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UNIVERSIDAD DE CASTILLA - LA MANCHA Facultad de Ciencias Químicas Departamento de Química Analítica y Tecnología de los Alimentos
INFLUENCIA DE FACTORES AGRONÓMICOS Y TECNOLÓGICOS EN EL PERFIL DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Y VOLÁTILES DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN DE CALIDAD
Aurora Gómez-Rico Rodríguez-Barbero
TESIS DOCTORAL Ciudad Real, 2008
UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA Facultad de Ciencias Químicas Departamento de Química Analítica y Tecnología de los Alimentos
Influencia de factores agronómicos y tecnológicos en el perfil de los compuestos fenólicos y volátiles del aceite de oliva virgen de calidad Memoria de investigación presentada por Aurora Gómez-Rico RodríguezBarbero para aspirar al Grado de Doctor en Ciencia y Tecnología de Alimentos. Visado en Ciudad Real, 1 de Octubre de 2008
VºB
Fdo. María Desamparados Salvador Moya Profesora Titular de Universidad del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha
VºB
Fdo. Giuseppe Fregapane Quadri Profesor Titular de Universidad del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha
El Doctorando
Fdo. Aurora Gómez-Rico Rodríguez-Barbero
Dª. Antonia García Ruiz, Profesora Titular de Universidad y Secretaria del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha.
CERTIFICA:
Que el presente trabajo de investigación titulado Influencia de factores agronómicos y tecnológicos en el perfil de compuestos fenólicos y volátiles del aceite de oliva virgen de calidad, constituye la Memoria que presenta Dª Aurora Gómez-Rico Rodríguez-Barbero para aspirar al Grado de Doctor en Ciencia y Tecnología de Alimentos y ha sido realizado bajo la dirección de los profesores titulares Dr. D. Giuseppe Fregapane Quadri y Dra. Dª M. Desamparados Salvador Moya.
Y para que así conste, expido y firmo el presente certificado en Ciudad Real a uno de octubre de dos mil ocho.
VºBº
Fdo.: José Antonio Murillo Pulgarín
Fdo.: Antonia García Ruiz
Director del Departamento
Secretaria del Departamento
ÍNDICE
Índice
Página CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN GENERAL ............................................................................... 3 1.1. La calidad del aceite de oliva virgen ............................................................................ 6 Evaluación sensorial del aceite de oliva virgen ......................................................... 8 1.2. Compuestos volátiles del aceite de oliva virgen ......................................................... 10 Biosíntesis de los compuestos volátiles .................................................................. 11 Papel de los compuestos volátiles en la calidad del aceite de oliva virgen extra ... 14 1.3. Compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen ....................................................... 18 Contribución de los compuestos fenólicos a la calidad del aceite de oliva virgen ... 23 1.4. Factores que influyen en la composición volátil y fenólica del aceite de oliva virgen de calidad ............................................................................................................................... 26 Influencia de aspectos agronómicos y pedoclimáticas ............................................ 26 Influencia de aspectos tecnológicos durante la extracción del producto ................. 28
CAPÍTULO 2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 33
CAPÍTULO 3. MATERIAL Y MÉTODOS.................................................................................... 37 3.1. Planificación experimental de la aplicación de riego en el olivar de marco tradicional (Olea europaea L. Cornicabra cv.) .................................................................................... 37 Tratamientos de riego y organización de la parcela ................................................. 37 Toma de muestra del fruto ....................................................................................... 39 3.2. Planificación experimental del riego en olivares jóvenes de cubierta incompleta (Olea europaea L. Cornicabra cv. y Morisca cv.) ........................................................................ 40 Estrategias de riego y organización de las parcelas ................................................ 40 Toma de muestra del fruto ....................................................................................... 46 3.3. Planificación experimental del estudio de componentes minoritarios del fruto (Olea europaea L.) y aceite de oliva virgen en diversas variedades españolas ......................... 46 Toma de muestras en el ensayo .............................................................................. 47 3.4. Planificación experimental del estudio de los componentes minoritarios del aceite de oliva virgen (Cornicabra cv.) durante el batido .................................................................. 47 Características técnicas de la almazara experimental ............................................. 47 Obtención de las muestras del ensayo .................................................................... 49 I
Índice
3.5. Elaboración de aceite de oliva virgen con el sistema Abencor ……........................... 50 3.6. Métodos analíticos realizados en el fruto ................................................................... 51 Índice de madurez .................................................................................................... 51 Rendimiento graso obtenido con el equipo Abencor ................................................ 51 Rendimiento graso de la pasta de aceituna ............................................................. 52 Determinación de compuestos fenólicos en fruto ................................................... 52 3.7. Métodos analíticos realizados en el aceite de oliva virgen ....................................... 54 Grado de acidez........................................................................................................ 54 Índice de peróxidos .................................................................................................. 55 Absorción de radiación ultravioleta (K232 y K270) ....................................................... 55 Pigmentos clorofílicos y carotenoides ...................................................................... 56 Composición en ácidos grasos ................................................................................ 56 Determinación de compuestos fenólicos en aceite de oliva virgen .......................... 57 Determinación de oleocantal por HPLC ................................................................... 60 Índice de amargor (K225) ........................................................................................... 61 Determinación de tocoferoles por HPLC .................................................................. 62 Determinación de la estabilidad oxidativa por el método Rancimat ......................... 63 Determinación de compuestos volátiles ................................................................... 64 Valoración organoléptica .......................................................................................... 66 3.8. Métodos estadísticos .................................................................................................. 66
CAPÍTULO 4. RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIÓN ......................................... 71 4.1. Resultados experimentales ……………………………………………………………….. 71 “Effect of cultivar and ripening on minor components in Spanish olive fruits and their corresponding virgin olive oils” ………..…….……………………………………….….. 83 “Influence of different irrigation strategies in a traditional Cornicabra cv. olive orchard on virgin olive oil composition and quality” .……………..…………………………….. 91 “Phenolic and volatile compounds of extra virgin olive oil (Olea europaea L. Cv. Cornicabra) with regard to fruit ripening and irrigation management” ……………. 103
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Índice
“Virgin olive oil and olive fruit minor constituents as affected by irrigation management based on ETc, SWP and TDF in medium-density young olive orchards (Olea europaea L. Cv. Cornicabra and Morisca)” .……..………………………...…. 111 “Effect of malaxation conditions on phenolic and volatile profiles of olive paste and their corresponding virgin olive oils (Olea europaea L. cv. Cornicabra)” …………. 135 4.2. Discusión general ………………………………………………………………………… 155
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES ............................................................................................. 175
CAPÍTULO 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 181
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Abreviaturas
ABREVIATURAS UTILIZADAS 3,4-DHPEA
hidroxitirosol
3,4-DHPEA-AC
acetato de hidroxitirosol
3,4-DHPEA-EA
forma aldehídica del ácido elenólico unida a hidroxitirosol
3,4-DHPEA-EDA
forma dialdehídica del ácido elenólico unida a hidroxitirosol
AAT
alcohol acil transferasa
ADH
alcohol deshidrogenasa
AOV
aceite de oliva virgen
C16:0
ácido palmítico
C18:0
ácido esteárico
C18:1
ácido oléico
C18:2
ácido linoléico
C18:3
ácido linolénico
DAD
detector de diodos en línea
DO
Denominación de Origen
DOC
Denominación de Origen Controlada
DOP
Denominación de Origen Protegida
ETc
evapotranspiración del cultivo
FAO
Food and Agriculture Organization
FCP
perfil de libre elección
FID
detector de ionización en llama
GC
cromatografía de gases
GC-MS
cromatografía de gases-espectrometría de masas
GC-O
cromatografía de gases-olfatometría
HPL
hidroperóxido liasa
HPLC
cromatografía líquida de alta eficacia
IM
índice de madurez
IP
índice de peróxidos
LC-MS
cromatografía líquida-espectrometría de masas
LOX
lipoxigenasa
MDS
escalado multidimensional
MOD
máxima oscilación del diámetro de tronco
MS
espectrometría de masas
MUFA
ácidos grasos monoinsaturados
p-HPEA
tirosol
p-HPEA-AC
acetato de tirosol
p-HPEA-EA
forma aldehídica del ácido elenólico unida a tirosol
p-HPEA-EDA
forma dialdehídica del ácido elenólico unida a tirosol
PAL
L-fenilalanina amonio liasa
PCA
análisis de componentes principales V
Abreviaturas
PLS
mínimos cuadrados parciales
POD
peroxidasa
PPO
polifenoloxidasa
PUFA
ácidos grasos poliinsaturados
QDA
análisis descriptivo cuantitativo
RDI
riego deficitario regulado (regulated deficit irrigation)
RMN
resonancia magnética nuclear
ROS
especie reactiva de oxígeno
SΨ
integral de estrés hídrico estacional
SΨ229-277
integral de estrés hídrico durante el periodo DOY 229-277
SFA
ácidos grasos saturados
SPE
extracción en fase sólida
SPME
microextracción en fase sólida
SWP
potencial hídrico del tronco (stem water potential)
TCT
tasa de crecimiento de tronco
TDF
fluctuaciones del diámetro del tronco (trunk diameter fluctuations)
UFA
ácidos grasos insaturados
UV-Vis
ultravioleta-visible
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Publicaciones Científicas
PUBLICACIONES CIENTÍFICAS EN REVISTAS INTERNACIONALES • Fregapane, G, Mancebo-Campos, V., Gomez-Rico, A., Salvador, M.D. “Natural antioxidants content in virgin olive oil – Influence of agronomical and technological factors, and nutritional importance”, in Innovations in traditional foods. Vol. II. Ed. Elsevier/UPV. Pág. 963-966 (2005) ISBN 84-9705-881-X • Salvador, M.D., Gomez-Rico, A., Inarejos A.M., Fregapane, G. “Minor components with nutritional value, antioxidant activity and organoleptic properties status through the market period of commercial olive oil types”, in Special Issue of Italian Journal of Food Science- Shelflife International Meeting. Ed. Chiriotti/GSICA/DOFATA. Pág. 337-342 (2006) ISSN 1120-1770 • Aurora Gómez-Rico, M. Desamparados Salvador, Marta La Greca, Giuseppe Fregapane. “Phenolic and Volatile Compounds of Extra Virgin Olive Oil (Olea europaea L. Cv. Cornicabra) with Regard to Fruit Ripening and Irrigation Management”. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 7130-7136 (2006). • Alfonso Moriana, David Pérez, Aurora Gómez-Rico, M. Desamparados Salvador, Nicolás Olmedilla, Francisco Ribas, Giuseppe Fregapane. “Irrigation scheduling for traditional, lowdensity olive orchards: Water relations and influence on oil characteristics”. Agricultural Water Management, 87, 171-179 (2007). • Aurora Gómez-Rico, M. Desamparados Salvador, Alfonso Moriana, David Pérez, Nicolás Olmedilla, Francisco Ribas, Giuseppe Fregapane. “Influence of different irrigation strategies in a traditional Cornicabra cv. olive orchard on virgin olive oil composition and quality”. Food Chemistry, 100, 568-578 (2007). • Aurora Gómez-Rico, Giuseppe Fregapane, M. Desamparados Salvador. “Effect of cultivar and ripening on minor components in Spanish olive fruits and their corresponding virgin olive oils”. Food Research International, 41, 433-440 (2008). • Antonio M. Inarejos-García, Aurora Gómez-Rico, M. Desamparados Salvador, Giuseppe Fregapane. “Virgin olive oil processing technology: Influence of malaxation temperature and time and overall oil quality”. Food Research International, (aceptado). • Aurora Gómez-Rico, Antonio M. Inarejos-García, M. Desamparados Salvador, Giuseppe Fregapane. “Effect of malaxation conditions on phenolic and volatile profiles of olive paste and their corresponding virgin olive oils (Olea europaea L. cv. Cornicabra)”. Journal of Agricultural and Food Chemistry, (enviado). • Aurora Gómez-Rico, M. Desamparados Salvador, Giuseppe Fregapane. “Virgin olive oil and olive fruit minor constituents as affected by irrigation management based on ETc, SWP and TDF
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Publicaciones Científicas
in medium-density young olive orchards (Olea europaea L. cv. Cornicabra and Morisca)”. Food Research International, (enviado). • Antonio M. Inarejos-García, Aurora Gómez-Rico, M. Desamparados Salvador, Giuseppe Fregapane. “Effect of pre-processing storage conditions on olive oil quality and composition”. Journal of Agricultural and Food Chemistry, (enviado).
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1. INTRODUCCIÓN GENERAL
1. Introducción General
Según el Consejo Oleícola Internacional, “el aceite de oliva es el producto procedente únicamente del fruto del olivo (Olea europaea L.), con exclusión de los aceites obtenidos por disolventes o por procedimientos de reesterificación y de toda mezcla con aceites de otra naturaleza” (C.O.I., 2003). Además, dentro de los aceites de oliva que se pueden comercializar se considera que “el aceite de oliva virgen es el obtenido del fruto del olivo únicamente por procedimientos mecánicos o por otros medios físicos en condiciones especialmente térmicas, que no produzcan la alteración del aceite, que no haya tenido más tratamiento que el lavado, la decantación, la centrifugación y el filtrado” (C.O.I., 2003). El aceite de oliva virgen que se obtiene de esta forma se convierte, por tanto, en un producto único que es directamente apto para el consumo humano, lo que lo diferencia de los aceites vegetales comestibles, que en su gran mayoría, se deben someter obligatoriamente a procesos de refinado previamente a su consumo, lo cual provoca la desaparición de compuestos de gran interés estrechamente relacionados con las características sensoriales, la estabilidad oxidativa del producto y sus propiedades biológicas. El cultivo del olivo se encuentra localizado en los países de la cuenca mediterránea, que cuenta con el 98% del total de la superficie olivarera mundial, aunque durante los últimos años se ha extendido más allá de las zonas tradicionales de cultivo, como son los Estados Unidos, Sudáfrica, Sudamérica y Australia. De la misma forma, la mayor parte de la producción mundial de aceite de oliva se localiza en los países mediterráneos, siendo España, Italia, Grecia y los países del Magreb los principales productores, con un aporte medio de aproximadamente 2,5 toneladas anuales (C.O.I, 2005). En España se localiza alrededor del 39% de la producción mundial de aceite de oliva y una cuarta parte de la superficie olivarera (C.O.I, 2005), lo que nos da una clara idea de la gran relevancia social y económica de este producto en nuestro país. De hecho, el consumo de este aceite vegetal constituye la principal fuente de lípidos utilizada en la dieta mediterránea, aunque éste se ha visto incrementado durante los últimos años en países fuera de este área, debido por una parte a sus características sensoriales únicas y por otro lado, a que recientes investigaciones han demostrado que el consumo habitual de aceite de oliva virgen supone un aporte continuo de compuestos antioxidantes, descritos como sustancias protectoras contra enfermedades neuro-degenerativas, problemas cardiovasculares y algunos tipos de tumores (Visioli et al., 1995; Owen et al., 2000b; Rocca et al., 2002, etc.). Para mantener o incluso incrementar el consumo de este producto a nivel mundial es necesario ampliar los mercados, para lo cual se hace necesario proporcionar a los consumidores, no sólo aceites de oliva virgen de alta calidad, sino también información nutricional relevante sobre los beneficios del consumo de este aceite respecto del resto de aceites vegetales. Para ello, el énfasis ya realizado sobre los beneficios proporcionados por el aceite de oliva virgen debido a su alta composición en ácidos grasos monoinsaturados, necesita ser reforzado con información
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1. Introducción General
sobre la presencia de compuestos minoritarios en su composición responsables de su aroma y sabor únicos y sus propiedades antioxidantes (García-González et al., 2007). Actualmente, la reglamentación comunitaria vigente permite la clasificación del aceite de oliva en tres categorías comerciales en base a una serie de parámetros químico y sensoriales, “virgen extra”, “virgen” y “lampante”, esta última no apta para el consumo humano directo y destinada principalmente a procesos de refinado. Podría decirse que la reglamentación CEE 2568/91 y sus posteriores modificaciones (CE 796/2002, CE 1989/2003 y CE 640/2008) regulan un conjunto de parámetros analíticos y atributos sensoriales, así como sus valores límite. El objetivo que persigue esta reglamentación es obtener un producto alimenticio que presente unas características físico-químicas adecuadas para el consumo humano, además de evitar posibles fraudes, pero sin atender de forma explícita al grado de aceptación de este producto por parte de los consumidores, siendo esto último, el principal factor de interés para los productores de aceite de oliva virgen, que tienen ante sí un mercado cada vez más exigente y una mayor competencia, lo que les obliga a la elaboración de productos de mayor calidad. El principal factor que determina el grado de preferencia del aceite de oliva virgen por parte de los consumidores es la calidad sensorial del mismo, y que en este producto depende básicamente de las características organolépticas que son percibidas por el consumidor como un conjunto de sensaciones valoradas a través del olfato y el gusto (Morales et al., 2000). Existen multitud de compuestos orgánicos que determinan las características organolépticas del aceite de oliva virgen, siendo los compuestos fenólicos y volátiles los principales responsables de las mismas, y que son retenidos en él debido a que durante su proceso de elaboración solamente se utilizan procedimientos mecánicos, sin posteriores operaciones de refinado. Los compuestos volátiles son los principales responsables del aroma del aceite de oliva virgen y están relacionados con las notas aromáticas frescas y verdes propias de la materia prima de la que procede. Por otro lado, los compuestos fenólicos han sido relacionados con el sabor del aceite, en particular con los atributos sensoriales positivos de “amargo” y “picante” (Morales et al., 2000; Angerosa et al., 2000c), además de presentar un importante carácter antioxidante y ser considerados compuestos bio-activos, lo que los hace también responsables, entre otros, de la estabilidad oxidativa y del valor nutricional del producto (Shahidi et al., 1992; Servili et al., 1996). Por lo tanto, la presencia final de estos compuestos minoritarios en el aceite de oliva virgen representan en gran medida su aceptación sobre otras grasas vegetales comestibles presentes en el mercado. El contenido y el perfil de compuestos fenólicos y volátiles presentes en un aceite de oliva virgen depende de varios factores, principalmente agronómicos, como son el cultivar de procedencia, la madurez del fruto en el momento de la recolección, las condiciones pedo4
1. Introducción General
climáticas y la disponibilidad de agua durante el desarrollo del fruto, así como de factores tecnológicos, como la metodología de extracción utilizada y las condiciones de almacenamiento del producto una vez elaborado (Angerosa et al., 2004; Servili et al., 2004). Por todo ello, en el presente trabajo de investigación se plantea el estudio de distintos factores agronómicos y tecnológicos que afectan al contenido y composición de estos componentes minoritarios del aceite de oliva virgen, como son el cultivar de origen, el grado de maduración del fruto, las técnicas de riego aplicadas en el olivar, así como la influencia de determinadas variables durante el proceso tecnológico de batido de la pasta de aceituna.
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1. Introducción General
1.1. LA CALIDAD DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN. El principal objetivo del control analítico de los aceites vegetales comestibles establecido según la reglamentación internacional del Codex Alimentarius y la Comisión Europea es el de determinar la calidad, la pureza y la posible presencia de contaminantes, y está principalmente orientada hacia la clasificación de los aceites comestibles en diversas categorías comerciales. De esta forma, la evaluación de la calidad y la pureza de los aceites de oliva virgen se lleva a cabo mediante la medida de una serie de parámetros analíticos orientados principalmente hacia la detección de posibles fraudes, adulteraciones o degradación en el producto. Y por tanto, los límites establecidos por la reglamentación vigente están orientados básicamente hacia la clasificación del aceite de oliva dentro de la categoría comercial correspondiente, sin atender explícitamente los atributos de calidad positivos y específicos de este apreciado producto. De hecho, los criterios de calidad y pureza de los distintos tipos de aceite de oliva establecidos por la Reglamentación CEE 2568/91 y sus posteriores modificaciones (“virgen extra”, “virgen”, “lampante”,...) están basados principalmente en parámetros químicos como son el grado de acidez, el índice de peróxidos, las características de absorción en el UV, además de la valoración sensorial, entre otros parámetros de pureza. Aún así, la cuantificación de la mayoría de estos parámetros químicos en muestras de aceite de oliva, que han sido obtenidos a partir de frutos en buen estado y mediante procesos de extracción adecuados, no excede los límites máximos establecidos por la reglamentación vigente, siendo la evaluación sensorial del producto la herramienta más importante para determinar la calidad final del producto y que permite en muchos casos establecer el precio del aceite de oliva. Asimismo, se debe destacar que son las características organolépticas del producto las que determinan el grado de preferencia de los consumidores, ya que la elección de los alimentos que consumimos se basa primordialmente en los atributos que percibimos a través de nuestros sentidos. Los atributos sensoriales que consideramos principalmente en los alimentos son la apariencia, el color, la textura, la forma y el tamaño, la viscosidad, las sensaciones táctiles y kinestésicas, el olor y el sabor, además de sensaciones quimioestésicas, como una respuesta combinada de la sensación cutánea, térmica y de los estímulos dolorosos producidos por determinadas sustancias químicas irritantes (Angerosa, 2000a). En el caso del aceite de oliva virgen, como alimento líquido que es, el número de atributos que determinan su calidad sensorial y que son valorados por los consumidores quedan básicamente reducidos al color, olor y sabor, además de ciertas sensaciones quimioestésicas, como el picor y la astringencia típicas de este producto (Morales et al., 2000).
