UNIVERSIDAD J.F.KENNEDY DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

BROMATOLOGIA

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

( Curso 2012)

Dra. Monica Galdi

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INDICE Pagina

I.-

Métodos generales de análisis

1.- Determinación del contenido de agua..................................................

1

2.- Determinación del contenido de ceniza................................................. 2 3.- Determinación del nitrógeno proteico y no proteico............................... 4 4.- Determinación de grasas y aceites.......................................................

5

5.- Análisis de hidratos de Carbono ........................................................... 5 6.- Análisis de fibra bruta y dietaria...........................................................

6

7.- Análisis de Materia inorgánica por Absorción atómica............................

7

8.- Análisis cromatografico de vitaminas , contaminantes, aditivos, etc........

8

II.- Algunos métodos particulares de análisis

1.- Productos proteicos : Carnes, huevos y derivados ...............................

8

2.- Grasas y aceites.................................................................................

10

3.- Productos Làcteos y derivados ............................................................ 12 4.- Jugos y productos azucarados ............................................................. 13 5.- Cereales y sus subproductos ................................................................ 14 6.- Bebidas estimulantes .......................................................................... 17 7.- Bebidas alcohólicas............................................................................. 21

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I.- METODOS GENERALES DE ANALISIS 1.- Determinación del contenido de agua 1.1.- Métodos indirectos Principio: Son métodos de desecación. El peso del residuo obtenido corresponde a los sòlidos totales y la pérdida de peso al agua libre evaporada. Para ello puede recurrirse a: Determinación del contenido acuoso por calor: Ya sea por calor radiante o por circulación forzada de aire, se emplea estos métodos en alimentos con alto contenido acuoso, que no se descomponen a la temperatura utilizada. Se utiliza una fracción de 2 a 5 g de alimento homogeneo y se calienta a 100. 130 o 150ºChasta peso constante. Se retira de la estufa y enfría en desecador para pesar. Se trata de métodos relativamente poco exactos ya que ocurren pérdidas de componentes volátiles

(alcohol, aceites esenciales),

caramelización de azucares, carbonización parcial, oxidación de aceites, etc . Sin embargo son muy utilizados por ser sencillos y rápidos. No usar en alimentos que ebullen o proyenctan o caramelizan por calentamiento. Para cada alimento, se encuentra generalmente descriptas en normas nacionales o internacionales las condiciones de temperatura y tiempo necesarias para una correcta desecación. Calentamiento a presión reducida: Se utilizan estufas conectadas a una bomba de vacío ( 25-50 mm de Hg)

a temperaturas

cercanas a 70ºC. Se aplica a alimentos que caramelizan o descomponen a temperaturas mayores. El aire a utilizar para liberar el vacío debe ser secado sobre ac. sulfurico. Se utilizan porciones de alimento homogeneo de 2 g que se desecan hasta peso constante ( Variación menor de 2 mg). Error relativo porcentual en estos 2 métodos depende de la balanza utilizada. Para un balanza analítica de 4 decimales, se acepta un error de 1 mg o sea 0.2% aprox. y un mínimo detectable de 1,5% de agua. 1.2.- Metodos directos A) Metodos fisicos Principio: se evalua una propiedad eléctrica (resistencia, frecuencia, propiedades dieléctricas) relacionada con el contenido acuoso. El error asociado resulta de 1% Métodos por destilación Principio: Se arrastra el vapor de agua con un disolvente menos denso que ésta y de punto de ebullición mayor ( tolueno, heptano, benceno o xileno). Se conecta una trampa (conocida con el nombre de Dean-Stark) entre el balón y el refrigerante de modo que los líquidos en ebullición pase por esta antes de retornar al balón. Al cabo de un tiempo se lee en la trampa graduada el volumen de agua recogido. El método es aplicable a grasas, emulsiones, productos deshidratados, de bajo contenido acuoso que contengan componentes volátiles o se descompongan a altas temperaturas. El limite de detección del método ronda en el 0.2% y su precisión depende de la graduación de la trampa ( aprox. 0.5%) B) Métodos químicos Principio: En presencia de pequeñas cantidades de agua, esta limita la reducción del iodo en presencia de dióxido de azufre, piridina. El medio de reacciòn debe ser extrictamente anhidro, utilizándose metanol anh. como disolvente. El punto final de la reacción puede determinarse colorimétricamente ( titulando el iodo remanente de un exceso inicial perfectamente medido) o potenciométricamente ( adicionando iodo hasta que el potencial se mantenga estable). Este método es aplicable a alimentos con bajo contenido acuoso (menor del 5%), condiciones en las que resulta mucho:más exacto que los métodos indirectos o por destilación. Actividad de agua La disponibilidad de agua para el desarrollo de microorganismos y reacciones bioquimicas se evalúa a traves de la actividad de agua (aw). Se define como la relacion entre la presión de vapor en equilibrio en la muestra (P) y la del agua pura (Po) a esa temperatura. aw

=

P / Po

(con valores entre 0 y 1)

La aw puede expresarse como Humedad Relativa de Equilibrio equivalente a

HRE = aw x 100 La mediciòn de la aw se puede realizar en forma estática ( en un ambiente hermético, por equipos Pag 3 de 23

electrónicos que utilizan alguna propiedad física para reflejar la cantidad de agua disponible en el ambiente, higrómetros) o en forma dinámica ( sometiendo el alimento a ambientes herméticos de diferente contenido de humedad conocido y evaluando su incremento en peso. Finalmente se interpola el contenido en agua real del alimento de la grafica de contenido acuoso vs. humedad relativa ambiente, conocida como isoterma de absorción). 2.- Determinación del contenido de cenizas Principio: Se basa en la eliminación de toda sustancia orgánica quedando solo

sus componenetes

inorgánicos. La cantidad de muestra a tomar, dependerá del contenido porcentual de éstas y de los análisis posteriores que se requiera hacer sobre las cenizas (determinación de hierro, calcio, sodio, potasio, etc.). Es prudente partir de no menos de 2 g. Si el alimento es líquido deberá evaporarse el agua antes de su calcinado. Para facilitar la disgregación del material puede adicionarse arena, vaselina o tierra de infusorios. La temperatura de calcinación no debe sobrepasar la de volatilización de los minerales presentes. Si hubiera cantidades importantes de cloruro, sodio, postasio, sulfuro y fósforo, no sobrepasr los 550ºC Error del método: sensibilidad de la balanza, oxidación incompleta, descomposición de sales con desprendimiento dióxido de carbono, pérdidas mecánicas y de manipulación. Sensibilidad del método: se ha observado un desvío estàndar de 0,15% para valores de 2% cenizas., con un límite de detección de alrededor de 0,5% Precauciones generales de trabajo: Carbonice en cápsula de cerámica a la llama directa suave el material si contiene grasa u otro material fácilmente combustible, antes de poner en la mufla, para evitar desprendimientos de material al entrar en combustión. Si se prendiera fuego no sople, retire el fuego y tape. No introduzca espátula para revolver. Mineralización vía húmeda Se aplica cuando se desea obtener una solución inorgánica de los minerales para analizar posteriormente por otro método ( Abs. Atómica por ejemplo) Consiste en el uso de acidos fuertes ( sulfurico, nítrico-perclórico, nitrico-sulfúrico). La elección depende de la presencia de calcio ( el sulfato de calcio resulta insoluble), cloruros (el acido sulfúrico desplaza los cloruros como gas, ocasionando pérdidas), etc. 3.- Determinación del nitrógeno proteico y no proteico (AOAC 2.051)(ISO 3188) El método de Kjeldahl es el método patrón. Otros métodos están disponibles, pero Kjeldahl el método tradicional o en sus variantes modernas, sigue siendo el utilizado universalmente. Principio: Se basa en 3 pasos consecutivos: la oxidación húmeda de la materia orgánica, la destilación en medio alcalino del amoniaco, que es recogido sobre ácido bórico y su titulación con un ácido más fuerte valorado. -Mineralización: Se utiliza aproximadamente 2g de muestra con la cantidad necesaria de acido sulfúrico concentrado, adicionado de sulfato de potasio ( para aumentar el punto de ebullición ) y sulfato de cobre o selenio como oxidantes. La oxidación requiere alta temperatura y varias horas de calentamiento hasta que se obtiene una solución translúcida. -Destilación La solución anterior debe neutralizarse en un equipo que permita la adición de NaOH 40% en cantidad suficiente sin pérdidas de amoníaco y su destilación por arrastre con vapor en un sistema hermético, recogiendo el amoníaco y vapor sobre ácido bórico 4%. -Titulación Los equivalente de amoníaco fijados por el ácido bórico son titulados con acido diluido (0,02N) utilizando verde de tashiro o rojo de metilo 1% acuoso como indicador de punto final ( pH 4,5 aprox). -Cálculos El volumen de ácido gastado en la valoración en litros (V ) multiplicado por la normalidad del ácido ( N) y por el equivalente del nitrógeno ( 14) corresponde a la cantidad de nitrógeno en la muestra. Dado que se expresa el contenido en forma habitual en forma porcentual, la fórmula a aplicar será N% = V x N x 14 x 100 g / gr muestra Cada proteína presenta cierta proporción típica de Proteína/ N. Para obtener el % de proteína en un alimento, se multiplica el %N hallado por un factor característico. Por ejemplo Trigo, harina, y otros derivados de cereales: 5,83 nueces : 5,41 Carne: 6,25 Maiz: 6,25 Leche 6,38 Soja: 5,71 Pag 4 de 23

-Ambito de validez de los resultados El método de Kjeldahl, con un error del 1% (para el sistema automatizado) al 5% ( para el método manual) y un límite de detección de 0,1g%, refleja todo el nitrógeno orgánico presente en la muestra: proteínas, bases nitrogenadas, aminas cadavéricas, etc. No determina el nitrógeno inorgánico. Determinación de nitrógeno no orgánico La presencia de nitritos y nitratos debe investigarse por métodos específicos o previa reducción. Determinación de aminas cadavéricas La presencia de aminas volátiles se determina por agregado de oxido de magnesio a la muesta, suspensión en agua y destilación en medio alcalino. Se recoge el amoníaco sobre bórico y procede como se describió más arriba. 4.- Determinación de grasas y aceite Los componentes lipídicos pueden clasificarse en libres ( extraíbles con éter y otro solvente), combinados con proteínas ( requieren hidrólisis en un medio ácido o alcalino), o saponificables (esterificados, hidrolizables en medio alcohólico o acuoso alcalino y extraíbles luego en éter). a) Extracción de lipidos libres Métodos contínuos: El método de Bolton consiste en un goteo continuo desde una ampolla de decantación sobre una muestra extendida en un filtro tipo buchner. La grasa se recoge en un kitasato inferior en forma continua. Se procede en frío, aplicable a grasas, pero principalmente a aceites. Métodos intermitentes El método de Soxhlet es universalmente utilizado para grasas sólidas. Requiere de un equipo especial de destilación que se intercala entre un balon y un refrigerante vertical. En el interior del equipo se coloca la muestra dentro de un cartucho contenedor ( papel o celulosa) y sobre él gotea el solvente condensado. La muestra se encuentra inmersa intermitentemente en el solvente, el cual desagota hacia el balón inferior por un sifón. El solvente es evaporado en forma continua desde el balon y condensado por el refrigerante superior. Para ambos métodos de extracción, debe tenerse en cuenta el contenido acuoso del alimento y el tipo de grasa a extraer en el momento de seleccionar el solvente. Por ejemplo, para alimentos que pudieran contener agua, se utiliza una mezcla de solventes con metanol. Si el alimento está deshidratado y la grasa es de cadena larga, poco polar, se utiliza hexano. Si son de cadena corta, éter. Si se sospecha la presencia de acidos grasos libres, más polares se recomienda cloroformo. b) Lipidos asociados a proteínas En este tipo de muestras se utiliza un ataque ácido ( con ácido clorhídrico en concentración 6N, como el método de Werner-Shmid) o alcalino (tratamiento con amoníaco y alcohol, como en el método de Rose-Gotlieb) y luego se procede a una extracción contínua o discontínua. Análisis posteriores de los extractos Los extractos lipídicos pueden utilizarse posteriormente para estudiar la rancidez de la grasa extraída y su composición en acidos grasos . La elección del método dependerá entonces del análisis posterior a realizar. Cálculos y expresión de resultados Los extractos etéreos se evaporan a fin de poder determinar el peso del residuo graso extraído, el cual se expresa en forma porcentual respecto de la masa inicial de alimento. Sensiblidad: El método presenta un desvío estàndar de 4.5% con un límite de detección de 1g % aproximadamente. 5.- Analisis de Hidratos de Carbono Los hidratos de carbono se encuentran en forma de polímeros (almidón, dextrosas, celulosa), dímeros

( galactosa, sacarosa , etc.) y monoméros. Los métodos químicos que se describen a

continuación se basan en la capacidad reductora de los aldehidos libres.

