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REGISTRO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

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k ES 2 002 621 kN´umero de solicitud: 8602469 kInt. Cl. : C12N 15/00

11 N.◦ de publicaci´ on: 21

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˜ ESPANA

A23C 19/032 //(C12N 15/00, C12R 1:46)

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PATENTE DE INVENCION

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22 Fecha de presentaci´ on: 08.10.86

A6

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73 Titular/es: Microlife Technics, Inc.

1833 57th Street Sarasota, 33578 Florida, US

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30 Prioridad: 11.10.85 US 786631

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72 Inventor/es: Vedamuthu, Ebenezer R.

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74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Alberto

45 Fecha de anuncio de la concesi´ on: 01.09.88

46 Fecha de publicaci´ on del folleto de patente:

01.09.88

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54 T´ıtulo: M´ etodo para impartir resistencia a fagos a bacterias Streptococcus, as´ı como para hacer m´ as

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espesos los productos l´ acteos.

57 Resumen:

M´etodo para impartir resistencia a fagos a bacterias Streptococcus, as´ı como para hacer m´as espesos los productos l´acteos, en donde se transfiere a una cepa sensible a fagos un pl´asmido que codifica la producci´on de una sustancia mucoide (Mu+ ), de tal manera que, incluso si se elimina el pl´asmido por curado a altas temperaturas, la cepa sigue siendo resistente a los fagos. El espesamiento de productos l´acteos, sin adici´on de estabilizantes, se efect´ua incorporando a un producto que contiene leche una bacteria que incluye un pl´asmido transferido que contiene ADN derivado de un pl´asmido progenitor que codifica dicha sustancia mucoide, e incubando el producto que contiene leche con la bacteria resistente a fagos para desarrollar la sustancia mucoide y hacer m´as espeso dicho producto. El invento es ´util en relaci´on con fermentaciones, particularmente fermentaciones de leche.

Venta de fasc´ ıculos: Registro de la Propiedad Industrial. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

2 002 621 DESCRIPCION

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La presente invenci´on se refiere a un m´etodo para producir bacterias resistentes a fagos a partir de cepas sensibles a fagos de Streptococcus del grupo N de este g´enero. Adem´as, la presente invenci´on se refiere a nuevas composiciones bacterianas que incluyen cepas resistentes a fagos de Streptococcus del grupo N de este g´enero derivadas de cepas sensibles a fagos. La aparici´on de estreptococos l´acticos que producen una textura correosa y mucoide en la leche est´a bien documentada (Hammer, B.W., Iowa Agr. Expt. Sta. Research Bul. 74:260-270 (1923)). Tales estreptococos l´acticos correosa se usan en las leches fermentadas escandinavas llamadas taette (Foster, E.M. et al., Dairy Microbiology, p´ ags. 14-15, 48 y 332, (1957); Rasic, J.L. et al., Yoghurt-Scientific grounds, technology, manufacture and preparations, p´ ag. 194 (1978)), Swedish lang mjolk (Bottazzi, V., Biotechnology, Vol. 5, p´ags. 328, 345-346 (1983); Macura, D. et al., J. Dairy Sci. 67:735-744 (1984)) y Finnish villii (Saxelin, M. et al., Canadian J. Microbiol. 25:1182-1187) (1979). Forsen, R., Finnish J. Dairy Sci. 26:1 (1966), aisl´ o cepas mucoides de los tres estreptococos l´acticos, a saber Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis y Streptococcus lactis subesp. diacetylactis, a partir de villii finland´es. La inestabilidad de la caractertica mucoide en estreptococos l´acticos ha sido observada por varios investigadores (Foster, E.M. et al., Dairy Microbiology, p´ ags. 14-15, 48 y 332 (1957); Hammer, B.W., Iowa Agr. Expt. Sta. Research Bul. 74:260-270 (1923); y Macura, D. et al., J. Dairy Sci. 67:735-744 (1984)). Foster et al. indicaron que los estreptococos l´acticos mucoides conseguian o perd´ıan “caprichosamente” la propiedad productora de limo. Macura y Townsley encontraron que los estreptococos l´ acticos correosos perd´ıan la propiedad mucoide despu´es de 10 ´o 12 transferencias en serie; algunas cepas se vuelven no mucoides incluso despu´es de seis transferencias. Brooker (Brooker, B.E., J. Dairy Research 43:283-290 (1976) trabajando con un cultivo en leche pura de una cepa de S. cremoris espesa observ´ o variaciones considerables en la proporci´ on de c´elulas que producen material capsular extracelular. Tradicionalmente, en la producci´ on de leches escandinavas, se prefiere una temperatura de incubaci´ on baja, entre 13◦ C y ◦ ◦ ◦ on a temperaturas mayores que 27 C a 30 C produce una reducci´on considerable 18 C, porque la incubaci´ o una p´erdida de la alta viscosidad y calidad mucoide deseables (Bottazzi, V., Other Fermented Dairy Products, p´ ags. 328, 345-346. En: G. Reed (red.), biotechnology-Vol. 5, Food and Feed Production with Microorganisms. Verlag Chemie, Winheim, Rep´ ublica Federal de Alemania (1983); y Macura, D. et al., J. Dairy Sci. 67:735-744 (1984)). Se hab´ıa sugerido por la t´ecnica anterior inicial que la calidad mucoide pod´ıa proteger el Streptococcus l´actico frente a bacteri´ofagos; sin embargo, esto se ha demostrado equivocado. Sozzi et al., Milchwissenschaf 33, 349-352 (1978). La asociaci´on de varias funciones metab´ olicas en estreptococos l´acticos con ADN de pl´ asmido est´a actualmente bien admitida (McKay, L.L., J. Microbiol. 49:259-274 (1983)). Sobre la base de la inestabilidad observada de la caracter´ıstica correosa en estreptococos l´acticos, Macura y Townsley (Macura, D. et al., J. Dairy Sci, 67:735-744 (1984)) y McKay sugirieron que pod´ıa estar involucrado ADN pl´asmido en la expresi´on de fenotipo mucoide (Muc+ ). Un problema de la t´ecnica anterior es poder producir cepas resistentes a fagos de Streptococcus que sean miembros del grupo N. Ser´ıa muy deseable ser capaces de impartir resistencia a fagos a cepas de Streptococcus que sean sensibles a fagos, porque estas bacterias son muy importantes en fermentaciones comerciales para producir productos l´ acteos fermentados. McKay et al., Applies Environmental a asociada con pl´ asmidos. Microbiology, 47:68-74 (1984) describen resistencia a fagos limitada que est´ agina 22, trata de la resisKlaenhammer, J., Advances in Applied Microbiology 30, 1-29 (1984), en la p´ tencia a fagos codificada por pl´ asmidos. La resistencia a fagos no ha sido asociada con un pl´asmido de 18,5 Mdal en Streptococcus cremoris que codifica la calidad mucoide. Adem´as, se obtuvo Streptococcus cremoris NRRL-B-15995 como una colonia simple aislada de una cepa resistente a fagos, pero es un productor de a´cido lento y no es una cepa u ´ til por tanto para fermentaciones de leche. Un objeto de la prente invenci´ on es proporcionar un m´etodo para impartir resistencia a fagos a Streptococcus del grupo N que sean sensibles a fagos. Adem´ as, es un objeto de la presente invenci´ on proporcionar nuevas bacterias resistentes a fagos derivadas de cepas sensibles a fagos. Figura 1

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Es un dibujo de una electroforesis en gel de agarosa de ADN pl´ asmido de Streptococcus cremoris MS y sus derivados curados que muestra un pl´ asmido de 18,5 Mdal que codifica la producci´on de sustancia mucoide. Estos son los siguientes: (A) Cepa progenitora MS, (B) MS01, (C) MS02, (D) MS03, (E) MS04, (F) MS05 y (G) ADN pl´ asmido de referencia para determinaci´ on de tama˜ nos moleculares de escherichia coli V517. 2