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1. Introducción General
El color del aceite de oliva depende de la presencia de determinados pigmentos liposolubles que se encuentran inicialmente en el fruto y que se transfieren al aceite durante el proceso de molienda y batido de la pasta de aceituna. Las distintas tonalidades verde-amarillentoanaranjado que pueden observarse en un aceite de oliva virgen dependen del contenido en clorofilas y carotenos. Los niveles de estos pigmentos se ven afectados principalmente por factores genéticos y por el grado de maduración del fruto, éste último supone un importante descenso en la concentración de los mismos, pudiendo llegar a desaparecer en los aceites de oliva virgen obtenidos a partir de frutos muy maduros (Mínguez-Mosquera et al., 1989; GandulRojas et al., 1996). A pesar de que el color es una de las características sensoriales más importantes y que es valorada en la mayoría de los productos alimentarios, la metodología aplicada por la reglamentación actual para clasificar el aceite de oliva (Reglamento CE nº 640/2008, última modificación del Reglamento CEE 2568/91) no juzga este atributo sensorial. Aún así cabe destacar el hecho de que el consumidor percibe el color del aceite de oliva como un indicador indirecto del olor y sabor del mismo, relacionando los aceites de color verdoso con notas sensoriales más verdes y siendo concebidos como más amargos y picantes, mientras que los aceites amarillentos, obtenidos de frutos maduros, se relacionan con notas sensoriales más frutadas y menos amargas. El conjunto de sensaciones olfativas y gustativas de un alimento, complementadas por las sensaciones táctiles y kinestésicas percibidas por los receptores táctiles y olorosos alojados en la boca, recibe el nombre de “flavor” (Reineccius, 1993). Existen multitud de compuestos orgánicos responsables del flavor del aceite de oliva virgen, los cuales pueden presentar características organolépticas positivas o negativas, de manera que la aceptación del producto por parte de los consumidores dependerá tanto de la presencia o ausencia de determinados compuestos, así como de los umbrales de detección de los mismos y de su concentración en el aceite. A lo largo de las dos últimas décadas, numerosas investigaciones han tratado de identificar cualitativa y cuantitativamente los compuestos orgánicos volátiles y no-volátiles responsables del flavor del aceite de oliva virgen y relacionarlos con los atributos sensoriales que percibe el ser humano, sobre todo aplicando procedimientos estadísticos multivariantes, con lo que se ha conseguido relacionar determinados compuestos con las notas sensoriales que generan (Morales et al., 1993; Morales et al., 1995; Aparicio et al., 1996; Andrewes et al., 2003). Algunos estudios han destacado la estrecha relación existente entre determinados compuestos fenólicos, principalmente los derivados secoiridoideos del hidroxitirosol y tirosol, con la intensidad del atributo amargo del aceite de oliva virgen, el cual se considera la percepción gustativa más importante del producto, además de ser responsables de las sensaciones
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1. Introducción General
quimioestésicas como la astringencia y el picor (García et al., 2001; Gutiérrez-Rosales et al., 2003; Andrewes et al., 2003), por lo que, probablemente, estos compuestos son las únicas sustancias responsables del las percepciones gustativas reales que nos ofrece el aceite de oliva virgen. Por otro lado, los compuestos volátiles se han relacionado principalmente con las notas sensoriales olfativas percibidas tanto por vía nasal directa como por vía retronasal, por lo que son los responsables del aroma global de este apreciado producto. Se han identificado cientos de compuestos volátiles en el aroma del aceite de oliva virgen mediante técnicas de cromatografía de gases y espectrometría de masas (Camera et al., 1990; Morales et al., 1994), siendo los aldehídos, alcoholes y ésteres de seis átomos de carbono los volátiles que se encuentran en mayor concentración y que contribuyen principalmente a su aroma (Morales et al., 1995; Olías et al., 1980). Pero aún en la actualidad, la determinación instrumental de los compuestos fenólicos y volátiles, basados en técnicas de separación, concentración y/o aislamiento desde su matriz oleosa y su posterior relación con las notas sensoriales del aceite de oliva virgen resulta ser un proceso complicado, básicamente porque las sensaciones olfato-gustativas percibidas por el ser humano resultan de la amplia combinación e interacción de un número elevado de sustancias orgánicas entre sí y con los receptores sensoriales localizados en la boca y en la cavidad nasal, lo que hace que el análisis sensorial aún sea la metodología más eficaz para evaluar sus características organolépticas, así como la aceptación final del producto por parte de los consumidores. EVALUACION SENSORIAL DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN. La evaluación sensorial del aceite de oliva virgen está ampliamente descrita en los Reglamentos CEE 2568/91 y CE 640/2008. Para llevar a cabo la valoración de los atributos sensoriales del aceite de oliva virgen se ha generado un vocabulario específico que permite describir el flavor de este producto, basado en la metodología propuesta por el COI en 1987. Por una parte, se distinguen los atributos positivos: “frutado”, “amargo” y “picante”, definidos como: -
Frutado: conjunto de sensaciones olfativas características del aceite, dependientes de la variedad de las aceitunas, procedentes de frutos sanos y frescos, verdes o maduros, y percibidas por vía nasal y/o retronasal. El atributo frutado se considera verde cuando las sensaciones olfativas recuerdan las de los frutos verdes, características del aceite procedente de frutos verdes. El atributo frutado se considera maduro cuando las sensaciones olfativas recuerdan las de los frutos maduros, características del aceite procedente de frutos verdes y maduros.
-
Amargo: sabor elemental característico del aceite obtenido de aceitunas verdes o en envero. Se percibe en las papilas circunvaladas de la uve lingual.
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1. Introducción General
-
Picante: sensación táctil de picor, característica de los aceites obtenidos al comienzo de la campaña, principalmente de aceitunas todavía verdes. Puede ser percibido en toda la cavidad bucal, especialmente en la garganta.
Por otro lado, también se han descrito una serie de atributos negativos, con el fin de describir los posibles defectos que se pueden encontrar en los aceites de oliva de baja calidad, y que se deben a la presencia de ciertos compuestos volátiles indeseables que pueden aparecer si el aceite se ha obtenido a partir de frutos dañados y/o almacenados durante largo tiempo a temperatura ambiente y altas humedades relativas, o bien si se ha producido un procesado deficiente de la materia prima o a un almacenamiento inadecuado del producto final. Estos atributos sensoriales negativos se encuentran ampliamente descritos en el Reglamento CE 640/2008 y se denominan con los siguientes descriptores: atrojado/borras, moho-humedad, avinado-avinagrado/ácido-agrio, metálico, rancio, cocido o quemado, heno-madera, basto, lubricante, alpechín, salmuera, esparto, tierra, gusano, pepino y madera húmeda. La primera aplicación del análisis sensorial a este producto fue introducida por el COI en 1987 y posteriormente se incorporó en el Reglamento de la Comunidad Económica Europea (CEE) 2568/91, con la finalidad de detectar posibles defectos sensoriales y clasificar los aceites de oliva virgen en diversas categorías comerciales (“Virgen extra”, “Virgen”, “Virgen corriente” y “Virgen lampante”), en función de la intensidad de los defectos y atributos sensoriales positivos. El método empleaba una escala estructurada de 0 a 5, en la cual el 0 indicaba “ausencia total” y el punto 5 indicaba “percepción extrema”, además el catador debía proporcionar una puntuación total del aceite en una escala de 9 puntos. En este reglamento se indican, según las directrices establecidas por el COI, las características de la sala de cata y las cabinas que se deben utilizar. También se describe en detalle las pautas a seguir en el proceso de selección y entrenamiento de los catadores, además de las normas y condiciones necesarias para la realización del ensayo sensorial, el empleo de una copa normalizada para la degustación y una descripción detallada de las características generales en las que debe efectuarse la valoración sensorial. La experiencia aportada por esta metodología y los problemas surgidos en su aplicación plantearon que en 1996 el COI adoptara nuevos criterios en la valoración sensorial del aceite, de forma que se diseñó un nuevo formulario que clasificaba los aceites exclusivamente a través de sus perfiles en función de la intensidad de los defectos y considerando únicamente los atributos positivos “frutado”, “amargo” y “picante”, empleando escalas no estructuradas de 10 cm, en la cual el extremo izquierdo de la escala indica “ausencia total” y el extremo derecho indica “percepción extrema”. Esta reforma fue incluida en el Anexo XII de la reglamentación CE 796/2002 y muy recientemente en la reglamentación CE 640/2008, modificando determinados aspectos de la norma CEE 2568/91, de forma que actualmente el aceite de oliva se clasifica en tres categorías “Virgen extra”, “Virgen” y “Lampante” en función de la mediana de los posibles 9
1. Introducción General
defectos que se pueden encontrar en el aceite y del atributo “frutado” obtenidas por el panel de cata integrado como mínimo por ocho catadores expertos. Remarcar que con la nueva norma, el formulario a emplear mantiene la misma estructura, a excepción de la incorporación de una casilla en la que el catador señala si el atributo “frutado” presenta un carácter de verde o maduro y el agrupamiento de los defectos “atrojado” y “borras” dentro de la misma percepción olfativa. En los casos en los que el análisis sensorial del aceite de oliva virgen tiene por finalidad una diferenciación en el producto, como es el caso de aceites acogidos a una Denominación de Origen Protegida (DOP) o Controlada (DOC), cuya clasificación está ligada a factores geográficos y varietales, el uso de la ficha de cata empleada actualmente en la norma CE 640/2008 no ofrece una información completa sobre el perfil que incluya posibles notas que pueden describirlo y caracterizarlo. Para llevar a cabo esta evaluación sensorial el COI ha adoptado en la norma COI/T.20/Doc nº 22 (Noviembre de 2005) un método específico para la valoración organoléptica de un aceite de oliva virgen extra que opta a una denominación de origen (DO). La norma propone, basado en un método de perfil, la selección de descriptores característicos de los productos a partir de una amplia lista en los que se incluyen sensaciones olfativas evaluadas por vía nasal directa o retronasal como almendra, manzana, hierba, tomate, alcachofa, verde, etc., sensaciones gustativas como amargo y “dulce”, la persistencia de la sensación percibida por vía retronasal y sensaciones táctiles como la fluidez y el picante.
1.2. COMPUESTOS VOLÁTILES DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN. La fracción volátil del aceite de oliva virgen está compuesta principalmente por numerosos aldehídos, alcoholes, ésteres, cetonas e hidrocarburos, la mayoría de los cuales han sido identificados mediante técnicas de CG-MS (Angerosa, 2000a). El perfil de compuestos volátiles detectado en un aceite de oliva varía en función de la calidad sensorial del mismo. De tal forma que en la fracción volátil de los aceites obtenidos a partir de frutos sanos y frescos mediante técnicas adecuadas de extracción, predominan principalmente los aldehídos, alcoholes y ésteres de seis átomos de carbono (C6), además de diversos compuestos carbonílicos de cinco átomos de carbono (C5), los cuales proceden de la oxidación enzimática de los ácidos grasos poliinsaturados a través de la denominada “ruta de la lipoxigenasa”, ruta LOX (Sánchez et al., 2000), y que son los principales responsables de las notas sensoriales verdes y frutadas propias del aceite de oliva virgen de alta calidad. Por otro lado, la fracción volátil de los aceites de oliva que presentan defectos sensoriales se caracteriza por la menor concentración o ausencia total de los productos de la ruta LOX, así como por la elevada presencia de aldehídos insaturados de siete a once átomos de carbono 10
1. Introducción General
(C7-C11) (Solinas et al., 1987a y 1988), dienales de seis a diez átomos de carbono (C6-C10) (Aparicio et al., 2000), compuestos carbonílicos de ocho átomos de carbono (C8) (Angerosa et al., 1999b) o aldehídos y alcoholes ramificados de cinco átomos de carbono (Angerosa et al., 1996a), todos ellos caracterizados por poseer umbrales de detección bajos y por ser responsables de los atributos sensoriales negativos. BIOSINTESIS DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES. La presencia de compuestos volátiles es apenas imperceptible durante el crecimiento de la aceituna hasta que se inicia la fase climatérica, en la cual aumenta la producción de etileno, lo que implica numerosos cambios físicos, químicos y bioquímicos en el fruto, además del incremento de la síntesis proteica, acídica y un aumento en la actividad de las enzimas presentes, factores de los que posteriormente dependerá la presencia de compuestos volátiles en el aceite obtenido. Aunque existen una serie de volátiles presentes en el aceite de oliva virgen que se encuentran inicialmente de forma natural en el fruto intacto, los principales compuestos responsables del aroma
de
este
producto
son
metabolitos
secundarios,
cuya
formación
comienza
inmediatamente después de la ruptura del fruto y continúa durante el batido de la pasta de aceituna, debido a la actividad de diversas enzimas que actúan en presencia de oxígeno (Tressl et al., 1973; Olias et al., 1993) y que utilizan como principales sustratos los ácidos grasos y algunos aminoácidos, como la leucina, la isoleucina y la valina. Las principales rutas bioquímicas implicadas en la síntesis de los compuestos volátiles del aceite de oliva virgen de calidad son las que se resumen a continuación: (i) Metabolitos lipídicos: -
Metabolismo de ácidos grasos. Durante la maduración del fruto se ha descrito la conversión de algunos ácidos grasos en cetonas, ésteres y alcoholes (Tressl et al., 1973), que posteriormente forman parte del perfil aromático del aceite de oliva virgen.
-
Ruta de la Lipoxigenasa (LOX). Como se ha comentado previamente, los compuestos volátiles C6, presentes no sólo en el aroma del aceite de oliva virgen sino también en numerosas frutas y vegetales, se generan a través de una serie de reacciones enzimáticas encadenadas que conforman la denominada ruta LOX y que utiliza como sustratos los ácidos grasos linoleico y linolénico (Olías et al., 1993). La Figura 1.1 representa de forma esquemática los principales productos obtenidos mediante esta ruta, así como las enzimas implicadas en la misma. La rotura de los tejidos de la aceituna durante la etapa de molienda permite la liberación de las enzimas implicadas en esta ruta bioquímica, que comienza tal y como puede 11
1. Introducción General
observarse en la Figura 1.1 a través de la enzima lipoxigenasa (LOX), la cual cataliza la dioxigenación de los ácidos grasos poliinsaturados que presentan la estructura (Z-Z)1,4pentadieno en su cadena carbonada originando los correspondientes hidroperóxidos ∆13 y ∆-9. Estudios recientes han puesto en evidencia la regioespecificidad de la enzima LOX, presente en la pulpa de aceituna, por la posición ∆-13 de los ácidos linoleico y linolénico, obteniéndose entre un 75-90% de hidroperóxidos ∆-13, además de una actividad dos veces superior sobre el ácido linolénico respecto del linoleico (Salas et al., 1999c; Sánchez et al., 2000), lo que explica que los volátiles insaturados C6 sean los componentes mayoritarios presentes en el aroma del aceite de oliva virgen de calidad. Posteriormente, la enzima hidroperóxido liasa (HPL) cataliza la ruptura de los hidroperóxidos formados en la etapa anterior a través del enlace situado entre el átomo de carbono que contiene el grupo hidroperóxido y el adyacente que contiene el doble enlace con isomería E. Esta enzima muestra un especificidad estricta, por lo que las HPL específicas de los hidroperóxidos ∆-13 catalizan la formación de aldehídos C6 y oxoácidos C12, mientras que las HPL específicas de los hidroperóxidos ∆-9 generan aldehídos y oxoácidos C9. El aislamiento parcial de esta enzima en la pulpa de aceituna y su posterior estudio ha determinado una especificidad estricta por los hidroperóxidos ∆-13 derivados de los ácidos linoleico y linolénico, generándose hexanal y Z-3-hexenal, respectivamente, además de una actividad 2,5 veces superior sobre el hidroperóxido ∆13 del ácido linolénico que sobre el isómero análogo del ácido linoleico (Salas et al., 1999b), lo cual explica la ausencia de compuestos volátiles C9, además de la presencia mayoritaria de compuestos C6 insaturados en el aroma del aceite de oliva virgen de alta calidad. La alta inestabilidad del aldehído insaturado Z-3-hexenal generado en esta etapa, promueve su transformación casi inmediata en el isómero E-2-hexenal, gracias a la actividad de la enzima Z-3:E-2-enal isomerasa (Williams et al., 2000). La posterior reducción de los aldehídos C6 es llevada a cabo por la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) (Figura 1.4). En la pulpa de aceituna se han aislado e identificado tres isoenzimas distintas en función de su dependencia del nucleótido NADH o NADPH, estableciéndose que según sus características cinéticas, la única isoenzima envuelta en la biogénesis de los alcoholes C6 es la ADH NAPH-dependiente, que presenta una actividad 20 veces superior a la NADH-dependiente (Salas et al., 1998). La última etapa de la ruta LOX implica la formación de los correspondientes ésteres volátiles de los alcoholes saturados e insaturados C6, que se forman mediante la esterificación de los alcoholes con derivados acetil-CoA gracias a la acción de la enzima 12
1. Introducción General
alcohol aciltransferasa (AAT). Esta enzima no actúa sobre alcoholes de cadena corta, como el metanol y el etanol, mostrando una actividad baja sobre el butanol y el 3metilbutanol (Sanchez et al., 2000), por lo que la falta de actividad de esta enzima sobre los alcoholes de cadena corta explica le escasez de los acetatos de hexilo y hexenilo que se observa en el aroma del aceite de oliva virgen (Morales et al., 1995), a pesar de la alta concentración relativa de los correspondientes sustratos (hexan-1-ol, Z-3-hexen1-ol y E-2-hexen-1ol) (Salas, 2004). Aún así los mayores valores de actividad enzimática se han obtenido al utilizar como sustratos el hexan-1-ol y el Z-3-hexen-1-ol (Salas, 2004). -
Existe una rama adicional en la ruta LOX que tiene como sustrato específico el hidroperóxido ∆-13 del ácido linolénico, a través de la cual se generan dímeros de penteno y alcoholes C5, como el 1-penten-3-ol y el 2-penten-1-ol. La posterior actividad de la ADH podría ser la responsable de la formación de los correspondientes aldehídos C5 que también se han encontrado en el aroma del aceite de oliva virgen (Angerosa et al., 1998a).
ADH
LOX
HIDROPERÓXIDO ∆-13
ACETATO DE HEXILO
HEXAN-1-OL
HEXANAL
ÁCIDO LINOLEICO
AAT
HPL Isomerasa E-2-HEXENAL
E-2-HEXEN-1-OL
ADH ÁCIDO LINOLÉNICO RADICAL 13-ALCOXI
Z-3-HEXENAL
Z-3-HEXEN-1-OL RADICAL PENTENO
DÍMERO PENTENO
ADH
AAT
ACETATO DE Z-3-HEXENILO
2-PENTEN-1-OL 1-PENTEN-3-OL
2-PENTENAL 1-PENTEN-3-ONA
Figura 1.1. Ruta de la Lipoxigenasa, responsable de la formación de los compuestos volátiles C6 y C5 presentes en el aroma de los aceites de oliva virgen de calidad. (Fuente utilizada: Angerosa et al., 2004).
13
1. Introducción General
(ii) Metabolitos de aminoácidos: Ciertos volátiles presentes en el perfil aromático del aceite de oliva virgen proceden de la estructura ramificada de aminoácidos, como la valina, leucina e isoleucina, generando respectivamente los aldehídos ramificados, 2-metilpropanal, 3-metilbutanal y 2-metilbutanal, a través de una serie de transformaciones bioquímicas (Wyllie et al., 1995). La posterior actuación de la alcohol deshidrogenasa y la alcohol aciltransferasa supone la formación de los correspondientes alcoholes y ésteres ramificados (Van de Hijden et al., 1996; Wyllie et al., 1996). PAPEL DE LOS COMPUESTOS VOLÁTILES EN LA CALIDAD DEL ACEITE DE OLIVA. Todos los componentes de la fracción volátil del aceite de oliva virgen no presentan la misma influencia en la percepción sensorial del aroma del producto, ya que, aunque todos estos compuestos presentan unas características comunes, como son una masa molecular relativa baja (por debajo de los 300 Da), un carácter polar y ser suficientemente liposoluble, lo cual permite por un lado su difusión en el mucus que recubre las células epiteliales olfativas y su posterior disolución en la membrana lipídica que rodea los receptores proteicos, la capacidad olorosa depende además de otros factores, como son: -
La capacidad de unión a los receptores proteicos presentes en el epitelio olfativo de las fosas nasales, lo cual viene determinado principalmente por su estructura química, como son la estructura conformacional de la molécula, además del tipo y posición de los grupos funcionales (Pelosi, 1994; Rossiter, 1996).
-
La presencia y posición de los dobles enlaces y su isomería cis-trans (Bedoukian, 1971), la cual se ha relacionado con la calidad del olor generado por el volátil.
-
La concentración en la que se encuentren los compuestos volátiles (Morales et al., 1997) y su umbral de detección (Ullrich et al., 1988), el cual se define como la mínima concentración de una sustancia volátil capaz de producir una respuesta olfativa. La relación existente entre la concentración de un compuesto volátil y su umbral de detección determina principalmente la contribución de cada compuesto volátil al aroma global del aceite de oliva virgen, de forma que cuanto más alto sea este valor, mayor será la intervención de dicha sustancia en la percepción aromática del producto (Grosch, 1993).
Se han aplicado diversas técnicas de cromatografía de gases-olfatometría (GC-O) en el estudio de las notas sensoriales generadas individualmente por los compuestos volátiles presentes en el perfil aromático del aceite de oliva virgen (Aparicio et al., 2002; Morales et al., 1997; Morales et al., 2005; Reiners et al., 1998, entre otros). En la Tabla 1.1 se resumen las notas sensoriales características de los principales compuestos volátiles presentes en el aceite de oliva virgen 14
1. Introducción General
extra, así como los umbrales de detección determinados por diversos autores y recogidos en bibliografía. En estos trabajos se puede observar que para un mismo compuesto volátil se han determinado diferentes umbrales de detección, lo cual puede deberse por una parte a que la matriz oleosa empleada en la determinación del mismo ha sido diferente, utilizándose aceite de girasol refinado (Aparicio et al., 1998; Reiners et al., 1998), aceite vegetal refinado (Aparicio et al., 2002), aceite de oliva refinado (Morales et al., 2005) o parafina. También se conoce el hecho de que las sustancias proteicas, carbohidratos u otros componentes minoritarios pueden alterar la intensidad aromática de las sustancias volátiles debido a la formación de complejos intramoleculares o a procesos de adsorción (Jung et al., 2000). Y por último, se debe tener también en cuenta que la determinación de este valor umbral depende en gran parte de la sensibilidad y entrenamiento de los catadores y que puede ser variable entre distintos sujetos. Otro hecho que destaca es que en ocasiones las notas aromáticas descritas por los catadores para un determinado compuesto volátil puedan ser ligera o bastante diferentes, como ocurre en el caso del hexan-1-ol (ver Tabla 1.1). Angerosa et al. (2002) argumenta que puede deberse a la dificultad de conciliar las sensaciones percibidas por los distintos paneles sensoriales, a pesar de utilizar un mismo vocabulario consensuado. No obstante, queda suficientemente aceptado que los aldehídos y alcoholes C6 son los principales responsables de las notas sensoriales verdes y herbáceas perceptibles en los aceites de oliva virgen obtenidos a partir de frutos verdes o en envero, mientras que los ésteres C6 están ligados a las sensaciones frutadas y florales del producto. Por otro lado, los compuestos C5 también contribuyen de forma positiva al flavor del aceite de oliva virgen, al estar relacionados con las notas sensoriales verdes, además de estar involucrados en la percepción del atributo “picante”, como es el caso del pentan-1-ol y 1-penten-3-ona, sustancias volátiles capaces de generar sensaciones punzantes, ásperas y astringentes. Como se ha dicho previamente (apartado 1.1), han sido numerosos los estudios que han tratado de relacionar los compuestos volátiles presentes en el aroma del aceite de oliva virgen con los atributos sensoriales que percibe el ser humano. A pesar del importante desarrollo de la instrumentación de hoy día, las técnicas analíticas todavía no son capaces de evaluar las interacciones y los sinergismos que derivan de la combinación e interacción de las diferentes sustancias volátiles entre sí y con los receptores sensoriales localizados en orificios nasales y boca. No obstante es posible relacionar determinados compuestos volátiles con las distintas notas sensoriales evaluadas por grupos de catadores entrenados, gracias al empleo de diferentes procedimientos estadísticos aplicados a los valores proporcionados por los equipos instrumentales y los paneles de cata.