Si se desea conocer el

contenido de azúcares totales presentes, debe someterse el alimento a una hidrólisis previa del los polímeros y dímeros. En el caso de la celulosa, constituyente de la fibra, se evita su hidrólisis, ya Pag 5 de 23

que se trata como un compuesto no absorbible por el organismo. En todos los casos deben extraerse los azucares del alimento y presentarlos en solución acuosa translúcida Preparación de la muestra A) Preparacion de soluciones translúcidas para evaluación de azucares libres Debe

diluirse

convenientemente

los

azúcares

presentes

(0.2-0.5g%)

a

la

vez

que

se

desproteiniza Por ejemplo, en jugos: Se mide 10 ml de jugo, que se disgrega en mortero con 40 ml de agua. Se lleva a un erlenmeyer y se calienta 10 min a 50ºC. Se agrega 5 ml de ferricianuro de potasio 15% y 5 ml de Acetato de Zn 30%. Agitar, centrifugar o filtrar. Llevar a 100 ml . B) Hidrólisis previa del almidón Se calienta a reflujo 20 g de muestra con 75 ml de KOH etanólico 8% a fin de gelatinizar el almidón. Luego de 30 minutos de calentamiento con agitacion ocasional, se filtra y lava el residuo con etanol caliente. El residuo puede hidrolizarse en medio acido ( 100 ml de ClH 1M calentando 2,5 horas). Luego se lo neutraliza, filtra y lleva volumen para la determinación del azucar contenido. Si se desea determinar el contenido total de azucares, no se filtra y separa el almidón, por el contrario, se realiza inmediatamente la hidrólisis acida mencionada, filtra , neutraliza

y lleva a

volumen conveniente. C) Hidrólisis y desproteinización En el caso de cereales, por ejemplo, el resultado de la hidrólisis (2,5 g de muestra y 50 ml de ClH 1M, calentando a ebullición durante 15 minutos exactos.) no permite su filtración por lo que se adiciona 5 ml de reactivo de Carrez 1 y 5 ml de Carrez 2 ( ver pag. 23 ). Se procede luego a filtrar y finalmente neutralizar. 5.-1 Metodo de Fehling ( Modificado por Lane y Eynon) Principio :El reactivo de Fehling esta formado por sulfato de cobre (69,3 g de pentahidrato en un litro de agua , Solución A )y tartrato de sodio y potasio ( Sal de Rochelle) ( 345 g en un litro de agua, a la que se agrega 100 gr de NaOH, Solución B ). En presencia de azucares, se observa la formación de óxido cuproso que precipita. La adición de azul de metilo exalta el punto final de la reacción. La titulaciòn se realiza en ebullición. Solución patrón: Se pesan 23,7 g de sacarosa y se disuelven en 120 ml de agua. Se agrega 9 ml de ac. clorhídrico concentrado y se deja a temp. amb. 8 días a fin de invertir el azucar. Se lleva a 250 ml y se guarda. Solución estandar: Se toma 200 ml de la solución patrón, se agrega 71 ml de NaOH 4% y 4 g de ac. benzoico como conservador.Se lleva a 2 litros con agua y conserva en frascos oscuros. El pH debe ser 3. Esta soluciòn contiene 1g% de azúcar y se diluye convenientemente antes de usar para la calibración del reactivo. Procedimiento: Con pipeta volumétrica tomar 20 ml del Reactivo (10 mL de Solución A y 10 mL de solución B) y colocarlo en un erlenmeyer de 200ml. Agregar 15 ml de agua y dejar caer solución estandar 0.25% gota a gota mientras la solución se encuentra en ebullición. Adicionar azul de metilo (1% en sol acuosa) para mejorar la visión del punto final. Titular en ebullición hasta que desaparezca el azul y se torne violáceo. Repetir con soluciones estandar 0.3, 0.4 y 0.5 %. Construir una curva de calibración. Repetir con la solución en estudio diluida convenientemente a fin de que posea una concentración de azúcares entre 200 y 500 mg%. 6.- Analisis de fibra Se denomina fibra al componente del alimento que no es absorbido por el organismo, aunque no por ello deja de ser importante para el funcionamiento del organismo En principio se definió fibra como el residuo orgánico combustible e insoluble que queda luego que de la muestra se ha tratado con eter de petróleo ( para extraer las grasas), por hidrólisis acida y básica , lavada con alcohol y éter etílico. Este procedimiento standarizado proporciona el valor de Pag 6 de 23

fibra bruta. Resulta que ésta representa sólo una parte ( un séptimo a veces ) del material no absorbido. La fibra dietaria representa el conjunto de componentes que no degradados por enzimas en las condiciones del tracto digestivo humano. Estan constituidos por celulosa ( fibra cruda) , hemicelulosa ( fibra cruda), pectinas, gomas , mucílagos, lignina (fibra bruta) y polisacáridos modificados tecnológicamente. 6.1.- Fibra bruta o total ( Método AOAC e ISO 5498) Se trabaja sobre muestra seca y desgrasada. Se pesa alredeor de 2 g de muestra . Se transfiere a un erlenmeyer de 600 ml agregando 1 g de asbesto previamente preparado, 200 ml de Ac. sulfurico 1,25 % o sea 0.255 N y 1 gota de antiespuma. Se calienta a reflujo 30 min. Se enfria y filtra a través de malla de acero 200 ( abertura de 1 mmcuadrado), colocada sobre un embudo büchner de placa perforada precalentado y con papel de filtro ( Whatman 54 o 541. Alternativamente se puede usar crisol de Gooch. Se filtra con ayuda de vacío y se lava con agua caliente. El tiempo de filtrado debe ser menor de 10 min. , caso contrario, se recomienza. Se lava con 25 ml de ac. sulfúrico 1,25% caliente y luego con agua hasta reaccion neutra al tornasol. Finalmente se lava con 25 de alcohol etílico. Se regresa el residuo al erlenmeyer y se agrega

200 ml de NaOH 1, 25% o sea

0.313 N. Se calienta a reflujo nuevamente 30 min. Se filtra de igual modo, lavando finalmente con eter etílico. Retirar el residuo del filtro, colocarlo sobre una cápsula tarada y secarlo a 103ºC durante 2 horas. Pesar. Calcinar 30 min a 600ºC y pesar. La diferencia de peso se refiere a 100 g de producto en base seca y se expresa como gramos de fibra / 100g de alimento. 6.2.- Fibra dietaria (Metodo AOAC) Se trabaja con muestra seca y desgrasada. En muestras con menos de 5% de grasa puede obviarse. Se trabaja por triplicado ( denominaremos muestra M1,M2 y M3 a las alicuotas). Las muestras se colocan en un erlenmeyer y se agrega 50 ml buffer fosfato pH6. Se agrega 100ul de Temamyl (amilasa termoestable). Se tapa el erlenmeyer con aluminio e incuba en baño hirviente 15 min., agitando ocasionalmente.Se enfria y lleva el pH a 7,5 con NaOH 0.17 N. Se agrega 5 mg de proteasa, cubre e incuba 30 min a 60ºC, con agitacion ocasional. Se enfria y lleva el pH a 4,5 con Ac. fosfórico 0.205M. Se agrega 100 ul de solucion de amiloglucosidasa. Se cubre nuevamente y lleva 30 min a 60ºC, con agitación. Finalmente se agrega 280 ml de etanol precalentado a 60ºC y se mide el volumen final. Dejar enfriar 1 hora Se prepara un crisol de Gooch con celite y se lo tara. Filtrar con ayuda de vacío, lavando con 3 porciones de 20 ml de etanol 78º, 2 de 10 ml de etanol 95º y dos porciones de 10 ml de acetona. Secar el crisol M1 toda la noche a 105ºC. Enfriar y pesar. Calcinar el crisol M2 a 525ºC durante 5 horas. Determinar nitrógeno en la muestra M3. % TDF =

Peso M 1 -(% proteinas M3 + % cenizas M2) x100 / Peso inicial de la muestra

7.- Análisis de Materia inorgánica por Absorción atómica La Absorción atómica resulta una herrramienta muy útil para determinación de los minerales en alimentos. El método tiene suficiente versatilidad todos los minerales. Sólo unos pocos podrían determinarse alternativamente en forma colorimétrica, por formación de complejos ( Fe, Ni, Cu, por ejemplo) pero AA tiene una alta sensibilidad, 100 veces superior a los métodos colorimétricos, lo que lo hace el metodo de elección para oligoelementos tóxicos y determinaciones en agua de consumo. Las muestras deben ser mineralizadas por via húmeda para oxidar los minerales y solubilizarlos, a fin de realizar una aspersión sobre la llama, a exepción del Hg, que debe ser reducido, ya que es volátil como elemento. 8.- Análisis cromatografico de vitaminas , contaminantes, aditivos La cromatografía líquida de alta performance con detección UV se puede aplicar a vitaminas, pesticidas, toxinas vegetales, aminoácidos. Con detección de IR a hidratos de carbono La cromatografía gaseosa se puede aplicar a ácidos grasos (sus derivados metilicos), agroquímicos, tóxicos fúngicos, aromas, sabores y productos de alteración volátiles

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II.- ALGUNOS METODOS PARTICULARES DE ANALISIS 1.- ALIMENTOS PROTEICOS 1.1.- Carnes Preparación de la muestra: La muestra debe ser homogeneizada y reenvasada herméticamente. Si se trata de enlatados, se utiliza un envase entero. Si se trata de chacinados embutidos, se separa el envoltorio, que se analiza por separado a) Proteínas El análisis de carnes frescas arroja valores ínfimos de carbohidratos y fibra, siendo sus principales componentes: la proteína ( factor de expresión de nitrogeno = 6,25), lipidos y agua. El contenido de cenizas suele ser inferior al 1%. Por lo tanto, a fin de definir la calidad del corte, suele utilizarse las expresiones "Proteína libre de grasa" (contenido proteico porcentual respecto del peso magro) o "equivalente en carne". Este valor debe ser menor del 25% (indicaría un alto contenido de grasa) y no menor de 22% (indicaría un corte de bajo contenido proteico). El método de elección es el de Kjeldahl. Se utilizan 2 g de muestra, catalizadores sulfato de potasio anh. 15 g y sulfato de cobre 0.5g o selenio y oxido de selenio o Zn, Hg y Oxido de mercurio) y 25 ml de ac. sulfúrico cc. b) Agua: La adición de agua durante el envasado o fraccionamiento es desenmascarada por determinación de la pérdida por goteo (debe ser inferior al 7,4 %) , excepto en aves tratadas con polifosfatos. La determinación del contenido acuoso por métodos químicos debe arrojar valores menores del 72% para carne magra, siendo aún menor para cortes diversos( picada: 65%). Los métodos de desecación en estufa son lentos. Organismos especializados (CITECA, AOAC, ISO) normatizan la disgregación de 5g de la muestra en 15 g de arena calcinada, con ayuda de 5 - 10 ml de etanol. Este se evapora a 80ºC y luego se seca en estufa a 105ºC durante 2-8 horas (ISO 1442) Se puede aplicar la destilación directa empleando la trampa de Dean-Stark y xileno o tolueno como solvente de arrastre. Es aconsejable utilizar 10 g de muestra para multiplicar el volumen obtenido por 10 y expresar el resultado en g%. También se recomienda utilizar un colorante soluble en una u otra fase para mejor visualización del resultado. c) Rancidez en la grasa extraída Se extrae la grasa con cloroformo, como se describió en la sección