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Figura 2

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Es un dibujo de una electroforesis en gel de agarosa de ADN pl´ asmido de (A) S. lactis ML-3/2.2, (B) S.lactis ML-3/2.201, (C) S. cremoris MS, (D) S. cremoris MS04, (E) S. cremoris MS0401, (F) S. lactis ML-3/2.202 y (G) ADN pl´ asmido de referencia para determinaci´ on de tama˜ nos moleculares de E. coli V517. Figura 3

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Es un dibujo de una electroforesis en gel de agarosa de ADN pl´ asmido de (A) S. lactis ML-3/2.202, (B) S. lactis de malta 4/4.201, (C) S. lactis subesp. diacetylactis SLA3.25, (D) S. lactis subesp. diacetylactis SLA3.2501 y (E) ADN pl´ asmidos de referencia para determinaci´ on de tama˜ nos moleculares de E. coli V517. 15

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La presente invenci´on se refiere a un m´etodo para impartir resistencia a fagos a bacterias Streptococcus que comprende: proporcionar una bacteria sensible a fagos del g´enero Streptococus grupo N que se lisa mediante un fago hom´ ologo; e introducir un pl´ asmido transferido en la bacteria sensible a fagos para producir por ello una bacteria resistente a fagos que es resistente al fago hom´ ologo, en donde el pl´ asmido transferido contiene ADN derivado de un pl´ asmido paterno que codifica una sustancia mucoide alrededor del exterior de Streptococcus cremoris (MS) NRRL-B-15995. Adem´as, la presente invenci´on se refiere a una bacteria resistente a fagos de la especie Streptococcus lactis o Streptococcus lactis subespecie diacetylactis en forma sustancialmente pura derivada de una bacteria sensible a fagos y que contiene ADN de pl´ asmido derivado de un pl´ asmido paterno que codifica una sustancia mucoide de Streptococcus cremoris (MS) NRRL-B-15995, en donde la bacteria resistente a fagos es resistente a un fago hom´ ologo, y a derivados resistentes a fagos curados con calor de la bacteria resistente a fagos con el pl´ asmido integrado en la bacteria de manera que sea inidentificable, generalmente en los cromosomas de la bacteria.

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La presente invenci´on se refiere tambi´en a una bacteria resistente a fagos de la especie Streptococcus lactis o Streptococcus lactis subespecie diacetylactis que se derivan de c´elulas protenitoras sensibles a fagos por transferencia conjugal de un pl´ asmida que codifica una sustancia mucoide de Streptococcus cremoris (MS) NRRL-B-15995. Adem´ as, la presente invenci´on se refiere a derivados Muccurados con calor de los transconjugantes resistentes a fagos que carecen del pl´asmido de 18,5 Mdal, que conservan a´ un resistencia a fagos hom´ ologos. Las c´elulas bacterianas pueden prepararse para su uso como un concentrado que tiene un pH entre aproximadamente 4 y 8 y que contiene como m´ınimo de alrededor de 1 x 107 c´elulas por gramo hasta aproximadamente 1015 c´elulas por gramo, usualmente entre aproximadamente 1 x 109 y 1012 c´elulas por gramo. Los concentrados pueden congelarse con o sin un agente estabilizante de la congelaci´ on tal como glutamato monos´odico, extracto de malta, leche desnatada en polvo, glicerofosfato de metal alcalino, ´acido glut´ amico, cistina, glicerol o dextrano o similares, y descongelarse despu´es para su uso, o pueden liofilizarse o secarse los concentrados por otros medios a un polvo, como es bien conocido por los expertos en la t´ecnica. Las c´elulas bacterianas se usan generalmente en un intervalo entre aproximadamente 105 y 109 c´elulas por ml de leche a fermentar, dependiendo del producto a producir. Todo esto es muy bien sabido por los expertos en la t´ecnica. La Patente de Los EE.UU. 3.420.742 describe diversos m´etodos de conservaci´on.

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La Patente de los EE.UU. 4.382.097 de uno de los presentes inventores describe cultivos mixtos que incluyen cepas productoras de sustancias mucoides (Muc+ ). Las cepas productoras de sustancias mucoides, resistentes a fagos, de la presente invenci´on pueden usarse en la preparaci´ on de estos cultivos mixtos con buenos resultados.

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El siguiente Ejemplo muestra el compromiso de ADN pl´ asmido (pl´asmido Muc) en la expresi´on del fenotipo Muc+ en Streptococcus cremoris MS. Adicionalmente, el Ejemplo muestra la transferencia conjugal de Muc-pl´ asmidos de un Streptococcus cremoris espeso a un Streptococcus lactis no mucoide (Muc− ), y del transconjugante de Streptococcus lactis mucoide resultante a una variante de malta de Streptococcus lactis (antes Streptococcus lactis var. maltigenes) y una cepa de Streptococcus lactis subesp. diacetylactis, y la expresi´on de fenotivp Muc+ en todos los transconjugantes. Las cepas de Streptococcus lactis y Streptococcus lactis subesp. diacetylactis transconjugantes resultantes son resistentes a fagos. La susceptibilidad a fagos del transconjugante de Streptococcus lactis de malta no se determin´ o debido a la indisponibilidad

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2 002 621 de un fago l´ıtico para la cepa progenitora. Se cree que es resistente a fagos.

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Cuando se desarrolla en leche a 24◦ C Streptococcus cremoris MS (NRRL-B-15995), fermenta lactosa agulo mucoide (correoso) (Muc+). Se aisl´ o Streptococcus cremoris MS por el (Lac+ ) y produce un co´ inventor a partir de productos l´ acteos, y no est´a disponible de ninguna otra fuente. Incubando Streptococcus cremoris MS a 38◦ C, se obtuvieron varios aislados no mucoides (Muc− ). Una comparaci´on de los perfiles de pl´asmidos de aislados mucoides y no mucoides mostr´o que estaba involucrado un pl´ asmido de 18,5 Mdaltones (pSRQ2202) en la expresi´ on del fenotipo mucoide. Adicionalmente, los experimentos de curado revelaron que, en Streptococcus cremoris MS, estaba asociado un pl´ asmido de 75,8 Mdaltones (pSRQ2201) con la capacidad para fermentar lactosa. Los derivados que carecen de pSRQ2201 no fermentan lactosa (Lac− ). En experimentos de apareamiento usando como donante Streptococcus cremoris MS, se transifiri´ o conjugativamente pSRQ2201 a Streptococcus lactis ML-3/2.2 Lac− . El Streptococcus o que el pSRQ2201 codificaba la utilizaci´on lactis ML-3/2.201 transconjugante era Lac+ , lo que confirm´ de lactosa.

