la transferencia de la excreta. El tracto digestivo de un decápodo adulto tiene una parte externa donde se localizan el esófago y el estómago; una parte media donde se localizan los túbulos, sitios secretorios de las enzimas digestivas; y una parte final donde se localizan el recto y el ano. Se ha establecido que el principal órgano del sistema digestivo de los crustáceos es el hepatopáncreas, además de ser el órgano de mayor tamaño, tiene varias funciones biológicas como son la síntesis y secreción de las enzimas digestivas, la absorción, el mantenimiento de sustancias minerales y orgánicas, funciones metabólicas y la distribución de las reservas almacenadas. Para que la

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digestión química se lleve a cabo se requiere la acción de una serie de enzimas digestivas. Desde el punto de vista fisiológico el estudio de las enzimas digestivas del camarón ha presentado una importante herramienta, se pueden describir patrones de conducta alimentaria, como la habilidad de hidrolizar materiales específicos de la dieta, la respuesta a diferentes tipos de nutrientes, la contribución de las enzimas bacterianas. Las enzimas digestivas identificadas en el camarón son principalmente del tipo proteasas, aunque también se han detectado carbohidrasas y lipasas. (Martínez, L., 1999). Proteasas. En general, la pepsina en el estomago y la tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasas y aminopeptidasas en el intestino, son responsables de la hidrólisis de las proteínas ingeridas. (Withaker, J., 1994). La mayoría de las proteinasas identificadas en los camarones pertenecen a la familia de la serina, como la tripsina (Galgani, F., et al., 1984; Honjo, I., et al., 1990), quimotripsina (Tsai, H., et al., 1986 y 1991), aminopeptidasas, y carboxipeptidasas. Carbohidrasas. También existen enzimas que digieren los glúcidos: amilasas, maltasas, sacarasas y algunas veces celulasas. De forma general se sabe que los peces y crustáceos tienen baja capacidad para utilizar glúcidos. Lipasas. La digestión de los lípidos está asegurada por las lipasas y esterasas. Los lípidos alimenticios deben sufrir dos tipos de transformación para ser absorbidos. Una emulsificación que conduce a una microemulsión y una hidrólisis. En los crustáceos los compuestos emulsificantes que desempeñan la misma función que la bilis en los mamíferos es decir, la de disipar las grasas antes de su digestión, son derivados de la taurina y los ácidos cólicos y desoxicólicos (Cruz, L., 1994).

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2.5. Ensilados como alternativa para el aprovechamiento de materia prima. El método de ensilado se conoce desde hace más de cien años, pero los primeros antecedentes formales se registraron en 1936 cuando Virtanen trabajó en la conservación de forrajes. Podemos así definir al ensilado como un método de conservación basado en la acidificación de la materia prima, misma que conlleva a una hidrólisis enzimática. El acido empleado para este fin puede ser añadido o producido in situ por bacterias (Ojeda. M., 1993). El ensilado a partir de productos marinos es empleado con muy buenos resultados en la alimentación animal, su uso a nivel comercial comenzó en los países nórdicos como Noruega y Dinamarca, en donde se ha utilizado principalmente para la engorda de cerdos. Actualmente se emplea en la alimentación de animales de pieles preciosas, (Hussein R. et al., 1987), salmónidos (Affandi, R., 1986), etc. 2.6. Tipos de ensilados. Existen varios tipos de ensilados entre ellos: El biológico, donde el acido es obtenido in situ mediante la participación de microorganismos; y el químico, que es aquel en el que deliberadamente se agrega un acido como agente conservador (Martínez, L., 1999). Ensilados biológicos. En el método biológico se mezclan los residuos del pescado con una fuente de carbohidratos que es de primordial importancia en el proceso, ya que se requiere para la producción de acido láctico, mismo que reduce el pH y logra la estabilidad del producto. Las fuentes de carbohidratos pueden ser almidones o bien sustancias ricas en azucares (Martínez, L., 1999). Las BAL fermentan el azúcar presente y lo convierten en ácidos orgánicos, dando como resultado una disminución en el pH, inhibiendo el crecimiento de organismos putrefactivos y patógenos (FAO-COPESCAL, 1983).Las bacterias deseables dentro del proceso son las homo-fermentativas, que producen dos moles de acido láctico

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por mol de glucosa, y que por su naturaleza no se encuentran en el pescado o calamar y por tanto es necesario la inclusión de alguna cepa bacteriana, como Lactobacillus plantarum (FAO-COPESCAL, 1983). El objetivo fundamental de ensilar es el de conservar la materia prima mediante acidificación, sin embargo, este proceso provoca cambios bioquímicos entre los que destacan la hidrolisis de la proteína. Efecto hidrolítico. El efecto hidrolítico del ácido se debe especialmente a la formación de en grupos hidronios capaces de reaccionar rompiendo los enlaces peptídicos de la proteína. Esta actividad estará en función de la concentración, la temperatura y el ácido empleado (Thorpe, B., 1984). 2.7. Uso de probióticos. Los probióticos son microorganismos cuya actividad primordial es la de colonizar competitivamente dentro del tracto digestivo de los organismos en cultivo, evitando que microorganismos potencialmente patógenos lo hagan primero. A esta acción se le llama “exclusión competitiva” (Brown, H., 1989). Los probióticos implican el uso de bacterias vivas o levaduras en la dieta o en el agua de cultivo, que favorecen que el tracto digestivo sea colonizado inicialmente por microorganismos benéficos. Otras formas de acción de los probióticos, además de la colonización competitiva, es a través de la producción de sustancias inhibidoras contra otras bacterias (Austin, B., 1987), mejorando la actividad enzimática y digestiva de los organismos cultivados, para optimizar los factores de conversión alimenticia, o como degradadores de sustancias toxicas del medio, con lo que se mejora la calidad del agua. 2.8. Bacterias acido lácticas (BAL) reconocidas. Las bacterias acido lácticas, incluyendo los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporo lactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus, y Weisella. Estas bacterias se caracterizan por ser Gram positivas, normalmente inmóviles y no esporuladas,