I, se filtra el extracto

desecándolo sobre sulfato ferroso, evaporando el residuo a sequedad. Se pesa el residuo y suspende en alcohol neutro. Se titlula los Ac. grasos libres con hidróxido de sodio 0.1 M contra fenolftaleína. Suelen aceptarse valores de AGL no mayores de 1,2 g de ac. oleico por 100 g de grasa extraída. Para ello se utiliza el factor de expresión correspondiente (0.028245 g/ml de ác. oleico equivalen a 1 mL de una solución 0.1 N, o sea que se multiplica el volumen gastado en ml por 0.028245, obteniendose los g de ác. oleico contenidos en es residuo obtenido por extracción clorofórmica). Hacer la corrección necesaria para expresar % g de grasa Alternativamente se puede determinar el índice de peróxidos en la grasa extraida, como se describe en la sección correspondiente a Grasas. (ISO 1444) Alternativamente, la industria frigorífica utiliza el método de Gerber, originalmente diseñado para lácteos con algunas modificaciones: Se introduce en el butirómetro( ver capítulo de leche) 2,75 g de muestra homogeneizada con 8 ml de agua caliente (60-70ºC) y 10 ml de ac. sulfúrico cc. Agitar rápidamente, agregar 1 ml de alcohol amílico . El valor obtenido, debe multiplicarse por 4 ya que el butirómetro fue calibrado para mostrar el contenido de grasa /100 g de muestra, utilizando 11 ml de leche como muestra ( 2,75 x 4 = 11) d)Estimación del contenido de sal adicionada: Las sal, adicionada como elemento saborizante y conservante debe limitarse a fin de proteger a la población que sensible a problemas de hipertensión. Las cenizas, enfriadas en desecador, correspondientes a 2 g de muestra, se disuelven en 100 ml de agua. Se introducen en un erlenmeyer y se agrega 2 ml de cromato de potasio 10%. Se titula con solución de nitrato de plata 0.1 N hasta viraje del amarillo al rojizo. ! ml de solución de nitrato de plata 0.1 N equivale a 0.003546 g de cloruros o a 0.005844 de sal. Se expresa el % de cloruros o de sal /100g de muestra. e) Nitratos y nitritos adicionados: La adicíón de estas sales tiene por objeto inhibir el desarrollo microbiano, pero también producir un color rojizo deseable ( nitrosomioglobina). Su contenido máximo se encuentra legislado por el CAA (200 ppm como nitrito sodico, máximo) . La AOAC y otros organismos internac. recomiendan la determinación de nitritos por el método de diazotación ( con ac. sulfanílico y 1-naftol ) y para los nitratos, su reducción a nitritos empleando una columna de vidrio rellenada con Cd. Este se prepara Pag 8 de 23

reduciendo en el momento sulfato de Cd con Zn. La muestra atraviesa dicha columna en un medio ácido, siendo reducido el nitrato a nitrito, el que posteriormente es valorado por diazotación Preparación de la muestra: Las muestras se homogenizan de inmediato. Pueden conservarse hasta 4 dias a 0ºC. Se macera 5 g de muestra en 100 ml de agua a 80-100 ºC ( calentando 30 min a reflujo). Se enfría y agrega agente desproteneizante ( dicloruro de mercurio, sol sat, o AcZn 25 %por ejemplo). Se filtra ( con ayuda de celite si fuera necesario ) y clarifica. Nitratos: Se utiliza 10 ml de filtrado. Se agrega 1 ml de ac. sulfurico cc. sobre baño de hielo, agitando. Luego, 0.25 ml de solución de brucina 0.1% recientemente preparada. Se lleva a ebullición durante 30 minutos, enfriando luego. Se lee la absorbancia a 420 nm, realizando una curva de calibración con nitrato de sodio 0.01 g / ml. Nitritos: a) ANA :Se utiliza 10 ml de filtrado, se agrega 1 ml de ac.sulfanílico 0.6 % en ac. acetico 50% o ác. clorhidrico 10%. Se deja reposar 10 min. Luego se agrega 1 ml de alfa naftilamina 0.1% en AcH 50% o ClH 10%. (disuelta previamente en un mínimo volùmen de agua) y 1 ml de buffer de AcNa 0,2M pH 4,5. Se deja reposar 10 min y se lee la absorbancia a 543 nm Se realiza una curva de calibración con solución de nitrito de sodio 0.01 g / ml, utilizando 0.1- 0.2- 0.5 y 1 ml de solución patrón. Nitritos b) NED: Alternativamente se utiliza como reactivos de diazotación sulfanilaminda (0.5g en 150 ml de AcH al 15% y 2,5 ml de NED ( 0.2 g de clorhidrato de N-(1-naftil)etilendiamina en 150 ml de AcH 15%. Se lee la absorbancia a 520 nm realizando la correspondiente curva de calibración. f) Nitrógeno básico volátil De principal aplicación en pescados, se aplica sobre 50 g de muestra macerada en agua corriente. Se destila como se procedió para el Kjeldahl añadiendo 1-2 g de oxido de Mg durante 20 minutos exactos 1.2.- Huevos Extracto seco: estufa de vacío a no mas de 25 mm de Hg y 98-100ºC, utilizando 5 g de producto Nitrógeno total: Método de Kjeldhl utilizando 2-3 g de producto Grasa: Metodo 16.008 de AOAC( Röse-Gottlieb): Se debe realizar un ataque ácido utilizando 3 -5 g de huevo y 10 ml de ClH. Se lleva a baño de 70ºC y se eleva lentamente la temperatura a ebullición Se mantiene 30 min. agitando vigorosamente a intervalos de 5 min. Se enfría y extrae con eter (25 ml)-eter de petróleo liviano (25 ml). Se separa la fase orgánica, deseca, evapora y pesa el residuo Cloruros totales: se determinan sobre ceniza como se describió para carnes ( 1.1 .e, método de Vohlard )(Se adiciona hasta 10% de sal en huevos congelados) Glucosa:En

la

cromatográficos

secciòn

II.4

se

discuten

diversos

métodos

aplicables,

aunque

se

prefiere

( los huevos deshidratados pueden mostrar valores bajos por utilizaciòn de

glucosa-oxidasa-catalasa y peróxido de hidrógeno a pH 6-7 para reducir el desarrollo microbiano o por accion de levaduras.)(los huevos conservados por congelaciòn o deshidratacion,destinados a confiteria suelen ser adicionados para su mejor conservaciòn) Indices químicos del deterioro de huevo Determinación de ac. succínico y láctico ( productos que no aparecen en huevos frescos). Metodos AOAC 16034 y 15.012 se basan en una extraccion contínua y separación por cromatografía de partición. En forma opcional se puede aplicar cromatografía gaseosa. -Nitrógeno amoniacal ( huevos frescos no contienen mas dse 1 mg N amoniacal %): Metodo de N basico volátil -Flotaciòn en soluciòn 10% de cloruro sódico ( huevos frescos no flotan, huevos envejecido flotan por su mayor cámara de aire) -Observaciòn a transluz: con una luz puntual e intensa, se observa el tamaño de la cámara de aire (huevos fresco tiene una profundidad de hasta 3 mm,tolerándose hasta 7 mn) 2.- GRASAS Y ACETIES 2.1.-Características físicas y química Características fisicas: El Indice de refracción ( 25ºC según AOAC p. 437, 1980), peso específico ( IRAM 5504 a 25/4ºC) y rango de fusión son las más frecuentes. Permiten la certificación de la pureza de un aceite si coinciden con los valores tabulados típicos (Tipificación). Características químicas: a) relacionados con el tipo de aceite en estudio, su composición caracteristica: composición en ac. grasos, ac. grasos insaturados, tamaño de los ac. grasos, indice de acetilo, carbonilo , identificación de comuestos característicos de uno u otro aceite. b) estudio del grado de alteración del aceite o grasa: rancidez hidrolítica y/o oxidativa. 2.2. Tipificación de aceites y grasas Pag 9 de 23

Grado de insaturación determinado por el índice de iodo:(AOAC 26.020 y 26021) Se emplea Reactivo de Hanus como halogenante (monobromuro de iodo formado por adicion de 13,2 g de iodo en un litro de AcH y luego bromo hasta duplicar el contenido de halógeno. Para ello se titula la solución anterior con tiosultado de sodio 0.1N y se calcula la normalidad de Iodo. Luego se prepara una solución de 3 ml de bromo en 200 ml de AcH. Se titula ésta con tiosulfato previo agregado de IK 15%. Se adiciona la cantidad conveniente de la solución de bromo a la de iodo. ) o alternativamente Reactivo de Wijs ( monocloruro de iodo). Procedimiento: Se pesa 0.2 g de grasa o 0.15 de aceite en un erlenmeyer con tapa esmerilada seco. Se disuelve con 10 ml de cloroformo y agrega 25 ml de reactivo de Hanus. Al cabo de 30 min. De reposo, se añade 10 ml de IK 15% y agitar. Luego añadir 100 ml de agua destilada libre de cloro, limpiando el iodo del tapon. Titular el iodo con tiosulfato de sodio 0.1 N hasta decoloración. En el punto final, agregar almidón 1% para verificar la desaparición del iodo. (blanco - muestra) x O.1N x 12,69 Indice de iodo = -------------------------------------------------------------peso de la muestra Estimación del peso molecular promedio: indice de saponificación: (AOAC 26.029) Se define el indice de saponificación como los mg de KOH necesarios para saponificar por completo 1 g de aceite. El reactivo saponificante se prepara hirviendo a reflujo durante 30-60 minutos 5-10 g de KOH en 1,2-1,5 l de etanol en presencia d 5 g de Aluminio. Se destila un litro de alcohol descartando los primeros 50 ml ( KOH 40 g / litro ) Aproximadamente 5 g de aceite se calientan a reflujo, durante 30 minutos o hasta que la solución sea límpida con 40-50 mL de la solución . Finalmente se titula el exceso de KOH con ClH 0.5N, contra fenolftaleina. El PM del KOH es 56,1, de modo que los ml de ClH gastados deben multiplicarse por 28,05 para expresarlos como g de KOH ( 0.5 meq/ml x 56.1 mg/ meq) 28,05 ( titulo blanco-titulo muestra) Indice de saponificación =

----------------------------------------------------------peso de la muestra

Residuo insaponificable:(IRAM 18/99196)(AOAC 26.071) Incluye todos los compuestos insaponificables por alcalis, insolubles en agua y solubles solventes orgánicos. Reúne los hidrocarburos saturados y no saturados, alcoholes de alto PM, esteroles, tocoferoles, retinol, colorantes liposolubles. Constituye menos de 2% de la muestra, pero puede incluir aceites minerales en caso de fraude. Se procede como se describió para el indice de saponificación . Una vez titulada la muestra, se alcaliniza nuevamente con KOH 4 % y se añade 40 ml de agua. Se extrae en ampolla de decantación con 3 fracciones de 50 ml de eter etílico o de ml de éter de petróleo ligero. Lavar las fases orgánicas reunidas con alcali y luego agua hasta reacción neutra al tornasol (a fin de eliminar jabones ácidos). Filtrar sobre sulfato sodico anhidro y llevar a sequedad. Expresar el resultado en g/100 g de aceite. El residuo puede utilizarse para la detección de aceite mineral (AOAC 26.086) utilizando un butirómetro.. Indice de Reicher-Meissl: Numero de ml de alcali 0.1 N necesarios para neutralizar los ac. grasos volatiles solubles ( fundamentalmente butírico y caproico) en 5 g de grasa o aceite. 5 g de la muestra se saponifican con NaOH 5% en glicerol . Se agarega 135 ml de agua y destila luego en medio ácido ( por adición de 6 ml de sulfurico) recogiendo 110 ml de destilado. Este se enfria a 15ºC y filtra por pael seco. Para el Indice de RM se utilizan 100 ml exactos del filtrado, los que se titulan con NaOH 0,1 N contra fenolftaleina. Se realiza un blanco Indice de R.M.