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Por t´ecnicas de selecci´on indirecta usando marcadores gen´eticos para la utilizaci´ on de lactosa o la resistencia a fagos, se transfiri´ o primero conjugativamente pSRQ2202 de un derivado Lac− Muc− de Streptococcus cremoris MS (CepaMS04) a Streptococcus lactis ML-3/2.201 Lac+ Muc− . El Streptococcus lactis ML-3/2.202 transconjugante resultante era Lac+ y Muc+ . Subsiguientemente, comoviliz´o pSRQ2202 con pSRQ2201 en experimentos de apareamiento, de Streptococcus lactis ML-3/2.202 (NRRL-B-15996) (doasmidos, y a un Streptococcus nante) a un Streptococcus lactos 4/4.2 de malga Lac− Muc− , exento de pl´ lactis subesp. diacetylactis SLA3.25 Lac− Muc− . Los transconjungantes respectivos eran Lac+ y Muc+ , confirmando que pSRQ2201 y pSRQ2202 codifican respectivamente los fenotipos Lac+ y Muc+ . Con la transferencia de pSRQ2202, los transconjugantes Streptococcus lactis ML-3/2.202 (NRRL-B-15996) y Streptococcus lactiso subesp. diacetylactis SLA3.2501 (NRRL-B-151994) y 18-16.01 (NRRL-B-15997) no s´olo obtuvieron fenotipo Muc+ , sino tambi´en resistencia a fagos, que eran l´ıticos para las respectivas cepas progenitoras, a saber, Streptococcus lactis ML-3/2.201 y Streptococcus lactis supesp. diacetylactis SLA3.25 y 18-16. Las cepas marcadas con un n´ umero NRRL se depositaron en el Northern Regional Research Labaratory, Peoria, Illinois, y est´ an siponibles libremente para los que las soliciten por su nombre y n´ umero. Ejemplo 1 Materiales y M´etodos

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Cultivos y fagos Las cepas bacterianas usadas en este estudio se listan en la Tabla 1. TABLA 1 Cepas bacterianas

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Cepa Streptococcus

cromos´omicoa

Pl´ asmiodo (Mdal)

Ninguno

105,6, 75,8, 35,8, 18,5, 6,3, 5,8, 4,7, 3,0, 2,7, 1,5 105,6, 75,8, 6,3, 5,8, 4,7, 3,0, 2,7, 1,5 105,6, 75,8, 35,8, 6,3, 5,8 4,7, 3,0, 2,7, 1,5 105,6, 75,8, 18,5, 6,3, 5,8 4,7, 3,0, 2,7, 1,5 105,6, 18,5, 6,3, 5,8, 4,7, 3,0, 2,7, 1,5

Descripci´on o fuentea,b

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S. cremoris MS 50

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MS01

Ninguno

MS02

Ninguno

MS03

Ninguno

MS04

Ninguno

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Tipo silvestre; este estudio; Lac+ Muc+ Lac+ Muc− Lac+ Muc− Lac+ Muc− Lac− Muc+

2 002 621 TABLA 1 (Continuaci´on). Cepas bacterianas

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Cepa Streptococcus

cromos´omicoa

Pl´ asmiodo (Mdal)

MS0401

Ninguno

MS05

Ninguno

MS05.2

Smr Fusr

TR TR01

Ninguno Ninguno

105,6, 75,8, 18,5, 6,3, 5,8, 4,7, 3,0, 2,7, 1,5 105,6, 6,3, 5,8, 4,7, 3,0 2,7, 1,5 105,6, 6,3, 5,8, 4,7, 3,0 2,7, 1,5 No determinado No determinado

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S. lactis SLA 1.1 SLA 1.8 ML-3/2.2 ML-3/2.201

Smr Rifr Smr Fusr Smr Fusr

ML-3/2.202

Smr Fusr

ML-3/2.202.1

Smr Fusr

4/4.2 de malta

Rifr Fusr

Ninguno Ninguno 5,2, 2,2, 1,5 75,8, 5,8, 5,2 2,2, 1,5 75,8, 18,5, 5,8 5,2, 2,2, 1,5 18,5, 5,8, 5,2 2,2, 1,5 Ninguno

4/4.201 de malta

Rifr Fusf

75,8, 18,5, 5,8

Ninguno Rifr

41, 28, 6,4, 5,5, 3,4, 3,0 25,8, 5,5, 4,7, 3,4, 3,2

SLA 3.2501

Rifr

18-16.01

Ninguno

75,8, 25,8, 18,5, 5,8 5,5, 4,7, 3,4, 3,2 61, 28, 25, 5,5, 3,4 3,0

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S. lactis subsp. diacetylactis 18-16 SLA 3.25

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Transconjugante MS04; Lac+ Muc+ Lac− Muc− Lac− Muc− Smr Fusr Lac+ Muc− ; Cepa comercial Transconjugante Lac+ Muc+ (ML-3/2.202.1xTR) Smr , LM0230 Rifr , LM0230 Lac− ML-3, Smr , Fusr Transconjugante Lac+ de ML-3/2.2 Transconjugante Lac+ Muc+ de ML-3/2.201 Lac− Muc+ ML-3/2.202 Derivado curado con plasmido Rifr Fusr de S. lactis 4 de malta Transconjugante de 4/4.2 de malta; Lac+ Muc+ Cepa comercial Lac+ Muc− Derivado Lac− Rifr de cepa 18-16 Transconjugante de SLA 3.25; Lac+ Muc+ Transconjugante Lac+ Muc+ (ML-3/2.202.1x18-16)

Siendo: a b

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Descripci´on o fuentea,b

Fus-Acido fusdico; Rif-Rifampina; Sm-Estreptomicina; r-resistente

Lac+ -fermentador de lactosa; Lac− -negativo para lactosa; Muc+ -mucoide; Muc− -no mucoide.

El fago c2 lisa Streptococcus lactis C2 y Streptococcus lactis ML-3. El fago 643 es litico para Streptococcus lactis ML-3 y el fago litico (denoniminado fago 18-16) se cultiva en placas sobre Streptococcus lactis subesp. diacetylactis 18-16 y SLA 3.25. 60

Medio de cultivo y propagaci´ on Se propagaron rutinariamente cultivos que fermentaban lactosa (Lac+ ) en leche desnatada en polvo 5

2 002 621 (NFM) reconstituida al 10% a 24◦C durante 14-16 horas. Las cepas que eran negativas para lactosa (Lac− ) se desarrollaron en NFM est´eril fortificada con glucosa al 0,5% y extracto de levadura al 0,2% (FNFM). 5

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Se distribuyeron en viales criog´enicos y se guardaron en nitr´ ogeno l´ıquido cultivos madres desarrollados en NFM o FNFM que conten´ıan glicerol est´eril al 10% como crioprotector. Para su uso rutinario, se guardaron en un congelador mantenido a -60◦C viales adionales de cultivos. En experimentos de curado para eliminar el fenotipo Muc+ se us´o inicialmente NFM o FNFM. Despu´es, se utiliz´o caldo BMG (Gonz´ alez. C.F. et al., App. Environ. Microbiol. 46:81-89 (1983)), y para la selecci´on y purificaci´ on de colonias Lac− , se emple´o agar de BML (BMLA) descrito por Gonz´alez y Kunka. Se us´ o agar indicaro de leche (MIA) para la selecci´on y purificaci´ on de fenotipos que expresan variaciones de Lac y Muc (Lac+/− Muc+/− ) en experimentos de curado y apareamiento. El MIA se prepar´ o en dos partes separadas que, tras esterilizar y atemperar a 60◦ C, se mezclaron entre s´ı. La primera parte consist´ıa en agua destilada en la mitad del volumen final del medio (volumen final 1 litro), que conten´ıa la cantidad requerida de s´ olidos de leche desnatada para dar una concentraci´ on final del 5%; la segunda parte consist´ıa en la mitad restante de agua destilada que conten´ıa la cantidad requerida de agar para obtener 1,5% en el medio final, y 10,0 ml de soluci´ on acuosa al 0,8% de p´ urpura de bromocresol. Se desarrollaron cultivos de donante y receptor para apareamiento hasta fase logaritmica (6-8 horas a 24◦ C) en caldo de suero (cepas Lac+ ) en caldo de suero-glucosa (cepas Lac− ). El caldo de suero (WB) se prepar´ o en dos partes, se esterilizaron separadamente, y, despu´es de enfriar, se mezclaron entre si para hacer 1 litro de WB, se disolvieron 70,0 g de suero en polvo dulce (pallio Dairy Products Corp., Campbell, N.Y.) en 500 ml de agua destilada y se centrifug´ o para eliminar el residuo no disuelto. Se a˜ nadieron al sobrenadante claro 19,0 g de beta -glicerofosfato s´odico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), se mezcl´ o on del medio consistia en 5,0 g de bien y se esteriliz´o a 121◦ C durante 15 minutos. La segunda porci´ extracto de levadura, 10,0 g de triptona, 5,0 g de gelatina, 0,5 g de acetato s´ odico, 0,5 g de MgSO4 .7H2 O y 0,2 g de CaCl2 .2H2 O disueltos en 500 ml de agua destilada. Tras esterilizar a 121◦C durante 15 minuo caldo de suero-glucosa (WBG) tos, se mezclaron entre s´ı las dos partes al enfriar (a 50◦C). Se prepar´ incluyendo 5,0 g de glucosa en la formulaci´ on para WB. Se realizaron apareamientos en placas de agar de leche-glucosa (MGA) al 5% como se describe pro McKay et al. (McKay, L.L. et al., Appl. Environ. Microbiol. 40:84-91 (1980)). Curado