15
1. Introducción General
Tabla 1.1. Notas sensoriales de los principales compuestos volátiles C6 y C5 presentes en el aroma del aceite de oliva virgen extra determinados mediante técnicas de GC-O por diversos autores. Umbral detección
Compuesto
Nota aromática
Hexanal
Verde-dulce
75
Aparicio & Luna, 2002
Manzana verde, herbáceo
80
Morales et al., 2005
Hexan-1-ol
Acetato hexilo
(µg/Kg de aceite)
Referencias
400 Fruta, banana, césped recién cortado
Aparicio & Morales,1998
Indeseable
400
Aparicio & Luna, 2002
Verde, frutado, dulce
1040
Aparicio & Luna, 2002 Morales et al., 1997
E-2-hexenal
Verde, manzana
424
Reiners & Grosch, 1998
Verde, almendra amarga
420
Morales et al., 2005
Verde astringente
1125
Aparicio & Luna, 2002
Z-3-hexenal
Verde
3
Aparicio & Luna, 2002
E-2-hexen-1-ol
Hoja Césped, hojas
1,7 5000
Reiners & Grosch, 1998 Morales et al., 2005
Verde, herbáceo, dulce
8000
Aparicio & Morales, 1998
Z-2-hexen-1-ol
Fruta verde
------
Aparicio & Morales, 1998
Z-3-hexen-1-ol
Verde
6000
Aparicio & Luna, 2002
Hoja
1100
Reiners & Grosch, 1998
E-3-hexen-1-ol
Verde
1500
Morales et al., 1997
Acetato Z-3-hexenilo
Verde, frutado
750
Aparicio & Luna, 2002
Banana, floral
200
Reiners & Grosch, 1998
Verde, manzana
300
Morales et al., 2005
Verde, almendra amarga
300
Aparicio & Luna, 2002
Z-2-pentenal
Verde
------
Morales et al., 1997
Pentan-1-ol
Picante
------
Morales et al., 1997
Z-2-penten-1-ol
Banana
------
Morales et al., 1997
1-penten-3-ona
Verde, punzante
50
Aparicio & Luna, 2002
Verde, picante
0,73
Reiners & Grosch, 1998
Tierra húmeda
------
Morales et al., 1997
E-2-pentenal
1-penten-3-ol
* Fuentes utilizadas: Angerosa et al. (2004) y Kalua et al. (2007).
16
1. Introducción General
De esta forma, Angerosa et al. (2000c) utilizaron el Análisis de Regresión Lineal para relacionar los compuestos C6 y C5 de la ruta LOX con los atributos sensoriales evaluados por un panel de jueces entrenados, obteniendo valores de R2 no demasiado elevados para las distintas notas aromáticas “verdes” evaluadas (entre 0,21 y 0,65). Aún así, se encontraron ciertas relaciones interesantes, como el hecho de que el hexanal presenta un papel esencial en la formación de la mayoría de los atributos sensoriales “verdes”, mientras que el E-2-hexenal participa en las notas olfativas descritas bajo los términos hierba, banana y almendra, el E-2hexen-1-ol se asocia con las notas florales, frutadas y tomate, y el acetato de Z-3-hexenilo es el mayor contribuyente en las notas banana y cáscara de nuez. El Análisis de los Componentes Principales (PCA) y Mínimos Cuadrados Parciales (PLS) fueron utilizados por Servili et al. (1995) para establecer posibles relaciones entre la concentración de los compuestos volátiles del aceite de olive virgen evaluados mediante GCMS y los atributos sensoriales evaluados mediante la metodología de perfil de libre elección (FCP) y el análisis descriptivo cuantitativo (QDA). De los resultados obtenidos cabe destacar que las muestras de aceite evaluadas se agruparon en conjuntos similares tanto en función de su composición volátil, como a través de las puntuaciones obtenidas en el conjunto de notas sensoriales evaluadas al aplicar la técnica PCA. Se han encontrado buenas predicciones mediante la regresión PLS procedente de los datos de composición volátil y el QDA. La predicción de la nota sensorial de “hierba recién cortada” se obtuvo a partir de cinco compuestos volátiles no identificados, los cuales presentaban un espectro de masas similar, por lo que posiblemente se trataba de compuestos isómeros, aunque mediante GC-O se determinó que sólo uno de ellos presentaba capacidad aromática y posiblemente sea el que podría relacionarse con el descriptor sensorial. De la misma forma Morales et al. (1995) utilizaron el Escalado Multidimensional (MDS) para establecer las posibles inter e intra-relaciones entre los compuestos volátiles del aceite de oliva virgen y los atributos sensoriales evaluados por seis paneles de catadores distintos, dos de ellos integrados por jueces expertos y el resto formado por consumidores habituales y potenciales entrenados para el ensayo. Al aplicar la técnica de MDS las diversas notas sensoriales se clasificaron en siete grupos de diferentes percepciones sensoriales -dulce, frutado, fruta madura, fruta sobre-madura, indeseable, amargo-picante y verde- dentro de las cuales se clasificaron los distintos compuestos volátiles presentes en el aceite de oliva virgen, de forma que los agrupamientos de sustancias aromáticas obtenidos deberían explicar cada una de las percepciones sensoriales definidas. De esta forma, el E-2-hexenal se incluye en la percepción amargo-picante, debido a sus notas sensoriales de almendra amarga, al igual que el E-3-hexen-1-ol. Compuestos como Z-3-hexenal, E-2-hexen-1-ol, Z-3-hexen-1-ol, Z-2-penten1-ol y los ésteres C6 forman parte de la sensación de verde, mientras que el hexanal y el 1penten-3-ona se localizan en la percepción de dulce-frutado.
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1. Introducción General
Cabe destacar la elaboración de la denominada Rueda Sensorial para el aceite de oliva virgen extra llevada a cabo por Aparicio et al. (1995), en donde se representa el flavor global de un aceite a través de siete zonas sensoriales –verde, amargo-picante, indeseable, aceituna madura, fruta madura, frutado y dulce- mediante la utilización de datos sensoriales obtenidos a partir del QDA y técnicas estadísticas multivariantes, como el PCA. La asignación de coordenadas dentro de la rueda sensorial para cada compuesto volátil permite obtener información de las características sensoriales de estos componentes orgánicos en base a las propiedades sensoriales del sector de la rueda del que forman parte. Así, compuestos como el Z-3-hexen-1-ol, acetato de hexilo y acetato de Z-3-hexenilo fueron localizados en el sector “verde”, enfatizando la contribución de estos volátiles a la percepción de las notas sensoriales verdes, mientras que el hexanal y 1-penten-3-ona se incluyeron en el “dulce” y volátiles como el E-2-hexen-1-ol, 1-penten-3-ol y hexan-1-ol formaron parte de la zona de “indeseable”. Recientemente se ha desarrollado un método instrumental rápido y no destructivo, la denominada nariz electrónica, permitiendo el estudio de las posibles relaciones sinérgicas de los compuestos volátiles presentes en el aroma de los alimentos. Este equipo constituido por un conjunto de sensores normalmente de materiales poliméricos conductores que alteran su conductividad al ser expuestos a sustancias volátiles, son capaces de establecer la denominada “huella digital” del aroma de un producto e incluso discriminarla dentro de un conjunto de sustancias olorosas. Su uso en el aceite de oliva se ha aplicado en el reconocimiento y cuantificación de defectos típicos (García-González et al., 2002), también ha permitido monitorizar el proceso de enranciamiento (Aparicio et al., 2000), así como discriminar pastas y muestras de aceite en función de su calidad (García-González et al., 2003 y 2007).
1.3. COMPUESTOS FENÓLICOS DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN. Los compuestos fenólicos constituyen un extenso grupo de sustancias presentes de forma natural en los tejidos vegetales. Están presentes principalmente en los frutos, aunque también en menor proporción, en hojas, tallos y otros órganos vegetales. Los fenoles son metabolitos aromáticos secundarios e incluyen un amplio número de compuestos que presentan en su estructura un anillo aromático sustituido por uno o varios grupos hidroxilo (Macheix et al., 1990). Aunque resulta más conveniente definir estos compuestos fenólicos, en función de su origen metabólico, como aquellas sustancias que proceden de la ruta del ácido siquímico y del metabolismo fenilpropanoide (Ryan et al., 1998). La mayor parte de los compuestos fenólicos presentes en el aceite de oliva virgen están presentes también en el fruto o bien son derivados de éstos, transfiriéndose al aceite durante las distintas etapas del proceso de extracción (Servili et al., 1999a). 18
1. Introducción General
Los compuestos fenólicos presentes en el fruto del olivo son reconocidos, entre otros aspectos, por su actividad antimicrobiana (Fleming et al., 1973; Tranter et al., 1993; Aziz et al., 1998), por su papel preventivo en las infecciones por Dacus oleae (Lo Scalzo et al., 1994) y por su actividad inhibidora de enzimas celulolíticas, tanto endógenas como exógenas (Heredía et al., 1990), constituyendo, por tanto, una parte importante del sistema químico de defensa de la aceituna. El fruto del olivo presenta un elevado contenido de fenoles, los cuales llegan a constituir hasta el 3% del peso fresco de la pulpa (Raina, 1995), siendo los ácidos fenólicos, alcoholes fenólicos, flavonoides y secoiridoideos los principales grupos fenólicos presentes. Los compuestos secoiridoideos constituyen el grupo fenólico más abundante en el fruto del olivo, encontrándose de forma exclusiva en la familia Oleaceae. Estos compuestos se caracterizan por incluir en su estructura molecular el ácido elenólico o algún derivado de éste. Dentro de estos secoiridoideos, la oleuropeína es el componente predominante en la aceituna, cuyo contenido puede alcanzar hasta un 14% de la materia seca en aceitunas verdes. Panizzi et al. (1960) establecieron que se trataba de un éster heterosídico del ácido elenólico y el 3,4dihidroxifeniletanol. Posteriormente, Kubo y Matsumoto (1984) aislaron en la pulpa de la aceituna el secoiridoideo ligustrósido, cuya estructura es similar a la oleuropeína, con la excepción
de
secoiridoideos
que
el
presentes
p-hidroxifeniletanol en
la
aceituna,
sustituye
al
3,4-dihidroxifeniletanol.
aunque
en
menor
proporción,
Otros son
la
demetiloleuropeína y el nüzhenido, éste último localizado únicamente en la semilla del fruto (Servili et al., 1999b). Los
compuestos
3,4-dihidroxifeniletanol
(3,4-DHPEA)
y
p-hidroxifeniletanol
(p-HPEA),
conocidos, como hidroxitirosol y tirosol, respectivamente, son los alcoholes fenólicos más abundantes del fruto. También se han identificado una gran número de ácidos fenólicos como el ácido cinámico y sus derivados: ferúlico, p-cumárico, o-cumárico, cafeico, sinapínico; derivados del ácido benzoico: p-hidroxibenzoico, gálico, protocatéquico; derivados del ácido fenilacético: p-hidroxifenilacético (Brenes et al., 1992; Romani et al., 1999; Servili et al., 1999a). Dentro del grupo de los flavonoides, se han identificado flavonoles como quercetín-3-rutinósido y quercetín-3-ramnósido; flavonas como luteolín-7-glucósido, luteolín-5-glucósido y apigenín-7glucósido y antocianinas, siendo cianidina-3-glucósido y cianidina-3-rutinósido las presentes en mayor proporción en los frutos maduros (Vázquez-Roncero et al., 1974; Esti et al., 1998; Romani et al., 1999; Ryan et al., 1999). El verbascósido es el derivado del ácido hidroxicinámico más abundante en la aceituna (Fleuriet et al., 1984) y es un éster heterosídico del ácido cafeico y el 3,4-dihidroxifeniletanol. Otro derivado del ácido hidroxicinámico identificado en este fruto es el 1-cafeil-glucosa (Vázquez-Roncero et al., 1974).
19
1. Introducción General
En la biosíntesis de estos compuestos se ha identificado un intermediario común, la Lfenilalanina, aminoácido aromático precursor de la mayoría de los compuestos fenólicos (Haslam, 1993). Las principales rutas biosintéticas implicadas en la formación de estos compuestos se han esquematizado en las Figuras 1.2 y 1.3: Ruta del ácido siquímico: ruta responsable de la formación de los aminoácidos aromáticos Lfenilalanina y L-tirosina. La glicólisis no oxidativa de la glucosa origina el fosfoenol piruvato y la eritrosa-4-fosfato, compuestos que se unen mediante una serie de reacciones dando lugar al ácido siquímico, precursor biosintético de los aminoácidos aromáticos. El posterior conjunto de reacciones implicadas en la formación del ácido p-cumárico a partir de L-fenilalanina, es lo que se conoce como “metabolismo general fenilpropanoide”. Las enzimas que catalizan las reacciones parciales de esta ruta son: L-fenialanina amonio liasa (PAL), cinamato-4-hidroxilasa (C4H) y hidroxicinamato CoA ligasa.
FOSFOENOL PIRUVATO
ERITROSA-4-FOSFATO
+
L-TIROSINA
Ac. SINÁPÍNICO
SIQUIMATO
CORISMATO
Ac. FERÚLICO
Ac. CAFEICO
L-FENILALANINA
PAL
Ac. p-CUMÁRICO
Ac. CINÁMICO
C4H
H.CoA ligasa
Ac. o-CUMÁRICO
SINAPINIL-CoA
FERULIL-CoA
CAFEIL-CoA
p-CUMARIL-CoA
FLAVONOIDES SINAPINIL ALCOHOL
CONIFERIL ALCOHOL
CAFEIL ALCOHOL
p-CUMARIL ALCOHOL
LIGNINAS LIGNANOS
Figura 1.2. Ruta del ácido siquímico y metabolismo general fenilpropanoide. (Fuente utilizada: Ryan et al., 2002).
La enzima L-fenilalanina amonio liasa es clave en la biosíntesis de compuestos fenólicos, ya que cataliza la desaminación no oxidativa y esteroespecífica de la L-fenilalanina para formar el ácido trans-cinámico (Haslam, 1993). La posterior hidroxilación del ácido trans-cinámico, llevada a cabo por la enzima cinamato-4-hidroxilasa, tiene como resultado la formación del ácido p-cumárico. En esta reacción se requiere oxígeno y NADPH. Si la hidroxilación es llevada a cabo en la posición orto se genera el ácido o-cumárico. Mientras que la enzima hidroxicinamato CoA ligasa cataliza la formación de CoA ésteres de los ácidos hidroxicinámicos, en presencia de CoA, ATP e iones Mg2+. Estas moléculas poseen un papel
20
1. Introducción General
importante en la síntesis posterior de fenoles como flavonoides y hidroxicinamil alcoholes, éstos últimos precursores de ligninas y lignanos. Ruta del ácido mevalónico: ruta responsable de la síntesis de los compuestos secoiridoideos del fruto y forma parte del metabolismo secundario de los terpenos. Damtoft et al. (1993) propusieron la ruta biosintética esquematizada en la Figura 1.3 para la formación de los secoiridoideos ligustrósido y oleuropeína a partir del ácido mevalónico.
H 3C
OH
OH
OH
OH
OH
Ác. mevalónico CHO
O
O
O
OH
OH
OH COOH
COOH
COOH
HO
O
O
O
O OGlu
OGlu
OGlu
Ác. deoxilogánico
Ác. 7-epilogánico HOOC
COOMe
O
COOH
Ác. 7-cetologánico GluOOC
COOMe
COOMe
O
O
O
OGlu
OGlu
OGlu
7-cetologanina
7-β-1-D-glucopiranosil 11-metil oleósido
Éster 11-metil oleósido
HO HO
O
O
CO OMe
HO
O
O
Ligustrósido
OGlu
O
COOMe
O
Oleuropeína
OGlu
Figura 1.3. Ruta del ácido mevalónico. Propuesta por Damtoft et al. (1993) para la biosíntesis de los secoiridoideos oleuropeína y ligustrósido presentes en la aceituna. (Fuente utilizada: Ryan et al., 2002).
La presencia de los componentes fenólicos en el aceite de oliva virgen fue determinada en 1969 mediante la utilización de métodos colorimétricos por Cantarelli y Montedoro. Sin embargo han sido los estudios exhaustivos llevados a cabo durante los últimos veinte años los que han permitido identificar y clasificar los compuestos fenólicos hidrofílicos presentes en este 21
1. Introducción General
producto. Se han identificado prácticamente las mismas familias que en la aceituna, a excepción de la ausencia de antocianinas y flavonoles, y la presencia de lignanos. Los ácidos fenólicos, similares a los encontrados en la aceituna, fueron los primeros compuestos fenólicos identificados en el aceite de oliva virgen. Éstas sustancias junto a los alcoholes fenólicos (hidroxitirosol y tirosol) y las flavonas (luteolina y apigenina), procedentes de la hidrólisis de sus correspondientes glucósidos presentes en la pulpa y que se produce durante el proceso de extracción del aceite, se encuentran en concentraciones muy bajas en el aceite de oliva virgen (Vázquez-Roncero et al., 1976; Solinas et al., 1981; Brenes et al., 1999). Los acetatos de hidroxitirosol (3,4-DHPEA-AC) y tirosol (p-HPEA-AC), que también se encuentran en bajas cantidades, son dos de los últimos compuestos cuya presencia ha sido descrita en la bibliografía para el aceite de oliva virgen (Brenes et al., 1999; Mateos et al., 2001). Además, se ha determinado la presencia de dos compuestos pertenecientes a la familia de los lignanos, el pinorresinol y el 1-acetoxipinorresinol (Brenes et al., 2000, Owen et al., 2000a). El pinorresinol, sus derivados y glicósidos de éstos han sido aislados de la corteza de los olivos y otras oleáceas (Tsukamoto et al., 1984 y 1985), por lo que, éstos podrían encontrarse como tales en la aceituna o proceder de la degradación hidrolítica de sus glicósidos. Sin embargo, los compuestos fenólicos mayoritarios en el aceite de oliva virgen son derivados secoiridoideos del hidroxitirosol y tirosol, los cuales proceden de la hidrólisis enzimática de la oleuropeína, la demetiloleuropeína y el ligustrósido, proceso que se inicia con la molienda del fruto y continua durante el batido de la pasta de aceituna debido a la acción de la enzima βglucosidasa. Los principales secoiridoideos del aceite son las formas dialdehídica y aldehídica del ácido elenólico unido al hidroxitirosol, denominadas generalmente como 3,4-DHPEA-EDA y 3,4-DHPEA-EA, respectivamente, y sus formas análogas del ácido elenólico unido al tirosol: pHPEA-EDA y p-HPEA-EA, respectivamente. La identificación de la estructura de los derivados 3,4-DHPEA-EDA, 3,4-DHPEA-EA y p-HPEA-EDA fue llevada a cabo en 1993 por Montedoro et al. mediante RMN y posteriormente confirmada por otros autores (Angerosa et al., 1995; Angerosa et al., 1996b; Owen et al., 2000a). En 1995, Angerosa et al. determinó la estructura del p-HPEA-EA mediante GC-MS, la cual fue confirmada posteriormente con RMN por Mateos et al. (2001). Aunque, aún en la actualidad, se desconocen los mecanismos bioquímicos que generan la presencia de estos compuestos secoiridoideos en el aceite de oliva virgen, se ha propuesto la ruta de biosíntesis esquematizada en la Figura 1.4.
22
1. Introducción General
R
R
R O
HO
O
COOMe
I O
- Glu
O
HO
O
COOMe
O
O
HO
COOMe
II
β-glucosidasa O
OGlu
O
OH
O
R
R O
HO
O COOMe
O
HO
O COOMe
III OH
O
O
O
Metilesterasa R
- CH3
R O
HO
O HO
O
O COOH
IV O O
O O
Figura 1.4. Mecanismo propuesto para la biosíntesis de los derivados secoiridoideos presentes en el aceite de oliva virgen. I: R=H, ligustrósido; R=OH, oleuropeína. II: R=H, p-HPEA-EA; R=OH, 3,4DHPEA-EA. III y IV: R=H, p-HPEA-EDA carboximetilada y decarboximetilada; R=OH, 3,4-DHPEA-EDA carboximetilada y decarboximetilada, respectivamente. (Fuente utilizada: Servili et al., 2004).
CONTRIBUCIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS A LA CALIDAD DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN. Los compuestos fenólicos están relacionados con las notas sensoriales amargas del aceite de oliva virgen, así como con las sensaciones quimioestésicas de astringencia y picor característicos de este producto. Varios estudios han puesto de manifiesto la relación existente entre los atributos sensoriales positivos “amargo” y “picante” y el contenido fenólico total del aceite. En 1992, GutiérrezRosales et al. observaron una elevada correlación entre la intensidad de amargor del aceite de oliva virgen y la absorbancia a 225 nm de sus extractos fenólicos correspondientes, parámetro denominado por los autores como K225.