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producen ácido láctico como principal o único producto de metabolismo fermentativo. Todas las bacterias acido lácticas crecen anaeróbicamente no obstante, a diferencia de los muchos anaerobios, no son sensibles al oxigeno y pueden crecer tanto en ausencia como en presencia del mismo. La mayor parte de las BAL obtienen energía solo del metabolismo de los azucares y compuestos relacionados fermentativos. Están restringidas a hábitats ricos en azucares normalmente, su capacidad biosintética es limitada y sus complejos requerimientos nutritivos incluyen aminoácidos, vitaminas, purinas y pirimidinas. Dentro del grupo de las bacterias acido lácticas se encuentran los probióticos más ampliamente estudiados y utilizados a nivel comercial como complemento dietético para humanos, animales de granja y de importancia acuícola. El género Lactobacillus se encuentra presente en 3 grupos, los cuales son Thermobacterium, Streptobacterium y Betabacterium. Para el crecimiento de Lactobacillus se necesita un medio complejo que contenga aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y carbohidratos fermentables, por lo que se encuentra generalmente asociado con hábitats ricos en nutrientes como leche, pescado, cereales, leguminosas, cavidades orales, tracto gastrointestinal etc. La actividad antimicrobiana de Lactobacillus se encuentra directamente asociada con la producción de ácidos orgánicos (láctico y acético), producción de otros productos finales del metabolismo como etanol, bacteriocinas, péptidos inhibidores del crecimiento microbiano, producción de sustancias antimicrobianas debajo peso molecular (Enríquez, N., 2009). 2.9. Alimentos balanceados. Se considera alimento balanceado el que es adecuado desde el punto de vista nutricional para un determinado animal en un estado físico específico, que sea capaz de mantener la vida y/o promover el crecimiento sin el consumo de otras sustancias adicionales salvo el agua (Tacon, A., 1990). Un alimento con dichas características representa del 50% al 60% del costo de la producción, por lo que su diseño, formulación y elaboración, debe de tener como objetivo encontrar el que sea optimo, económico y menores efectos de contaminación al ambiente. En la obtención de un alimento balanceado,

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se debe tomar en cuenta los siguientes factores: Especie y su hábitat, disponibilidad y calidad de ingredientes. Especie y hábitat. Entre los factores que se deben considerar en este punto están saber si la especie es carnívora, omnívora o herbívora, si se alimenta en el fondo (bentónica) o en la superficie (pelágica); si come durante el día o la noche; si su comportamiento con respecto al alimento es visual u olfatoria; si es rápido o lento en su alimentación; también es importante conocer la capacidad digestiva (actividad enzimática) y en lo posible saber acerca de los requerimientos nutricios de la especie. Disponibilidad y cantidad de los ingredientes. Un alimento balanceado se compone de ingredientes nutricios y no nutricios (aditivos). Los nutricios proporcionan los nutrimentos necesarios para un óptimo crecimiento y desarrollo del organismo; mientras que los aditivos son sustancias que se agregan en cantidades traza al alimento para diferentes propósitos. La disponibilidad de ingredientes llevará a formular el alimento deseado. Es importante seguir una serie de guías (Tacon, A., 1990; Cruz, L., 1998), en cuanto al control de calidad de los ingredientes para dar lugar a un alimento balanceado de calidad (Martínez, L., 1999). Factor de conversión alimenticia. Las especies que se consideran más rentables para cultivar, son las que tienen una tasa baja de conversión alimenticia, es decir que pueden adquirir una buena biomasa con la menor cantidad posible de alimento suministrado. Las tasas de menos de 2:1 con las que se obtienen 2kg de camarón por cada kg de alimento suministrado se consideran aceptables. (Martínez, L., 1999).

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2.10. Calamar gigante (Dosidicus gigas). El calamar gigante (Dosidicus gigas) es una especie oceánica y migratoria del pacifico mexicano oriental desde Monterey, California, hasta el norte de Chile, Sudamérica. Las principales zonas de pesca se encuentran frente a la costa oriental de la península de Baja California. Durante la primavera y el verano la pesca de calamar se realiza por la noche con poteras operadas manualmente y con la ayuda de iluminación potente con varias lámparas de 100 Watts o más, siendo el calamar gigante una de las especies marinas de mayor abundancia en Baja California Sur (Rivera, G., 2001). La composición química del calamar en base seca es de 68% de proteína, 4.7% de lípidos y 6.2% de cenizas. La composición de aminoácidos esenciales del calamar fresco en una dieta básica son: Arginina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Fenilananina, Valina y Triptofano. De acuerdo con los análisis de Cruz, E., et al. 1987, se deduce que la proteína de calamar puede ser utilizada como un complemento en la dieta para el cultivo de camarón.

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3. Justificación. En años recientes, mientras que el consumo de alimentos marinos se ha incrementado, el aumento anual del consumo de camarones ha sido casi de 9%, y el valor de las importaciones de camarones fácilmente excede el valor de los demás alimentos marinos. Dentro de los crustáceos marinos, los camarones del género Litopenaeus están entre los de mayor producción a nivel mundial, ya sean éstos obtenidos en ambiente natural o por cultivo. La creciente demanda de estos camarones posiblemente se debe a su alto rendimiento en carne, que está alrededor del 65%. Existen razones por las cuales el camarón ocupa una posición significativa en el mercado internacional. Una de ellas se debe a que este pequeño crustáceo es de algún modo diferente a otros mariscos, porque su carne no tiene espinas ni huesos. Otra razón es su popularidad, por la amplia distribución que tiene, ya que después de congelados pueden ser transportados fácilmente a cualquier parte del mundo, pero la verdadera causa de la fama de los camarones, especialmente entre las amas de casa, es porque estos a diferencia de los peces, su cocción es fácil y rápida. Hervidos, al vapor, salteados o en microondas, los camarones están listos para una multitud de usos y preparaciones. Debido a las características que presentan, incluyendo preferencia en el mercado, las mejores especies para el cultivo en Latinoamérica y Estados Unidos son: L. vannamei, L. stylirostris y L. schmitti. Las proteínas son el principal material orgánico en los tejidos animales, y constituyen entre el 65-75% del peso total, en base seca (Zendejas, J., 1991). El nivel óptimo de proteínas en la dieta de los crustáceos oscila entre 30 y 57% (Froster, J., 1975; Akiyama, D., 1989). Kanazawa ha señalado que el requerimiento proteico para el optimo crecimiento y eficiencia alimenticia en Litopenaeus vannamei es de 30% (Kanazawa, A., 1985). Lo estudios sobre requerimientos proteicos han correlacionado las propiedades nutritivas de las proteínas con su contenido y composición de aminoácidos. Las proteínas más nutritivas