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Para curado por temperatura, se incubaron cepas de S. cremoris entre 38◦ C y 39◦ C; las cepas de Streptococcus lactis y Streptococcus lactis subesp. diacetylactis se incubaron entre 41◦ C y 42◦ C. Para on del 0,05% en BMG se incubaron durante eliminar el fenotipo Lac+ , cultivos inoculados en la proporci´ la noche a temperaturas elevadas y cultivaron en placas en diluciones adecuadas sobre placas de BMLA. Se confirmaron las supuestas colonias Lac− blancas por su incapacidad para fermentar lactosa, y se purificaron por aislamiento de colonia simple en BMLA. Para eliminar el fenotipo Muc+ , cultivos inoculados al 0,05% en NFM/FNFM o BMG se incubaron a temperatura elevadas durante la noche, y se cultivaron en placas con diluci´on adecuada sobre placas de MIA. Se seleccionaron colonias individuales en NFM on o espesamiento de (Lac+ ) o en FNFM (Lac− ) y se incubaron a 24◦C hasta que tuvo lugar coagulaci´ la leche. Se ensay´o luego la calidad mucoide de los cultivos con pipetas serol´ogicas graduadas de 1,0 ml. Se usaron como criterios de ensayo para establecer la calidad mucoide la resistencia a un flujo f´acil y la formaci´ on de correosidad (filamentos correosos largos) durante la ca´ıda libre desde la punta de la pipeta. Apareamiento

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En cada experimento de apareamiento, se utilizaron dos relaciones donante: receptor (es decir, 1:2 y 1:4). Las mezclas de apareamiento y los respectivos testigos de donante y receptor extendidos sobre placas de MGA se incubaron durante la noche a 24◦ C en una jarra anaerobia Gas Pak (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD). Se recogieron las c´elulas de la superficie de las placas de MGA con caldo Basal est´eril (BM, Gonz´alez y Kunka indicado previamente), usando 1,0 ml de BM por placa. Los lavados de cada serie de placas que conten´ıan una variable experimental (es decir, placas con c´elulas donantes o c´elulas receptoras o mezcla de apareamiento 1:2 o mezcla de apareamiento 1:4) se agruparon entre s´ı, centrifugaron y resuspendieron en 1,0 ml de BM. La suspensi´ on completa se cultiv´ o luego en placa sobre cinco placas de BMLA (0,2 ml por placa) que conten´ıa una concentraci´ on apropiada de f´ armacos selectivos. Se a˜ nadi´ o extreptomicina (Sm) para obtener una concentraci´ on final de 1.000 microgramos por ml; a´cido fus´ıdico (Fus) hasta una concentraci´ on final de 20 microgramos por ml y Rifampina (Rif) hasta una concentraci´ on final de 300 microgramos por ml. Las placas se incubaron a 24◦C durante 72 6

2 002 621 horas y se examinaron. Todas las colonias Lac+ se llevaron a NFM para ensayar la calidad mucoide. Se purificaron aislados mucoides por aislamiento de colonias de simples en MIA, y se sometieron a ensayos de confirmaci´ on. 5

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En experimentos de apareamiento en los que se us´o como agente selectivo un fago l´ıtico espec´ıfico, se resuspendieron c´elulas globulizadas recogidas de placas de MGA en 2,0 ml de lisado de fago de alto t´ıtulo nadi´ o a cado tubo un d´ecimo de ml de CaCl2 0,2 M, se mezcl´o lentamente y se (> 107 UFP/ml). Se a˜ dej´ o reposar durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente para adsorber el fago. Los contenidos de cada tubo se extendieron despu´es sobre 10 placas de BMLA (0,2 ml por placa). Para recuentos de entrada del donante, se cultivaron en placa diluciones sobre BMLA (Lac+ ) o BMGA (Lac− ). Los cultivos en placa para recuentos se hicieron inmediatamente antes de extender sobre MGA las mezclas de apareamiento y los testigos. Las frecuencias de transferencia se calcularon como el n´ umero de colonias mucoides por unidad de formaci´ on de colonia (UFC) del donante. Los experimentos de apareamiento se repitieron al menos una vez, y en algunos casos dos veces. Para excluir la transducci´on como un modo posible de transferencia gen´etica, se sustituyeron partes al´ıcuotas de cultivo de donante en mezclas de acoplamiento parelas por una cantidad igual de filtrados libres de c´elulas (filtro Millipore, tama˜ no de poros 0,45 micras, Millipore Corp., Bedford, MA) del donante. Para excluir transformaci´ on, se a˜ nadi´ o a la mezcla de apareamento antes de cultivar en placa y al MGA utilizado ADNasa con una concentraci´on final de 100 microgramos por ml. Como testigo negativo para mostrar que se necesitan c´elulas vivas para la transferencia gen´etica observada, se sustituyeron en mezclas de acoplamiento paralelas partes al´ıcuotas de cultivo de donante por porciones de cultivo de donante muerto por calor (ba˜ no de agua hirviendo durante 10 minutos). Ensayos de confirmaci´ on Los ensayos de confirmaci´ on se hicieron por hidr´ olisis de arginina (Niven, C.F., Jr. et al., J. Bacteriol. 43:651-660 (1942)), producci´ on de diacetil-aceto´ına a partir de citrato en leche (King, N., Dairy Industries 13:800 (1948)), y susceptibilidad a fagos espec´ıficos por ensayo de manchas sobre placas sembradas recubiertas de agar. Cuando fue necesario, se determin´o la resistencia o sensibilidad a marcadores de f´ armacos adicionales no seleccionados en los protocolos de apareamiento. Lisis de c´elulas y electroforesis

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Para un examen r´apido de cepas para pl´ asmidos, se us´ o el m´etodo descrito para Anderson y McKay (Anderson, D.G. et al., Appl. Environ. Microbiol. 46:549-552 (1983)). Se utilizaron los procedimientos descritos por Gonz´alez y Kunka (indicados anteriormente) para examen rutinario de ADN pl´asmido, y para preparar ADN de pl´ asmido purificado usando gradientes de cloruro de cesio.