=

1,1

x ( Muestra - blanco )

Indice de Polenske Numero de ml de alcali 0,1N necesarios para neutralizar los ác. grasos insolubles ( principalmente caprílico, cáprico y láurico) en 5 g de grasa . Se procede como se describió anteriormente pero se utiliza el contenido del papel de filtro. Se lo lava con agua y redisuelven en etanol. Se titula con NaOH contra fenolftaleina Indice de Polenske =

ml de NaOH

( No es necesario multiplicar por 1,1 porque se utilizó el total de los ac. grasos insolubles) Indice de acidos grasos libres Se expresa como mg de KOH requeridos para neutralizar los ácidos grasos libres presentes en 1 g de grasa. Pag 10 de 23

Se disuelve 1- 2 g de muestra en etanol-éter neutros y se titula con NaOH 0.05 N. Puede expresarse tambien como g de ac. oleico/ 100 g de muestra. En este caso, se utiliza el factor de conversion corespondiente ( 1ml de NaOH 0.1 N equivale a 28,24 mg de ac. oleico) Indice de éster o neutralización Se obtiene por diferencia entre el indice de saponificación y acidez. Corresponde a los mg de KOH necesarios para neutralizar los ésteres presentes. Resulta útil para estimar el peso molecular promedio de los ac. grasos de la grasa. Peso molecular promedio de los ac. grasos

=

56,1 / indice de acidez

Peso molecular promedio de los ac. grasos esterificados =

3 x 56,1 / indice de saponificación

Pruebas para aceites específicos Algodon: El reactivo de Halphen ( S2C en alcohol amilico) por calentamiento a 110ºC durante 2 horas da color rojizo. Esta prueba revela concentraciones de hasta 1% de aceite de algodon adulterante Sesamo . El reactivo de Villavecchia ( furfural 2% en etanol) produce color rosa en la fase inferior. Adicionando agua, se torna rojizo. El reactivo detecta hasta 0.5% de aceite de sésamo adulterante. Mani: (AOAC 26.078) se basa en la insolubilidad de ac. araquídico ( previa saponificación) en etanol acidificado. Colza: Adulterante del aceite de oliva, posee importantes cantidades de ac. erúcico. Colesterol: Grasas de origen animal: El método de elección es de Cromatografia en fase gaseosa, que permite identificar el Colesterol ( origen animal ) o fitoesterol ( origen vegetal). En su defecto, se aplican otros métodos colorimétricos. Dado que el colesterol se encuentra en el insaponificable, es necesario redisolver el residuo de saponificación en el solvente adecuado para su evaluación. 2.2 b) Indices de rancidez Indice de acidez: Como ya se describió mas arriba, puede ser utilizado como un indicador de la rancidez hidrolítica Indice de Kreiss 10 ml de muestra en un tubo de ensayo, se adiciona de 10 ml de ClH, se agita y se agrega 10 ml de floroglucina 0,1% en éter y agita. Color rojizo en la capa ácida indica enranciamiento oxidativo incipiente (ensayo similar al indice de peróxidos en este sentido) Modificación de Kerr ( semicuantitativo): se procede a diluir el aceite original con 9 volumenes de vaselina y/o con 19 volumenes de vaselina. Reacciòn positiva en esta última dilucion indica estado definitivamente rancio. Indice de Tiobarbitúrico (TBA) El ác. tiobarbiturico en soluciòn acuosa da un color rosa en presencia de aldehidos. Resulta un indicador ùtil de las fases tardías del enranciamiento oxidativo. Indice de Peróxidos (AOAC 26.024) Se pesa 5 g de muestra en un erlenmeyer con tapon esmerilado. Añadir 30 ml de Cloroformo-AcH (3:1) y agitar. Añadir 0.5 ml de IK saturado ( solución recientemente preparada y que no presente coloración por agregado de almidón, En caso afirmativo, decolorar con tiosulfato de sodio 0.1N). Esperar exactamente 1 minuto y añadir 30 ml de agua. Titular el iodo liberado con tiosultato de soodio 0.01 N, dejando caer gota a gota mientras se agita. Añadir almidon 1% para hacer más preciso el punto final. Realizar un blanco. Indice de peróxidos =

(meq perox./Kg grasa) =

ml

x

N

x

1000 / g de muestra

3.- ANALISIS DE ALIMENTOS LACTEOS Toma y conservación de la muestra Teniendo en cuenta que las muestras se deterioran rápidamente, se conservarán a 0-4ª hasta un máximo de 8 horas. Se homogenizarán una vez llevadas a temperatura ambiente previo su análisis Extracto seco Por pesada ( Método AOAC 15.014) pesando 5 g de muestra evaporando en baño vapor hasta residuo blanco y luego en estufa a 98-100ºC durante 3 horas, enfriar pesar . Densidad Por medio de un Lactodensímetro calibrado en grados Quèvenne (25 -30ºQ, correspondiente a una densidad de 1.0025-1.0035) con corrección de por temperatura. Por convención la densidad se expresa a 15ºC y se suma o resta 0,24 unidades Q por cada grado por arriba o debajo de 15ºC respectivamente. La densidad permite estimar el extracto seco mediante la siguiente fórmula E S = 0,25 ºQ + 1,22 (% grasa) + 0,72 Pag 11 de 23

Proteínas ( AOAC 15.017) Método de Kjeldhal utilizando 5 g de muestra Grasa ( Método de Babckock AOAC 15.030 y 15.087) para leches Se utiliza un recipiente volumétrico especialmente diseñado ( Gerber para leches y Babcock para cremas), una centrífuga especial de mayor diámetro a lo habitual. Se pipetea con exactitud 11 ml de leche dentro del butirómetro, agregando 10 mL de acido sulfúrico 90% ( es muy importante la concentración, suficiente para hidrolizar los complejos lipo-proteicos pero no para producir su carbonización) y 1 mL de alcohol amílico ( dens 0,811, que actuará mejorando la separación de la fracción grasa respecto de la acuosa). Se agita hasta disolución de la fracción lipídica. Se tapa y coloca el butirómetro en un baño a 65ºC en forma vertical con el tapón hacia abajo. Luego de 5-10 minutos se centrifuga a más de 600 rpm durante 5 minutos. El butirómetro se coloca nuevamente en el baño a 65ºC y se lee en la escala graduada el contenido graso porcentual. Para otros derivados lácteos líquidos ( crema, helado, manteca) se utilizan equipos de vidrio más grandes y para quesos se utiliza el método de Rose-Gotlieb Lactosa: Método polarimétrico ( AOAC 15.026) La muestra debe ser clarificada y diluida aprovechando la presencia de lactosa como hidrato de carbono mayoritario Lactosa:Método gravimétrico (AOAC 15.028) Se precipita en medio alcalino y ebullición sulfato cuprico en forma cuantitativa y proporcional al hidrato de carbono reductor presente Cenizas (AOAC 15.016) Se pesa aproximadamente 5 g de muestra en una cápsula que se lleva a residuo sobre la llama y luego calcina a 500ºC Acidez total (AOAC 15.0004) Se debe medir con exactitud 20 mL de muestra en una cápsula, añadir agua libre de dióxido de carbono e indicador fenolftaleína. Titular con NaOH 0,1N hasta rosa persistente La acidez se debe expresar en términos de % de ác. Láctico por 100 mL muestra ( 1ºDorinc equivale a 0,01% de acido láctico). 1 mL de NaOH 0,1 N equivale a 0,009 g de acido láctico Otros metodos para detección de aguado en leches Descenso crioscópico Indice de refracción Relación Proteína/Grasa en leche entera Metodos para la detección de adulterantes Formaldehido :Se utilizan acidos fosfórico y acido cromotrópico en caliente obteniéndose color púrpura Agua oxigenada: Se utiliza oxido de vanadio en acido sulfúrico, el cual torna a rosa o rojo. Cloro : Se utilizan los reactivos usuales para detección en aguas de consumo ( ver más adelante) Métodos para estimar el grado de desarrollo de la flora microbiana Prueba de reductasas o azul de metileno La actiivdad reductora propia de la leche se ve incrementada por la presencia de microorganismos, observándose decoloración del indicador en un medio libre de oxígeno. Se ha estandarizado la prueba rigurosamente: La muestra debe dejarse 24 hs a temperatura ambiente (21ºC) antes de la prueba. 10 mL de leche se introducen en un tubo de ensayo provisto de tapón de goma. Con cuidado y sin alterar la superficie se deposita 1 ml de azul de metileno 0,005% acuoso). Se tapa e invierte el tubo 2 veces. Se incuba a 37ºC en oscuridad. La prueba se considera satisfactoria si NO se decolora el azul al cabo de 30 minutos. Métodos para corroborar el proceso térmico empleado - Prueba de turbidez en presencia de sulfato de amonio La leche pasteurizada o esterilizada muestra una precipitación total de la albúmina y caseina en presencia de sulfafo de amonio, aún cuando sea estéril. La leche sometida a ulta-calentamientos o no calentada da negativo. - Prueba de fosfatasas alcalinas ( AOAC 15.049, 15.154, 15.157 y 15.199) La actividad fosfatásica presente el leche cruda desaparece por calentamiento a temperaturas mayores a 70ºC. El sustrato utilizado es p nitrofenilfosfato en buffer carbonato, cuantificandose el nitrofenol liberado luego de una incubación a 37ºC en forma colorimétrica - Prueba de Peroxidasas La actividad peroxidada desaparece por calentamiento a 100ºC. Se utiliza como reactivo dador de oxígeno agua oxigenada y se mide la oxidación enzimática de un sustrato colorimétrico, como la tetrametilbencidina por ejemplo Pag 12 de 23

4.-ANALISIS DE JUGOS Y ALIMENTOS AZUCARADOS Determinación de contenido acuoso Debido a la posibilidad de caramelización se debe utilizar el secado en estufas de vacío. Determinación de azúcares totales Métodos químicos: colorimétricos, titrimétricos, precipitación de oxido cuproso Métodos físicos: Indice de refracción, polarimetría, densimetría Grados BRIX En este tipo de alimentos, los métodos se estandarizan utilizando grados sacarímetricos o BRIX utilizando soluciones de sacarosa “normal” o 26%. Para cada tipo de solución azucarada o alimento y para cada método, se expresa el valor respecto del que tendría una solución de sacarosa. Por ejemplo : el porcentaje de sólidos de un alimento es 4ºBrix, indica que tiene la misma cantidad de sólidos que una solución 4% sacarosa.

Si la densidad es 4ºBrix indica que la densidad es tal

como la de una solución 4% sacarosa. Los sacarímetros ( polarímetros calibrados) indican 100ºBrix en su escala para el ángulo obtenido cuando la luz polarizada previamente filtrada por dicromato de potasio incide sobre una solución normal de sacarosa contenida en un tubo de 200 mm. En un equipo así, se obtienen valores estandarizados de angulos de rotación específicos. Este valor específico, propio de cada azúcar

[ α ] = 100 x α / 20 mm x cc muestra.