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para una determinada especie suelen ser aquellas en las que su contenido en aminoácidos es semejante a la composición de la especie (Martínez, L., 1999).Siendo la proteína la más costosa dentro de los requerimientos nutricionales. Así mismo la carga microbiana es importante ya que algunas bacterias, levaduras, mohos y virus tienen la capacidad de producir enfermedades en el camarón. La adición de bacterias probióticas con actividades metabólicas deseables además de estimular la producción de proteínas inmunitarias, contribuye a la bioconservación de los alimentos con sus metabolitos antimicrobianos. Así mismo las bacterias se pueden emplear de manera directa en el procesamiento de alimentos, por ejemplo en los ensilados (Bibek, R., 2010). El grupo de bacterias mas empleadas para la elaboración de alimentos son las bacterias ácido lácticas, las cuales sintetizan su ATP en la fermentación láctica de los glúcidos. La elaboración de algunos alimentos se basa en la maduración donde intervienen principalmente las bacterias lácticas. Durante ésta, las proteínas se hidrolizan por la acción combinada de diferentes proteasas presentes como son nativas, coagulantes y microbianas. Los tratamientos previos, la selección del inoculo y las condiciones de maduración determinan la evolución de la proteólisis. La degradación de las proteínas puede seguirse por precipitaciones fraccionadas o por electroforesis. Las precipitaciones fraccionadas permiten separar las diferentes fracciones según el tamaño de los péptidos. La proteólisis primaria se refiere al rompimiento de las proteínas en polipéptidos solubles a pH 4.6 los cuales son aprovechados principalmente por la quimiosina y por endopeptidasa microbiana. (García, M., et al. 2005).

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4. Hipótesis. La sustitución de la harina de pescado por ensilado de calamar en la dieta de camarones adultos es una alternativa económica que conserva la conversión alimenticia obtenida con la harina de pescado.

5. Objetivos. 5.1. Objetivo general. Validar el ensilado de calamar como fuente de proteína de alta calidad para camarones adultos en cultivo.

5.2. Objetivos particulares.

a) Mejorar la calidad de la proteína contenida en el manto de calamar a través de la fermentación con bacterias probióticas para camarón. b) Analizar microbiológica y bromatológicamente el producto de la fermentación (ensilado). c) Elaborar el alimento y evaluación in vivo en organismos adultos de camarón blanco, la dieta incluida con ensilado de calamar.

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6. Materiales y métodos.

6.1. Reactivación y cultivo de la cepa TD23. Se tomó una asada de la cepa Lactobacillus plantarum TD23, congelada a -84 C y se sembró por estría cruzada en Agar MRS (DIFCO), Se incubó en una jarra de anaerobiosis por 24 horas. Se tomó una colonia aislada y se transfirió a un tubo con 5 ml de caldo de MRS e incubó aproximadamente 12 horas. A partir de este cultivo se preparo el inoculo para el ensilado en el mismo medio y mismas condiciones mencionadas en un matraz de 1L. El volumen que se preparó fue del 5% del calamar molido. El cultivo fue centrifugado y posteriormente lavado con PBS (phosphate buffered saline) 1x y se inoculó al manto de calamar triturado y homogenizado.

6.2. Elaboración del ensilado. Como materia prima se empleo manto de calamar (Dosidicus gigas), el cual se obtuvo del mercado local y fue llevado refrigerado al laboratorio. Primeramente, el manto fue lavado con agua corriente varias veces y posteriormente con agua estéril, se le quito la piel y se volvió a lavar. Una vez que el calamar estaba limpio se cortó en tiras y se congeló a -20˚C para después ser molido en un molino para carne previamente esterilizado. Después se le agregó como fuente de carbohidratos 5% de azúcar y como agente antimicótico se le adicionó 0.25% de ácido sórbico. Posteriormente se adicionó la bacteria probiótica Lactobacillus plantarum TD23, la cual se inoculó al 5% y se mezcló durante 5 minutos. La mezcla a ensilar se colocó en un recipiente cerrado y se llevó a la incubadora a 30 C, por 72 horas. La composición química de los ensilados fue analizada al finalizar el proceso.

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Figura 2. Manto de calamar previamente desinfectado y limpiado

6.3. Cuenta de bacterias acido lácticas (BAL) en el ensilado. Se tomó 1g del ensilado, se coloco en un tubo de ensaye que contenía 9 ml de PBS 1X y se realizó la dilución 10-1 a partir de ésta se prepararon las diluciones decimales de 102

hasta 10-4. Se tomaron 100 l de cada tubo y se sembraron por duplicado y por vaciado en

placa en Agar Rogosa y en Agar MRS. Se incubaron en jarra de anaerobiosis a 30 C. 6.4. Determinación de pH y acidez titulable. Se pesó 1 g de ensilado y se colocó en un tubo cónico con 10 ml de agua desionizada, se mezcló perfectamente durante 5 minutos y se tomó la lectura en un potenciómetro. Medición de Acidez. En un matraz Erlenmeyer de 150ml de capacidad se vertió 10ml del ensilado y se agregaron 3 gotas de fenolftaleina al 1%, se fijó la bureta en un soporte universal y se aforó con

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NaOH 0.1N. Se tituló la muestra hasta obtener una coloración rosa. El cálculo se hizo utilizando la siguiente fórmula: % de acidez= [(ml NaOHxN(NaOH)x mili equivalentes ácido láctico) / (ml de muestra)] x100.

Figura 3. Determinación de pH usando potenciómetro.

Figura 4. Determinación de acidez titulable.

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6.5. Análisis bromatológico del ensilado. Todos los análisis se hicieron por triplicado. 6.5.1. Determinación de humedad. La muestra del ensilado del calamar se colocó en una cápsula de porcelana de fondo plano, previamente puesta a peso constante, se pesaron 15g de muestra con una precisión de ±1mg. Se secaron la muestra en una estufa durante 4 horas a 100°C, para después enfriarse en el desecador 30 minutos a temperatura ambiente, se pesó y se registró este valor Posteriormente se realizo el cálculo utilizando la formula siguiente: %H = 100 (((b-a)-(c-a))/(b-a))Donde: a = peso de la charola seca (g) b = peso de la charola + muestra húmeda (g) c = peso de la charola + muestra seca (g) 6.5.2. Determinación de cenizas. Se pesó 1 gramo de muestra de calamar sin humedad a peso constante en un crisol a peso constante. Se incinero la muestra en la estufa, hasta la desaparición de los humos. Se introdujeron los 3 crisoles con la muestra en la mufla a 700ºC por 3 horas hasta la obtención de cenizas blancas. Se enfrió las muestras en un desecador por 1 hora y se pesaran rápidamente. Después se realizo el cálculo del porcentaje de cenizas con la siguiente fórmula: % de cenizas en base seca= peso muestra incinerada / peso de la muestra seca x 100