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Procedimientos Experimentales Curado de fenotipo Muc+

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Experimentos iniciales con Streptococcus cremoris MS mostraron que la calidad mucoide (o correosidad) en esta cepa pod´ıa eliminarse f´acilmente incubando tubos de NFM inoculados a 38◦ C durante 14 a 16 horas. En tres experiencias independientes, una media de 30% de colonias aisladas de placas de MIA extendidas con Streptococcus cremoris MS que se hab´ıan incubado a temperaturas elevadas en NFM, eran no mucoides. Veinte aislados de coagulaci´ on de leche (en 18 a 24 horas a 24◦ C) mucoides y 20 no mucoides se purificaron y se examin´ o su contenido de ADN de pl´ asmido por electroforesis en gel de agarosa. Todos los tipos mucoides con una excepci´on, a saber, la cepa MS03, presentaban perfiles de pl´ asmidos similares a los del Streptococcus cremoris MS mucoide de tipo silvestre (Figura 1). En Streptococcus cremoris MS03 estaba ausente el pl´ asmido de 35,8 Mdaltones. Todos los aislados no mucoides con una excepci´on presentaban perfiles de pl´ asmidos similares al Streptococcus cremoris MS01 (Figura 1). En estas cepas, estaban ausentes dos pl´asmidos, a saber, los pl´asmidos de 35,8 Mdaltones y 18,5 Mdatones. En el aislado no mucoide sencillo, Streptococcus cremoris MS02, s´ olo estaba ausente el pl´asmido de 18,5 Mdaltones (Figura 1). Examinando los perfiles de pl´ asmidos de Streptococcus cremoris cepas MS, MS01, MS02 y MS03, s´ olo el pl´ asmido de 18,5 Mdaltones (pSRQ2202) pod´ıa estar asociado posiblemente con el asmido fenotipo Muc+ , porque la cepa MS03 conservaba el fenotipo Muc+ incluso con la p´erdida del pl´ de 35,8 Mdaltones. Por otra parte, la cepa MS02, que pose´ıa el pl´ asmido m´as grande de 35,8 Mdaltones, se hizo no mucoide con la eliminaci´on del pSRQ2202.

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2 002 621 Curado de fenotipo Lac+

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Est´ a bien establecido actualmente que la capacidad fermentadora de lactosa en estreptococos l´ acticos est´a soportada por pl´ asmidos (Mckay, L.L., Regulation of lactose metabolism in dairy streptococci, p´ ags. 153-182. En R. Davis) (red.), Developments in Food Microbiology-1. Applied Science Publishers Ltd., Essex, Inglaterra (1982)). Para determinar si el Lac-pl´ asmido en Streptococcus cremoris MS03 Muc+ pod´ıa curarse sin p´erdida de la caracter´ıstica mucoide o correosa, se incub´ o el cultivo a 38◦ C durante 16 horas y se cultiv´o en placa sobre BMLA. De un total de 80 colonias que aparec´ıan en las placas de BMLa, el 15% fueron Lac− . Todas las colonias Lac− se transfirieron a la FNFM y se incubaron a 24◦C hasta que tuvo lugar espesamiento a coagulaci´ on. Se comprob´ o en los cultivos la calidad mucoide en esta fase. Con la excepci´on de los aislados, todos los dem´ as eran no mucoides. El Streptococcus cremoris alisis de los perfiles de pl´asmidos de derivados MS04 representa el fenotipo Lac− Muc+ (Figura 1). El an´ Lac-curados sugiri´ o que la p´erdida de capacidad fermentadora de lactosa estaba asociada con la eliminaci´on de un pl´ asmido de 75,8 Mdaltones (pSRQ2201). El fenotipo Lac− Muc− est´a representado por Streptococcus cremoris MS05. Desarrollo de estrategias para transferir Muc-pl´ asmido

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A lo largo de los experimentos de curado, se examinaron extensamente en cepas mucoides y no mucoides sus diferencias en modelos de fermentaci´on de hidratos de carbono, resistencia a diferentes niveles de NaCl, sales biliares, etanol, nisina y antioxidantes como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT). No se observaron diferencias que pudieran usarse para examinar r´apidamente tipos mucoides en presencia de tipos no mucoides sobre placas de agar. Experimentos adicionales en medios de agar que contenian diversos colorantes y diversos niveles y combinaciones de az´ ucar, componentes de leche y minerales (Mg++ , Ca++ , Mn++ , Fe++ ) no produjeron un buen medio diferencial para distinguir visualmente colonias mucoides de mucoides. Se decici´o entonces intentar una selecci´on indirecta de posibles tipos mucoides en experimentos gen´eticos. Puesto que la transferencia conjugativa de pl´ asmidos en estreptocos l´acticos est´a bien documentada (Gasson, M-J, J. Microbiol. 49:275-282 (1983)), se decidi´ o examinar se pod´ıa usarse Lac-pl´ asmido en cepas mucoides como marcador metab´olico para detectar comovilizaci´on de Muc-pl´ asmido en experimentos de apareamiento. asmido Transferencia conjugativa de Lac− pl´

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Varios intentos para transferir fenotipo Lac+ de Streptococcus cremoris MS (Lac+ Muc+ Sms ; el super´ındice s indica “sensible” en todo el texto) a Streptococcus cremoris MS05.2 (Lac− Muc− Fusr Smr ) y al Streptococcus lactis SLA 1.1 libre de pl´asmidos (Lac− Muc− SMr ) se demostraron infructuosos. En un experimento de apareamiento posterior, se transfiri´o el fenotipo Lac+ de Streptococcus cremoris MS a Streptococcus lactis ML-3/2.2 (Lac− Muc− Smr Fusr ). El Streptococcus lactis ML-3/2.201 transconjuasmido de 75,8 Mdaltones de Streptococcus cremoris gante era Lac+ pero Muc− , y hab´ıa adquirido un pl´ MS. Adicionalmente, el transconjugante era positivo en el ensayo de hidr´ olisis de arginina y susceptible a los fagos c2 y 643. La expresi´on del fenotipo Lac+ por Streptococcus lactis ML-3/2.201 como resultado de la obtenci´ on de un pl´ asmido de 75,8 Mdaltones, pSRQ2201, del donante, y los datos de curado obtenidos con Streptococcus cremoris MS y sus derivados indicaron que el pSRQ2201 codificaba la utilizaci´on de lactosa en Streptococcus cremoris MS. Los resultados de tres experimentos de apareamiento independientes reconfirmaron la asociaci´ on del fenotipo Lac+ en transconjugantes con la obtenci´on de pSRQ2201 de Streptococcus cremoris MS. Algunos de los transconjugantes obtenidos en estos apareamientos presentaban coagulaci´on en cultivos de caldos similar al fen´ omeno se˜ nalado anteriormente por Walsh y McKay (Walsh, P.M. et al., J. Bacterior. 146:937-944 (1981)). Experimentos testigo en paralelo realizados con uno de los apareamientos para excluir la transformaci´ on y la transducci´on, y un experimento testigo negativo usando c´elulas de Streptococcus cremoris MS donante muertas por calor, mostraron que la transferencia de Lac-pl´asmido era por conjugaci´ on. Transferencia conjugativa de Lac- y Muc-pl´ asmidos

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Se us´ o como donante un Streptococcus lactis ML-3/2.201 transconjugante Lac+ coagulante en un apareamiento con Streptococcus cremoris MSO4 para determinar si el Lac-pl´ asmido pSRQ2201 observado en el Streptococcus lactis ML-3/2.201 transconjugante pod´ıa transferirse de vuelta a Streptococcus cremoris MSO4, un derivado Lac− Muc− del tipo silvestre. El agente selectivo para este apareamiento era fago c2 (en una concentraci´ on de 1 x 104 UFP/ml) que lisa el donante, Streptococcus lactis ML-3/2.201. El fago no infecta el Streptococcus cremoris MSO4 receptor. Debido al bajo t´ıtulo de fago usado para seleccionar frente a c´elulas del donante, placas testigo del donante mostraron varias colonias supervivientes Lac+ por placa. Sin embargo, las placas que contenian las mezclas de apareamiento tenian como m´ınimo dos veces 8