Como el valor de la rotación específica de cada sustancia varía con la temperatura, para mezclas de azúcares se pueden establecer sistemas de 2 ecuaciones con 2 incógnitas midiendo los ángulos de rotación a 2 temperaturas diferentes. Determinación enzimática de glucosa Se utiliza el metodo de glucosa oxidasa para el desarrollo de una reacción colorimétrica en presencia de agua oxigenada. Metodos cromatográficos ( HPLC) Los hidratos de carbono, en su mayoría pueden ser separados por cromatografía líquida de lata performance y detectados por Indice de refracción. Determinación de acidez La acidez se determina por titulación de 25 de jugo con NaOH 0,1 N El valor obtenido se expresa como mg del ácido predominante por 100 mL de jugo. Relación ºBrix/acidez La relación óptima para el sabor es 8-20, es decir que el % de azúcar es aproximadamente 10 veces mayor que la acidez expresada en mg de ácido % MIELES Es muy importante en mieles el exámen organoléptico ( turbidez, aroma, sabor) la observación microscópica (polen, almidón, restos de abjas) y la detección de agroquímicos. En cuanto al análisis químicos, se determina la acidez, expresada como ácido fórmico y la determinación de adulteraciones: Ensayo de diastasas La actividad propia de la miel se encuentra reducida por calentamiento o por envejecimiento. Se diluye aproximadamente 5 g de miel con 10 mL de agua y agrega 1 mL de solución de almidón 1%. Se incuba 1 hora a 45ºC. Se enfría y agrega 1 mL de solución yodo-ioduro ( 1 g de yodo, 2 g de ioduro, 300 mL de agua). Las mieles naturales frescas no presentan cambio de color ya que el almidón se ha hidrolizado por acción de las diastasas. Mieles envejecidas o calentadas por sobre la temperatura de pasteurización presentan coloración violácea o roja. Detección de azucar de caña: Reacción de Fiehe La presencia de 5-hidroximelfurfural o metilfurfural producto del calentamiento de sacarosa comercial se detecta en presencia de resorcina al 1% en HCl concentrado. Utilizar 5 gr de miel y suspender en 5 mL de eter etílico. Detección de dextrinas Azúcares de alto peso molecular precipitan en medio hidroalcohólico. Se toma un volumen de miel y se suspende en 10 veces ese volumen de alcohol.

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5.- ALIMENTOS RICOS EN HIDRATOS DE CARBONO ANALISIS DE GRANOS Las muestras representativas ( 1-5% del peso total) se embolsan herméticamente, mezclando cantidades iguales de los diferentes sacos o recipientes de almacenaje. Si se toma de cinta transportadora, se toma a intervalos regulares y se mezclan. a) análisis fisico: Se determina el peso de un determinado volumen, con lo cual puede inferirse el tamaño del grano o su contenido en agua b) análisis con equipos automatizados: Una vez calibrados para una determinada variedad de granos ( contrastando las medidas fisicas de conductividad termica, Reflectancia al Infra Rojo u otra medida fisica , con determinaciones quimicas indicadas mas abajo), pueden utilizarse estos equipos para determinaciones rápidas de contenido de nitrógeno, agua, hidratos de carbono, grasas, etc. c) contenido de agua, nitrogeno y otras determinaciones quimicas: se procede a la molienda de los granos y su posterior analisis como se describe mas abajo. Es aconsejable determinar la actividad de agua de los granos a los fines de su preservación optima. ANALISIS DE HARINAS 5.1.- TIPIFICACIÓN SEGUN CAA (Grado de extracción) a) determinación del contenido de agua: Sobre 5 g de muestra existen 3 posibilidades: - Por calentamiento en estufa a 98 -102ºC con vacío durante 5 horas (AOAC ) Este procedimiento evita la caramelizacion de azucares libres y es el mas exacto. - Por calentamiento a 130ºC durante 1 hora (AOAC ) metodo rapido y conveniente para un análisis aproximado. Tambien es posible a 155ºC durante 15 min. - o por destilación y arrastre con éter de petróleo utilizando una (recordar que al ser la concentración de agua menor al 15%, g de muestra, a fin de asegurar que se recojan al

trampa de Dean-Stark debe utilizarse por lo menos 40

menos 5 ml de agua en la trampa

El contenido de agua se expresa en g /100 g de harina con precision de 1 decimal b) determinación de la capacidad de absorción de agua. Se determina la cantidad de agua que es capaz de absorber 25 g de harina. Se expresa como peso de agua absorbida por 100g de masa, sin decimales. Este indice se utiliza para tipificar harinas. c) determinación del contenido de cenizas: La calcinacion se realiza a temperaturas moderadas para evitar la volatilizacion de cloruros ( 500-550ºC). Si la calcinacion se torna dificil , se deja enfriar y humedece con agua destilada o nitrato de amonio, se seca y se vuelve a calcinar. El dato de cenizas, muy util de por si para la tipificacion de harinas segun el CAA y para la determinacion del grado de extraccion, tambien se aplica como paso previo para la determinacion del contenido de minerales en harinas (calcio, hierro), para examinar su solubilidad en ácido clorhidrico diluido, contenido de sodio, acidez, alcalinidad, etc. El contenido de cenizas se expresa en g /100 g de harina con presicion de 3 decimales. Es posible que la adicion de creta (200-400 mg /100g) a la harina incremente los valores de cenizas hallados, por lo que debe determinarse tambien el calcio presente en la misma ya sea con equipos de absorcion atomica o por titulacion con Calcon. Habitualmente esta contiente 15-20 mg de calcio/100 g de harina.Reglamentaciones internacionales obligan la fortificacion con calcio y hierro de harinas blancas. El contenido de hierro puede valorarse en las cenizas utilizando equipos de absorcion atomica o por complejometria con o-fenantrolina. d) determinación del contenido de proteinas: Se aplica el metodo de Kjeldahl ya descripto Para el calculo del contenido porcentual de proteinas, se multiplica el valor de nitrogeno por 5,71 para el caso del trigo y por 6,25 para el resto de los cereales. El valor de proteinas se expresa en g/100g harina con 1 decimal. 4.2.- OTRAS DETERMINACIONES DE INTERÉS determinación del contenido de fibra bruta Se realiza como se ha descripto oportunamente segun las tecnica descripta en AOAC determinación del contenido de grasa: (AOAC) Se procede a una extraccion de 2 g de muestra con eter etilico en un equipo de Soxhlet durante 4 horas.El resultado se expresa en g/100g de harina con un decimal. Se puede utilizar el residuo para la busqueda de blanqueadores clorados. determinación del contenido de fibra dietaria: se procede como se ha descripto oportunamente segun la tecnica estandarizada por la AOAC determinación de acidez: Puede titularse el extracto eterero, alcoholico o acuoso, obteniendose una medida del deterioro de la harina durante su almacenaje. Corrientemente se determina electronicamente por medio de un pHmetro calibrado. En harinas frescas, el valor debe oscilar entre 5,8 y 6,2. Un valor menor indica alteracion por desarrollo microbiano.Se pesa 10 g de harina, que se suspenden en 100 Pag 14 de 23

ml de agua destilada neutra. Se deja en remojo 30 min con agitacion ocasional. Se decanta y determina el pH del sobrenadante. determinación del contenido de hidratos de carbono: Estos incluyen : almidon, fibra total o dietaria, dextrinas, maltosa, pentosanos y azucares libres. La determinacion de almidon por hidrolisis acida total dara resultados elevados por inclusion de hidrolisis parcial de fibra dietaria, pentosanos, etc. Se utliza 2,5 g de harina, que se mezclan con 50 ml de agua y se deja reposar 1 hora. Se pasa a un filtro y se lava con 250 ml de agua a fin de eliminar las sustancias solubles ( otros azucares), solucion que se reserva para su analisis posterior. El residuo se calienta a reflujo durante 2,5 horas con 20 ml de ClH ( dens. 1,125) y 200 ml de agua. Se neutraliza y diluye a 250 ml. Se valora el contenido de azucares por el metodo en uso para tal efecto ( Fehling, ferrocianuro, Lane y Eynon, cromatografico, glucosa oxidasa,etc.) El valor obtenido se multiplica por 0.9 ya que el almidon incorpora agua al hidrolizarse, incrementando asi su peso. Este valor corresponde al contenido de Almidon ( expresado en g/100g de harina). Debe sumarse el valor correspondiente a la solución de azucares obtenidas en la primer etapa del analisis para obtener el contenido de Hidratos de carbono totales. Si solo se desea este ultimo valor, puede omitirse el filtrado y lavado inicial y proceder directamente a la hidrolisis acida. Para evaluar la cantidad de almidón, evitando incluir el contenido de fibras, se utiliza una hidrolisis enzimática con diastasa a 55ºC durante no menos de 1 hora. Se completa la determinación como se indicó mas arriba, a partir de: Se neutraliza y diluye… determinaciòn del contenido de almidón dañado o actividad diastásica o indice de maltosa: ( Metodo de Blish y Sandstedt). a) Desproteinización : Una muestra de 5 g de harina y una cucharadita de arena calcinada se mezclan con solución buffer acetato pH 4,7 e incuba 1 hora a 30ºC, agitando ocasionalmente. Se añade 2 ml de solucion sulfurico 1:10 y 2 ml de wolframato de sodio 12%. Se mezcla y deja decantar. Se filtra por papel Whatman nº4, descartando las primeras gotas que no son límpidas. b) Reacción: Se toma 5 ml de filtrado en un tubo de ensayos. Se agrega 10 ml de solución alcalina de ferrocianuro de potasio y se hiervie durante exactamente 20 min. Se enfría y adiciona acido acético, acetato de Zn , 1 ml de almidon 3% como solución indicadora. Se titula el iodo liberado con tiosulfato de sodio 0.1N. Se realiza un blanco , valor que se resta de la titilación de la muestra. Los ml titulados se expresan como mg de maltosa y se expresa el contenido de maltosa en 100g . Detección de aditivos Sales de calcio y fosfatos (Antipegajosos) :se determinan sobre cenizas. Persulfato de amonio y otros oxidantes: Reaccion azul a la bencidina 0.1% en solucion alcoholica diluida (50%) en ClH 50% Oxidantes: Bromatos y persulfatos se detectan rociando una fraccion de harina extendida sobre un vidrio de reloj con IK 2% en ClH dil (1:10) . Aparecen manchas pardas. Bromatos y cloruro amonico: Extraer 30 de harina con 50 ml de eter de petroleo. Evaporar el solvente y someter el residuo a la llama: halogenos dan llama verde. Vitamina C: Se cuantifica por titulacion con 2,6 diclorofenol, indofenol (decoloracion del indicador 0.1 % en solucion acuosa) o por determinacion cromatografica Peróxido de benzoilo: Se trata una alicuota de harina con hidroxido de sodio/acetona, obeniendose ac. benzoico. Este se cuantifica luego de convertilo en ac. salicilico. 5.3.- CALIDAD PANADERA Contenido de gluten : Se trata de una determinacion empirica, altamente dependiente de las condiciones de trabajo. Se puede realizar en forma manual, pero lo habitual es recurrir a un equipo automatizado, para evitar variaciones interpersonales. Se amasa 25 de harina con 15 ml de agua en un mortero hasta que se separe la masa del borde. Se deja en reposo 1 hora y luego se lava el bollo bajo canilla hasta que no se elimine mas almidon. Esto se comprueba escurriendo el bollo sobre una probeta con agua limpida, observando que se mantenga la transparencia de la misma. Conviene utilizar un colador para evitar perdidas de material durante el lavado. Una vez escurrida, la masa se pesa ( gluten humedo) y se seca ( 24 horas a 100ºC o 1 hora a 130ºC) y vuelve a pesar ( gluten seco). El valor de gluten seco se expresa en gr/100 de harina con 1 decimal de precision. Ensayos fisicos: Ver más adelante 5.4.- ADULTERANTES detección de harina de centeno como adulterante de harina de trigo: Se suspenden 5 g de harina en 20 ml de alcohol 70º, agitando durante 15 min. Enfriar en baño de hielo durante 10 Pag 15 de 23