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Figura 5. Mufla (Thermolyne Type 1400 Furnace), desecador y pinzas empleados para la determinación de cenizas. 6.5.3. Determinación de grasas por el método de Soxhlet. Se pesó 1 g de muestra sin humedad a peso constante de ensilado de calamar y se colocó en un cartucho de extracción puesto previamente a peso constante. Posteriormente se colocó un tapón de algodón al cartucho. El cartucho se colocó dentro del tubo en el sistema de extracción de grasa (Buchi mod. B-811) y se agregaron dentro de este 250 ml de éter de petróleo. Se conectó al condensador y se abrió la llave del agua procurando mantener un flujo adecuado. Se encendió el equipo y se mantuvo la extracción por un tiempo de 2 horas y 10 minutos para extracción de la grasa de la muestra, posteriormente se separó el éter de petróleo. Al transcurrir el tiempo establecido, se apagó el equipo, se retiraron los cartuchos y se dejaron secar por 1 hora a temperatura ambiente en una campana de extracción, después se colocaron en la estufa a 50˚C durante 12 horas. Las muestras se enfriaron en el desecador por 20 minutos y se pesaron. El cálculo será realizado con la siguiente fórmula: Grasa cruda en base seca= (mi) – (mg) / (mi) * 100

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Dónde: mi= muestra inicial y mg= muestra desgrasada

Figura 6. Extractor de grasa (Buchi Extraction System B-811) empleado para determinación de grasas. 6.5.4. Determinación de proteína método de Kjeldahl. Se pesó 0.5 gramos de muestra de ensilado de calamar sin humedad, a peso constante, se colocaron en los tubos Kjeldahl, se adicionó 20 ml deH2SO4 al 98% y media tableta de catalizador Kjeldahl. Los tubos se colocaron en el digestor (Buchi K-424) y se precalentaron por 10 minutos en posición 10, después se cambio el digestor a posición 8 durante 1 hora 20 minutos. Una vez digerida la muestra se enfrió aproximadamente 20 minutos y se pasó al destilador (Buchi B-324), al cual se le acomodó un matraz de 250ml con 70 ml de ácido bórico para recibir el destilado. El programa de destilación que se utilizo fue el siguiente:

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Tabla 1. Programa del destilador (Buchi Destillation Unit B-324). H2O (el doble de H2SO2)

50 ml

NaOH

70 ml

Delay

10 seg

Dist

3 min

Vapor

75%

Al concluir el programa de destilación se agregaron 3 gotas de solución indicadora (verde de bromocresol y rojo de metilo en metanol) y se tituló con HCl al 1.15 N, posteriormente se realizaron los cálculos utilizando la formula siguiente: p(N) =

[v(1) – v(b)] x fc x f x m(N)

m . 1000

% N= p (N) x 100% % P = p (N) x pf x 100% p (N): peso de la fracción de nitrógeno v(1): consumo del titulante de la muestra (ml) v(b): consumo del titulante del blanco (ml) fc: factor de reacción molar f: molaridad del titulante m(n): peso molecular del n m: peso de la muestra (g)

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1000: factor de conversión Pf: factor de proteína % N: % de peso del N % P: % de peso de la proteína en base seca

Figura 7. Digestor kjeldahl, (Buchi Digestion Unit K-424) A), purificador de gases (Buchi Scrubber B-414) B) y destilador (Buchi Destillation Unit B-324) C). 6.6. Liofilización del ensilado de calamar. El ensilado fue colocado en recipientes estériles y transportado al CIBNOR donde se congelo en los frascos de la liofilizadora a -40 C y se colocaron las muestras en la liofilizadora hasta sublimar todo el hielo y obtener el ensilado deshidratado. 6.7. Cuenta de BAL, mesófilos aerobios y coliformes en el ensilado liofilizado. Las BAL se cuantificaron siguiendo el mismo procedimiento empleado en el apartado 6.3. Los mesófilos aerobios y los coliformes se cuantificaron en agar para métodos estándar (DIFCO) y agar rojo violeta bilis (DIFCO) respectivamente.

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6.8. Preparación del alimento. La formulación del alimento se realizó en el laboratorio de nutrición del CIBNOR por el M.C. Ernesto Goytortua Bores con el software MIXIWIN 2005, sustituyendo el 100% de harina de pescado por ensilado de calamar biológico, siguiendo la metodología descrita en la tesis de maestría de Macías Mejía, A., 2009 de acuerdo a la siguiente tabla. Tabla 2. Ingredientes de los alimentos para camarón formulados Alimentos experimentales HP

Ingredientes

EC

base húmeda base húmeda H desechos atún hpdatun1004

31.09

0.00

H integral trigo hit1004

24.18

35.00

Pasta de soya psoy1002

25.00

25.00

Ensilado de calamar liofilizado

0.00

21.55

Celulosa (c 8002)

10.00

6.51

Aceite de hígado de bacalao

2.43

4.65

Ácido alginico (a-7128)

2

2

Pre mezcla vitamina crustáceos

1.8

1.8

Lecitina de soya (lsoy1005)

1.5

1.5

Fosfato dibásico de sodio

1.2

1.2

Pre mezcla mineral crustáceos

0.5

0.5

Cloruro de colina

0.2

0.2

Vitamina C

0.09

0.09

Antioxidante BHT

0.004

0.004

Los ingredientes fueron pesados y mezclados uno por uno en una mezcladora, agregando macro-ingredientes para después homogenizar, una vez homogenizados perfectamente se incorporaron los micro ingredientes, los cuales fueron homogenizado en un recipiente, por último se agregaron los aceite de hígado de bacalao, para después pasarse a un molino.

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La pasta que se formó se colocó en un molino, la mezcla fue pasada por un cedazo en el molino hasta que esta se homogenizó totalmente tomando así forma de pellets. Una vez formados se colocaron en charolas de acero inoxidable para pasarse a una estufa a 60°C por 18 horas. 6.9. Análisis bromatológico del alimento. Aunque el software usado para formular el alimento proporcionó una composición bromatológica teórica de acuerdo a la composición de los ingredientes, se decidió hacer el análisis utilizando la misma metodología descrita anteriormente para el ensilado. 6.10. Evaluación in vivo del ensilado de calamar como fuente de proteína en camarones juveniles. El experimento se llevó a cabo en el laboratorio húmedo de la unidad Pichilingue de la UABCS durante 8 semanas. Se utilizaron 12 tanques de alrededor de 160 L de capacidad para el bioensayo, adecuados con suministro de agua, aire y corriente eléctrica. Los tanques contenían 2000 L de agua tratada con filtros de arena, de 10, 5 y 1 micra y luz ultravioleta. La empresa acuacultura Mahr donó post-larvas de camarón blanco, las cuales fueron transportadas a la unidad Pichilingue. Estas post-larvas fueron distribuidas en tanques de 500 L, y alimentadas con alimento comercial marca Bernaqua con el fin de llevarlas a un peso entre 0.2 a 0.3g. El experimento se llevo a cabo con 2 tratamientos. Dieta 1 control con harina de pescado y dieta 2. Ensilado de calamar que sustituyó totalmente la harina de pescado. Replicas. Se tuvieron 6 replicas por cada tratamiento. Densidad de organismos: 30 organismos por tanque. Muestreo. Se tomaron los pesos iníciales y finales y se llevaron a cabo los siguientes análisis de los resultados.