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m´as colonias Lac+ por placa que las placas de donante testigo. Todas las colonias productoras de a´cido de placasde BMLA que conten´ıan las mezclas de apareamiento se transfieron a NFM, y, tras incubar, se comprob´ o su calidad mucoide. Se purificaron 200 aislados no mucoides elegidos al azar y se comprob´ o su resistencia a la estreptomicina (1.000 microgramos por ml) en BMLA. Todos eran resistentes; adicionalmente, dieron ensayos positivos de liberaci´ on de NH3 de arginina, indicando que eran de tipos donantes. Seis aislados que eran mucoides se purificaron en MIA y se comprob´o en ellos sensibilidad o resistencia a estreptomicina, e hidr´ olisis de arginina. Dos de los aislados mucoides eran negativos para la hidr´ olisis de arginina y los otros cuatro eran positivos. Aislados repurificados de los seis cultivos mucoides mostraron las mismas caracter´ısticas de hidr´ olisis de arginina que en el primer ensayo. Los dos aislados mucoides que no liberaban NH3 de arginina eran tambi´en sensibles a estreptomicina (1.000 microgramos por ml) y ´acido fus´ıdico (20 microgramos por ml), lo que indic´ o que eran transconjugantes Lac+ de tipo receptor. Los restantes cuatro cultivos mucoides que eran positivos para la hidr´olisis de arginina eran resistentes a los mismos niveles de estreptomicina y ´acido fus´ıdico que el donante. Streptococcus lactis ML-3/2.201. La totalidad de los seis aislados mucoides era resistente a los fagos c2 y 643. La electroforesis en gel de agarosa de ADN de pl´ asmido de los seis aislados mostr´o que se obtuvieron dos tipos de transconjugantes. Los dos aislados Lac+ Muc+ sensibles a la estreptomicina y negativos para arginina eran tipos de Streptococcus cremoris MSO4 receptores que hab´ıan obtenido el Lac-pl´ asmido (y fenotipo Lac+ ) del donante (de los que es ejemplo Streptococcus cremoris MS0401, Figura 2). Los cuatro aislados Lac+ Muc+ positivos para arginina eran transconjugantes de tipo Streptococcus lactis ML-3/2.201 donantes que hab´ıan adquirido el Muc-pl´ asmido de 18,5 Mdaltones de Streptococcus cremoris MSO4 (de los que es ejemplo Streptococcus lactis ML-3/2.202, Figura 2). La resistencia a fagos de transconjugantes Muc+ de tipo Streptococcus lactis ML-3/2.201 donante sugiri´ o que la obtenci´ on del pl´ asmido pSRQ2202 de 18,5 Mdaltones y el fenotivo Muc+ confer´ıa resistencia a virus al transconjugante ML-3/2.202, aunque la cepa progenitora ML-3/2.201 (Lac+ Muc− ) era susceptible al mismo fago. En base a estas observaciones iniciales, se repiti´o el apareamiento con Streptococcus cremoris MSO4 como donante, y usando un alto t´ıtulo de lisado de fago c2 (3,0 x 109 UFP/ml) para seleccionar eficazmente frente a c´elulas de Streptococcus lactis ML-3/2.201 receptor sensible a fagos Lac+ . Se obtuvieron placas testigo receptoras libres de colonias. Puesto que el uso de algo t´ıtulo de lisado de fago proporcion´ o una selecci´on eficaz frente a c´elulas receptoras sensibles a fagos, Lac+ , no mucoides, las colonias Lac+ que aparec´ıan sobre placas de apareamiento eran probablemente transconjugantes de tipo Streptococcus cremoris MSO4 donante que hab´ıa adquirido el Lac-pl´asmido de Streptococcus lactis ML-3/2.201, o eran transconjugantes resistentes a asmido de Streptococcus cremoris MSO4. fagos Muc+ de tipo ML-3/2.201 que habi´an adquirido el Muc-pl´ En base a esta premisa, todas las colonias Lac+ de placas de BMLA que contenian las mezclas de apareamiento se llevaron a NFM y se ensay´ o su calidad mucoide. Todos los aislados mucoides se purificaron y sometieron a ensayo de hidr´ olisis de arginina confirmatorio. Con el uso de alto t´ıtulo de lisado de fago se observ´ o transferencia de fenotipo Muc+ a una frecuencia de 3,0 x 10−4 . Experimentos testigo paralelos realizados para excluir la transforamci´ on y transducci´on y un experimento testigo negativo usando c´elulas de Streptococcus cremoris MSO4 donante muertas por calor mostraron que el modo de transferencia de Muc-pl´ asmido de donante a receptor era conjugativo. La incubaci´ on del Streptococcus lactis ML-3/2.202 transconjugante Lac+ Muc+ entre 41 y 42◦ C permiti´ o la selecci´on de todas las combinaciones posibles de fenotipos Lac+/− y Muc+/− . Los perfiles de electroforesis en gel de agarosa de ADN de pl´asmido de tales derivados confirm´ o que el fenotipo Lac+ se expresaba cuando estaba presente el pl´ asmido pSRQ2201 de 75,8 Mdaltones, y que en ausencia de ese pl´ asmido la bacteria era Lac− . De manera similar, la presencia y ausencia del pl´asmido pSRQ2202 de 18,5 Mdaltones estaban directamente asociadas con la expresi´on de fenotipos Muc+ y Muc− respectivamente. Para caracterizar adicionalmente el Muc-pl´ asmido de 18,5 Mdaltones era necesario obtener el ADN circular cerrado covalentemente espec´ıfico en forma purificada. Para obtener pSRQ2202 aislado por si mismo en cepas paternas o transconjugantes, ser´ıa necesario curar varios otros pl´asmidos residentes en aquellas cepas. Alternativamente, el Muc-pl´ asmido pod´ıa transferirse a una cepa libre de pl´ asmidos simplemente o en asociaci´on con otro pl´ asmido, por ejemplo Lac-pl´asmido, que pod´ıa despu´es eliminarse por curado dejando s´ olo el Muc-pl´asmido. El Streptococcus lactis LM0230 y sus derivados libres de pl´asmidos se habian usado con ´exito como receptores para facilitar tal transferencia de un pl´ asmido deseado simplemente o en asociaci´on con otro pl´ asmido que pod´ıa eliminarse por curado subsiguientemente dejando s´olo el pl´ asmido deseado en el receptor (McKay, L.L. et al., Appl. Environ. Microbiol. 47:68-74 (1984)). Por consiguiente, se realiz´ o un experimento de apareamiento con Streptococcus cremoris 0401 (transconjugante Lac+ Muc+ ) como donante y Streptococcus lactis SLA 1.1 (Lac− Muc− Smr libre de pl´asmidos) como receptor. La selecci´on de transconjugantes se bas´ o en el fenotipo Lac+ y en la resistencia a la estreptomicina. Se encogi´o como donante Streptococcus cremoris 0401 porque permitir´ıa el an´ alisis de un marcador no seleccionado (hidr´ olisis de arginina) en presuntas colonias transconjugantes. El apareamiento MS0401 x SLA 1.1 produjo la transferencia de fenotipo La+ a una frecuencia de 2.0 x 10−3 ; sin 9

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embargo, no hubo transferencia de fenotipo Muc+ . Un examen r´ apido de los perfles de ADN de pl´ asmido o a 200 aislados purificados Lac+ de las placas de apareamiento que eran positivas para arginina revel´ que, en la mayor´ıa de los aislados, eran contransferidos adem´ as del Lac-pl´asmido algunos de los pl´ asmidos cr´ıpticos residentes en Streptococcus Cremoris MS0401. Los intentos para cotransferir Muc-pl´ asmido con el Lac-pl´asmido de Streptococcus lactis ML-3/2.202 a Streptococcus lactis SLA 1.8 libre de pl´ asmidos (Lac− Muc− Rifr ) se demostraron insatisfactorios. Cotransferencia de Muc-pl´ asmido con Lac-pl´ asmido