min.Centrifugar y separar el sobrenadante. Añadir a 10 ml del filtrado, o.5 ml de NaOH 1 N. La harina de trigo permanece clara mientras la de centeno se pone turbia e incluso precipita. detección de harina de soja Agitar 3-5 g material con 5ml de urea 2%. Incubar el tubo a 37ºC durante 2 h, t apado flojamente, intercalando un papel tornasol. Si existe soja, la ureasa presente libera amoniaco, que vira el tornasol al violeta. La presencia de proteinas de soja puede detectarse electroforeticamente. 5.5.- ENSAYOS FÍSICOS Trataremos solo 2 de los múltiples aparatos que existen para evaluar la calidad panadera de harinas y ayudar en el cálculo de la capacidad de absorcion de agua de una masa, resistencia al amasado, viscosidad, y otros parámetros de uso en la industria. Extensimetro

o Alveografo de Chopin: Ya sea por extension de un rodillo de masa o por

insuflamiento de aire bajo un trozo circular de masa, el objetivo es determinar la elasticidad maxima de la masa ( la que depende del contenido de prolaminas de esta) y la extensibilidad o cohesion de ella ( que depende en mayor medida del contenido de glutelinas ). Cuanto mayor sea la elasticidad (E), mayor es el volumen de aire insuflado o distancia recorrida antes de que se rompa la masa , representada por el pico en el grafico. La masa se retrae por cohesion y disminuye lentamente el valor de E registrado hasta que finalmente se rompe, luego de un tiempo F, para un volumen de aire o distancia G. Harinas fuertes presentan valores de E altos, que disiminuyen lentamente y finalmente la masa se rompe de golpe ( se pincha el globo o se deshilacha el rodillo. F resulta corto y G resulta alto. Harinas debiles presentan picos E bajos, rapidamente caen a G bajos y F prolongados ( baja cohesion, baja elasticidad) : Harinas con oxidantes presentan E altos ( ya que se incrementa la elasticidad principalmente, pero la cohesion no se incrementa, siendo F largos y G bajos.( la masa se pincha rapidamente pero tarda en desinflarse o cortarse por la baja cohesion. Farinografo de Brahbender y similares: Son amasadoras en que se registra la fuerza que deben hacer las paletas durante el trabajo de amasado. Puede utilizarse para calcular la capacidad de retencion de agua y por lo tanto la cantidad exacta de agua a agregar para la fabricacion de pan con determinada partida de harina ( analisis diario). Esto se realiza registrando la viscosidada a medida que se agrega agua. Cuando esta comienza a decaer, significa que hay agua libre. Tambien puede agregarse una cantidad predeterminada de agua inicialmente y registrar el tiempo que tarda en alcanzar el pico (A) o tiempo minimo de amasado(B); la altura del pico, en unidades de viscosidad (A), es decir la fuerza maxima desarrollada ;el tiempo de amasado maximo (c) a partir del cual la viscosidad decae o estabilidad de la masa y la diferencia entre viscosidad maxima y minima (D) que depende de la cohesion de la masa. Harinas fuertes dan altos valores de A , que se mantiene un prolongado tiempo C y un bajo D. Harinas debiles dan bajos A, con largos B, y un decaimiento de la viscosidad importante y rapido. La adicion de mejoradores incrementa la elasticidad o la diferencia D acortando el tiempo B e incrementando A. 5.6.- CONTENIDO DE VITAMINAS DEL COMPLEJO B Y NIACINA: Se utilizan tecnicas microbiologicas ( laboriosas, costosas y lentas ) o cromatograficas (HPLC) 5.7.- ANALISIS DE PRODUCTOS DE PANIFICACION a) Determinacion de agua, nitrogeno, grasa, cenizas, fibra, sodio : Tecnicas habituales b) determinacion de volumen especifico: . Relaciones Vol/peso de 4,2-4,3 corresponden a panes normales. Valores mayores indican uso de mejoradores y valores menores, de insuficiente calidad de la harina. c) Pan "lactal": se determina la cantidad de lactosa presente, aprovechando que esta no es fermentada durante la elaboracion del pan. utilizando el metodo de Fehling o cromatograficamente. 5.8.- ANALISIS DE PASTAS ALIMENTICIAS a) Determinacion del contenido de agua, grasa, nitrogeno, fibra y cenizas, por los metodos habituales b) determinacion de la presencia de huevo: se evalua el colesterol presente luego de extraerlo con metanol y cuantificarlo por metodos enzimaticos,similares a los utilizados para la determinacion de colesterol en sangre ( Método de colesterasa) o cromatograficamente (GC) El valor de colesterol obtenido, en g/100 g de pasta por 5 equivale al numero de huevos porcentualmente utilizados en la pasta. c) Determinación de acidez: titulación con NaOH 0.1N en medio hidro-alcohólico

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6.- BEBIDAS ESTIMULANTES 6.1.- CAFE Examen macroscópico y microscópico: Se identifican granos ajenos, trozos de vainas, achicoria si hubiere. Los granos de cafe (reconocibles por su vaina central) y sus fragmentos flotan en agua fría, los excesivamente tostados no lo hacen. Determinación de humedad:(Método AOAC 14.010) Se toma una muestra de 5 g . Se des eca a temperatura de ebulllición y a presión menor de 100 mm de Hg o a 105 - 110 ºC durante 5 horas o más si fuera necesario. Determinación de cenizas El café es combustible, por lo que se lo lleva a residuo en una cápsula amplia sobre mechero. Luego se calcina a 550-600ºC durante 1 hora. Las cenizas se conservan para análisis posteriores. Si se desea realizar varios análisis conviene comenzar con una muestra de 5 - 8 g. Determinación de cenizas insolubles en Ac. clorhídrico 10% Se suspenden las cenizas de aprox. 2 g de muestra en 50 ml de ácido HCl 10%. Se separa el sobrenadante por filtración con papel Whatman ashless. El papel y su contenido se calcinan a 550ºC. El peso del residuo se refiere a la cantidad de muestra utilizada. Determinación de cloruros en cenizas ( Método de Vohlard AOAC 6.065) Se redisuelven las cenizas de aprox. 2 g de muestra en 100 ml de agua. Se prepara una solución patrón de nitrato de plata 0.1N. ( 1 ml de esta solución equivale a 0.03546 g de cloruros ) Se agrega 0.5 g de carbonato de calcio y 2 ml de cromato de potasio a la solución de las cenizas y se titula con nitrato de plata hasta viraje al rojo. El resultado se expresa en g cloruro /100 g cenizas En la solución utilizada: g de cloruros = V x N X 0.3546 Referir a los gr de cenizas utilizados para preparar esa solución Sulfatos en cenizas: La cenizas correspondientes a aprox. 2 g de muestra se disuelven en 100ml de agua . Se toma una alicuota de 10 ml , a la que se agrega unos cristales de cloruro de bario. Se agita .Se realiza simultaneamente una curva patron con cantidades crecientes de sulfato de sodio 0.01M ( 1, 2, 4, 5 ,10 ml ) Se completa el volumen con agua destilada a 10 ml y se agrega cristales de cloruro de bario. Se lee la absorbancia de las soluciones a 420 nm. Extracto acuoso: ( % de cafe que resulta solubilizado ) No es similar al extracto seco Se suspende 2 g de cafe molido en 100 ml de agua calentando a reflujo durante 1 hora. Se filtra y retorna el residuo al matraz, agrega otros 100ml de agua y vuelve a calentar otra hora. Filtrar nuevamente, lavando el matraz a fin de extraer todo el residuo. Lavar el residuo con agua caliente, enfriar y enrasara 250 ml. Tomar 50 de la solución obtenida para desecar, primero a baño maria y luego en estufa. Pesar y expresar el resultado como porcentaje de residuo soluble sobre muestra en base humeda. Determinacion de piedras y polvos Se separan por levigacion de los granos de café Extracto metilico( cafe tostado)( tec. An. Asoc.Quimica 29-153-1941) Se extrae 2 g de muestra en Soxhlet con eter etilico durante 6 hs. El cafe desgrasado se seca y pasa a un Erlenmeyer de 250 ml. Se agrega 10'0 ml de metanol puro. Se cierra y tara. Se calienta a reflujo 45 min., al cabo de los cuales se enfria se completa el peso inicial con metanol. Se filtra por papel plegado y se toma 25 ml de extracto exactamente medido para su evaporacion a 100105ºc y desecado durante 3 horas. El peso del residuo se refiere a 100g de muestra. Contenido de cafeina ( Metodo de Bailey y Andrew AOAC) Se suspende 10 mg de OMg en 100 ml de agua , en una capsula de porcelana y se le agrega a 10 g de muestra pulverizada,5 g de cafe instantaneo o de te o yerba. Se macera durante 2 horas, con calentamiento a ebullicion, al cabo de las cuales se enfria y filtra. Una fraccion de 200 ml del filtrado es hidrolizado mediante ac. sulfurico al 10% (20 ml) y luego se extrae con cloroformo ( fracciones de 25, 20, 15, 10 y 10 ml). El extracto organico se reune y se trata con NaOH 1% y separa la fase organica. El cloroformo es evaporado y el residuo se procesa para la determinacion de nitrogeno utilizando el metodo de Kjeldahl. El valor de nitrogeno obtenido, multiplicado por 3.464 corresponde al valor de cafeina en el polvo. Actualmente se utilizan metodos de cromatrografia gaseosa para la determinacion de cafeina o el Método de Cortés ( ver "Analisis de Te") Acidos volatiles y no volatiles ( malico, oxalico, citrico, tartarico, piruvico, valerianico, butirico, propionico, acetico y formico). Se investigan por cromatografia gaseosa Componentes volatiles diversos ( aldehidos, cetonas, metanol, cianuro de alilo, furano, pirrol, acetato de metilo, isopreno, etc.) .Se determinan por GC con deteccion de masa Determinacion del acido clorogenico: ( Metodo AOAC 14.025) Se toma 1 gr de muestra y suspende ne 400 ml de agua hirviendo. Se calienta rapidamente a ebullicion durante 15 min. Se enfria, se enrasa en un matraz de 500 ml, y filtra, descartando los primeros 20-25 ml. Se toma 10 ml de filtrado, lleva a 100 ml y se determina la absorbancia a 324 nm contra blanco de agua, valor que se toma como blanco. Otra fracción se le agrega 10 ml de solucion basica de acetato de plomo ( agente clarificante). Llevar a baño hirviendo durante 5 minutos y luego enfriar rapidamente. Agitar 1 hora y luego filtrar, descartando los primeros 20-25 ml. Leer la absorbancia a 324 nm. Realizar una curva de calibracion con ac. clorogenico con correccion del valor del clorogenato de plomo (0.00045/5) La importancia de su determinacion deriva del gusto amargo que le brinda al cafe. Sedimento en el cafe soluble Pag 17 de 23