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Ganancia en peso (g); gw = pf – pi donde pf es el peso final promedio de los organismos y pi es el peso inicial promedio de los organismos. Porcentaje de peso ganado; %w = gw * 100 / pi; y Factor de conversión alimenticia (FCA): Alimento aparentemente consumido (g) / Incremento en peso corregido (g). Este factor se corrige en función de la mortalidad: IPC=Bf+ ½ (Ppf+Ppi)(Nm)-Bi IPC= Incremento de peso corregido Bf= Biomasa final Ppf= Peso promedio final. Ppi=Peso promedio inicial. Nm= Número de muertos

Figura 8. Estanques de engorda en unidad Pichilingue.

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Figura 9. Estanque y alimento balanceado con camarones de tratamiento EC

Figura 10. Estanque y alimento balanceado con camarones de tratamiento HP 6.11. Determinación de pH. Este se realizo siguiendo la metodología descrita en la sección 6.4.

6.12. Estabilidad en el agua. Se pesó 1gramo de cada uno de los alimentos EC y HP, se homogenizaron en un mortero previamente desinfectado, se agregaron 100 ml de agua destilada y se dejo reposar

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por 1 hora sin agitación en vasos de precipitado de 250 ml. Se filtro en un papel filtro (puesto a peso constante) Whatman, colocado en el filtro Buchner y éste en un matraz Kitazato conectado a una bomba de vació. Posteriormente se tomo el papel con una pinzas desinfectada, se colocó en una estufa a 100˚C durante 1 hora y se pesó en una balanza analítica. Se utilizaron las siguientes formulas para sacar el porcentaje de Retención de Materia Seca (RMS) y la Pérdida de Materia Seca (PMS) por triplicado en agua destilada a temperatura ambiente . PMS% = (peso del alimento antes de lixiviar – peso del alimento después de lixiviar) * 100 / alimento en base seca antes de lixiviar RMS% = Peso seco del alimento residual x 100 / Peso seco del alimento.

Figura 11. Alimentos balanceados EC y HP en agua destilada Tratamiento estadístico. Los datos resultantes de los porcentajes de proteína de las dos dietas y los pesos iníciales y finales de los organismos en cada tratamiento fueron sometidos a un análisis de varianza (Anova) de un factor de datos agrupados a un nivel de confianza del α=95%, con la finalidad de determinar diferencias significativas. Los datos se utilizarán bajo principios de normalidad y homogeneidad de varianza y se llevaron a cabo análisis de comparaciones múltiples por el método de Tukey. El programa estadístico utilizado fue Statistic 8.

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7. Resultados. 7.1. Características físicas y microbiológicas del ensilado de calamar fresco. Las características organolépticas encontradas en el ensilado de calamar empleando solo el musculo del manto fueron las típicas proveniente de calamar gigante (Dosidicus gigas); de buena calidad, observándose una coloración crema (tono lechoso), de aroma ácido y consistencia liquido-pastosa, mostrando un pH de 4.1, Tabla 3. En el análisis microbiológico realizado al ensilado de calamar donde se utilizó Agar MRS empleado para el desarrollo de bacterias ácido lácticas se observó un buen el crecimiento encontrando 5.0x108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. realizando un frotis con algunas colonias y se observo al microscopio (NIKON ECLIPSE E600) encontrando bacterias con morfología bacilar, donde ninguna de ellas presentó movilidad, Así mismo se realizó el mismo procedimiento en Agar Rogosa (AR) siendo un medio más selectivo para el crecimiento de Lactobacillus donde se observó un crecimiento de 5.7x107 UFC,lo que confirmo la presencia predominante de Lactobacillus en el ensilado. Tabla 3. Características físicas y microbiológicas del ensilado biológico de calamar fresco

Olor

AcidoDulce

Color

Consistencia

pH

Crema

Liquido-

4.1

Pastosa

Acidez titulable 5.58

UFC/ml 5.0x107(MRS) 5.7x107 (AR)

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Figura 12. Lactobacillus plantarum TD23 utilizada para la elaboración del ensilado

7.2. Análisis bromatológico del ensilado de calamar. Los análisis de humedad, cenizas,

grasa y proteína no tuvieron varianza

significativa (α=0.154) resultando un ensilado rico en proteínas con baja cantidad de lípidos y cenizas (Tabla 4). Tabla 4. Composición química proximal del ensilado biológico de calamar con la bacteria probiótica TD23 en base seca y en base húmeda Ensilado de calamar Base seca

Humedad (%)

Cenizas (%)

Proteína (%)

1.13±0.02

Extracto etéreo (%) 1.04±0.03

76.30±0.12

Base húmeda

23.60±0.12

4.78±0.10

4.41±0.16

65.67±0.48

40

15.56±0.11

7.3. Características microbiológicas del ensilado de calamar liofilizado. Con el fin de deshidratar el ensilado sin que perdiera sus propiedades probioticas, se llevó a cabo la liofilización del mismo en un laboratorio del CIBNOR. Al ensilado liofilizado se le evaluó la calidad microbiológica. Además de cuantificar bacterias acido lácticas en Agar MRS y Rogosa, se sembraron muestras del mismo en Agar para métodos estándar para mesófilos aerobios y en Agar rojo violeta bilis para cuantificar coliformes. Los resultados mostraron una carga microbiana de bacterias ácido lácticas más baja que en el ensilado fresco, reflejada también en el Agar para métodos estándar, así como la nula presencia de organismos coliformes. Tabla 5. UFC/ml de ensilado de calamar liofilizado MEDIO

UFC/ml

Agar MRS

7.5x104

Agar Rogosa

3x102

Agar Métodos Estándar

2.2x105

Agar bilis rojo violeta

0

41

7.4. Análisis bromatológico de los alimentos. Los análisis realizados se muestran en la Tabla 6. Donde se observa una variación entre los 2 alimentos en base seca con un mayor contenido de proteína en el alimento EC (4.15%) con respecto al alimento HP, Cenizas con 2.54%. Tabla 6.Características físicas de alimentos de ensilado biológico de calamar y alimento control a partir de harina de pescado Alimento con ensilado de calamar Base húmeda Base seca Base húmeda Base seca

Cenizas (%) Extracto etéreo (%) Proteína (%) Humedad (%) 5.00±0.10

14.45±0.13

33.00±0.19

5.34±0.113

15.40±0.142

35.16±0.206

Alimento con Harina de pescado 2.67±0.03 15.73±0.34

29.68±0.59

16.44±0.356

31.01±0.619

2.79±0.036

6.14±0.17

4.28±0.12

7.5. Características físicas de los alimentos balanceados EC y HP. Ambos alimentos mantuvieron una consistencia dura mientras que el alimento con EC tuvo un olor ácido y una coloración amarilla así como un pH de 4.8, acido y una pérdida de materia seca (PMS) de 38.31 porciento. Sin embargo el alimento HP mantuvo un pH de 6.3 y una PMS 18.26% con una coloración marrón. Tabla 7. El análisis microbiológico realizado, mostro que no había ni una sola bacteria ácido láctica en el alimento, asumiendo que el tratamiento térmico que se le dio al alimento las destruyó.