23
1. Introducción General
Aunque, aún en la actualidad, no se han definido claramente las relaciones existentes entre los compuestos fenólicos individuales y las características sensoriales del aceite de oliva virgen, algunos estudios han puesto en evidencia tanto la falta de correlación existente entre los ácidos fenólicos y el amargor del aceite de oliva virgen, así como el importante impacto sensorial de los derivados secoiridoideos presentes en este producto (Uccella et al., 2001). De esta forma, se han descrito la elevada correlación estadística entre las formas 3,4-DHPEAEDA, 3,4-DHPEA-EA y p-HPEA-EDA y la intensidad de amargor del aceite de oliva virgen (García et al., 2001; Kiritsakis et al., 1998b; Gutiérrez-Rosales et al., 2003; Tovar et al., 2001). Por otro lado, en un intento de determinar las propiedades sensoriales de los compuestos fenólicos de forma individual, Gutiérrez et al. (2000) fraccionaron los fenoles de un aceite de oliva virgen utilizando HPLC preparativa encontrando cuatro picos mayoritarios. Tras su separación y aislamiento, los extractos fueron presentados a un panel de cata y fueron descritos dos de ellos como ligeramente amargos, otro de ellos como fuertemente amargo, y uno como picante. Los picos aislados no fueron identificados, aunque tras el análisis HPLC de la fracción más amarga se encontró que a su vez estaba constituida por al menos tres picos distintos. Un estudio más exhaustivo realizado por Andrewes et al. (2003) puso de manifiesto, tras el aislamiento e identificación parcial de diversas fracciones fenólicas a través de sus características de absorción en el UV y por MS, y posterior presentación ante un panel de cata, que aunque todas las fracciones fenólicas estudiadas fueron descritas como amargas y picantes, el p-HPEA-EDA, identificado mediante MS y RMN, es el principal contribuyente a las notas sensoriales picantes de los aceites de oliva virgen, al producir una sensación ardiente en la parte posterior de la garganta, mientras que la forma 3,4-DHPEA-EDA sólo causó una pequeña sensación picante en los catadores. Por otro lado también es conocida desde hace tiempo la capacidad antioxidante de los compuestos fenólicos presentes en el aceite de oliva virgen, ya que son numerosos los autores que han relacionado el contenido de compuestos fenólicos con su estabilidad oxidativa, evaluada mediante el test de capacidad de absorción del radical oxígeno (ORAC), como con la vida útil del producto, evaluada mediante ensayos acelerados de estabilidad oxidativa, como son el método Rancimat o el método del oxígeno activo (AOM) (Gutiérrez et al., 1977; Gutfinger, 1981; Montedoro et al., 1992a; Baldioli et al., 1996; Litridou et al., 1997; Salvador et al., 1999; Ninfali et al., 2002). Estos compuestos actúan como antioxidantes primarios evitando la propagación de las reacciones oxidativas mediante la donación de un radical hidrógeno a los radicales peroxilo que se forman durante la fase de iniciación de la oxidación lipídica, con la consecuente formación de radicales fenoxilo, los cuales son estables por resonancia y relativamente no reactivos frente a los ácidos grasos y el oxígeno, por lo que no son capaces de iniciar o propagar reacciones de oxidación. La eficacia de los compuestos fenólicos como sustancias antioxidantes depende de 24
1. Introducción General
la estabilidad por resonancia de los radicales fenoxilo a los que dan lugar, que se encuentra condicionada por la presencia de sustituyentes donadores de electrones en el anillo aromático y por el tamaño de los mismos (Scott, 1965). Existen varios estudios sobre la capacidad antioxidante individual que presentan determinados compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen, como es el caso del hidroxitirosol, tirosol y ácidos fenólicos, como el cafeico, p-cumárico, ferúlico o vanílico, cuya actividad antioxidante ha sido estudiada tras su adición a aceite de oliva refinado o de girasol, observándose el gran poder antioxidante del hidroxitirosol (Chimi et al., 1991; Papadopoulos et al., 1991). Está claramente confirmado que el hidroxitirosol y sus derivados secoiridoideos (3,4-DHPEAEDA y 3,4-DHPEA-EA) son los antioxidantes naturales del aceite de oliva virgen que muestran una mayor capacidad antioxidante, frente al tirosol y sus derivados secoiridoideos, los cuales demostraron una escasa o nula actividad antioxidante (Baldioli et al., 1996; Mateos, 2002; Carrasco-Pancorbo et al., 2005). La razón de las diferencias encontradas entre ambas especies fenólicas se debe a la presencia del grupo o-difenol en la estructura del hidroxitirosol y sus derivados, la cual origina radicales fenoxilo muy estables por la presencia de grupos donadores de electrones. La elevada capacidad antioxidante demostrada por el hidroxitirosol y sus derivados permitiría su uso como aditivos antioxidantes en la industria alimentaria, además de incrementar el valor nutricional de los productos (Shahidi et al., 1992), sin embargo su empleo no se ha generalizado debido al carácter poco liposoluble del hidroxitirosol y a que sus derivados secoiridoideos son amargos. Asimismo, la capacidad antioxidante de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen, y en especial del hidroxitirosol, ha sido relacionada durante los últimos años con una efectiva actividad protectora frente a enfermedades cardiovasculares, neuro-degenerativas y algunos tumores, debido a que estas sustancias son capaces de inhibir ciertas especies reactivas de oxígeno (ROS) responsables del estrés oxidativo que se produce en todas estas enfermedades. Así por ejemplo, estudios in vivo han demostrado que la ingesta habitual de aceite de oliva virgen reduce el riesgo relativo estimado de cáncer de pecho (Martín-Moreno et al., 1994), páncreas (Soler et al., 1998), colón y recto (Stoneham et al., 2000), entre otros. Mientras que, otras investigaciones in vitro han establecido la capacidad protectora del hidroxitirosol frente a los cambios producidos por los peroxinitrilos en las bases del DNA (Dejana et al., 1999), su actividad inhibidora de los procesos de agregación plaquetaria (Petroni et al., 1995), así como su capacidad protectora de los eritrocitos, las lipoproteínas de baja densidad y los fosfolípidos de los liposomas frente a procesos oxidativos (Aeschbach et al., 1994; Visioli et al., 1995; Manna et al., 1999).
25
1. Introducción General
Dentro de los derivados secoiridoideos presentes en el aceite de oliva virgen, resulta de gran interés destacar el reciente re-descubrimiento del p-DHPEA-EDA como un potente agente antiinflamatorio no-esteroideo, similar al ibuprofeno, y denominado por los autores con el nombre de oleocantal (Beauchamp et al., 2005). En lo que respecta a otros compuestos fenólicos presentes en este producto en concentraciones apreciables, como son los lignanos, varios estudios han mostrado el interés farmacológico de estas sustancias debido a su actividad antiviral, antimitótica y anti-tumoral (Nikaido et al., 1981; MacRae et al., 1984; Oomad et al., 1998). Por otro lado, aunque la capacidad antioxidante de estas sustancias fue expuesta por Owen et al. (2000b), otros autores no han encontrado ninguna correlación entre la concentración de lignanos y la estabilidad oxidativa del aceite de oliva virgen (Tovar et al., 2001).
1.4. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA COMPOSICIÓN VOLÁTIL Y FENÓLICA DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN DE CALIDAD. El perfil fenólico y volátil del aceite de oliva virgen, así como el resto de componentes minoritarios y mayoritarios del mismo, depende de una serie de interacciones entre factores genéticos, ambientales y tecnológicos que influyen tanto en el desarrollo y maduración del fruto, como en el posterior procesado del mismo (Montedoro et al., 1991). INFLUENCIA DE ASPECTOS AGRONÓMICOS Y PEDOCLIMÁTICOS. El principal factor que determina el perfil de compuestos volátiles y fenólicos de un aceite de oliva virgen es la variedad de aceituna de la que procede, lo cual se debe al hecho de que el contenido enzimático de un fruto, responsable tanto de la formación de sustancias volátiles durante su molturación como de la acumulación previa y posterior transformación de los metabolitos fenólicos de la aceituna, está determinado genéticamente. Así, diversos estudios han llevado a cabo la clasificación de aceites de oliva virgen monovarietales en función tanto de sus componentes volátiles (Angerosa et al., 1999a; Aparicio et al., 2002; Luna et al., 2006), como fenólicos (Briante et al., 2002; Gómez-Alonso et al., 2002). La composición volátil y fenólica cuantitativa del producto depende de la actividad de las enzimas presentes en su fruto, la cual se ve afectada por una serie de parámetros externos, como son el grado de maduración del fruto, el área geográfica de crecimiento, la disponibilidad de agua durante el desarrollo del fruto, así como las condiciones tecnológicas utilizadas en la extracción del aceite de oliva virgen. Así, se ha determinado como la actividad enzimática de la mayoría de las enzimas responsables de la formación de los volátiles C6 y C5 a través de la ruta LOX disminuye a 26
1. Introducción General
medida que madura el fruto, como es el caso de la ADH (Salas et al., 1998) y la LOX (Salas et al., 1999c), lo cual apoya la disminución en la formación de estos compuestos volátiles que han observado numerosos autores, a medida que aumenta el grado de maduración de las aceitunas (Morales et al., 1996; Aparicio et al., 1998). Aún así, la evolución de los distintos compuestos C6 es variable; por ejemplo, se ha descrito como el E-2-hexenal aumenta hasta una concentración máxima, lo cual sucede cuando el color del fruto pasa de verde-amarillento a púrpura, momento a partir del cual su contenido en el aceite de oliva virgen comienza a disminuir (Solinas et al., 1987b), y mientras que el contenido de la mayoría de los alcoholes C6 disminuye con la maduración del fruto, la concentración de hexan-1-ol aumenta en algunas variedades (Benincasa et al., 2003). De igual forma se ha observado un importante descenso en el contenido de compuestos fenólicos presentes en el aceite de oliva virgen a medida que aumenta el índice de madurez del fruto, sobre todo en los derivados secoiridoideos del hidroxitirosol y tirosol (Pannelli et al., 1989; Brenes et al., 1999; Uceda et al., 1999), lo cual podría estar relacionado con la disminución del contenido de precursores fenólicos presentes en la aceituna, como es el caso de la oleuropeína y el ligustrósido, hecho observado por varios autores a medida que el fruto madura (Amiot et al., 1986; Ryan et al., 1999; Morelló et al., 2004). El contenido de volátiles C6 y C5 también puede verse modificado por factores geográficos. Por ejemplo, el contenido mayoritario de E-2-hexenal en el aroma de los aceites europeos señalado por numerosos autores (p.e. Cavalli et al., 2004) no ha sido observado en muchos aceites australianos (Tura et al., 2004), mientras que los aceites obtenidos en la zona del Magreb se caracterizan por un gran contenido en ésteres C6 (Reiners et al., 1998). Asimismo, el estudio de la composición volátil de diversos aceites de oliva virgen monovarietales procedentes de dos áreas italianas distintas, permitió clasificar correctamente todas las muestras en función de su origen geográfico basándose principalmente en la composición de aldehídos y alcoholes C6, lo que sugiere que las condiciones medioambientales pueden influir en la actividad de enzimas como la ADH (Vichi et al., 2003a). Por otro lado, la disponibilidad de agua por parte del fruto durante su desarrollo, ha sido descrito como uno de los factores agronómicos más importantes en la posterior composición fenólica del aceite de oliva virgen obtenido. Varios autores han determinado un menor contenido fenólico en los aceites obtenidos a partir de frutos desarrollados bajo diversas técnicas de riego, y que por tanto, no han sufrido condiciones de estrés hídrico apreciable, encontrando una relación inversamente proporcional entre las dosis de agua aplicadas en el olivar y la presencia de sustancias fenólicas en los aceites (D´Andria et al., 1996; Motilva et al., 1999; Motilva et al., 2000; Tovar et al., 2001; Romero et al., 2002; Servili et al., 2007). Este hecho podría estar relacionado con la menor concentración fenólica observada en los frutos cuando se aplica riego al olivar (Patumi et al., 1999; Tovar et al., 2002b), y también ha sido 27
1. Introducción General
asociado a cambios en la actividad de las enzimas implicadas en la síntesis fenólica, como la L-fenilalanina amonio liasa (PAL), cuya actividad es mayor ante situaciones de estrés hídrico elevado, favoreciéndose la acumulación de fenoles en la drupa y por lo tanto un mayor contenido fenólico en el aceite de oliva virgen obtenido. Aún así, no todas los compuestos fenólicos presentes en el aceite de oliva virgen se ven afectados de igual forma por la disponibilidad de agua durante el desarrollo del fruto, así es el contenido de los derivados secoiridoideos 3,4-DHPEA-EDA, 3,4-DHPEA-EA y p-HPEA-EDA el que más disminuye al descender el estrés hídrico de los frutos (Tovar et al., 2001; Romero et al., 2002; Servili et al. 2007). En lo que respecta a la influencia de la aplicación de riego en el olivar sobre la composición volátil del aceite posteriormente obtenido, recientemente se ha descrito un aumento significativo de los compuestos C6, como el E-2-hexenal, hexanal, Z-3-hexen-1-ol y hexan-1-ol, en aquellos obtenidos a partir de frutos que no han sufrido condiciones de estrés hídrico apreciables (Gómez-Rico et al., 2006; Servili et al., 2007), por lo que se puede decir que la actividad de las enzimas de la ruta LOX, especialmente la ADH y la HPL, puede verse afectada por el estado hídrico de las aceitunas. INFLUENCIA DE ASPECTOS TECNOLÓGICOS DURANTE LA EXTRACCIÓN DEL PRODUCTO. Varios autores han apuntado la importancia de las distintas fases de extracción del aceite de oliva virgen sobre la composición minoritaria del mismo y los cambios observados en estos compuestos. Así, el uso de molinos metálicos permite una mayor ruptura de los tejidos vegetales dando lugar a una mejor extracción de las sustancias fenólicas en comparación con los molinos de piedra (Caponio el al., 2003), obteniéndose de este modo aceites más amargos y con una mayor estabilidad oxidativa (Di Giovacchino et al., 2002). De igual forma, Servili et al. (2002b) describieron también cambios en la composición volátil de este producto en función del tipo de molino utilizado, de forma que la cantidad total de volátiles era significativamente superior en aceites obtenidos a partir de molinos de piedra, sobretodo en lo que respecta al contenido de Z-3-hexen-1-ol, hexanal y E-2-hexenal. Este último compuesto llegó casi a triplicarse frente al aceite obtenido utilizando un molino metálico de discos. La razón de ello, es que la temperatura que puede alcanzar la pasta de aceituna después de su molturación en un molino metálico es 10 ºC superior a la de un molino de piedra, con el consecuente descenso en la actividad de las enzimas de la ruta LOX (Salas et al., 1998 y 1999b). En el caso de los molinos metálicos, también se ha descrito que el tamaño de la luz de malla del tamiz es un importante factor a valorar, ya que cuanto menor es el diámetro del tamiz, 28
1. Introducción General
mejor es la extracción de las sustancias polares presentes en los tejidos vegetales, como son los compuestos fenólicos (Di Giovacchino et al., 2002). En lo que respecta al posterior proceso de batido, esta etapa permite no sólo la ruptura de las emulsiones entre la fase acuosa y oleosa presentes en la pasta de aceituna y la consiguiente agregación física de las partículas de aceite, sino que además tengan lugar numerosos procesos bioquímicos que afectan a la calidad final del producto obtenido. De hecho, las condiciones utilizadas durante esta etapa afectan tanto al rendimiento graso obtenido en el proceso de extracción, como a la composición minoritaria del aceite de oliva virgen. El tiempo y la temperatura de batido son las principales variables a controlar durante esta etapa, de forma que es posible cambiar potencialmente la composición volátil y fenólica del aceite de oliva virgen obtenido y, por consiguiente, sus características sensoriales. Así, un incremento de la temperatura de batido generalmente implica un mayor contenido fenólico en los aceites (Di Giovacchino et al., 1991; Ranalli et al., 2001), debido al aumento que se produce en los coeficientes de partición de estos compuestos entre la fase acuosa y oleosa de la pasta de aceituna, y que supone el incremento de la solubilidad relativa en la fase oleosa (Rodis et al., 2002). Por el contrario, en la composición volátil del aceite obtenido disminuye el contenido de Z-3-hexen-1-ol y ésteres C6, mientras que aumenta el hexan-1-ol y E-2-hexen-1-ol, además de favorecerse la acumulación de 2-metilbutanal y 3-metilbutanal, a causa de la activación de la ruta de conversión de los aminoácidos (Morales et al., 1999; Angerosa et al., 2001). Aún así, en varios estudios llevados a cabo en procesos de extracción a escala de laboratorio, en donde se han procesado lotes de frutos inferiores a 10-20 Kg, se ha descrito un descenso en la concentración fenólica del aceite al incrementarse la temperatura de batido, lo cual, independientemente del aumento de la solubilidad de estas sustancias en la fase oleosa, es atribuido a la acción de enzimas oxidativas como la polifenoloxidasa y peroxidada. Estos resultados aparentemente contradictorios pueden explicarse en función de la concentración de O2 atmosférico en contacto con la pasta de aceituna durante el batido que favorece la degradación oxidativa de los compuestos fenólicos, y que es más evidente al procesar poca cantidad de aceituna (Servili et al., 1994; Angerosa et al., 2001). Este hecho pone en evidencia la precaución de trasladar las pruebas realizadas a escala de laboratorio para predecir los resultados a obtener en plantas de extracción industriales. Por otro lado, los tiempos de batido largos favorecen la degradación oxidativa, ya sea química o enzimática, de los compuestos fenólicos, obteniéndose aceites de oliva virgen con un menor contenido en las formas 3,4-DHPEA-EDA, 3,4-DHPEA-EA y p-HPEA-EDA (Lercker et al., 1999; Angerosa et al., 2001; Di Giovacchino et al., 2002), aunque se ha puesto de manifiesto que una reducción en la disponibilidad de oxígeno, disminuye la actividad de la polifenoloxidasa y peroxidasa, aumentando el contenido fenólico del aceite (Servili et al., 1999). Sin embargo, el
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1. Introducción General
contenido volátil de los aceites se ve incrementado, debido principalmente a un aumento de los aldehídos y alcoholes C6, compuestos con umbrales de detección bajos y que por tanto contribuyen en gran medida al aroma del producto (Angerosa et al., 2001; Ranalli et al., 2003). El proceso de separación sólido-líquido que permite extraer el aceite de oliva virgen de la pasta de aceituna puede realizarse de diferentes formas. En la elección de uno u otro sistema se debe considerar que la composición fenólica y volátil del aceite puede verse afectada. La utilización de los sistemas de centrifugación de tres fases implica la adición de agua en el proceso, aproximadamente en torno a 40-60 L por 100 Kg de pasta, para conseguir la correcta separación de las mismas, ejerciendo un efecto de lavado sobre el aceite, que puede modificar el equilibrio de partición y arrastrar parte de las sustancias polares, como los compuestos fenólicos y sustancias volátiles. Algunos estudios han descrito que los aceites obtenidos empleando sistemas de extracción por presión o equipos de percolación para la separación sólido-líquido son más ricos en fenoles y en volátiles C6, como Z-3-hexen-1-ol, hexan-1-ol y E2-hexen-1-ol, que los obtenidos por sistemas de centrifugación en tres fases (Nergiz et al., 1991; Di Giovacchino et al., 1994; Di Giovacchino et al., 1995). Como mejora tecnológica para la elaboración del aceite de oliva virgen, en la década de los noventa se introdujo un nuevo sistema de centrifugación en dos fases que no necesitaba de la adición de agua a la pasta de aceituna para efectuar la separación sólido-líquido. Como cabía esperar, varios estudios han descrito que los aceites obtenidos mediante este sistema muestran un mayor contenido medio en fenoles y volátiles C6, como E-2-hexenal y alcoholes C6, respecto a los obtenidos por centrifugación de tres fases, aunque no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (Angerosa et al., 1996b y 2000b; Ranalli et al., 1996; Salvador et al., 1998; Di Giovacchino et al., 1994 y 2001). Finalmente, durante la separación líquido-líquido, que se efectúa para limpiar el aceite completamente de los restos de aguas de vegetación y que actualmente suele llevarse a cabo empleando centrífugas verticales, se produce de nuevo la reducción en el contenido en fenoles (Ranalli et al., 1998). Esta disminución se debe a la adición de agua, que suele estar en torno a una relación 1:1 a 1.5:1 v/v (agua/aceite) y que se realiza en esta etapa del proceso de extracción para el adecuado funcionamiento de la centrífuga.
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2. OBJETIVOS
2. Objetivos
El objetivo general de la Tesis Doctoral ha sido el estudio de la influencia que distintos factores agronómicos y tecnológicos ejercen sobre los componentes minoritarios del aceite de oliva virgen, y muy especialmente sobre la composición fenólica y volátil, estrechamente relacionada con la calidad de este producto y que por tanto representan en gran medida el grado de preferencia de este aceite frente a otras grasas vegetales comestibles presentes en el mercado. A continuación se resumen los objetivos específicos planteados en este trabajo: Influencia de diferentes estrategias de riego en el olivar sobre la calidad y los componentes mayoritarios y minoritarios del aceite de oliva virgen. • Evaluar la influencia que diferentes tratamientos de riego ejercen en el desarrollo y productividad de un olivar adulto de baja densidad con un marco tradicional de plantación (Olea europaea L. Cornicabra cv.), así como sus efectos sobre la composición y calidad del aceite de oliva virgen obtenido. Resulta de especial interés el estudio de los compuestos fenólicos y volátiles, debido a la gran relevancia de estos componentes minoritarios sobre la características organolépticas de este aceite de oliva monovarietal, caracterizado por una destacada presencia del atributo sensorial amargo. • Evaluar la viabilidad de diversas programaciones de riego basadas en medidas del estado hídrico de la planta en dos olivares jóvenes de cubierta incompleta (Olea europaea L. Cornicabra cv. y Morisca cv.), como son el potencial hídrico del tronco (stem water potential, SWP) y las fluctuaciones del diámetro del tronco (trunk diameter fluctuations, TDF), respecto de la metodología de riego propuesta por FAO (Food and Agriculture Organization), y analizar su repercusión sobre la composición de los aceites de oliva virgen obtenidos. • Optimizar la aplicación de riego en los olivares Cornicabra de marco tradicional de la región de Castilla-La Mancha, teniendo en cuenta la escasez de recursos hídricos que presenta esta zona de la geografía española y que obliga a establecer un adecuado compromiso entre la producción del cultivo y el consumo de agua, con el fin de mejorar la productividad y obtener un producto de excelentes características químicas y sensoriales, a la vez que se racionaliza el gasto de los recursos hídricos disponibles. • Analizar el efecto de la aplicación de programaciones de riego en dos olivares de cubierta incompleta (Olea europaea L. Cornicabra cv. y Morisca cv.) cultivados en zonas geográficas españolas diferentes, Castilla-La Mancha y Extremadura, sobre los componentes mayoritarios y minoritarios de los aceites de oliva virgen obtenidos.
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2. Objetivos
Efecto de los factores agronómicos “variedad” e “índice de madurez” sobre los componentes minoritarios del fruto (Olea europaea L.) de diversas variedades españolas y en sus aceites de oliva virgen correspondientes. • Conocer el perfil cualitativo y cuantitativo de la fracción fenólica presente en los frutos, a distintos estadíos de maduración, de diversas variedades españolas (Olea europaea L. Arbequina cv., Cornicabra cv., Morisca cv., Picolimón cv., Picual cv. y Picudo cv.), cultivadas en un mismo olivar experimental, y por tanto, en las mismas condiciones agronómicas y pedoclimáticas. • Ampliar el conocimiento sobre los principales compuestos minoritarios presentes en aceites de oliva virgen monovarietales, con el fin de determinar su relación con los componentes precursores presentes en el fruto, así como la presencia de posibles marcadores varietales. • Estudiar la evolución de los componentes mayoritarios y minoritarios en los aceites de oliva virgen Cornicabra obtenidos durante del proceso de maduración del fruto y establecer el período óptimo de recogida de los frutos de esta variedad, en base a las características químicas y sensoriales de los aceites obtenidos. Influencia de la etapa tecnológica de batido de la pasta sobre los principales componentes minoritarios del aceite de oliva virgen (Cornicabra cv.). • Estudiar la influencia de las variables tiempo y temperatura durante la etapa tecnológica de batido sobre la composición fenólica y volátil de la pasta de aceituna, así como en los aceites de oliva virgen obtenidos. • Definir las condiciones de batido óptimas en la variedad Cornicabra, cultivada en Castilla-La Mancha, de manera que puedan ser aplicadas por las almazaras industriales de la región para optimizar las características sensoriales del aceite de oliva virgen.