Se pesan 5 g de cafe instantaneo en un vaso de 250 ml. Se añade 200 ml de agua caliente (a temp. no inferior a 85ºC) Agitar y filtrar utilizando un algodon "lintane" a temperatura no menor d e 60ºC. En el filtrado se determina el extracto acuoso como se indicó mas arriba. Grasa Se deseca a 100ºC y extrae con eter de petroleo durante 16 horas en Soxhlet. (AOAC 14.029) Analisis del aceite de cafe Se procede segun se ha descripto oportunamente para el analisis de Indice de acides, indice de iodo, indice de refraccion, de saponificacion, materia insaponificable y peso especifico. Azucares: Preparar una solucion que contenga aprox 1% de producto seco, clarificada y neutra. Para ello se utiliza Acetato de plomo neutro, eliminando el exceso de este con oxalato de potasio anhidro y neutralizando. El acetato de plomo se prepara a partir de litargirio (oxido de plomo) calcinado (130 g ) y acetato de plomo (430g) hervidos en 1 litro de agua durante 30 min.10 ml de esta solucion, se agrega 10 ml de solucion de cobre ( 34,639 g de sulfato de cobre pentahidr. en 500 ml de agua, solucion filtrada),20 ml de solucion de acetato de sodio ( 500 g de acetato de sodio trihidr. en 800 ml de agua) y 10 ml de agua. Agitar, tapar y llevar a ebullicion durante 20 minutos. Enfriar bajo canilla y añadir 25 ml de iodatod de potasio-ioduro de potasio (5,4 g de iodato +60 g de ioduro disueltos en 500 ml de agua, a la que se agrega 0.25 de hidroxido de sodio y se lleva a un litro). Agitar . Vertir 40 mls de ac. sulfurico 2N (57 ml/l) rapidamente. Luego agregar 20 ml de oxalato de potasio saturado (165 g%). Agitar hasta disolucion total. Titular el exceso de ioduro con tiosulfato de sodio 0.1 N (25 g de tiosulfato pentahidr. /litro). 1 ml de tiosulfato 0,1N = 6,354 mg de Cu. Realizar un blanco de agua y restar del valor obtenido. Titular cantidades conocidas de glucosa en estas condiciones para obtener una grafica de interpolacion. 6.2.- ANALISIS DE TE Analisis macro y microscòpico Se analiza la porcion insoluble en agua en busca de pigmentos, Se extiende cierta cantidad de te entre 2 hojas de papel blanco. Se aplica una plancha caliente sobre la hoja superior, las parafinas y ceras tiñen el papel. Se inspecciona visualmente o con ayuda de una lupa los residuos remanenetes por aplastamiento de hojas de te sobre papel blanco.Se observa la presencia de cristales, epidermis inferior, neural, apex, floemas, parenquima, pelos simples, celulas en empalizada, tallo, vasos, tejido cortica, etc. Humedad Se procede a la desecacion en estufa a 100-105ºC Cenizas totales, insolubles en HCL, Se procede como se describio anteriormente Cenizas extraibles en agua: Hervir 2 g de te molido con 100 ml de agua durante 1 hora bajo reflujo, filtrar a un matrz aforado de 250 ml. Regresar el residuo y volver a hervir otra hora. Reunir los filtrados, lavando el residuo con agua caliente. Enfriar el filtrado y enrasar a 250 ml, mezclar. Tomar una alicuota de 50 ml para determinar el residuo seco Referir a 100 g de muestra. Extracto acuoso: Se añade 200 ml de agua a 2 g de producto molido, se calienta en una matraz de 500 ml con un tubo de seguridadd de 75 cm, que actua como refrigerante. Se calienta suavemente durante una hora, con agitacion ocasional. Finalmente se toma una alicuota de 50 ml para evaporar a sequedad y determinar el residuo seco. se refiere a un peso de 100 g y se expresa como porcentaje Grasa: se procede igual que para el cafe ( extracto en eter de petroleo liviano) Cafeina : Metodo de Cortes sobre el producto seco (Normas de Análisis CAA Boletin Informativo del Ministerio de Salud y Accion Social, suplemento 430 , l989 Pesar 2 g de muestra en un Erlenmeyer de 100 ml . Agregar 4 ml de Ac. sulfurico cuidando que no se formen grumos, homogeneizar. calentar sobre baño de agua 15 minutos. A continuacion agregar 50 ml de agua hirviente. Romper los grumos carbonosos con una varilla y filtrar de inmediato. Lavar el vaso y el filtro con 3 porciones de 10 ml de agua caliente acidulada. Recibir los filtrados en una ampolla de decantacion y enfriar. Alcalinizar con una solucion concentrada de NaOH .Enfriar nuevamente. Agregar 30 ml de cloroformo. Agitar, y dejar separar las capas. Recoger el cloroformo en un balon tarado filtrando y repetir la extraccion 2 veces mas. Destilar el cloroformo hasta reducir a 20 ml. Evaporar en baño de agua , secar en estufa y pesar. Pag 18 de 23

Alternativamente se puede leer la absorbancia de la fase organica (realizar un espectro de absorcion entre 246 y 298 nm. La abs. max de cafeina corresponde a 272-276 nm) y comparar la lectura del extracto de la muestra con una curva de calibracion realizada previamente con cafeina en agua (00,1 mg/ml) Tanino :(Metodo AOAC 14.048 sobre producto seco) Hervir 5 g de muestra coon 400 ml de agua, enfirar y transferir a un matraz de 500 ml y enrasar. Tomar 10 ml de esta solucion, filtrada si fuera necesario y 25 de solucion de carmin indigo (6 g de producto , 50 ml de ac. sulfurico, y llevado a 1 litro con agua) y 750 ml de agua. Dejar caer desde bureta, solucion de permanganato de potasio 0.1N ( 1,33 g / litro, contrastado contra ac. oxalico 0.1N patron primario) hasta viraje al verde claro. Continuar gota a gota hasta color amarillo brillante. Los mililitros utilizados se anotan como A Tomar 100 ml de infusion clara de te, agregar 50 ml de solucion de gelatina ( 25 g en sol sat de NaCl, calentando hasta que disuelva y llevar a 1 litro con sol sat de NaCl), 100 ml de solucion acida de NaCl, y 10 g de caolin en polvo. Agitar. Dejar sedimentar y decantar. Filtrar. Mezclar 25 ml de filtrado con 25 ml de carmin indigo y 750 ml de agua. Titular con permanganato de potasio como antes. (vol B). A - B = ml de permanganato requeridos para oxidar taninos en estas condiciones 1 ml de permanganato 0.1 N equivale a 0.0042 ag de tanino (ac. galotanico) Fibra Cruda Metodo AOAC ya descripto 6.3.- ANALISIS DE YERBA MATE Analisis macro y microscópico: Se observa las caracteristicas morfologicas, frecuencia de tallos, etc. Se utiliza el Metodo de Scala antes descripto Analisis de humedad, cenizas, cafeina, extracto acuoso: semejantes a los descriptos para te 6.4.- ANALISIS DE CACAO Analisis macro y microscópico: Se observa el pigmento moreno, granos de almidon pequeños, casi incloros, pelos en forma de cachiporra y cristales de grasa. Humedad: 100-105ºC en estufa Cenizas, cenizas insolubles en HCL, en agua , fibra bruta: como se describio anteriormente Almidon de cacao Se desgrasa 8 g de muestra y se pesa 5 g de residuo seco. Se pasa a un matraz, se adiciona 100 ml de alcohol 12%, agita y lava con 20 ml de alcohol industrial. Se lava el residuo extraido en un matraz con 50 ml de agua libre de amoniaco. Se calienta en un baño Maria durante 20 min y se enfria. Se adiciona 0.1 g de diastasa en agua y se mantiente a 50-55ºC durante 2 horas. Se enfria, lleva a 250 ml y filtra. Se mezcla 200 ml de filtrado con 20 ml de HCl (dens 1,125) y se calienta en baño maria durante 3 horas. Se enfria, neutraliza, y se lleva a 250 ml. Se determina los azucares reductores con Sol de Fehling y calculandolos como dextrosa ( Dextrosa x 0.9 = almidon). Grasas de cacao: Se pesa alrededor de 1 de producto molido y se coloca en el fondo de un separador de Jacobs Singero o similar. Se agrega 10 ml agua y se agita para formar una pasta. Se agrega 2 ml de amoniaco,se agita y se hierve suavemente durante 5 min. en baño de agua hirviente. Se enfria y adiciona 11 ml de alcohol Se procede luego segun el metodo de Rose Gottlieb. En las grasas de cacao se estudiaran: punto de fusion , indice de refraccion, peso especifico, numero de acido, indice de ioduo, materia volatil a 105ºC, sustancias insolubles en hexano, hierro, Arsenico, cobre, plomo, indice de saponificacion. Solidos no grasos de cacao: Se determina el contenido de teobromina y de cafeina Teobromina En un frasco de 500 ml adicionar 2 g de muestra, 270 ml de cloroformo y 10 ml de sol. amoniaco. (10%NH3 m/m) Tapar y agitar durante 5 min. Adicionar 12 g de sulfato de sodio anh. Agitar y dejar reposar durante la noche.Filtrar y lavar con 100 ml de cloroformo. Destilar el solvente y eliminarlo a 100ºC. Agregar 50 ml de agua a la teobromina extraida y hervir.Enfriar, neutralizar con NaOH 0.1M ( 1 o 2 gotas contra rojo de fenol 0.1% en alcohol). Adicionar 20 ml de nitrato de plata 0,1 M. Titular el acido que es liberado, con NaOH hasta color rojo indicador ( pH 7, 4). 1 ml de NaOH= 18,0 mg de teobromina Arsenico, plomo, cobre: Se recomiendan metodos de Absorcion Atomica Grasas de leche: Se calcula en base de la caseina. Esta se extrae del chocolate por su propiedad de ser soluble en oxalato de sodio. Se parte de 10 g de chocolate desgrasado, se agrega 200 ml de solucion de oxalato 3%. Se deja reposar durante 4 horas con agitacion frecuente. Se filtra y determina N en una alicuota del filtrado. Otra alicuota se utiliza para precipitar las proteinas con AcH glacial y determinar el contindo de N en el filtrado remanente. La diferencia, multiplicada por 6, 38 corresponde al N de caseina. Azucares Pag 19 de 23