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Como alternativa para derivados de Streptococcus lactis LM0230, se us´ o como receptor en un apareamiento con Streptococcus lactis ML-3/2.202 un Streptococcus lactis 4/4.2 de malta libre de pl´ asmidos (obtenido curando dos pl´ asmidos residentes de la cepa Streptococcus lactis 4 de malta de tipo silvestre). El Streptococcus lactis 4/4.2 de malta ten´ıa marcadores Rifr y Fusr . El Streptococcus lactis 4 de malta de tipo silvestre di´ o una fuerte reacci´on Lac+ en BMLA y leche coagulada en 10 a 12 horas a 24◦ C. El Streptococcus lactis 4/4.2 derivado de malta libre de pl´ asmidos presentaba una d´ebil reacci´on Lac+ en BMLA cuando se incubaba m´ as de 48 horas a 24◦C y dejaba de coagular leche despu´es de 48 horas a 24◦ C. La respuesta indicadora en BMLA al nivel umbral de utilizaci´ on de lactosa por Streptococcus lactis 4/4.2 se eclips´o por la adici´ on a BMLA de beta-glicerofosfato dis´ odico al 0,5%. El cultivo en placa de las mezclas de apareamiento en el medio tamponado que conten´ıa el antibi´ otico selectivo posibilit´o la selecci´on de transconjugantes Lac+ . Se ensay´o el fenotipo Muc+ en aislados purificados positivos para lactosa examinados por su sensibilidad a la estreptomicina. Se confirmaron los presuntos transconjugantes Lac+ Muc+ ensayando la producci´ on de olor de malta en lech que conten´ıa sal s´odica de a´cido 4-metil-2-oxopentanoico (Langeveld, L.P.H. Neth. Milk Dairy J. 29:135 (1975)). Se observ´ o la movilizaci´on de otros pl´ asmidos cr´ıpticos adem´ as del Muc-pl´ asmido con la transferencia de Lac-pl´ asmido de Streptococcus lactis ML3/2.202 a Streptococcus lactis 4/4.2 (Figura 3). En experimentos de repetici´ on con testigos adecuados, se estableci´o que la transferencia de Lac- y Muc-pl´asmidos era conjugativa. Fue de inter´es determinar si el Muc-pl´ asmido pod´ıa conferirse con Lac-pl´asmido al tercer miembro del grupo Streptococcus l´actico, es decir, Streptococcus lactis subesp. diacetylactis. Se realizaron experimentos de apareamiento usando Streptococcus lactis ML-3/2.202 como donante y Streptococcus lactis subesp. diacetylactis SLA3.25 como receptor. Estos apareamientos produjeron la cotrransferencia de Lac- y Muc-pl´asmidos a Streptococcus lactis subesp. diacetylactis, y, en algunos casos, se observ´ o y la transferencia de s´olo el Lac-pl´asmido. El Streptococcus lactis subesp. diacetylactis SLA3.25 receptor y los transconjugantes Lac+ eran sensibles al fago 18-16. Sin embargo, el Streptococcus lactis subesp. diacetylactis SLA3.2501 transconjugante Lac+ Muc+ era resistente al fago 18-16. Incubando el SLA3.2501 transconjugante Lac+ Muc+ entre 41 y 42◦ C, se obtuvieron todas las combinaciones posibles de fenotipos Lac y Muc (Lac+/− y Muc+/− ). Como se observ´ o con el Streptococcus lactis ML-3/2.202, la eliminaci´on de pSRQ2201 y pSRQ2202 de SLA3.2501 estaba correlacionada con la incapacidad de los deriviados para expresar fenotipos Lac+ y Muc+ respectivamente. En experimentos de repetici´on con testigos adecuados, se confirm´ o que la cotransferencia de Lac- y Muc-pl´asmidos de Streptococcus lactis ML-3/2.202 a Streptococcus lactis subesp. diacetylactis SLA3.25 era conjugativa. La Tabla 2 resume las frecuencias de transferencias inter -especies para pSRQ2201 y pSRQ2202 asmido de Streptococcus lactis ML simplemente, y para la cotransferencia de pSRQ2202 con el lac-pl´ -3/2.202 a Streptococcus lactis 4/4.2 de malta y Streptococcus lactis subesp. diacetylactis SLA3.25.

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TABLA 2 Frecuencia de transferencia inter-especies de pl´ asmidos pSRQ2201 y pSRQ2202 entre estreptococos l´ acticosa. 50

Pl´ asmido

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pSRQ2201

pSRQ2202 Cotransferencia de pSRQ2201 y pSRQ2202

D x Rb,c

Frecuencia

ScMS S1 ML-3/2.201 Sc MSO401 CS MSO4

S1 ML-3/2.2 Sc MSO4 S1 SLA1.1 S1 ML-3/2.201

S1 ML-3/2.202 S1 ML-3/2.202

MS1 4/4.2 S1s SLA3.25

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Transconjugantec

7,01 x 10−8 0,3 x 10−8 2,0 x 10−3 3,0 x 10−4 d

S1 ML-3/2.201 Sc MSO401 S1 SLA1.101 SL ML-3/2.202

1,7 x 10−8 2,0 x 10−8

MS1 4/4.201 S1s SLA3.2501

2 002 621 Siendo: a

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.- La frecuencia se expresa como el n´ umero de transformantes Lac+ o Muc+ o Lac+ o Lac+ Muc+ (cotransferencia) por CFR donante. Los CFR donantes se determinaron antes de aparear. Los valores de la frecuencia indicados son medias de al menos dos experimentos independientes. b

.- D-doantne; R-receptor.

c

.- S. cremoris; S1-S. lactis de malta; S1d -S. lactis subespe. diacetyulactis.

d

.- Resultados de apareamiento usando lisado de fago con concentraci´on > 1 x 109 UFP por ml.