34
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3. Material y Métodos
3.1. PLANIFICACIÓN EXPERIMENTAL DE LA APLICACIÓN DE RIEGO EN EL OLIVAR DE MARCO TRADICIONAL (Olea europaea L. Cornicabra cv.). Este ensayo fue llevado a cabo durante las campañas olivareras 2003/04 y 2004/05 en una parcela propiedad de la Conserjería de Agricultura y Medio Ambiente, ubicada a 3 Km de la Escuela en Capacitación de Almodóvar del Campo (Ciudad Real). En ella está ubicado un olivar adulto de marco tradicional (50 años, marco 12 x 12 m2) de la variedad Cornicabra (Olea europaea L.), con una densidad de 70 olivos por hectárea y una superficie total de 46080 m2. El clima de la zona es continental-mediterráneo con una precipitación media anual de 404 mm, mayoritariamente distribuida fuera de la estación veraniega. Durante 2003 y 2004 la precipitación registrada fue de 426 y 484 mm, respectivamente, siendo de 41 y 138 mm desde mayo a septiembre, época que coincide con el periodo de riego en la parcela.
TRATAMIENTOS DE RIEGO Y ORGANIZACIÓN DE LA PARCELA. La aplicación de los tratamientos de riego que constituyen este ensayo comenzó en 2001, encontrándose la parcela originariamente en condiciones de secano. Las estrategias estudiadas fueron las siguientes: (1) Secano, sin aporte de riego. Actuó como control, con el fin de comparar los datos obtenidos con los restantes tratamientos. (2) Riego Deficitario Regulado o, en inglés, Regulated Deficit Irrigation (RDI). El límite legal de riego permitido en numerosas zonas olivareras españolas es de 100 mm, por ello para este tratamiento se estableció como objetivo dar un riego durante ambas campañas inferior a 75 mm, en función de la climatología y el estado fenológico de los olivos, aunque en cada campaña se evaluaron dos estrategias de riego distintas. Durante el 2003, el agua fue aplicada durante toda la estación de riego con una distribución de 28 mm en mayo y junio, 21 mm en julio y agosto y 7 mm en septiembre (RDI-1); mientras que en 2004, el agua fue aplicada solamente a partir de agosto, cuando comienza la acumulación de aceite en el fruto (RDI-2). (3) FAO. Este tratamiento tuvo como objetivo aplicar dosis de riego equivalentes al 100% de la demanda evapotranspirativa del olivo, es decir, reponer el 100% de las pérdidas hídricas del cultivo en función de la evapotranspiración del cultivo (ETc), la cual fue estimada según la metodología propuesta por la FAO (Food and Agriculture Organization). De esta forma las necesidades hídricas de los olivos se determinaron restando la precipitación efectiva (41 mm en 2003 y 138 mm en 2004) del valor de evapotranspiración del cultivo (ETc), calculado este último término según la siguiente ecuación (Doorenbos y Pruitt, 1977); ETc = Kc x ETo x Kr
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3. Material y Métodos
donde ETo es la evapotranspiración de referencia del cultivo, la cual se estimó usando la ecuación de Penman-Monteith según datos climáticos obtenidos de una estación meteorológica cercana y empleando los coeficientes de cultivo (Kc) estimados por Orgaz y Fereres en 1997 (0,55 en mayo, junio y septiembre y 0,50 en julio y agosto). Por último, el coeficiente reductor (Kr) que depende de la densidad y tamaño de los olivos, se calculó mediante la ecuación; Kr = 2 x π x D2 x N / 4,1 x 105, siendo D el diámetro medio de la copa de los olivos (m) y N la densidad de la plantación de olivos (olivos/Ha). (4) 125 FAO. La dosis de riego aplicada en este tratamiento fue incrementada un 25% respecto al tratamiento FAO, ya que en condiciones de baja cobertura del terreno, como es el caso de este olivar de baja densidad (70 olivos/Ha), las necesidades hídricas reales del olivar pueden ser ligeramente superiores a las calculadas mediante la metodología FAO. En la experimentación realizada se utilizó un diseño estadístico de bloques al azar con cuatro repeticiones de cada tratamiento de riego, lo que supuso un total de dieciséis bloques distintos. Cada bloque elemental estuvo compuesto por tres filas de cuatro olivos cada una (1728 m2), de los que se tomaron para los muestreos los dos olivos centrales de la fila intermedia. El ensayo se encontraba rodeado por dos filas de olivos en regadío que actuaban de bordes. La Figura 3.1 representa de forma esquemática el diseño estadístico utilizado en el olivar experimental.
Figura 3.1. Diseño estadístico utilizado en el olivar experimental Cornicabra de marco tradicional. Secano; RDI; FAO; 125 FAO; , olivo borde.
El suministro de las diferentes dosis de riego se realizó mediante portagoteros a lo largo de la línea de olivos, realizándose un bucle alrededor de cada árbol, donde se insertaron ocho goteros autocompensantes de 4 l/h. Al comienzo de cada parcela elemental se instaló un 38
3. Material y Métodos
contador con el fin de conocer la cantidad de agua suministrada, y un contador totalizador de cada tratamiento de riego. Destacar que, a excepción de las dosis de agua aplicadas a los olivos, el resto de las prácticas agronómicas y fitosanitarias fueron similares en toda la parcela. Las dosis de agua aplicadas en la campaña 2003 en cada tratamiento de riego fueron: 56 mm en RDI-1, 148 mm en FAO y 206 mm en 125 FAO. Para 2004: 60 mm en RDI-2, 124 mm en FAO y 154 mm en 125 FAO. Con la finalidad de describir el estado hídrico de los olivos sometidos a los distintos tratamientos de riego, se presentan en la Tabla 3.1 los valores de las integrales de estrés hídrico (SΨ) (MPa x día, según Myers, 1998), calculadas a partir de los datos de potencial hídrico del tronco obtenidos a mediodía, y el valor potencial hídrico mínimo registrado durante cada campaña. Tabla 3.1. Dosis de agua aplicada en cada tratamiento y distintos parámetros representativos del estrés hídrico de los olivos Cornicabra durante 2003 y 2004. Dosis agua aplicada (mm)
SΨ
(MPa x día)
Potencial hídrico de tronco mínimo (MPa)
SECANO
0,0
332
-4,1 (mediados de septiembre)
RDI-1
56,0
316
-4,1 (mediados de septiembre)
FAO
148,0
218
-2,3 (mediados de septiembre)
125 FAO
206,0
172
-1,8 (mediados de septiembre)
SECANO
0,0
269
-4,1 (mediados de octubre)
RDI-2
60,0
223
-2,9 (inicios de agosto)
FAO
124,0
176
-2,2 (finales de septiembre)
125 FAO
154,0
159
-1,7 (mediados de octubre)
2003
2004
* Datos proporcionados por el Dr. Alfonso Moriana (C.M.A. El Chaparrillo, Ciudad Real).
TOMA DE MUESTRA DEL FRUTO. Durante la campaña olivarera 2003/04 se realizaron cinco muestreos en distintos grados de maduración del fruto en cada uno de los dieciséis bloques en los que se dividía la parcela, de forma que fue posible estudiar no sólo el efecto de los distintos tratamientos de riego sobre el fruto y el aceite de oliva extraído, sino también la evolución de los distintos parámetros analíticos y de calidad a lo largo de la maduración del fruto. Los muestreos se efectuaron basándose en el grado de maduración del fruto, definido por la pigmentación de la piel de las aceitunas, correspondiéndose a los colores verde, pintona (al inicio y al final del envero), morada y negra. Por el contrario, durante la campaña 2004/05 se realizaron únicamente tres muestreos, correspondiéndose con la pigmentación pintona (inicio y final del envero) y morada del fruto.
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3. Material y Métodos
La recolección de las aceitunas en las dos campañas olivareras fue llevada a cabo mediante el sistema manual de ordeño desde noviembre hasta finales de diciembre. A excepción del quinto y último muestreo realizado en la primera campaña, que se llevó a cabo a mediados de enero utilizando un vibrador; sistema mecánico que agita los pies del olivo produciendo el desprendimiento de las aceitunas. Una vez recogidos los frutos, se procedió a su molturación inmediata en la Planta Piloto de Tecnología de Alimentos (UCLM), empleándose el sistema de extracción a escala de laboratorio Abencor (Abengoa S.A., Sevilla, España) (ver epígrafe 3.5). El aceite se almacenó en oscuridad en botellas de vidrio color topacio a 4º C y sin espacio de cabeza hasta su análisis.
3.2. PLANIFICACIÓN EXPERIMENTAL DEL RIEGO EN OLIVARES JÓVENES DE CUBIERTA INCOMPLETA (Olea europaea L. Cornicabra cv. y Morisca cv.). Este ensayo experimental fue llevado a cabo durante las campañas olivareras 2005/06, 2006/07 y 2007/08. Se utilizaron dos parcelas experimentales de las variedades Cornicabra y Morisca. El olivar Cornicabra estaba situado en la Finca “La Entresierra” (Ciudad Real) y es propiedad de la Consejería de Agricultura de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha. Fue plantado en 1999, con una superficie total de 3,2 hectáreas y un marco de plantación de 4,75 x 7,00 m2. El olivar de la variedad Morisca, situado en la Finca “La Orden” (Badajoz) y propiedad de la Consejería de Agricultura y Medio Ambiente de la Junta de Extremadura, fue plantado en 1998, con una superficie total de 1,0 hectárea y un marco de plantación de 6,00 x 4,00 m2. Ambas zonas presentan un clima continental-mediterráneo, aunque Badajoz muestra influencias atlánticas, debido a su proximidad a la costa portuguesa. La media anual de precipitaciones
es
de
404
mm
(Ciudad
Real)
y
475
mm
(Badajoz),
distribuidas
mayoritariamente fuera de la estación veraniega. Las precipitaciones registradas en Ciudad Real fueron 172 y 412 mm durante 2005 y 2006, respectivamente, y 324 y 199 mm a lo largo de 2006 y 2007 en Badajoz. Las lluvias durante el período de riego (desde mayo a septiembre) fueron alrededor de 27 y 95 mm en Ciudad Real (año 2005 y 2006, respectivamente), y 40 y 102 mm en Badajoz (año 2006 y 2007, respectivamente). A pesar de que las lluvias en este período en 2006 (Ciudad Real) y 2007 (Badajoz) fueron anormalmente altas, ambos olivares sufrieron los periodos de sequía propios de la estación veraniega.
ESTRATEGIAS DE RIEGO Y ORGANIZACIÓN DE LAS PARCELAS. Las estrategias de riego bajo estudio empleadas en ambas parcelas fueron las siguientes: (1) Tratamiento de riego basado en la metodología FAO. Fue utilizado como control, con el fin de evaluar la eficacia del resto de las estrategias evaluadas. Este método suministró dosis de 40
3. Material y Métodos
riego equivalentes al 100% de la evapotranspiración del cultivo (100% ETc), con el fin de reponer completamente el agua extraída del terreno por parte de los olivos. La evapotranspiración del cultivo se calculó, tal y como se ha explicado previamente en el apartado 3.1., mediante la ecuación ETc = ETo x Kc x Kr (Doorenbos y Pruitt, 1974). (2) Estrategia de riego basada en las Fluctuaciones del Diámetro del Tronco o, en inglés, Trunk Diameter Fluctuations (TDF). Las dosis de agua aplicadas dependieron de las medidas de la fluctuación diaria del diámetro de tronco, realizadas con dendrómetros (modelo DF 2.5; Solartron Metrology, West Sussex, UK), que tomaron datos con una frecuencia de 30 segundos y calcularon los valores medios cada 15 minutos. Los ciclos de TDF permitieron obtener dos índices: la Tasa de Crecimiento de Tronco (TCT), calculado como la pendiente obtenida a partir de los máximos diarios monitorizados y la Máxima Oscilación del Diámetro de Tronco (MOD), calculado como la diferencia entre el valor máximo y mínimo monitorizado cada día (Goldhamer and Fereres, 2001). En función de los trabajos de Moriana y Fereres (2003) se establecieron tres fases para la programación de la estrategia de riego y en cada una se adoptaron referencias diferentes: (a) Desde brotación hasta valor máximo de TCT igual a 0,15 mm/día. Se utilizó una ecuación que relaciona la TCT con la temperatura mínima (Tmin); TCT=-0,011 + 0,011 x Tmin
(1)
(b) Desde que se obtuvieron valores de TCT iguales a 0,15 mm/día hasta principios de Septiembre. Se aplicó el algoritmo de la Figura 3.2. (c) Desde Septiembre hasta las primeras lluvias de Otoño. Se usó la siguiente ecuación, que relaciona la TCT con la temperatura máxima (Tmax); TCT=-0,06 + 0,045 x Tmax
(2)
Las ecuaciones 1 y 2 fueron obtenidas a partir de los datos de TCT de Moriana y Fereres (2003) en relación con la temperatura. El crecimiento del tronco, representado por la TCT, es un factor más sensible al estrés hídrico del olivo que la MOD, por esa razón este último parámetro no se empleó en las fases a y c. La primera aplicación de riego se realizó cuando el valor de la medida TCT indicó estrés hídrico, es decir una TCT por debajo del valor marcado para la primera fase (0,15 mm/día) y la cantidad de agua aplicada en este primer riego fue estimada por el cálculo de la ETc entre las dos últimas fechas de medida. En los riegos sucesivos se incrementó o disminuyó un 10% la cantidad de agua aplicada en la fecha anterior según la TCT se encontraba por debajo o por encima del umbral establecido.
41
3. Material y Métodos
NO TCTi < TCTu
Disminuir 10% dosis de agua
SI Aumentar 10% dosis de agua
SI MODi < MODu
NO a=a+1
a=0
SI a=1 NO a=0
TCTu = TCTi
SI TCTi > TCTi-1 NO
NO
SI
NO
TCTi = TCTi-1 SI Mantener la dosis de agua
a=4
Figura 3.2. Algoritmo de decisión para la fase b del tratamiento TDF. Los subíndices “u” indican valores umbrales y los “i” valores actuales. Desarrollado por el Dr. Alfonso Moriana (C.M.A. El Chaparrillo, Ciudad Real).
La fase b de la programación de riego es la más larga. Investigaciones previas en olivares jóvenes indican que la sensibilidad de la MOD al estrés hídrico del árbol es pequeña, y que hay una influencia de la presencia del fruto y la edad del árbol en la TCT (Moriana y Fereres, 2002 y 2003). Para intentar integrar estos factores, se diseñó un algoritmo de decisión que se recoge en la Figura 3.2. El valor de TCT umbral (TCTu) en la fase b fue 0,15 mm/día. El valor de MOD se determinó por la recta de regresión entre este parámetro y el déficit de presión de vapor. La variable “a” es un contador que nos indica el número de veces que ocurre un evento.
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3. Material y Métodos
Como se ha dicho anteriormente, el crecimiento del olivo, representado por el parámetro TCT, se considera un factor más sensible al estrés hídrico que el MOD, por lo que si la TCT medida era superior a la TCTu se consideraba que el tratamiento estaba bien regado y se disminuía un 10% la aportación de agua. En el caso contrario, se comparaba el valor de MOD, de forma que si éste era superior al esperado se incrementaba un 10% el riego, ya que se suponía que éste era insuficiente. Si la MOD medida no era superior al esperado cabía la posibilidad de que este parámetro no fuera sensible al estrés hídrico o que los valores de TCT empleados como umbral fueran excesivamente altos. Si era la primera vez que ocurría esto (a=1) se incrementaba el riego un 10% para comprobar si había respuesta de los indicadores. Si no era así y este suceso había ocurrido en otras ocasiones (a>1), se comparaba la TCT obtenida en el periodo anterior con el actual; (i) si la TCT actual era mayor, implicaba que había habido una respuesta al incremento del riego y se incrementaba de nuevo otro 10%, (ii) si el valor de TCT actual era inferior que en el periodo anterior se suponía que existía un déficit hídrico en el olivo y se incrementaba la dosis de riego un 10%, (iii) si el valor de TCT actual era igual al medido en el período anterior, podría deberse a que el umbral empleado fuera mayor al umbral que le correspondería realmente al olivo, ya sea por edad o por carga de fruto, de forma que en este caso no habría variación en el aporte de agua y cuando los valores de TCT se estabilizasen en torno a ese valor (a=4) se usaría como nuevo valor umbral (ver Figura 3.2). (3) Programaciones de riego basados en el Potencial Hídrico del Tronco o, en inglés, Stem Water Potential (SWP). Las programaciones de riego se realizaron según los valores del potencial hídrico del tronco medidos con una cámara de presión (Soil Moisture Equip., Santa Barbara, CA, USA), utilizando hojas cercanas al tronco y cubiertas con papel de aluminio al menos una hora antes de efectuarse la medida (13:00 horas). Las dosis de agua aplicadas a los olivos durante el periodo de riego permitieron mantener las medidas del estado hídrico de los olivos en dos umbrales diferentes fijados al inicio del ensayo; -1,2 MPa (SWP -1,2), el cual no supuso ninguna condición de estrés hídrico en el árbol, y -2,0 MPa (SWP -2,0) que implicó condiciones hídricas ligeramente deficitarias. Las medidas de SWP se efectuaron dos veces por semana sobre doce olivos de referencia, de forma que el valor medio de las doce medidas se utilizaba para comparar con los umbrales establecidos previamente, iniciándose la aplicación de riego cuando la medida de potencial fuera inferior a dichos umbrales y tomando como dosis de agua inicial los valores de ETc obtenidos entre las dos ultimas fechas de medida. La sistemática de riego seguida en las fechas sucesivas supuso un incremento o un descenso de la dosis de riego de un 10%, en función de si el SWP medido estaba por encima o por debajo de los umbrales establecidos (en valores superiores a ±10%). Ambas parcelas utilizaron un diseño estadístico de bloques al azar con tres repeticiones de cada tratamiento de riego, lo que supuso un total de doce bloques distintos. Cada bloque elemental estuvo compuesto por cuatro filas de cuatro olivos cada una, de los que se tomaron
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3. Material y Métodos
para los muestreos los cuatro olivos centrales de las filas intermedias. El ensayo se encontraba rodeado por filas de olivos en regadío que actuaban de bordes. Las Figuras 3.3 y 3.4 representan de forma esquemática el diseño experimental utilizado en los olivares Cornicabra y Morisca de cubierta incompleta utilizados para la realización del ensayo.
Figura 3.3. Diseño estadístico utilizado en el olivar Cornicabra de cubierta incompleta. Localizado en la finca “La Entresierra” (Ciudad Real). SWP -2,0; SWP -1,2; FAO; TDF; , olivo borde.
Figura 3.4. Diseño estadístico utilizado en el olivar Morisca de cubierta incompleta. Localizado en la finca “La Orden” (Badajoz). SWP -2,0; SWP -1,2; FAO; TDF; , olivo borde.
El riego de las parcelas se realizó mediante portagoteros a lo largo de la línea de árboles, realizándose un bucle alrededor de cada olivo donde se insertaron cuatro goteros autocompensantes de 4 l/h, situados a un metro del tronco. El sistema de riego se surtía de un 44
3. Material y Métodos
pozo presente en cada una de las parcelas y disponía de un programador de riego y una bomba inyectora de fertilizantes. A excepción de las estrategias de riego descritas utilizadas, el resto de las prácticas agronómicas y fitosanitarias empleadas en los olivares fueron similares. Las dosis de agua aplicadas en cada una de las estrategias de riego a lo largo del ensayo están recogidas a modo de resumen en la Tabla 3.2. Con la finalidad de describir de manera más completa el estado hídrico de los olivos de las variedades Cornicabra y Morisca utilizados en cada tratamiento, esta tabla también muestra las integrales de estrés hídrico estacional (SΨ) y las integrales de estrés hídrico correspondiente al periodo DOY 229-277 (SΨ229-277) (MPa x día, según Myers, 1998), obtenidos a partir de los datos de potencial hídrico del tronco medidos a mediodía, además del potencial hídrico mínimo registrado en cada campaña. Tabla 3.2. Dosis de agua aplicada en cada tratamiento y distintos parámetros representativos del estrés hídrico de los olivos durante 2005, 2006 y 2007. (MPa x día)
SΨ229-277
(MPa x día)
Potencial hídrico de tronco mínimo (MPa)
125,0 70,1 179,5 28,9
94,6 98,7 75,0 161,6
26,0 28,8 19,2 43,1
-1,69 (mediados de agosto) -1,71 (mediados de agosto) -1,47 (inicios de sept.) -2,10 (mediados de sept.)
FAO
92,7
138,3
53,6
TDF
51,5
172,1
81,5
SWP -1.2
101,2
141,4
54,2
SWP -2.0
25,1
199,8
84,9
-1,75 (mediados de agosto) -2,10 (mediados de agosto y septiembre) -1,82 (mediados de agosto) -2,17 (mediados de agosto y septiembre)
FAO
408,9
197,6
82,3
TDF SWP -1.2
704,1 388,6
129,3 185,8
38,9 63,7
SWP -2.0
184,2
328,9
119,6
297,3 350,2 304,8 193,1
185,4 163,8 165,1 267,2
44,9 48,5 46,3 90,7
Dosis agua aplicada (mm)
SΨ
CORNICABRA ´05 FAO TDF SWP -1.2 SWP -2.0 CORNICABRA ´06
MORISCA ´06 -1,91 (inicios de agosto y mediados de septiembre) -1,28 (inicios de agosto) -1,71 (inicios de agosto) -2,71 (inicios de agosto y septiembre)
MORISCA ´07 FAO TDF SWP -1.2 SWP -2.0
-1,73 (mediados de sept.) -2,43 (inicios de sept.) -1,64 (mediados de sept.) -2,97 (inicios de sept.)
* Datos proporcionados por el Dr. Alfonso Moriana (C.M.A. El Chaparrillo, Ciudad Real) y la Dra. Henar Prieto (Centro de Investigación Finca La Orden, Badajoz).