42

Tabla 7. Características físicas de los alimentos a partir de ensilado biológico de calamar y alimento control a partir de harina de pescado Olor

Color Consistencia pH PMS (%) RMS (%) Alimento a partir de ensilado de calamar (EC) Acido amarillo Dura 4.8 38.31±0.29 61.60±0.31 Alimento a partir de harina de pescado (HP) Característico marrón Dura 6.28 18.26±0.36 80.11±1.60 del pescado

7.6. Análisis estadísticos del experimento in vivo donde se evaluaron las dietas EC y HP. Los pesos de organismos iníciales no tuvieron varianza significativa entre cada dieta como se muestra en la Figuras 13,14 y la Tabla 8. Así mismo el porcentaje de peso ganado y el factor de conversión alimenticia (FCA) no tubo varianzas significativa en ambas dietas mostrado en la Tabla 8, esto también se refleja en el análisis de varianza de mostrado en la Tabla 9 y reflejado en la Figura 16, en el análisis de homogeneidad de variables se reflejó la homogeneidad entre estas empleando 3 análisis estadísticos para obtener un resultado de mayor grado de confianza lo cuales se muestran en la Tabla 10, y la Figura 17. Tabla 8. Resultados estadísticos de la evaluación de las dietas con ensilado de calamar y el control en camarón blanco Litopenaeus vannamei Dieta

Peso inicial

Peso final

Ganancia en peso

promedio (g)

promedio (g)

(g)

EC

0.250±0.025

2.681±1.32

HP

0.249±0.025

2.643±1.38

FCA=Factor de conversión alimenticia.

43

% Peso ganado

FCA

2.43±1.32

974.70±272.08

1.86±0.20

2.39±1.38

959.69±268.43

1.85±0.25

Figura 13. Distribución normal de pesos iníciales del alimento control HP

Figura 14. Distribución normal de pesos iníciales del alimento EC

44

Figura 15. Distribución normal de pesos iníciales de los alimentos HP Y EC

Tabla 9. Análisis de varianza de alimentos EC y HP SS

MS

F

P

Dieta

O.111

0.111

0.52

0.471

Erro

71.949

.214

45

Figura 16. Análisis de varianza de alimento EC y HP

Tabla 10. Análisis de homogeneidad de varianzas de alimento EC y HP

Peso final

Hartley F-Max

Cochran C

Bartlett chi-sqr

df

P

1.353380

0.575079

3.805217

1

0.051093

46

Figura 17. Probabilidad normal de pesos finales de alimentos EC y HP 7.7. Análisis de varianza de parámetros ambientales. Los análisis de varianza de temperatura entre los estanques de ambas dietas no dio varianza estadísticamente la cual se muestra en la Tabla 11 y se refleja en la Figura 18, mientras que en los estadísticos realizados al oxigeno mostro una varianza significativa la cual se muestra en la Tabla 12 con una menor cantidad de oxígeno en los estanques que se les suministro EC con un intervalo de 5.41 a 5.59 mientras que en HP tiene un intervalo de 5.6 a 5.78 la cual se muestra en la Figura 19, en cuanto a la salinidad no hubo una varianza significativa la cual se muestra en la Tabla 13 y se refleja en la Figura 20.

47

Tabla 11. Análisis de varianza de temperaturas de alimento EC y HP SS

MS

F

P

Dieta

0.1

0.1

0.3

0.594982

Error

130.4

0.4

Figura 18. Análisis de varianza de temperaturas de alimentos EC y HP

Tabla 12. Análisis de varianza de oxigeno de alimento EC y HP SS

MS

F

P

Dieta

2.84

2.84

8.94

0.002994

Error

108.92

0.32

48

Figura 19. Grafica de análisis de varianza de oxigeno de los alimentos EC y HP

Tabla 13. Análisis de varianza de salinidad de alimento EC y HP SS

MS

F

P

Dieta

0.0

0.0

1

0.354223

Erro

17.4

0.1

49

Figura 20. Grafica de análisis de varianza de salinidad de alimento EC y HP

50

8. Discusión. Las BAL tienen una gran importancia debido a las actividades metabólicas que desarrollan en los alimentos, fundamentalmente en la producción de ácido láctico con el consiguiente descenso de pH Inducen cambios en el aroma, textura, sabor, color, digestibilidad y palatabilidad de las materias primas, originando productos finales con características organolépticas diferentes y deseables (Casaus, L., 2005). Lo anterior justifica las características presentes en el ensilado de calamar manteniendo un olor acido-dulce con un pH de 4.1 y una acidez de 5.58% las cuales se muestran en la Tabla 3. Dichas características son el resultado de la adición de azúcar y de la formación de ácido láctico por las bacterias, lo cual sugiere una buena calidad (Borghesi, R., 2004). Una consistencia pastosa es causada por la hidrólisis de las proteínas. Estos resultados coinciden con los reportados por Torres, R., 2007 en la elaboración de un ensilado de pescado con BAL. Es recomendable que el ensilado alcance y mantenga un pH de 4, ya que bajo estas condiciones se detiene el crecimiento y la actividad de algunos microorganismos contaminantes que descomponen el producto (González, D., 2005). Así mismo se realizó un análisis microbiológico del ensilado utilizando dos medios selectivos para BAL Agar MRS y Agar Rogosa, este último por sus características se considera un medio más selectivo para el género Lactobacillus; en este medio se observó un crecimiento de 5.7x107 UFC/ml mientras que en el medio MRS se observaron 5.0x107UFC/ml confirmando así la presencia de la BAL adicionada y las características deseadas para la formulación del alimento balanceado. La carga bacteriológica fue similar que la obtenida por Macías, A., 2009 quien obtuvo en Agar Rogosa 7.7x106UFC/ml en un ensilado de calamar con BAL. El crecimiento de las BAL en Agar Rogosa selectivo para Lactobacillus, constituyó un importante elemento de valoración microbiológica ya que demostró una buena carga microbiológica de bacterias de este género. El mismo análisis se llevó a cabo en el ensilado de calamar liofilizado utilizando Agar MRS, Rogosa, cuenta estándar y Bilis Rojo Violeta (Tabla 5), donde se contaron 3x105 UFC/ml en Agar Rogosa. Así mismo la cuenta viable en Agar para métodos estándar mostró una carga microbiológica de 2.2x105UFC/ml, sin embargo las BAL también crecen en este medio, por lo que se asume que este crecimiento