Se utilizan tecnicas para valorar azucares sobre la muestra privada de grasa. Se prepara una solucion al 5% se clarifica con ferrocianuro de Zn y se determina los azucares en el filtrado antes y despues de inversion con un metodo titrimetrico (Lane y Eynon o Luff y Shoorl). 7.- ANALISIS DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS 7.1- Análisis de vino Exámen organoléptico: Apreciación de aspecto ( límpido o turbio), color, aroma, acidez, sabor, cuepo, etc. Realizado por expertos, altamente entrenados. Puede separarse los precipitados , si los hubiera, para su estudio por separado. Constituyen los principales cualidades del vino. También son de importancia para la detección de alteraciones y adulteraciones, cortes con otro tipo de vino, etc. Análisis químico Peso específico Resulta un valor caracterísitico de cada vino y guarda relación con el Extracto Seco. Se determina empleando picnómetos o balanza de Mohr, normatizado a 15ºC. En el caso de vinos espumantes o carbonatados, es necesario eliminar las burbujas por agitación. Extracto Seco Se evapora 10 ml de vino a Baño María durante 1 a 2 horas, y luego 30 min a 100ºC en estufa o aún mejor: 6 horas a a70ºC en estufa de vacío. Cenizas: Se calcina 10 ml de vino a 600ºC, previa evaporación a sequedad. Las cenizas se reservan para la determinación de cloruros y/ alcalinidad en cenizas Grado alcohólico Se alcalinicza el vino y destila 100 ml, agregando 50 ml de agua. Se recoge exactamente 95 ml del destilado y se agrega 5 ml de agua. La densidad del destilado (o alguna medida física estandarizada (determinación directa o por picnometría, indice de refracción,refractimetría , etc) se correlaciona con tablas construidas a atal efecto con soluciones de distintas proporciones alcohol-agua. El grado alcohólico se expresa en % vol/vol. Valor frecuente para vinos : 9-13º. El valor final dependera de la resistencia de las levaduras a la presencia de alcohol y del contenido en azúcares del mosto. Azúcares reductores Se pueden aplicar métodos polarimétricos sobre al muestra despro-teinizada y clarificada con acetato de plomo ( el plomo remanente debe ser elilminado con carbonato de potasio y filtrado nuevamente). La rotación optica se mide en tubos de 20 cm. Luego de la fementación, el azúcar remanente es levulosa. Un valor positivo, de rotación, indicaría presencia de glucosa, es decir, fermentación incompleta. Cuando se sospecha la presencia de diversos azúcares, deben aplicarse los métodos sacarimétricos descriptos en Metodos generales. El contenido en azucares remanente oscila entre el 0.2% ( vinos secos) y el 6% ( vinos dulces) y 16% en Champañas. Es conveniente la aplicación de métodos cormatográficos ( HPLC con detector de Indice de refracción). Los métodos titrimétricos o colorimétricos pueden aplicarse sobre el vino clarificado. Extracto seco libre de azúcares: Resulta de interés calcular este valor como indicador de la concentración inicial del jugo y descartar el aguado en forma conjunta con adición de azúcar. PH Método 11.032 AOAC determina una calibración previa para el equipo con bitartrato de potasio, de modo que mida 3,55 a 20ºC. Acidez fija y volátil: Se define como acidez fija total, la candidad de álcali necesario para valorar el vino, hasta alcanzar un pH de 7,5 a 8,4 ( fenolftaleina. El valor resultante, expresado como ác. tartárico, representa el sistema buffer formado por el ácido y sus sales mono y polisódicas. ( 1 ml de NaOH 0.1N equivale a 0.0075 g de ac. tartárico). Es necesario eliminar el dióxido de carbono previamente por agitación. La acidez volátil está constituida por el ácido acético ( normalmente menor de 1 por mil) que se separa por arrastre con vapor ( igual que la destilación del vino para determinar grado alcohólico, pero sin neutralizar previamente) o por destilación al vacío. La acidez en el destilado se titula con NaOH 0.1N, de modo que un ml de base equivale a 0.006 g de ac. acético. Contenido de acidos tartárico, cítrico, láctico, succínico y otros: Pag 20 de 23

Si bien se ha usado con éxito métodos gravimétricos, actualmente, se prefieren métodos cormatográficos en fase gaseosa. -Detección de acidez mineral La titulación progresiva, con registro de la conductividad, permite detectar adulteración por agregado de un ácido mineral más fuerte. Los vinos, normalmente, responden en forma lineal a la titulación con álcalis, pero las sales de a´c.inorgánicos presentan una inflexión en el incremento de la conductividad En momento en que se forman las sales, de menor conductividad. Anhidrido sulfuroso Se puede utilizar una gran variedad e métodos, apliclables a todo tipo de alimentos, como por ejemplo el de destilación de Monier-Williamns (AOAC 29.78) para la determinación de anh. Total en hortalizas. Este consiste en la destilación de 100-300 ml de vino, recogiendo los gases en un frasco lavador, por el wque fluye gas nitrógeno. La salida pasa a un balón de 3 bocas. La segunda boca se conecta a un refrigerante con válvula de seguridad. La tercera a un refrigerante y éste a una serie de 3 tubos en U de tamaño estándarizado. En ,los tubos se introducen bolitas de vidrio, agua oxigenada 3% y indicador naranja de metilo. Dentro del frasco lavador se introduce solución saturada de pirogalol en medio básico. El frasco de 3 bocas debe ser introducido en una manta calefactora. Una vez introducida la muestra en el balón, se agrega ClH (dil 1+1) Se lleva a ebullición 2 horas y se comienza a hacer fluir nitrógeno por el lavador. Finalmente, se recoge el contenido de los tubos en U y se titula el anh sulfuroso atrapado con NaOH 0.1 N ( 1 ml de base equivalen a 3,2 ml de SO2) Los resultados pueden confirmarse por precipitación del anh., con bario y determinación gravimétrica del sulfato de bario formado. Para vinos blancos, puede utilizarse un método sencillo y directo, basado en la titulación del yodo remanente tras la oxidación en medio alcalino. El yodo setitula con tiosulfato de sodio 0,1 N, realizando un blanco en las mismas condiciones. Un ml de yodo 0,1 N ( y por lo tanto 1 m de tiosulfato 0,1N) equivale a 3,2 g de anh. Sulfuros. Para la determinación de anh.sulfuroso libre (de interés en vinos blancos oscurecidos durante la fermentación secundaria por acción de Botytis cenerea) puede titularse la muestra en medio ácido con yodo , frente a almidón. Hasta la aparición de color azul. Los ml de yodo por, su normalidad, representan los equivalentes de anhidrido presentes en la muestra. Sorbitol Su presencia en cantidades mayores de 200 mg/lt indica mezcla con vino de frutas. Se determina cromatográficamente, aunque existen técnicas gravimétricas disponibles, basadas en la precipitación del dibenzalsorbitol obtenido por adición de benzaldehido. Metanol Este se produce durante la hidrólisis de las pectinas del hollejo y es de interés su determinación en vinos de “grapa” ( hechos a partir de hollejos o orujos por destilación del fermento resultante) o al sospechar adulteracones con alcohol de quemar. Valores superiores al 1 por mil son tóxicos. Aunque actualmente se dispone de métodos cromatográficos ( CG con detector de masa) específicos, aún tienen valor los más antiguos, realizados sobre el destilado del vino utilizado para la cuantificación de etanol. a) método de ácido cromotrópico: 1 ml del destilado se acidifica con ac. fosfórico 20%y se oxida con permanganato de potasio al 1%. El exceso de permanganato se elimina con bisulfito de sodio. Se enfría y agrega acido 1,8dihidroxi naftalen 3,6 disulfónico en medio sulfúrico. En mido acuoso, lentamente se desarrolla un color violáceo cuantificable a 580 nm. b) Método del reactivo de Schiff: Se procede en forma similar a la técnica anterior pero elimando el exceso de permanganato con ac. oxálico. En medio ácido, el reactivo ( fucsina decolorada con anh sulfuroso)desarrolla color lentamente ( 12 horas) a violáceo cuantificable. c) Método AOAC 9.005: Se compara los valores obtenidos para el índece de refracción y peso específico en el destilado. Un valor relativamente bajo de refracción indica presencia de metanol. Existen tablas en las que se ha volcado el peso específico (15,6/15,6ºC) de soluciones etanol/metanol de diferentes proporciones, y la diferencia que le corresponde para el índice de refracción a 17,5 ºC. Estos métodos son aplicables para instrumentos perfectamente calibrados. Dióxido de carbono El método AOAC 11.056 utiliza la actividad de la anhidrasa carbónica en medio alcalino (NaOH 0.1N) para fijar el dióxido de carbono. La muestra debe ser conservada a 0ºC para evitar Pag 21 de 23

errores al pipetear. La titulación hasta pH 8,5 con ac. sulfúrico arroja el valor total de ácidos. Una titulación adicional una vez removido el dióxido de carbono por vacío ( 6-7 mm de mercurio) hasta pH 7,75 con NaOH 0,1 N permite valorar los ácidos distintos de ác. carbónico. Los ml netos de NaOH por su normalidad – los ml de ác. sulfúrico gastados por su normalidad son los equivalentes de anh carbónico , los que multiplicados por 44 y divididos por la cantidad de muestra tomada, equivalen a anh. Carbono/100 ml de vino. Nivel de glicerol: Se trata de un subproducto de fermentación alcohólica, cuya concentración es función de las levaduras utilizadas, frescura de las uvas, contenido de azúcar y sulfitado. Generalmente, presente en un 7-14% del valor de etanol. Resulta un indicador de posible agregado de alcohol o glicerina, con los fines de adulterar. Los métodos utilizados son antiguos y están siendo reemplazados por CG. Es posible la reacción con ac. iodhídrico para formar ioduro de isopropilo, de cual se precipita el ioduro con nitrato de plata y se determina gravimétricmente. Taninos Una pequeña alícuota de muestra se trata con reactivo de Folin-Denis (wolframato de de sodio-ac. fosfomolíbdico) solución saturada de carbonato de sodio. Se agita, lleva a volúmen y se compara con el color desarrollado con el de soluciones patrón de ac. tánico, tratado en iguales condiciones.

7.2- Análisis de Sidras El analisis de sidras resulta similar al de vinos gasificados, siendo de sumo interes para el CAA la determinacion de grado alcoholico ( minimo 4%), extracto seco reducido ( extracto seco - contenido de azucar, es decir 1,6 g% minimo) y cenizas ( 0.18% minimo 7.3- Cerveza Se aplican las tecnicas descriptas para vino con las siguientes modificaciones. Densidad: Se obtiene por densimetria previa evaporacion del alcohol y reconstitucion al volumen original con agua, con Hidrometro de Balling. Se expresa en grados Balling o sea g/100g a la temperatura. Esta se convierte en la corregida (20ºC) por medio de tablas. Para obtener el valor de extracto seco se multiplica el %g de azucar obtenido (grados Balling) x peso especifico de la muestra (g/ ml) Acidez: En cervezas oscuras es dificil ver el punto final de titiulacion contra fenolftaleina por lo que se realiza potenciometricamente (AOAC 10.024) Dioxido de carbono: se requiere de un equipo especialmente diseñado de modo de medir la presion del gas. Alternativamente se puede utilizar CG con detector de masa Correccion del valor de densidad del mosto original (GO) Se corrige para los casos en que el contenido de ac. acetico supera el 0.1% de acuerdo a tablas internacionalmente aceptadas. La intencion es incrementar el valor informado para la densidad del mosto original teniendo en cuenta la fraccion de este que genero ac. acetico. Tambien se conoce como "indicacion de espiritu" el valor obtenido por diferencia de la dens. del agua (1) y el de la densidad del destilado ( 0.99..) multiplicado por mil. El valor (1-20) tambien se corrige teniendo en cuenta la cantidad de alcohol que se transformo en ac. acetico ( recurriendo a tablas apropiadas), sumandole la fraccion correspondiente. Todas estas determinaciones apuntan a descubrir adulteraciones por aguado, una vez expedido el producto, ya que la cerveza tambien se comercializa "suelta" o "tirada". Conociendo los valores de densidad solo no seria posible evaluar si una disminucion del grado alcoholico se deba a aguado o fermentacion aerobica. Con el valor de densidad del mosto original corregido, se puede detectar aguados.

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Solidos totales: se puede calcular a partri de los valores de la densidad del extracto aplicando formulas empiricas. El Extracto primitivo se calcula como extracto seco % + 2 x contenido alcoholico %. Representa el extracto seco del mosto original ( antes de la fermentacion El grado de fermentacion se calcula como 200 x grados de alcohol% / Extracto primitivo Cromatografia en fase gaseosa con deteccion de masa: Se aplica actualmente a la cuantificacion de sustancias caracteristicas del sabor y aroma de la cerveza, a fin de asegurar un bouquet característico y similar entre partidas. Son de especial interes los componentes volatiles del mosto, entre ellos el diacetilo. Color: El color de la cerveza es objeto de estudios detallados. AOAC recomienda medir el coeficiente de extincion a 430 nm (color) y a 700 nm( claridad) Metales traza: Durante la elaboracion de la cerveza se deben utilizar diversos recipientes o cubas de metal, preferentemente cobre - bronce. Las latas contienen estaño y aluminio. Las tuberias pueden contener plomo, hierro, zinc. El cobalto se adiciona para regular la espuma (1ppm). La cuantificacion de los metales traza en cerveza es de capital importancia, preferentemente por espectrofometria de absorcion atomica

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