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3. Material y Métodos
TOMA DE MUESTRA DEL FRUTO. Durante las campañas olivareras 2005/06, 2006/07 y 2007/08 se realizaron dos muestreos a distintos grados de maduración del fruto en cada uno de los doce bloques en los que se dividían ambas parcelas (3 bloques x 4 estrategias de riego). Los muestreos se efectuaron basándose en el grado de maduración del fruto, definido por la pigmentación de la piel de las aceitunas, correspondiéndose con los colores pintona (al final del envero), morada y negra. La recolección de las aceitunas en las tres campañas olivareras fue llevada a cabo mediante el sistema manual de ordeño desde mediados de octubre hasta mediados de noviembre. Una vez recogidos los frutos se procedió a su molturación inmediata mediante el sistema de extracción a escala de laboratorio Abencor (Abengoa S.A., Sevilla, España) (ver epígrafe 3.5). El aceite obtenido se almacenó en oscuridad en botellas de vidrio color topacio a 4º C y sin espacio de cabeza hasta su análisis. Por último, destacar la imposibilidad de obtener muestras de frutos de la variedad Cornicabra durante la campaña olivarera 2007/08 en Ciudad Real y de la variedad Morisca en la campaña 2005/06 en Badajoz, debido a factores ajenos al ensayo. Durante el 2007, el olivar Cornicabra sufrió importantes heladas a inicios de Octubre, produciéndose la pérdida total del fruto, y en el 2005, el olivar Morisca no presentó apenas producción debido a un espectacular “año de descarga”.
3.3. PLANIFICACIÓN EXPERIMENTAL DEL ESTUDIO DE COMPONENTES MINORITARIOS DEL FRUTO (Olea europaea L.) Y ACEITE DE OLIVA VIRGEN EN DIVERSAS VARIEDADES ESPAÑOLAS. Este estudio fue llevado a cabo durante la campaña olivarera 2005/06, las muestras necesarias para el mismo se obtuvieron de un olivar experimental situado en Almodóvar del Campo (Ciudad Real) y propiedad del C.M.A El Chaparrillo, Servicio de Investigación y Tecnología Agraria. El clima de la zona es continental-mediterráneo; con una precipitación media anual de 404 mm, mayoritariamente distribuida fuera de la estación veraniega. El olivar estaba formado por olivos de seis años de edad (marco 4,5 x 6,0 m2) de seis variedades españolas distintas: Arbequina, Cornicabra, Morisca, Picolimón, Picudo y Picual. Todo el olivar se encontraba en condiciones de no laboreo y sin ninguna aplicación de riego; la maleza era controlada mediante herbicidas post-surgimiento. Destacar que el hecho de obtener todas las muestras del ensayo a partir de un mismo olivar experimental, permitió estudiar el efecto de las variables “variedad” e “índice de madurez” sobre los componentes minoritarios de frutos desarrollados en el mismo área geográfica, bajo la mismas condiciones agronómicas y pedoclimáticas.
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3. Material y Métodos
TOMA DE MUESTRAS EN EL ENSAYO. Se realizaron tres muestreos distintos a lo largo de la maduración del fruto en todas las variedades del olivar. El grado de maduración se determinó en función de la pigmentación de la piel, correspondiéndose con los colores verde, pintona y negra. La recogida del fruto se realizó mediante la técnica manual de “ordeño”, tomándose dos muestras representativas de cada variedad para cada etapa de maduración, las cuales eran inmediatamente congeladas mediante nitrógeno líquido y posteriormente almacenadas a -70 ºC hasta la realización de los análisis correspondientes. Se realizaron dos muestreos adicionales con el fin de obtener muestras de aceite de oliva virgen de cada variedad a partir de frutos inmaduros (pigmentación de la piel verde-amarillenta y pintona) y maduros (pigmentación de la piel morada y negra). Las muestras de aceite se obtuvieron mediante el sistema de molturación Abencor (Abengoa S.A., Sevilla, Spain), que como se ha comentado previamente permite la extracción de aceite de oliva virgen a escala de laboratorio (epígrafe 3.5). El aceite obtenido se almacenó en oscuridad en botellas de vidrio color topacio a 4º C y sin espacio de cabeza hasta su análisis.
3.4. PLANIFICACIÓN EXPERIMENTAL DEL ESTUDIO DE LOS COMPONENTES MINORITARIOS DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN (Cornicabra cv.) DURANTE EL BATIDO. El estudio del efecto que determinadas variables tecnológicas durante el batido de la pasta de aceituna tienen sobre la composición minoritaria del aceite de oliva virgen, se llevó a cabo durante la campaña olivarera 2005/06, utilizando dos lotes de frutos distintos (Olea europaea L. Cornicabra cv.) de aproximadamente 1600 Kg cada uno de ellos, con un índice de madurez de 4,5 y 4,7 (ver apartado 3.6), respectivamente. La realización de este ensayo tecnológico se llevó a cabo en las instalaciones de la Almazara Experimental (modelo Fattoria, Pieralisi España S.L.), ubicada el la Finca Galiana (Ciudad Real) y propiedad de la Universidad de Castilla-La Mancha, con una capacidad máxima de trabajo de 200 Kg/h de pasta de aceituna, lo que supone una producción de aceite de oliva virgen de unos 50 Kg/h. En la experimentación realizada también se empleó el sistema de molturación Abencor (Abengoa S.A., Sevilla, España) (epígrafe 3.5).
CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS DE LA ALMAZARA EXPERIMENTAL. La Almazara Experimental utilizada reproduce a escala piloto las instalaciones de una almazara industrial de grandes proporciones, de hecho se encuentra dividida físicamente en tres zonas diferenciadas; (a) zona de recepción y lavado de las aceitunas, (b) zona de molturación, batido 47
3. Material y Métodos
y centrifugación de las pastas de aceituna y (c) zona de almacenamiento del aceite de oliva virgen obtenido. (a) La zona de recepción de la materia prima está formada por una tolva de recepción con una capacidad de 400 Kg y que está conectada mediante una cinta transportadora ascendente a una deshojadora, que permite la eliminación de los restos vegetales de menor peso que las aceitunas, tales como hojas y pequeñas ramitas. A continuación, se encuentra la lavadora (modelo I10) conectada a la red pública de aguas y que permite una limpieza profunda de los frutos, eliminando polvo, barro o restos de mayor peso que las aceitunas que pueden acompañar a la materia prima, como son pequeñas piedras procedentes de las redes donde caen las aceitunas tras su recogida bien por vareo, o por la acción de los vibradores mecánicos. (b) En la zona de molturación se encuentra un molino de martillos de tipo vertical, que presenta una potencia de 11 KW. La etapa de batido se lleva a cabo en una batidora de dos cuerpos (modelo 7+7, potencia; 1,5 KW), con una capacidad total de 500 Kg de pasta de aceituna, está provista de aspas o brazos de acero inoxidable que permiten el movimiento de la pasta y de sondas de temperatura que permiten el control de temperatura de la misma durante el batido. La separación sólido-líquido se realiza mediante un decanter o centrífuga horizontal (modelo Baby I, potencia; 7,5 KW), con una capacidad de trabajo de 200 Kg/h de pasta de aceituna, que es trasegada a este equipo desde la batidora por la acción de una bomba de trasiego (modelo p40-p40, potencia; 0,55 KW). La fase líquida obtenida es recogida en un depósito de acero inoxidable, equipado en su parte superior con un vibrofiltro que elimina los posibles restos sólidos del producto. Posteriormente se procede a la separación de la fase oleosa de las aguas de vegetación del fruto, para ello se utiliza una centrífuga vertical constituida por 60 platos (modelo Cucciolo, potencia; 1,85 KW), equipada con una bomba autoaspirante (modelo Hydra, potencia; 0,25 KW), que lleva el aceite desde el depósito hasta la centrífuga.
48
3. Material y Métodos
(c) Posteriormente el aceite de oliva virgen obtenido es trasegado hacia la zona de almacenamiento. Esta se encuentra equipada con depósitos de acero inoxidable de fondo cónico (100 L de capacidad) y llave de purga, que permiten la decantación natural del producto durante unas 24 horas y la posterior eliminación de posibles restos de aguas de vegetación. Una vez realizada la purga del depósito, el producto final es trasvasado a depósitos de acero inoxidable con fondo plano (300, 100 y 50 L de capacidad) para su almacenamiento, evitando que exista espacio de cabeza en el depósito y se favorezca los procesos oxidativos del aceite.
OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DEL ENSAYO. Las variables tecnológicas bajo estudio en este trabajo experimental han sido la temperatura y el tiempo de batido de la pasta de aceituna y, como se ha explicado previamente, el estudio de su efecto sobre la composición minoritaria del aceite de oliva virgen. Se realizaron diversos ensayos en la almazara experimental utilizando diferentes condiciones de temperatura (20 ºC, 28 ºC y 40 ºC) y tiempo (30 min, 60 min y 90 min) de batido, procesándose en cada caso lotes de 200 Kg de aceitunas. Las muestras de aceite de oliva virgen obtenidas fueron recogidas a la salida de la centrífuga horizontal, filtradas a través de papel jarabe y almacenadas en oscuridad en botellas de vidrio topacio a 10ºC hasta la realización de los correspondientes análisis. Para el estudio de la evolución de los compuestos fenólicos y volátiles durante el proceso de batido también se recogieron muestras de fruto (100 g) y de pasta de aceituna (100 g) a lo largo de esta etapa a los tiempos correspondientes a los percentiles 25, 50 y 75 de cada ensayo. También se recogieron diversas muestras de orujo para analizar la composición fenólica retenida en la fase sólida tras la centrifugación de la pasta de aceituna. Todas estas muestras fueron congeladas y almacenadas a -70 ºC hasta su correspondiente análisis. Como ya se indicó previamente, además de los ensayos realizados en la Almazara Experimental, se llevaron a cabo pruebas adicionales a diferentes condiciones de temperatura y tiempo de batido con el sistema de extracción a escala de laboratorio Abencor, utilizando los mismos lotes de aceituna y que tuvieron como finalidad (i) comparar los datos obtenidos en la almazara y (ii) ampliar las condiciones de temperatura - tiempo de batido estudiadas en este trabajo experimental. La Tabla 3.3 muestra de forma esquemática las diferentes combinaciones de temperaturatiempo de batido utilizadas en este ensayo, tanto en la Almazara Experimental, como con el sistema Abencor.
49
3. Material y Métodos
Tabla 3.3. Combinaciones de temperatura - tiempo de batido utilizadas en el ensayo tecnológico. 20 ºC 15 min 30 min 45 min 60 min 75 min 90 min
□ ■ □ ■
24 ºC
□
28 ºC □ ■,□ □ ■,□ □ ■,□
35 ºC
□
40 ºC □ ■ □ ■
■, Pruebas realizadas en la almazara experimental; □, Pruebas realizadas con sistema Abencor.
3.5. ELABORACIÓN DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN CON EL SISTEMA ABENCOR. Este método reproduce a escala de laboratorio el procedimiento industrial habitual siguiendo las fases de molienda, batido, centrifugación y decantación (Martínez et al., 1975). El equipo consta de tres elementos básicos; un molino de martillos, una termobatidora y una centrífuga de pastas. El molino de martillos está construido de acero inoxidable y gira a una velocidad de 3000 r.p.m. La termobatidora consta de un baño de agua en su parte inferior, cuya temperatura está regulada mediante un termostato, y en la parte superior un sistema de paletas de acero inoxidable que gira a 50 r.p.m. y que permite el batido simultáneo de hasta ocho muestras de pasta de aceituna. La centrífuga de pastas es de tipo “cesta”, está construida de acero inoxidable y gira a 3500 r.p.m. El procedimiento experimental que se utiliza para la obtención del aceite de oliva virgen mediante este sistema consiste en molturar las aceitunas sanas, una vez limpias, lavadas y secas, en el molino de martillos. Posteriormente se homogeneiza la pasta obtenida y se procede al batido de la misma en cazos de acero inoxidable, en cada uno de los cuales se pesan 700 g de pasta, durante 20 minutos a 30 ºC. A continuación se añaden 100 ml de agua caliente y se continúa batiendo 10 minutos más. En el caso de pastas difíciles se añade microtalco natural en una cantidad adecuada (1,5-2,0 %) para romper la emulsión que pudiera formarse. Terminado el batido, se somete la pasta a centrifugación y se recoge el mosto oleoso en una probeta graduada. Con el fin de recuperar la máxima cantidad de aceite del retenido en la pasta, se añade una pequeña cantidad de agua y se centrifuga de nuevo, recogiendo el líquido separado en una probeta.
50
3. Material y Métodos
Una vez separadas las aguas de vegetación, el aceite de oliva virgen se recoge y se filtra a través de papel “jarabe”. El aceite filtrado se recoge en una botella de vidrio de color topacio y se almacena sin espacio de cabeza en nevera a 4 ºC hasta el momento de su utilización.
3.6. MÉTODOS ANALÍTICOS EMPLEADOS EN EL ANÁLISIS DEL FRUTO. Índice de madurez. Para la determinación del grado de maduración de las aceitunas se utiliza la escala propuesta por la Estación experimental Venta del Llano en Menjíbar (Uceda y Frías, 1975), que consiste en tomar del conjunto de frutos unas 100 aceitunas de forma aleatoria y clasificarlas en siete grupos diferentes en función del color de piel y pulpa de las mismas, según las características que se exponen a continuación: Grupo 0.- Piel verde intensa. Grupo 1.- Piel verde amarillenta. Grupo 2.- Piel verde con manchas rojizas (inicio del envero). Grupo 3.- Piel rojiza o morada (terminación del envero). Grupo 4.- Piel negra con pulpa blanca. Grupo 5.- Piel negra con menos de la mitad de la pulpa morada. Grupo 6.- Piel negra con la mitad o más de la pulpa morada. Grupo 7.- Piel negra con toda su pulpa morada. El índice de madurez se obtiene multiplicando el número de aceitunas incluidas en cada grupo por el número del grupo correspondiente, se suman los valores obtenidos y se divide por el número de frutos total.
Rendimiento graso obtenido con el equipo Abencor. Una vez extraído el aceite a través del equipo Abencor se decanta en una probeta graduada y se mide el volumen de aceite obtenido. El rendimiento graso de las aceitunas se obtiene aplicando la fórmula siguiente: Rendimiento (%) =
91 , 5 ⋅ V P
siendo V, el volumen de aceite obtenido (ml) y P, la cantidad de pasta de aceituna utilizada (g).
51
3. Material y Métodos
Rendimiento graso de la pasta de aceituna. Se ha utilizado el método Soxhlet para determinar la riqueza grasa total en pasta de aceituna. Este procedimiento se basa en la extracción de la grasa presente en una muestra totalmente desecada al ponerse en contacto con un disolvente orgánico, generalmente éter de petróleo o hexano. La fracción recogida es sometida a calefacción para eliminar el disolvente residual, quedando en el matraz solamente la grasa extraída de la pasta de aceituna (Norma UNE 55032). La riqueza grasa referida a materia seca se calcula mediante la fórmula: RGMS (%) =
100 ⋅ P ( mt + g ) ⋅ P ( mt ) P ( ms )
siendo P(mt+g) el peso del matraz con la grasa extraída (g), P(mt) el peso del matraz seco y vacío y P(ms) el peso de muestra seca empleado en la extracción (g).
Determinación de compuestos fenólicos en fruto. El procedimiento consiste en obtener en primer lugar la fracción fenólica del fruto mediante extracción sólido-líquido, para posteriormente analizarla mediante cromatografía liquida de alta eficacia (HPLC) a través de una columna C18 y empleando como sistema de detección la absorción en el ultravioleta-visible (UV-Vis). La obtención del extracto fenólico se realiza homogenizando la muestra de pulpa (4,0 g) con una mezcla de metanol:agua (80:20 v/v, 40 ml) con el homogeneizador Ultraturrax (14000 rpm, 2 min). La suspensión obtenida se agita durante 20 minutos a una velocidad de 250 rpm sobre un baño de hielo, para ser posteriormente centrifugada durante 10 minutos a una velocidad de 5000 rpm y una temperatura de 4 ºC. La fase hidrometanólica se recupera y se hace pasar a través de un filtro de jeringa de nylon (0,45 µm) para su posterior análisis cromatográfico. Para realizar la separación de los compuestos fenólicos se utiliza un equipo HPLC Agilent serie 1100 con detector ultravioleta-visible de diodos (DAD). La columna utilizada es una Zorbax SBC18 con tamaño de partícula de 5 µm y dimensiones 250 x 4,6 mm (Agilent Technologies, USA). La temperatura de análisis es de 30 ºC, y el volumen de inyección es de 20 µl. La separación de los fenoles se logra mediante una elución en gradiente con una mezcla de aguaácido acético 95:5 (v/v), metanol y acetonitrilo, cuyo esquema se recoge en la Tabla 3.4. Los cromatogramas se adquieren a diferentes longitudes de onda; 280, 340 y 520 nm. El hidroxitirosol, oleuropeína, demetiloleuropeína se cuantifican a 280 nm, los antocianos a 520 nm y el verbascósido, los flavonoles y flavonas a 340 nm. La cuantificación se realiza por interpolación del área de cada pico en rectas de calibrado de cinco puntos obtenidas en base a la disolución de las sustancias estándar correspondientes (Sigma Chemical Co. y
52
3. Material y Métodos
Extrasynthèse) en metanol:agua (80:20, v/v), exceptuando el hidroxitirosol, que se cuantifica como tirosol, y la demetiloleuropeína y los antocianos como oleuropeína. Tabla 3.4. Gradiente de disolventes empleado durante la separación cromatográfica de los fenoles de la pulpa de aceituna. Tiempo (min)
H2O-ácido acético (%)
Metanol (%)
Acetonitrilo (%)
Flujo (ml/min)
0 50 52 65 68 72
95,0 34,0 0,0 0,0 95,0 95,0
2,5 33,0 100,0 100,0 2,5 2,5
2,5 33,0 0,0 0,0 2,5 2,5
1,0 1,0 1,0 1,0 0,6 1,0
La identificación de los compuestos fenólicos se realiza por comparación de los tiempos de retención, características de absorción en el UV-Vis y espectros obtenidos mediante LC-MS de sustancias estándar. La demetiloleuropeína y los antocianos se identificaron mediante sus características UV-Vis y sus espectros de masas. El detector de masas utilizado ha sido un LCQ Deca XP Plus (Thermo Electron Corporation, Waltham, USA) equipado con un sistema de ionización electrospray. El nitrógeno utilizado como gas nebulizador se introduce con un flujo de 14 unidades. La temperatura y el voltaje del capilar han sido 250 ºC y 4,50 KV, respectivamente. Los datos fueron adquiridos en el modo de ionización negativo. Los experimentos de fragmentación se realizaron utilizando helio como gas de colisión, con una energía del 30-40%. La Tabla 3.5 recoge los valores de absorción en el UV-Vis, así como la relación masa/carga (m/z) del ión molecular y los fragmentos característicos obtenidos para cada uno de los compuestos fenólicos identificados en la pulpa de aceituna. Tabla 3.5. Características UV-Vis y relación m/z de los compuestos fenólicos identificados en la pulpa de aceituna. Pico
TR (min)
UV-visible λmax (nm)
Ión Molecular [M-H] (m/z)
Fragmentos (ESI -) (m/z)
PM
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
6,1 19,0 27,2 20,5 20,8 21,1 24,1 24,7 12,2 13,0
230, 280 230, 282 230, 282 257, 358 340 255, 350 256, 350 268, 335 520 520
153 525 539 609 623 447 447 431 447 593
---481, 345, 319 377, 345, 307, 275 301, 271, 179 461, 315 285 301, 271, 179 269 285 285
154 526 540 610 624 448 448 432 448 594
Compuesto identificado hidroxitirosol demetiloleuropeína oleuropeína quercetín-3-rutinósido verbascósido luteolín-7-glucósido quercetín-3-ramnósido apigenín-7-glucósido cianidín-3-glucósido cianidín-3-rutinósido
53
3. Material y Métodos
En la Figura 3.5 se muestra, a modo de ejemplo, un cromatograma de los compuestos fenólicos presentes en la pulpa del fruto de la variedad Cornicabra.
3
mAU 250
280 nm
200 150
1
100 50
2
0
5
mAU 80
10
15
20
25
30
35
min
4 5
340 nm
60
6
40
8 7
20 0 -20
5
mAU 30
10
520 nm
15
20
25
30
35
min
15
20
25
30
35
min
10
20
9
10 0
5
10
Figura 3.5. Cromatograma de los compuestos fenólicos de la pulpa del fruto variedad Cornicabra. 1, 3,4-DHPEA (hidroxitirosol); 2, demetiloleuropeína; 3, oleuropeína; 4, quercetín-3-rutinósido; 5, verbascósido; 6, luteolín-7-glucósido; 7, quercetín-3-ramnósido; 8, apigenín-7-glucósido; 9, cianidín-3glucósido; 10, cianidín-3-rutinósido.
3.7. MÉTODOS ANALÍTICOS EMPLEADOS EN EL ACEITE DE OLIVA VIRGEN. Grado de acidez. El grado de acidez de un aceite es el contenido en ácidos grasos libres presentes, expresados en tanto por ciento en peso de ácido oleico, el mayoritario del aceite de oliva. La determinación se realiza mediante valoración de la muestra, previamente disuelta en éter etílico-etanol 96º (1:1 v/v), con una disolución etanólica de potasa de concentración exactamente conocida (0,1 ó 0,5 N) utilizando fenolftaleína como indicador (CEE 2568/91). El grado de acidez o acidez libre del aceite de oliva se calcula a partir de la siguiente expresión: Grado de acidez =
54
282⋅V ⋅ N 10 ⋅ P
3. Material y Métodos
en donde V es el volumen de disolución de KOH gastado en la valoración (ml), N es la normalidad exacta de la disolución de KOH y P es el peso de la muestra de aceite (g).
Índice de peróxidos. El índice de peróxidos es el método químico más común para determinar el grado de deterioro oxidativo de las grasas y aceites. Los resultados se expresan como miliequivalentes de oxígeno activo por kilogramo de aceite que producen la oxidación del yoduro a yodo en unas condiciones determinadas (CEE 2568/91). En la reacción, que tiene lugar en medio ácido, se libera un mol de yodo por cada mol de oxígeno peroxídico presente en la muestra de aceite. El yodo liberado se valora con una disolución de tiosulfato sódico de concentración exactamente conocida (0,002 ó 0,01 N) utilizando almidón como indicador. Paralelamente se debe realizar una prueba en blanco, sin aceite, para conocer el estado de los reactivos y la limpieza del material empleado en la determinación analítica. El índice de peróxidos (IP) del aceite se calcula a partir de la expresión: Índice de peróxidos =
(V − Vo) ⋅ N ⋅1000 P
en donde V es el volumen de disolución de tiosulfato empleado en la valoración (ml), V0 es el volumen de la misma disolución utilizado en el ensayo en blanco (ml), N es la normalidad exacta de la disolución de tiosulfato sódico empleada y P es el peso de la muestra (g).