51

observado fue también de BAL. De acuerdo a la NOM-031-SSA1-1993 aplicada al consumo humano la carga microbiológica de mesófilos aerobios máxima en moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados es de 5x105 UFC, teniendo en cuenta que los resultados de UFC en el medio Agar Bilis Rojo Violeta fue de 0 UFC y asumiendo que los mesofilos aerobios fueron BAL, se sugiere una buena calidad microbiológica con respecto a bacterias contaminantes. Así mismo Torres, R., 2007, al comparar diferentes métodos de conservación, los cuales conservan la carga bacteriana en el ensilado de pescado recomienda el método de liofilización con el fin de conservar el valor nutricional así como el potencial probiótico de los ensilados. Fagberno, O., 1993, evaluaron el efecto de la temperatura sobre las características de un ensilado de tilapia y barbudo inoculada con bacterias productoras de ácido láctico y reportaron que temperaturas inferiores a 10°C pueden tener causas adversas sobre la actividad microbiana lo cual indica que el decremento de bacterias ácido lácticas en el ensilado de calamar liofilizado se puede deber a la exposición del ensilado a temperaturas fuera del rango de tolerancia de las BAL -40°C en el proceso de liofilización. En cuanto a la composición químico proximal del ensilado de calamar los valores que se obtuvieron fueron humedad 76.30±0.12%, cenizas

1.13±0.02%, extracto etéreo

1.04±0.03% y proteína 15.56±0.11%, Tabla 4. Estos resultados difieren de los obtenidos por Macías, A., 2009 quien obtuvo en sus análisis químico proximales de un ensilado en musculo de calamar una humedad de 66.56%, cenizas 1.27%, extracto etéreo 2.13%, proteína 17.11%. Esta diferencia pudo deberse al proceso de elaboración, ya que el manto de calamar se lava y se congela y es difícil quitar toda la humedad antes de congelarlo y molerlo y es lógico que al cambiar la humedad, cambien los demás valores, también pudo deberse a diferencias en la calidad del manto de calamar utilizado. Sin embargo, Bello et al. 1993 en un ensilado biológico de pescado adicionando con fruta y melaza como fuente de carbohidratos, no encontró diferencias entre los valores de análisis proximal durante el proceso y en periodos de almacenamiento, así mismo Torres, R., 2007, utilizando musculo de pescado no encontró diferencias en la composición químico proximal antes y después de la fermentación.

52

La formulación de los alimentos balanceados para camarón blanco fue realizada con el Software MIXIWIN 2005 en el CIBNOR de acuerdo a la composición de los macro nutrientes. Adicionalmente se llevó a cabo el análisis bromatológico donde se observó que proteína y cenizas en el alimento EC presentó una mayor cantidad que el alimento HP mientras que este presentó mayor contenido de grasas. Dichos resultados se pueden observar en la Tabla 6. La variación en grasa pudo deberse a que en el alimento HP se utilizaron desperdicios de atún además de la adición de aceite para su formulación siendo el atún un pez de tipo graso. También se observó que los análisis proximales del ensilado de calamar que utilizaron para hacer la formulación no fueron los reales. Por lo anterior se asume que estas variaciones fueron el resultado de un error durante el balance de los ingredientes para la formulación de los alimentos. Los alimentos balanceados resultantes tuvieron las características descritas en la Tabla 7. En el alimento EC la coloración amarillenta proveniente del manto de calamar mezclado con la harina de trigo, el aroma acido dulce procede de la actividad metabólica de las BAL que fermentaron el calamar. El pH de 4.8 significa un producto muy acido considerando que el camarón no tiene enzimas que digieran el alimento a esos valores de pH. El alimento EC presentó además una consistencia dura debida a la compactación de los pellets, sin embargo se lixivió rápidamente, ya que en pocos minutos el agua de los tanques se ponía blanca. El alimento HP tuvo una coloración marrón procedente de los desperdicios de atún así como un aroma característico a pescado proveniente del atún. El pH de este alimento fue de 6.28, lo cual muestra una diferencia significativa con respecto al pH del alimento EC. El pH es un valor de importancia en la biología de la especie, ya que las enzimas de los organismos funcionan adecuadamente dentro un rango determinado de pH (Martínez. L., 1999), así mismo este alimento presentó una consistencia dura por la compactación de los pellets y poca lixiviación aparente. La consistencia del alimento es de importancia ya que esta determina su estabilidad en el agua. Un alimento estable en el agua, produce mayor crecimiento y conversión alimenticia, comparado con uno menos estable debido a que este se desintegra antes de ser consumido. Esta estabilidad se refleja en la PMS y RMS calculadas, en donde el alimento EC presentó una PMS de 38.31±0.29% mientras que en el

53

alimento HP fue de 18.26±0.36%, siendo más del doble la pérdida de materia seca que en el alimento EC. La RMS en el alimento EC fue de 61.60±0.31% siendo una cantidad muy pobre, perdiéndose la mayor cantidad del alimento en el agua por lixiviación, mientras que el alimento HP presentó una RMS de 80.11±1.60%, siendo un alimento con poca perdida de materia en el agua. Esta inestabilidad del alimento EC en el agua pudo deberse a una mala optimización de gelatinizantes los cuales tienen un efecto aglutinante en el alimento permitiendo mantener el alimento en el agua por mayor tiempo con un mínimo de pérdida de este, (Martínez, L., 1999). De acuerdo a los hábitos del camarón, la estabilidad del alimento en el agua es de suma importancia. En cuanto a los análisis estadísticos Tabla 8 se muestra que el valor de los pesos iníciales promedio para ambas dietas estuvo entre 0.250±0.025 y 0.249±0.025 g y que tuvieron una distribución normal homogénea, lo cual se muestra las Figuras 13 y 14. También en la Figura 15 se observa una gráfica de distribución normal para ambos tratamientos. Con respecto a la ganancia en peso fue ligeramente mayor en EC con 2.43±1.32 g mientras que en tratamiento HP fue de 2.39±1.38 g y un % de peso ganado en un lapso de 8 semanas para EC con 974.70±272.08 % a diferencia del tratamiento HP con 959.69±268.43 %. Para corroborar estos datos se hizo un análisis de homogeneidad de varianzas de los alimentos EC y HP el cual se muestra en la Tabla 10 en el que se aplican 3 métodos estadísticos a los pesos finales dando un resultado P=0.471 lo cual demuestra que no hay varianzas en los pesos finales esto se corroboro al crear una gráfica de probabilidad normal de pesos finales de alimentos EC y HP Figura 17, la cual muestra una homogeneidad en los pesos finales. Así mismo la Tabla 9 muestra que existen varianzas ajenas a los alimentos, que pudieron haber tenido repercusiones en los valores finales por lo que se realizaron análisis estadísticos a parámetros ambientales como temperatura, salinidad y oxígeno. Se aplicó el método Anova tomando en cuenta que los cambios de temperatura pueden ser reflejados en un análisis de varianza (Tabla 11) y se observó una P=0.594, lo cual muestra que no hay varianza estadísticamente en cuanto a temperatura en ambos tratamientos. Esto se demuestra en la Figura 18, sin embargo en los días 22 y 23 del experimento se originó un incremento en la temperatura en 2 de los tanques con el alimento EC. Esto fué debido a un

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desperfecto en los calentadores, mostrando una temperatura arriba de 36°C, mientras que los demás tanques estuvieron a una temperatura promedio de 27°C. Esto dió como resultado la muerte de 4 camarones. De acuerdo a Martínez, L., 1999 hay especies de camarón que son muy tropicales y su rango óptimo de temperatura está entre 28 y 30°C, tal como el camarón tigre Penaeus monodon, mientras que los camarones americanos como el Litopenaeus vannamei y el camarón azul L. stylirostris pueden considerarse como tropicales o subtropicales, los cuales se desarrollan satisfactoriamente entre 25 y 28°C, aunque también crecen de manera aceptable a temperaturas entre 20 y 30°C. Los cambios bruscos de temperatura propician el estrés de los camarones, lo cual afecta su desarrollo, teniendo repercusiones negativas en la homogeneidad de las condiciones a las que fueron sometidos los tanques. En cuando a salinidad el análisis de varianza (Tabla 13) dio como resultado que P=0.3542 lo cual indica que no existen diferencias significativas entre ambos tratamientos. Esto se constató en la Figura 20. En cuanto al oxígeno disuelto el análisis de varianza dio un valor P=0.002994 el cual se muestra en la Tabla 12. Este valor menor de 0.05 indica una varianza significativa en el oxígeno disuelto entre ambos tratamientos, por lo que se realizó una gráfica de análisis de varianza de oxigeno la cual se muestra en la Figura 19. En esta figura se observa que el tratamiento EC tuvo menor cantidad de oxigeno con un rango de 5.41 a 5.58 mg/L mientras que el tratamiento HP tuvo un rango de 5.6 a 5.78 mg/L. Se ha reportado que los niveles mínimos de oxígeno para camarón blanco oscila entre 4 y 5mg/L lo cual es de gran importancia ya que con excepción de los microorganismos anaeróbicos, todos los seres vivos requieren de una fuente de oxígeno para realizar sus funciones metabólicas, siendo este parámetro muy importante para el desarrollo de organismos acuáticos como el camarón. La concentración de oxígeno disuelto puede bajar tanto hasta matarlos siendo estos organismos muy susceptibles al estrés, sin embargo efectos usuales en un oxígeno disuelto bajo, se manifiestan en crecimientos lentos o con mayor susceptibilidad frente a enfermedades, así mismo los camarones tienden a comer menos por lo que no habrá una

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conversión alimenticia comparable con la de un estanque con niveles de oxígeno normal. Así mismo el aumento de la biomasa implica una mayor demanda de oxígeno para su respiración. Es importante saber que el oxígeno es menos soluble en el agua a temperaturas y salinidades mayores, de tal manera que cuando estos dos parámetros están altos, se pueden esperar mayores problemas en cuanto a las bajas concentraciones de oxígeno (Martínez, L., 1999). Los resultados en los FCA mostrados en la Tabla 8, indican el comparativo de la cantidad de alimento consumido y el crecimiento del camarón, siendo ligeramente mayores los obtenidos por el alimento EC con 1.86±0.20, mientras que el tratamiento HP tuvo 1.85±0.25. Estos resultados nos indican que de haberse sometido ambos tratamientos a condiciones iguales de oxígeno los valores estadísticos en cuanto a FCA así como % de ganancia en peso y % de peso ganado hubiesen sido estadísticamente mejores para el alimento EC que para el HP.

56

9. Conclusiones. A) Los pesos iníciales de los organismos evaluados con los dos tratamientos EC y HP, fueron estadísticamente homogéneos, sin embargo, los parámetros ambientales, en particular la concentración de oxígeno disuelto y la temperatura no se mantuvieron iguales en los dos tratamientos durante el experimento. Adicionalmente las características físicas de los alimentos tampoco fueron similares, por lo que no se pudo hacer una comparación real entre los tratamientos. Sin embargo se muestra el análisis estadístico que avala estas conclusiones. B) El alimento EC presentó una PMS de 38.31% mientras que el alimento HP presentó una PMS de 18.26% por lo que no se obtuvieron datos estadísticos finales para la comparación de ambos tratamientos colocando en gran desventaja el tratamiento EC. C) No hay diferencias significativas entre los pesos finales de los 2 tratamientos a un nivel de α=0.95, al igual que los valores finales del % de ganancia en peso, % de peso ganado y FCA; sin embargo el FCA se pudo ver afectado debido a los diferentes niveles de oxigeno suministrado a estos, el cambio de temperatura y la lixiviación exagerada, poniendo en desventaja el alimento EC. D) Para evaluar proteínas provenientes de diferentes fuentes, en dietas isoprotéicas es importante mantener constantes durante el experimento los parámetros ambientales e igualar las características físicas del alimento para evitar que estos factores influyan en los resultados.

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10. Recomendaciones. A) Aplicar un control adecuado para evitar que las BAL probióticas se mueran en el proceso de liofilización del ensilado de calamar y en el secado del alimento.

B) Formular el alimento con la composición proximal actualizada para tener dietas equivalentes en composición nutrimental y evitar variaciones en las concentraciones de proteínas, extracto etéreo y cenizas.

C) Usar las cantidades adecuadas de gelificantes y emulsificantes en el EC para evitar la lixiviación en el agua de mar.

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tomada

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