Absorción de radiación ultravioleta (K232 y K270). La medida de absorción en el UV de una disolución de aceite en ciclohexano permite valorar su estado de deterioro oxidativo. Durante la autooxidación de los ácidos grasos poliinsaturados se forman hidroperóxidos que en su estructura contienen dobles enlaces conjugados los cuales absorben radiación en torno a una longitud de onda de 232 nm. Estos compuestos evolucionan con el tiempo dando lugar a otros como las diacetonas o, en el caso de los hidroperóxidos de ácidos grasos poliinsaturados, a sistemas con tres dobles enlaces conjugados. Estos productos secundarios, procedentes de la degradación de los hidroperóxidos, tienen la característica de absorber radiación UV entorno a los 270 nm. Los coeficientes de extinción de la muestra disuelta en ciclohexano se han determinado según el Reglamento de la Unión Europea (CEE 2568/91), utilizando un espectrofotómetro Agilent 8453. El coeficiente de extinción a una longitud de onda λ (Kλ) se calcula a partir de la expresión: Kλ =
Eλ C ⋅e
55
3. Material y Métodos
en donde Eλ es la extinción medida en el espectrofotómetro a dicha longitud de onda, C es la concentración de la disolución de aceite (g/100 ml) y e es el paso óptico de la cubeta (cm).
Pigmentos clorofílicos y carotenoideos. Los pigmentos clorofílicos y los carotenoides se han determinado según el método propuesto por Mínguez-Mosquera et al. (1991) empleando un espectrofotómetro Agilent 8453. El método analítico se basa en la capacidad de absorción de los pigmentos clorofílicos y carotenoides a 670 y 472 nm, respectivamente, de la muestra de aceite previamente disuelta en ciclohexano. El contenido de pigmentos se expresa en mg/kg a partir de las siguientes expresiones: Clorofilas =
A670 ⋅ V f E1% ⋅ P
Carotenoides =
⋅ 10000
A472 ⋅ V f E1% ⋅ P
⋅ 10000
siendo A670 y A472 la absorbancia medida a 670 y 472 nm respectivamente, Vf el volumen final de ciclohexano, E1% el coeficiente de extinción de clorofilas y carotenoides, igual a 613 y 2000, respectivamente, y P el peso de la muestra (g).
Composición en ácidos grasos. La composición en ácidos grasos del aceite de oliva se expresa como porcentaje de área de sus ésteres metílicos. El procedimiento consiste en realizar la hidrólisis de los triglicéridos y la transesterificación de los ácidos grasos obtenidos para dar lugar a los ésteres metílicos correspondientes. Posteriormente se procede a la separación de los ésteres metílicos formados por cromatografía de gases (GC) en columna capilar. El protocolo seguido para la formación de los ésteres metílicos en frío es una modificación del método A.O.C.S. Ch 1-91 correspondiente al Reglamento Europeo EU 796/2002. El procedimiento consiste en disolver en hexano (3 ml) una muestra de aceite (0,5 g). A continuación se añaden 0,5 ml de KOH metanólica 2 N, se agita enérgicamente durante 1 minuto y se deja reposar hasta la perfecta separación de las fases. La disolución sobrenadante que contiene los ésteres metílicos de los ácidos grasos es posteriormente inyectada en el cromatógrafo de gases. Para la separación de los ésteres metílicos de los ácidos grasos se ha seguido el método recogido en el Anexo X”A” del Reglamento CEE 2568/91. En la determinación se utilizó un cromatógrafo de gases Agilent serie 6890 equipado con un detector de ionización de llama (FID). La columna capilar empleada en la separación ha sido una SGL-1000 (Sugelabor,
56
3. Material y Métodos
España), con fase estacionaria de polietilenglicol acidificado (100%) y de dimensiones 50 m x 0,25 mm x 0,25 µm. Como gas portador se emplea helio con un flujo de 1 ml/min, el volumen de inyección de muestra es de 1 µl y la relación de split es 50:1. Durante el análisis la temperatura del inyector y el detector es de 250 ºC y el horno se mantiene a 210 ºC. El contenido de cada uno de los ésteres metílicos de los ácidos grasos (AGi) se expresa como porcentaje del total, calculándose de acuerdo a la siguiente expresión: AGi =
Ai ⋅ 100 AT
en la que Ai es el área de pico correspondiente al éster metílico del ácido graso “i” y AT es el área total correspondiente a la suma de todos los ésteres metílicos. En la Figura 3.6 se muestra, a modo de ejemplo, un cromatograma de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de un aceite de oliva virgen de la variedad Cornicabra. pA 1
160
6
7
140 120 100 5
80 60 2
40
8 20
9
34
10
11
0 2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 3.6 Cromatograma de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de un aceite de oliva virgen Cornicabra. 1, ácido palmítico (C16:0); 2, ácido palmitoleico (C16:1); 3, ácido margárico (C17:0); 4, ácido margaroleico (C17:1); 5, ácido esteárico (C18:0); 6, ácido oleico (C18:1); 7, ácido linoleico (C18:2); 8, ácido linolénico (C18:3); 9, ácido araquídico (C20:0); 10, ácido gadoleico (C20:1); 11, ácido behénico (C22:2).
Determinación de compuestos fenólicos en aceite de oliva virgen. Se ha realizado de acuerdo con el protocolo propuesto por Mateos et al. (2001). En primer lugar se extrae la fracción fenólica del aceite mediante extracción en fase sólida (SPE) y posteriormente se procede a su análisis cromatográfico a través de una columna C18, similar a la utilizada en la separación de los compuestos fenólicos del fruto. Como sistema de
57
3. Material y Métodos
cuantificación se ha elegido el método del patrón interno, utilizándose en este caso el ácido siríngico (Sigma Chemical Co.). Para la obtención del extracto fenólico se toman 2,5 g de muestra, se añaden 250 µl de una disolución (15 ppm) de patrón interno en metanol y se lleva a un evaporador rotativo a vacío (Büchi R-114) con el fin de eliminar el disolvente. Posteriormente, el aceite se disuelve en 6 ml de hexano y se hace pasar por una columna de extracción en fase sólida, con un volumen de 3 ml y un relleno de 0,5 g de fase diol (Supelco Inc., USA), que previamente ha sido acondicionada con 6 ml de metanol y 6 ml de hexano. A continuación, la columna SPE se lava con 6 ml de hexano y 4 ml de hexano-acetato de etilo 85:15 (v/v) para eliminar los posibles restos de grasa y otros compuestos ligeramente polares que pudieran contaminar el extracto. La elución del extracto fenólico se realiza por paso a través de la columna de tres volúmenes de 5 ml de metanol que se recogen en un solo matraz. A continuación, el extracto fenólico se lleva a sequedad en el evaporador rotativo a vacío a una temperatura no superior a 35 ºC. Una vez concentrado hasta sequedad, el residuo se disuelve en 250 µl de metanol-agua 50:50 (v/v), para su posterior análisis cromatográfico. La separación y detección de los fenoles del aceite de oliva se realiza en el mismo equipo HPLC y en condiciones similares a las utilizadas con la pulpa de aceituna. Los cromatogramas se adquieren a las longitudes de onda de 240, 280 y 335 nm, para la cuantificación se utilizan solamente los datos obtenidos a 280 nm, mientras que el resto se usan con fines cualitativos. Para la cuantificación se recurre al empleo del patrón interno, en este caso ácido siríngico, y por tanto la concentración de los compuestos (Ci) se expresa en miligramos de ácido siríngico por kilogramo de aceite, calculándose de acuerdo con la siguiente expresión:
Ci =
C PI ⋅ Ai API
donde CPI es la concentración del patrón interno en el aceite (mg/kg) y Ai y API son las áreas del compuesto fenólico de interés y el patrón interno respectivamente. Posteriormente se emplean los factores de respuesta corregidos a partir de los datos publicados por Mateos et al. (2001) y que se muestran en la Tabla 3.6 de acuerdo a la siguiente expresión:
C F = C i ⋅ FR donde CF es la concentración de compuesto fenólico en cuestión (mg/kg), Ci es la concentración de dicho compuesto fenólico expresada como miligramos de ácido siríngico por kilogramo de aceite y FR es el factor de respuesta.
58
3. Material y Métodos
Tabla 3.6. Factores de respuesta* respecto al ácido siríngico de los principales fenoles presentes en el aceite de oliva virgen. Compuesto
TR (min)
Factor de respuesta (FR)
Hidroxitirosol Tirosol Ácido vanílico Vainillina Ácido p-cumárico 3,4-DHPEA-AC Ácido ferúlico 3,4-DHPEA-EDA p-HPEA-AC p-HPEA-EDA Pinorresinol 1-acetoxipinorresinol Ácido t-cinámico 3,4-DHPEA-EA p-HPEA-EA
6,1 9,8 12,1 16,1 17,8 18,8 20,3 24,0-26,0 29,2 29,8 30,4 31,0 31,0 34,4 38,7
3,947 5,065 1,259 0,770 0,648 4,814 3,311 7,961 6,678 11,260 1,240 3,568 0,348 9,696 12,959
* Calculados a partir de los factores de respuesta respecto al ácido p-hidroxifenilacético publicados por Mateos et al. (2001)
En la Figura 3.7 se muestra un cromatograma típico de los compuestos fenólicos que se pueden encontrar en un aceite de oliva virgen a una longitud de onda de 280 nm. mAU 13
600 8
500
400 10
1 300
14 200 2 100
12 11
P.I. 3
4
0 5
10
15
5 6
7 20
9 25
30
35
40
45
min
Figura 3.7. Cromatograma de los compuestos fenólicos de un aceite de oliva virgen Cornicabra. 1, 3,4-DHPEA (hidroxitirosol); 2, p-HPEA (tirosol); 3, ácido vanílico; P.I., ácido siríngico; 4, vainillina; 5, ácido p-cumárico; 6, 3,4-DHPEA-AC; 7, ácido ferúlico; 8, 3,4-DHPEA-EDA decarboximetilada+carboximetilada; 9, p-HPEA-AC; 10, p-HPEA-EDA; 11, pinorresinol; 12, 1acetoxipinorresinol+ácido t-cinámico; 13, 3,4-DHPEA-EA; 14, p-HPEA-EA.
59
3. Material y Métodos
Determinación de oleocantal por HPLC. El contenido en oleocantal se ha determinado mediante el método desarrollado por Impellizeri et al. (2006), realizando primero una extracción líquido-líquido del compuesto de interés y su posterior determinación cromatográfica en una columna C18. Como sistema de cuantificación se ha elegido el método del patrón interno, en este caso de 3,5-dimetoxifenol (Sigma Chemical Co.). Para la obtención del extracto se toma 1,0 g de muestra, se añaden 250 µl de una disolución (200 ppm) de patrón interno en metanol y se lleva a un evaporador rotativo a vacío para eliminar el disolvente. Posteriormente, el aceite se disuelve en 2 ml de hexano y se pasa a un tubo de centrífuga (15 ml), al que se adicionan 5 ml de acetonitrilo y se agita con ayuda de un vórtex durante 15 s para favorecer la extracción del oleocantal, a continuación se centrifuga (4000 rpm, 5 min) para separar el solvente de la fase oleosa. Este procedimiento se repite tres veces, y el solvente del extracto obtenido se elimina mediante flujo de N2. Una vez concentrado hasta sequedad, el residuo se disuelve en 1 ml de metanol-agua 50:50 (v/v), y se adiciona 1 ml de hexano con el fin de eliminar las posibles restos de aceite, este proceso se repite tres veces. El tubo se centrifuga y se recupera la fase metanólica para su posterior análisis cromatográfico. Para realizar la separación del oleocantal se utiliza un equipo HPLC Agilent serie 1100 equipado con un detector ultravioleta-visible de diodos (DAD). La columna empleada en la separación es una Zorbax SB-C18 con tamaño de partícula de 5 µm y dimensiones 250 x 4,6 mm (Agilent Technologies, USA). La temperatura de análisis es de 25 ºC, y el volumen de inyección es de 20 µl. La separación de los fenoles se logra mediante una elución en gradiente con una mezcla de acetonitrilo y agua, cuyo esquema se recoge en la Tabla 3.7. Los cromatogramas se adquieren a la longitud de onda de 280 nm y a modo de ejemplo se presenta uno de ellos en la Figura 3.8. Tabla 3.7. Gradiente de disolventes empleado durante la separación cromatográfica de los fenoles de la pulpa de aceituna. Tiempo (min)
H2O (%)
Acetonitrilo (%)
Flujo (ml/min)
0 35 35,01 45 45,01 55
75 75 20 20 75 75
25 25 80 80 25 25
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Para la cuantificación se recurre al empleo del patrón interno, en este caso 3,5-dimetoxifenol, y por tanto la concentración de oleocantal (Co) se expresa en miligramos de 3,5-dimetoxifenol por kilogramo de aceite, calculándose de acuerdo con la siguiente expresión:
60
3. Material y Métodos
CO =
C PI ⋅ AO API
donde CPI es la concentración del patrón interno en el aceite (mg/kg) y AO y API son las áreas del oleocantal y el patrón interno respectivamente. mAU 40
30
20
Oleocantal Forma cis
Forma trans
10
0 0
5
10
15
20
25
30
min
Figura 3.8. Cromatograma obtenido en la determinación del contenido en oleocantal de un oliva virgen de la variedad Cornicabra.
Índice de amargor (K225). El índice de amargor se ha determinado según el método propuesto por Gutiérrez et al. (1994) empleando un espectrofotómetro Agilent modelo 8453. El procedimiento analítico consiste en la extracción de los compuestos amargos de la muestra de aceite disuelta en hexano mediante extracción en fase sólida (SPE), utilizando un columna de tipo C18 (Supelco Inc., USA) y su posterior elución utilizando una mezcla de metanol-agua 1:1 (v/v), cuya absorbancia se mide a 225 nm. Por definición, el parámetro K225 es la absorbancia de un extracto obtenido a partir de 1 g de aceite en 100 ml de disolvente de elución en las condiciones descritas. Por tanto:
K225 =
A225 ⋅ V 100 ⋅ P
siendo P el peso de la muestra (g), A225 la absorbancia del extracto medido a 225 nm y V el volumen de extracto (ml).
61
3. Material y Métodos
Determinación de tocoferoles por HPLC. Los tocoferoles se han determinado por cromatografía líquida de alta eficacia, según el método de la A.O.C.S. (Ce 8-89). El procedimiento analítico consiste en pesar 200 mg de aceite en un matraz aforado de 10 ml, disolverlos en hexano para HPLC e inyectar en el cromatógrafo. El αtocoferol, mayoritario en el aceite de oliva virgen, se ha cuantificado por interpolación del área del pico correspondiente en una recta de calibrado obtenida en las mismas condiciones experimentales, a partir de disoluciones patrón de α-tocoferol en hexano preparadas inmediatamente antes de su uso, de concentraciones exactamente conocidas que cubren el rango entre 1 y 8 mg/l. El equipo empleado para la separación y cuantificación del α-tocoferol ha sido un HPLC Agilent serie 1100 acoplado a un detector de fluorescencia Thermo Finnigan modelo FL3000 y una columna (250 x 4,6 mm) de relleno Lichrosorb Si-60 de 5 µm (Sugerlabor, España). La fase móvil utilizada es una mezcla de n-hexano-isopropanol 98,5:1,5 (v/v) a un flujo de 1 ml/min, y un volumen de inyección de 20 µl. Para la detección del α- tocoferol mediante fluorescencia se emplea una longitud de onda de excitación de 290 nm y una longitud de onda de emisión de 330 nm (Figura 3.9). mAU 225
α- tocoferol
200 175 150 125 100 75
γ- tocoferol δ- tocoferol
50 1
2
3
5
4
6
7
8
min
Figura 3.9. Cromatograma obtenido en la determinación de tocoferoles de un aceite de oliva virgen de la variedad Cornicabra.
La concentración de α- tocoferol en el aceite de oliva Cα-T (mg/kg) se calcula a partir de la siguiente expresión:
C α −T =
CD ⋅V P
en donde CD es la concentración de α- tocoferol en la disolución de aceite calculada a partir de la recta de calibrado (mg/l), V es el volumen del matraz donde se prepara la disolución de aceite (ml) y P es el peso de aceite empleado (g).
62
3. Material y Métodos
Determinación de la estabilidad oxidativa por el método Rancimat. Para la realización del ensayo de estabilidad oxidativa se ha empleado un equipo Rancimat 679 (Metrohm) en el cual el proceso de oxidación tiene lugar con saturación de oxígeno y a temperatura elevada. La determinación de la estabilidad oxidativa, que se mide en horas y se calcula como el periodo que tardan en producirse compuestos volátiles polares como consecuencia del inicio de la oxidación secundaria de las grasas y es denominado “periodo de inducción”. La medida proporcionada por este equipo se basa en la detección conductimétrica de los productos de descomposición de los hidroperóxidos, principalmente ácidos orgánicos de cadena corta. El aparato consta de un bloque calefactor, que puede alcanzar temperaturas de hasta 220 ºC. Para acelerar el proceso de oxidación se introduce un flujo de aire a través del aceite. Este aire, a la vez que proporciona el oxígeno necesario para la oxidación, arrastra los compuestos volátiles formados durante el proceso y los conduce a un frasco borboteador que contiene agua y una célula que mide constantemente la conductividad del agua. Cuando se inicia la descomposición de los hidroperóxidos, se desprenden una serie de compuestos volátiles, que son retenidos en el agua desionizada dando lugar a un aumento de la conductividad. El punto de inflexión de la curva de conductividad, denominada curva de oxidación, define el periodo de inducción del proceso de oxidación de la muestra, y se muestra a modo de ejemplo en la Figura 3.10.
Figura 3.10. Registro obtenido en la determinación de la estabilidad oxidativa “Rancimat” de tres muestras de aceite de oliva virgen.
Las condiciones de trabajo empleadas para el aceite de oliva virgen de este trabajo de investigación son una temperatura de 120 ºC y un caudal de aire de 20 l/h, según el método propuesto por Laübli et al. (1986).
63
3. Material y Métodos
Determinación de compuestos volátiles. La determinación de los compuestos volátiles del aceite de oliva virgen se ha realizado según el protocolo desarrollado por Vichi et al. (2003b). En primer lugar se procede a la extracción de estos compuestos mediante microextracción en fase sólida (SPME) y posteriormente al análisis cromatográfico mediante una columna capilar polar (100% polietilenglicol). Como sistema de cuantificación se ha elegido el método del patrón interno, en este caso el 4-metil-2-pentanol (Sigma Chemical Co.). El procedimiento analítico consiste en pesar una muestra de aceite de oliva virgen (1,5 g) a la que posteriormente se añade el patrón interno disuelto en aceite de oliva refinado hasta una concentración de 1,5 µg/g en un vial de 10 ml, sellado mediante un septum de silicona. El proceso SPME se realiza mediante la exposición de una fibra de 2 cm de longitud de DVB/Carboxeno/PDMS (50/30 µm, Supelco Inc., USA) durante 30 min en el espacio de cabeza de la muestra situada en un bloque calefactor a 40 ºC. Posteriormente la fibra se retrae dentro de la aguja e inmediatamente se transfiere y desorbe durante un minuto en el puerto de inyección de un cromatógrafo de gases Agilent serie 6890 equipado con un detector de ionización de llama (FID). La separación de los compuestos volátiles se realiza mediante una columna capilar Supelcowax-10 (30 m x 0,25 mm, Supelco Inc., USA) recubierta interiormente de una película de 0,25 µm de espesor de 100% polietilenglicol. Como gas portador se utiliza helio, con una presión en cabeza de columna de 10 psi. Durante el análisis la temperatura del puerto de inyección y del detector se mantienen a 260 ºC y 280 ºC, respectivamente y el gradiente de temperatura utilizado en el horno es el siguiente: temperatura inicial 35 ºC durante 10 minutos, rampa de 3 ºC por minuto hasta 160 ºC y posteriormente 15 ºC por minuto hasta 200 ºC, temperatura final que se mantiene durante 5 minutos. Para la cuantificación se recurre al empleo del patrón interno, en este caso 4-metil-2-pentanol, y por tanto la concentración de los compuestos (Ci) se expresa en miligramos de 4-metil-2pentanol por kilogramo de aceite, calculándose de acuerdo con la siguiente expresión:
Ci =
C PI ⋅ Ai API
en donde CPI es la concentración del patrón interno en el aceite (mg/kg) y Ai y API son las áreas del compuesto volátil de interés y el patrón interno, respectivamente. Los compuestos volátiles se identificaron por comparación de los tiempos de retención y los espectros de masas de las correspondientes sustancias estándar (Sigma Chemical Co.) adicionadas a aceites de oliva refinado. El equipo utilizado fue MS Agilent serie 5975C equipado con un detector de ionización por impacto electrónico (IE+) y acoplado a un GC Agilent serie 6850, con columna capilar DB-Wax (30 m x 0,25 mm, J&W Scientific, USA) recubierta interiormente de una película de 0,25 µm de espesor de 100% polietilenglicol. Como 64
3. Material y Métodos
gas portador se utiliza helio, con una presión en cabeza de columna de 5 psi. La temperatura de la línea de transferencia se mantiene a 280 ºC, y la de la fuente de ionización y el cuadrupolo, a 230 ºC y 150 ºC, respectivamente, con un voltaje en el electromultiplicador igual a 941 eV. La Tabla 3.8 recoge los valores de la relación masa/carga (m/z) de los iones característicos obtenidos en los principales compuestos volátiles presentes en el aceite de oliva virgen. Tabla 3.8. Valores m/z de los iones característicos obtenidos para los principales compuestos volátiles presentes en el aceite de oliva virgen. Pico
TR (min)
Iones MS (m/z)
CAS Number
PM
Compuesto identificado
1
13,1
27, 57
1629-58-9
84
1-penten-3-ona
2
17,0
56, 72, 82
66-25-1
100
hexanal
3
22,3
29, 57
616-25-1
86
1-penten-3-ol
4
25,8
55, 69, 83, 98
6728-26-3
98
E-2-hexenal
5
28,6
56, 61, 69, 84
142-92-7
144
acetato de hexilo
6
31,1
57, 68
1576-95-0
86
Z-2-penten-1-ol
7
31,3
43, 55, 67, 82
3681-71-8
142
acetato de Z-3-hexenilo
8
32,9
56, 69, 84
111-27-3
102
hexan-1-ol
9
34,5
55, 67, 82
928-96-1
100
Z-3-hexen-1-ol
10
35,6
57,67, 82
928-95-0
100
E-2-hexen-1-ol
En la Figura 3.11 se presenta un cromatograma típico de los volátiles presentes en un aceite de oliva virgen. pA
4
80 70 60 50 P.I.
40 2 30
9
1
6
8
20 3
10
7
5 0
5
10
15
20
25
30
10
35
min
Figura 3.11. Cromatograma de los compuestos volátiles de un aceite de oliva virgen Cornicabra. 1, 1-penten-3-ona; 2, hexanal; 3, 1-penten-3-ol; P.I., 4-metil-2-pentanol; 4, E-2-hexenal; 5, acetato de hexilo; 6, Z-2-penten-1-ol; 7, acetato de Z-3-hexenilo; 8, hexan-1-ol; 9, Z-3-hexen-1-ol; 10, E-2-hexen-1ol.
65
3. Material y Métodos
Valoración organoléptica. El análisis sensorial de las muestras de aceite de oliva virgen de este trabajo de investigación se ha realizado siguiendo el protocolo descrito en el Anexo XII del Reglamento CE nº 796/2002. Participaron entre 10 y 12 catadores adecuadamente seleccionados y entrenados pertenecientes al Panel Analítico de la Denominación de Origen de los Montes de Toledo y reconocido por el Consejo Oleícola Internacional (COI). El método descrito en el Reglamento CE 792/2002 clasifica los aceites de oliva en su categoría comercial en función de la posible presencia de defectos sensoriales en la muestra y por la intensidad de su atributo “frutado”, para lo cual se utiliza una hoja de perfil en donde cada catador anota la intensidad con que percibe cada uno de los atributos positivos y negativos en una escala no estructurada de 10 cm, en la cual el extremo izquierdo de la escala indica “ausencia total” y el extremo derecho indica “percepción extrema”. Estos datos se introducen en un programa informático que proporciona la categoría comercial del aceite evaluado junto a los índices estadísticos que indican la calidad del análisis efectuado. El aceite se clasifica, según los límites establecidos por el Reglamento CE nº 796/2002, en la denominación “Virgen extra” cuando la mediana de los defectos sea igual a cero y la mediana del frutado sea superior a cero. “Virgen” cuando la mediana de los defectos sea superior a cero e inferior a 2,5 y la mediana del frutado sea superior a cero. “Lampante” cuando la mediana de los defectos sea superior a 2,5, o bien, la mediana de los defectos es inferior o igual a 2,5 y la del atributo frutado sea igual a cero.
3.8. MÉTODOS ESTADÍSTICOS. Todos los análisis y tratamientos estadísticos de resultados que aparecen a lo largo de esta memoria han sido realizados aplicando el programa informático SPSS (SPSS Inc., Chicago, USA).
Estadística descriptiva. Este tratamiento se ha empleado para presentar los datos experimentales resumidos en las tablas de la memoria, a través de los parámetros estadísticos media y desviación típica, que representan la dispersión de los valores observados.
Análisis de la varianza. El análisis de la varianza estudia los efectos de uno o más factores sobre la variación de los valores medios dentro de uno o más grupos de datos, determinando si existen o no diferencias estadísticamente significativas entre los mismos. El nivel de la significación estadística se establece a partir del valor de F que proporciona este análisis. Para determinar entre qué grupos existen diferencias significativas se ha empleado el test de Duncan. 66
3. Material y Métodos
Análisis discriminante. El análisis discriminante es una técnica multivariante de clasificación supervisada, cuyo objetivo es encontrar funciones o reglas de clasificación que permitan la diferenciación entre poblaciones. Cuando en este análisis las variables independientes se van seleccionando de forma escalonada, de manera que en cada paso interviene la variable que más contribuye a la separación entre los grupos, la técnica se denomina análisis discriminante por pasos sucesivos.
67
4. RESULTADOS EXPERIMENTALES Y DISCUSIÓN
4.1. Resultados Experimentales
Del trabajo de investigación realizado durante la ejecución de esta Tesis Doctoral han derivado las siguientes publicaciones científicas: • ART. I: Aurora Gómez-Rico, Giuseppe Fregapane, M. Desamparados Salvador. 2008. “Effect of cultivar and ripening on minor components in Spanish olive fruits and their corresponding virgin olive oils”, Food Research International, 41, 433-440. • ART. II: Aurora Gómez-Rico, M. Desamparados Salvador, Alfonso Moriana, David Pérez, Nicolás Olmedilla, Francisco Ribas, Giuseppe Fregapane. 2007. “Influence of different irrigation strategies in a traditional Cornicabra cv. olive orchard on virgin olive oil composition and quality”, Food Chemistry, 100, 568-578. • ART. III: Aurora Gómez-Rico, M. Desamparados Salvador, Marta La Greca, Giuseppe Fregapane. 2006. “Phenolic and volatile compounds of extra virgin olive oil (Olea europaea L. Cv. Cornicabra) with regard to fruit ripening and irrigation management”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 7130-7136. • ART. IV: Aurora Gómez-Rico, M. Desamparados Salvador, Giuseppe Fregapane. 2008. “Virgin olive oil and olive fruit minor constituents as affected by irrigation management based on ETc, SWP and TDF in medium-density young olive orchards (Olea europaea L. cv. Cornicabra and Morisca)”, Food Research International. (Enviado). • ART. V: Aurora Gómez-Rico, Antonio M. Inarejos-García, M. Desamparados Salvador, Giuseppe Fregapane. 2008. “Effect of malaxation conditions on phenolic and volatile profiles of olive paste and their corresponding virgin olive oils (Olea europaea L. cv. Cornicabra)”, Journal of Agricultural and Food Chemistry. (Enviado). Previamente a la presentación de estas publicaciones científicas y con el fin de proporcionar una visión global de la estructura del trabajo experimental realizado, se procede a describir brevemente los resultados más relevantes que se han obtenido en esta Tesis Doctoral. Tal y como se ha descrito en el capítulo de Objetivos, la labor investigadora realizada ha estado principalmente orientada al estudio de la influencia que diversos factores agronómicos, como i) la variedad de aceituna, ii) el grado de maduración del fruto y iii) las prácticas de riego en el olivar, ejercen sobre la composición minoritaria tanto del fruto inicial utilizado, como de los aceites de oliva virgen obtenidos. Asimismo se ha determinado el efecto de las variables temperatura y tiempo utilizados durante la etapa tecnológica de batido, sobre la composición fenólica y volátil de la pasta de aceituna y de los correspondientes aceites de oliva virgen (AOV).
71
4.1. Resultados Experimentales
«El estudio de los perfiles fenólicos y volátiles obtenidos a partir de diversas variedades de aceituna españolas ha demostrado que poseen una composición cualitativa semejante, aunque muy diferente desde un punto de vista cuantitativo» El estudio de la influencia de la variable agronómica “variedad” sobre la composición minoritaria de la aceituna y sus correspondientes aceites de oliva virgen se ha llevado a cabo sobre seis variedades españolas - Arbequina, Cornicabra, Morisca, Picolimón, Picudo y Picual – cultivadas en un mismo olivar experimental y, por tanto, bajo idénticas condiciones agronómicas y pedoclimáticas. Se realizaron tres muestreos a lo largo de la maduración del fruto en todas las variedades del olivar, en base a la pigmentación de la piel; verde (índice de madurez, I.M = 1,0), pintona (I.M = 2,5) y negra (I.M = 4,0). Asimismo, se llevaron a cabo dos muestreos adicionales con el fin de obtener muestras de aceite de oliva virgen de cada variedad a partir de frutos inmaduros (pigmentación de la piel verde-amarillenta y pintona) y maduros (pigmentación de la piel morada y negra). Tras el análisis del efecto de esta variable agronómica sobre la composición fenólica de la drupa, se ha determinado que el oleósido oleuropeína es el compuesto fenólico más abundante presente en los frutos de las diversas variedades estudiadas, siendo su contenido ampliamente variable entre las mismas, al estar comprendido entre 2200 y 11600 mg/Kg, valores cuantificados en los frutos verdes de las variedades Arbequina y Cornicabra, respectivamente (ver ART. I; Tabla 1). Por otro lado, el oleósido demetiloleuropeína se ha detectado únicamente en los frutos Arbequina, doblando su concentración en la drupa a lo largo de la maduración de la misma y alcanzando valores de 2000 mg/Kg en el fruto maduro (I.M 4,0). La presencia de verbascósido en el fruto se ha relacionado inversamente con el contenido de oleuropeína del mismo, de forma que las variedades con una mayor concentración de oleuropeína mostraron, a su vez, un menor contenido de este compuesto fenólico. De esta forma los frutos de Arbequina presentaron un notable contenido en verbascósido (entre 15% y 22% del contenido fenólico total en frutos con I.M de 1,0 y 4,0, respectivamente) y la menor concentración de oleuropeína (entre 50% y 1% del total), mientras que variedades ricas en este oleósido (entre 90% y 50% del total), como Cornicabra y Picual, se distinguieron también por el menor contenido en verbascósido (del 0,5% al 4% del total) (ART. I; Tabla 1). La aplicación del Análisis Discriminante sobre el contenido fenólico de las drupas ha proporcionado la clasificación correcta del 100% de las muestras utilizadas en este ensayo en función de la variedad de origen, basándose en el contenido de oleuropeína, apigenin-7-Oglucósido, hidroxitirosol y cianidin-3-O-rutinósido (ART. I; Figura 1). Asimismo, el perfil fenólico de las distintas muestras de aceituna ha permitido su distribución en tres grupos distintos, el primero de ellos constituido por las variedades Cornicabra y Picual, caracterizadas por una composición similar en oleuropeína, flavonoides y antocianinas, un segundo grupo constituido 72
4.1. Resultados Experimentales
por los frutos de Picudo, que presentaron una alta concentración de hidroxitirosol y un tercer grupo formado por Arbequina, Morisca y Picolimón, que mostraron los mayores niveles de verbascósido y un contenido similar en flavonoides (ART. I; Tabla 1). Del mismo modo, en el análisis de los compuestos fenólicos y volátiles de los correspondientes aceites de oliva virgen elaborados a partir de las variedades estudiadas, se obtuvieron perfiles de composición cualitativa semejante, aunque muy diferentes desde un punto de vista cuantitativo. Así, mientras que los derivados secoiridoideos del hidroxitirosol y tirosol son los principales fenoles presentes en todos los aceites, su distribución varía entre las distintas variedades, siendo los derivados del hidroxitirosol los fenoles complejos más abundantes en las variedades Arbequina, Cornicabra, Picolimón y Picual (principalmente la forma 3,4-DHPEAEDA), con valores comprendidos entre 105,0 mg/Kg (en Morisca con I.M 3,0) y 1113,2 mg/Kg (en Cornicabra con I.M 2,5), mientras que los secoiridoideos del tirosol se detectaron en mayor concentración que sus análogos del hidroxitirosol en los aceites Morisca y Picudo (principalmente la forma p-HPEA-EDA), con concentraciones entre 54,8 mg/Kg (Picolimón, I.M 3,0) y 769,6 mg/Kg (Picudo, I.M 0,8) (ART. I; Tabla 2). En lo que respecta al contenido volátil, la fracción aldehídica C6, constituida por E-hexenal y hexanal, ha predominado en todos los aceites obtenidos en esta experimentación, siendo además los compuestos volátiles que han permitido la mejor discriminación entre los aceites en función de la variedad de procedencia, especialmente el contenido de E-2-hexenal, el cual ha variado desde 20,55 mg/Kg, como valor medio, en los aceites Arbequina hasta 3,15 mg/Kg en la variedad Cornicabra. Otro aspecto a destacar es la presencia de ésteres C6 en el aroma de los aceites, la cual está claramente establecida en la variedad Morisca, y especialmente en Arbequina y Picual (ART. I; Tabla 3). Por otro lado, puesto que los compuestos fenólicos presentes en un AOV son derivados de los oleósidos y lignanos de la aceituna, se ha relacionado el contenido oleosídico de las drupas con la composición secoiridoidea cuantitativa descrita en los correspondientes aceites del ensayo, observándose un ratio considerablemente heterogéneo entre las variedades estudiadas (aproximadamente 2,3 para Picudo, 4,5-5,5 para Cornicabra y Morisca, 7,0-8,5 para Arbequina y Picual y 28 para Picolimón) (ART. I; Figura 2). Lo cual permite establecer que la variedad Picolimón, con un contenido de oleuropeína relativamente alto en su fruto (4760 mg/Kg de media entre I.M 2,5 y 4,0) proporcionó el menor contenido secoiridoideo en su aceite (160 mg/Kg, I.M 3,0; ratio 29,8), mientras que Picudo, con un nivel bajo de oleuropeína (2305 mg/Kg, I.M 2,5), presentó un contenido relativamente alto de fenoles complejos en su aceite (1040 mg/Kg, I.M 2,5; ratio 2,3).
73
4.1. Resultados Experimentales
«La maduración de la drupa se caracteriza por una gran génesis de antocianos y un considerable descenso de oleuropeína, relacionándose con la disminución de derivados secoiridoideos en su aceite, donde también se ha observado una importante pérdida de la fracción aldehídica C6» Otra de las variables agronómicas bajo estudio ha sido el “grado de maduración” del fruto y su influencia tanto en la composición fenólica de la drupa, como en los perfiles fenólicos y volátiles del aceite de oliva virgen de calidad. Para ello, se han utilizados las drupas y aceites de oliva virgen obtenidos a partir de las variedades Arbequina, Cornicabra, Morisca, Picolimón, Picudo y Picual a distintos estadíos de maduración, como se ha comentado previamente. Además, con el objetivo de realizar un estudio más exhaustivo de esta variable agronómica y para evaluar su efecto sobre la variedad Cornicabra, mayoritaria en la región de Castilla-La Mancha, se prepararon un mayor número de muestras de aceite de esta variedad a partir de frutos con un I.M entre 1,5-2,0 hasta 5,0-5,5, sometidos a distintas condiciones de irrigación (secano, riego deficitario regulado (RDI), FAO y 125 FAO; sobre este aspecto se discutirá en profundidad en el siguiente apartado). Destaca en primer lugar el importante descenso observado en el contenido de oleuropeína a medida que madura la aceituna, independientemente de la variedad de procedencia. Así por ejemplo, los niveles de oleuropeína en los frutos de Arbequina descendieron desde 2230 mg/Kg (I.M 1,0) hasta 60 mg/Kg (I.M 4,0) y en Cornicabra desde 11600 mg/Kg (I.M 1,0) hasta 6340 mg/Kg (I.M 4,0), con la única excepción de los frutos de la variedad Morisca, en donde aumentó de forma no significativa desde 1954 mg/Kg (I.M 1,0) hasta 2639 mg/Kg (I.M 4,0). En segundo lugar, subrayar la génesis predominante de antocianinas responsables de la coloración negra de los frutos maduros (I.M 4,0), siendo el cianidin-3-O-rutinósido la antocianina más abundante en todas las variedades bajo estudio, variando su concentración entre 1058 mg/Kg en los frutos de Morisca y 3236 mg/Kg en la variedad Cornicabra. Por el contrario, la concentración de otros compuestos fenólicos como el verbascósido y los flavonoides, principalmente rutina y luteolin-7-O-glucósido, se vio incrementada durante la maduración del fruto, siendo ésta estadísticamente significativa solamente en las variedades Morisca (con incrementos del 160% en el contenido de rutina y 200% en el luteolín-7-Oglucósido) y Picolimón (con aumentos del 270% y 170% para rutina y luteolín-7-O-glucósido, respectivamente) (ART. I; Tabla 1). El descenso en el contenido de oleuropeína de las drupas a lo largo de su maduración, implica por supuesto, una disminución en la concentración de derivados secoiridoideos en sus correspondientes aceites de oliva virgen (ART. I; Tabla 2), con la única excepción de la forma 3,4-DHPEA-EDA en los aceites Morisca cuya concentración aumenta desde 67,6 mg/Kg (I.M 1,5) hasta 112,6 mg/Kg (I.M 3,0). En el caso de la variedad Cornicabra, con muestras de aceite obtenidos a partir de frutos con I.M 1,5-2,0 hasta I.M 5,0-5,5, se ha observado claramente la 74
4.1. Resultados Experimentales
tendencia descendente de los derivados secoiridoideos del hidroxitirosol y tirosol presentes en los mismos (ART. III; Figura 1), ya que la concentración de estas formas fenólicas complejas descendió alrededor de un 40% y 55% de su contenido inicial, respectivamente, en los aceites obtenidos a partir de frutos muy maduros, independientemente del tratamiento de riego empleado en el olivar (campaña 2003/04; I.M 5,0-5,5). Sobre la evolución de los compuestos volátiles C6 presentes en los aceites de las variedades Morisca, Picolimón y Picudo obtenidos en estadíos de maduración temprana (I.M1 0,8-1,5 y I.M2 2,3-3,0), se ha observado un incremento del contenido de E-2-hexenal, hexan-1-ol y Z-3-hexen1-ol, especialmente considerable en el caso del AOV Picudo (I.M1 0,8 y I.M2 2,3) en donde estos volátiles aumentaron un 47%, 162% y 55%, respectivamente. Por otro lado, en los aceites Arbequina, Cornicabra y Picual obtenidos a partir de frutos en estadíos de maduración algo superiores (I.M1 2,0-2,5 y I.M2 3,5-4,0), el incremento de estos volátiles fue menos perceptible e incluso se pudo observar un ligero descenso de los aldehídos C6 (ART. I; Tabla 3). De la misma forma que en los compuestos fenólicos, la evolución de los compuestos volátiles de la ruta LOX a lo largo de la maduración del fruto, se ha estudiado de forma más exhaustiva en la variedad Cornicabra, obteniéndose un descenso de los aldehídos C6 y los volátiles C5, como 1-penten-3-ona y 1-penten-3-ol, desde los estadíos inmaduros a sobremaduros, especialmente notable en el caso del E-2-hexenal, cuya concentración disminuyó entre un 40% (en aceites elaborados con frutos de secano) y un 60% (en aceites obtenidos con el tratamiento de riego FAO) durante la maduración del fruto (campaña 2003/04; ART. III; Figura 2 y Tabla 2). En lo referente a los alcoholes C6, se observó un considerable descenso del E-2-hexen-1-ol, mientras que la presencia de hexan-1-ol y Z-3-hexen-1-ol aumentó de forma significativa durante la maduración del fruto. Por ejemplo el contenido de hexan-1-ol se incrementó desde 0,04 mg/Kg hasta 0,14 mg/Kg y el de Z-3-hexen-1-ol desde 0,17 mg/Kg hasta 0,35 mg/Kg (AOV FAO) (campaña 2003/04; ART. III; Tabla 2). La aplicación del Análisis Discriminante sobre el contenido fenólico y volátil de los aceites de oliva virgen Cornicabra obtenidos a lo largo de la maduración de la aceituna, permitió clasificar correctamente el 85% de los mismos en función del índice de madurez de los frutos de los que procedían mediante el empleo de las variables hexan-1-ol, E-2-hexen-1-ol, 3,4-DHPEA-EDA y p-HPEA-EDA (ART. III; Figura 3), lo que pone de manifiesto la gran influencia de esta variable agronómica en la composición minoritaria del producto obtenido.
75
4.1. Resultados Experimentales
«El nivel de estrés hídrico de los olivos está relacionado directamente con el perfil fenólico secoiridoideo del aceite de oliva virgen e inversamente con su contenido en volátiles C6» En lo relativo al análisis del efecto que diversas estrategias de riego aplicadas en el olivar ejercen sobre la calidad y composición del aceite de oliva virgen obtenido, es importante destacar que para llevar a cabo este estudio se han realizado dos ensayos diferentes; (i) El primero de ellos se ha llevado a cabo en un olivar adulto Cornicabra de marco tradicional (50 años) originariamente en condiciones de secano, en donde se aplicaron distintas metodologías de irrigación basadas en el coeficiente de evapotranspiración del cultivo (ETc) y que suponían la aplicación de dosis de riego equivalentes o superiores a este coeficiente, como es el 100% ETc (o método FAO) o el 125% ETc (125 FAO), además de dos estrategias distintas de riego deficitario regulado (regulated deficit irrigation, RDI) en las cuales las dosis de agua se administraron bien a lo largo de toda la estación de riego (RDI-1), o bien a partir del mes de agosto, cuando comienza la acumulación de aceite en el fruto (RDI-2). (ii) El segundo ensayo se ha realizado en dos olivares jóvenes de cubierta incompleta de las variedades Morisca y Cornicabra, plantados en 1998 y 1999 respectivamente, en los cuales se evaluaron dos programaciones de riego basadas en medidas del estado hídrico del olivo in situ, como son el potencial hídrico del tronco (stem water potencial, SWP, con umbrales definidos a 2,0 MPa (SWP -2,0) y -1,2 MPa (SWP -1,2), y las fluctuaciones del diámetro del tronco (trunk diameter fluctuations, TDF), como posibles alternativas a la estrategia de riego en el olivar basada en el cálculo del ETc, como es el 100% ETc (o método FAO). Los detalles del procedimiento experimental utilizado están ampliamente recogidos en la sección de Material y Métodos. Estos ensayos agronómicos se han realizado con olivos de edades distintas y con estrategias de riego diferentes dirigidas a la consecución de objetivos específicos distintos en cada caso, por ello no es posible la comparación directa de los resultados obtenidos en los dos ensayos. Aún así, en ambos estudios se han observado tendencias similares, especialmente en la composición minoritaria de los aceites de oliva virgen obtenidos, que se describirán brevemente a continuación. En primer lugar, resaltar el aumento significativo de la productividad del olivar que supone la aplicación de riego en comparación con el cultivo de secano, cifrándose aproximadamente en un 35%. Se observó como la producción media obtenida en el olivar adulto Cornicabra a lo largo de las campañas olivareras consecutivas entre 2001 y 2004 aumentaba desde 39,2 Kg de aceituna por olivo en condiciones de secano hasta valores medios de 51,8-52,7 Kg de aceituna por olivo en las áreas de regadío (ART. II; Tabla 1).
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4.1. Resultados Experimentales
En lo referente a la influencia del riego sobre la composición fenólica de los AOV, en ambos ensayos se ha descartado cualquier tipo de influencia de este factor agronómico sobre el contenido de fenoles simples en el aceite, como es el caso del hidroxitirosol, tirosol y los ácidos fenólicos, ya que no se observaron diferencias estadísticas relacionadas con los diversas estrategias de riego ensayadas. Así por ejemplo, el contenido de hidroxitirosol en los AOV Cornicabra obtenidos en el olivar tradicional adulto durante la campaña 2003/04, varío entre 1,46 mg/Kg (RDI-1; I.M 1,8) y 3,31 mg/Kg (125 FAO; I.M 4,9), y el de tirosol entre 1,62 mg/Kg (secano; I.M 2,7) y 4,89 mg/Kg (FAO; I.M 5,5), mientras que la cantidad de ácidos fenólicos detectada fue muy pequeña -vainillina (