Los resultados del Ejemplo 1 presentados demuestran claramente que el fenotipo mucoide en los estreptococos l´acticos examinados es codificado en ADN de pl´ asmido. La asociaci´on del fenotipo mucoide con ASN de pl´ asmido en el S. cremoris MS de tipo silvestre se demostr´ o inicialmente por experimentos de curado. En estos experimentos, la presencia o ausencia de un pl´ asmido de 18,5 Mdaltones estaban correlacionadas respectivamente con fenotipos mucoide y no mucoide. La confirmaci´on real de que el fenotipo mucoide es codificado en ADN de pl´ asmido se obtuvo en experimentos de apareamiento, en donde la transferencia conjugativa de un pl´ asmido de 18,5 Mdaltones de S. cremoris MSO4 mucoide a S. lactis ML-3/2.202 no mucoide posibilit´o que el tranconjugante que conten´ıa el pl´ asmido pSRQ2202 de 18,5 Mdaltones expresar el fenotipo mucoide. Adicionalmente, la eliminaci´on de pSRQ2202 del S. lactis ML-3/2.202 transconjugante mucoide produjo un fenotipo no mucoide. Subsiguientemente, el pSRQ2202 se transfiri´ o conjugativamente a S. lactis subesp. diacetylactis SLA 3.25 y S. lactis 4/4.2. La expresi´ on fenot´ıpica de pSRQ2202 en los respectivos transconjugantes (S. lactis 4/4.201 y SLA 3.2501) indica que, en general, el fenotipo mucoide en estreptococos l´acticos est´a enlazado a ADN de pl´ asmido. La facilidad con la que se elimin´ o el Muc-pl´asmido incubando entre 38◦C y 42◦ C estaba de acuerdo con la observaci´on anterior de que el mantenimiento de la caracter´ıstica mucoide deseada en leches espesas on escandinavas ven´ıa favorecido por una temperatura de incubaci´ on baja, entre 13◦ C y 18◦ C; la incubaci´ a temperaturas mayores que 27◦ C a 30◦ C produc´ıa una reducci´on considerable o p´erdida de la alta viscosidad y calidad mucoide deseables. Adem´ as el Muc-pl´asmido, se consigui´o la transferencia del Lac-pl´asmido. El Lac-pl´ asmido de S. cremoris MS mucoide de tipo silvestre se transfiri´ o primero a Streptococcus lactis ML-3/2.2 y a continuaci´ on se retransfiri´ o el mismo pl´asmido de Streptococcus lactis ML-3/2.201 al derivado Lac− Muc+ del Streptococcus cremoris mucoide de tipo silvestre (S. cremoris MSO4). Adem´ as, el pl´ asmido se transfiri´ o del S. lactis ML-3/2.202 transconjugante Lc+ Muc+ al S. lactis 4/4.2 de malta y al S. lactis subesp. diacetylactis SLA 3.25. En estos dos u ´ ltimos apareamientos, el Lac-pl´ asmido moviliz´o tambi´en el Muc-pl´ asmido y otros pl´ asmidos cr´ıpticos. En todas estas transferencias, se expres´ o el fenotipo Lac+ en los transconjugantes respectivos, y la eliminaci´on del pl´ asmido de 75,8 Mdaltones de los transconjugantes respectivos los hizo Lac− . Aunque se detect´ o la transferencia de Muc-pl´asmido en estos experimentos de apareamiento usando procedimientos de selecci´on indirecta, a saber, marcando el fenotipo Lac+ y/o la resistencia a fagos, es posible el procedimiento de selecci´on directa mediante el uso de otro medio diferencial para distinguir entre tipos de colonias mucoide y no mucoide. Todo esto es bien conocido por los expertos en la t´ecnica. Un hallazgo significativo en el Ejemplo 1 fue la asociaci´ on de resistencia a fagos y calidad mucoide. Con la transferencia de un Muc -pl´asmido a un receptor sensible a fago no mucoide, el transconjugante mucoide resultante se hizo resistente al fago. Esto fue v´ alido con Streptococcus lactis y Streptococcus lactis subesp. diacetylactis. La asociaci´on de resistencia a fagos con fenotipo mucoide en transconjugantes ofrece otro mecanismo por el que pueden hacerse derivados resistentes a fagos para cultivos iniciadores. Adicionalmente, el procedimiento de selecci´ on para la distinci´ on de transconjugantes mediante el uso de lisados de fagos l´ıticos de alto t´ıtulo proporciona un medio para evitar marcadores de f´ armacos para la selecci´on. Esto es especialmente significativo para derivar cepas deseadas para fermentaciones en alimentos y piensos. Tambi´en se encontr´o que incluso si el pl´asmido Muc+ se curaba del transconjugante por incubaci´ on a temperatura elevada, las cepas resultantes eran residentes a fagos aunque habian perdido la capacidad para producir la sustancia mucoide. Parec´ıa que al menos parte del pl´ asmido se integraba con el material cromos´omico o con otra parte de la c´elula. Este es un m´etodo deseable para fijar resistencia a fagos en las c´elulas bacterianas.

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2 002 621 Ejemplo 2

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Una cepa comercial no mucoide bien conocida Streptococcus cremoris TR se hizo mucoide transfiriendo o fenotipo Muc+ de derivado Lac− de transconjugante ML-3/2.202 de Streptococcus lactis mucoide. Se us´ el fago tr, que es l´ıtico para S. cremoris TR, a fin de seleccionar frente a c´elulas receptoras Lac+ , sensibles a fagos y no mucoide. S´ olo colonias supervivientes Lac+ de placas de apareamiento se escogieron en leche y se ensay´o su calidad mucoide. Se purificaron en MIA cultivos mucoides y se reexamin´ o su calidad mucoide en leche, su resistencia a fagos e hidr´olisis de arginina, y se sometieron a an´ alisis de pl´ asmidos. El transconjugante mucoide TR01 era resistente a fago tr, no hidroliz´ o arginina y era Lac+ . on a alta temperatura. El derivado El transconjugante TR01 se cur´ o a fenotipo Muc− por incubaci´ no mucoide mantenia la resistencia al fago tr.

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El transconjugante mucoide y su derivado curado no mucoide no tienen marcadores antibi´ oticos y son adecuados para fermentaciones de alimentos. Si las bacterias han de usarse en alimentos, se hace la selecci´on para cepas que sean sensibles a antibi´oticos. Ejemplo 3

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Se tranfiri´ o Muc-pl´ asmido de deriviado Lac-curado de Streptococcus lactis ML-3/2.202 a Streptococcus lactis subesp. diacetylactis 18-16 sensible a fagos, Lac+ , no mucoide, usando fago 18-16 como agente seleccionante. S´olo se seleccionaron colonias Lac+ para examinar la calidad mucoide. Los cultivos mucoides se purificaron y se reexamin´o su calidad mucoide y resistencia a fagos, y se sometieron a ensayo de King conformatorio. El Streptococcus lactis subesp. diacetylactis 18-16.01 transconjugante no tiene ning´ un marcador anon de diacetilacetoina en leche, resistente al fago 18-16 y tibi´ otico, y era Lac+ , positivo para producci´ mucoide. La comparaci´on de perfiles de pl´ asmdos de Streptococcus lactis subesp. diacetylactis 18-16 progentor, Streptotoccus lactis subesp. diacetylactis 18-16.01 transconjugante y Streptococcus lactis ML3/2.202 Lac-curado donante mostr´ o que el transconjugante mucoide hab´ıa adquirido un pl´ asmido de 25 asmdo de 18,5 Mdal adquri´ o alg´ un ADN Mdaltones, que codificaba el fenotipo Muc+ . Al parecer el pl´ asmido de 25 adicional medante un suceso recombinacional. La asociaci´on de fenotipo Muc+ con el pl´ Mdal se confirm´ o por estudios de curado.

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Se examin´ o la aplicaci´on del transconjugante Streptococcus lacts subesp. diacetylactis 18-16.01 mucoide en condimento de nata para reques´ on. Se mezcla cuajada de reques´ on seca con suficiente condimento de nata para obtener el contenido de grasa l´ actea estipulada para cumplir las especificaciones legales. El condimento de nata puede cultivarse para desarrollar sabor de diacetilo y puede contener estabilizantes hddrocoloides (por ejemplo, agar, carragenina, gomas y similares) para aumentar la viscosdad del condimento de nata de modo que se adhiera a una superficie curada en lugar de sedimentar en el fondo del recipiente. El uso de cultivos de sabores en condimento de reques´ on para desarrollar sabor de diacetilo y aumentar la duraci´ on de almacenamiento es muy conocido en la industria. El uso de Streptococcus lactis subesp. diacetylactis productor mucoide, resistente a fagos, en mezclas de formaci´ on de nata de reques´on u otros productos que contienen leche para sustituir a estabilizantes es desconocido. Hay muchas cepas mucoides de manera natural. Se examin´o lo siguiente en el uso de Streptococcus lactis subesp. diacetylactis 18-16.01 mucoide en la elaboraci´on de reques´ on:

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1. Si una nata a partes iguales (18% de grasa de leche) cultivada con Streptococcus lactis subesp. diacetylactis 18-16.01 (in´oculo al 1%, 16 h a 23◦ C) es comparable en viscosidad a codimento de reques´ on estabilizado, no cultivado, comercial. 2. Si una nata a partes iguales cultivada con cepa 18.16.01 tiene mejores caracter´ısticas de sabor que el condimento comercial sin cultivar. 3. Si una nata a partes iguales cultivada con cepa 18-16.01 cuando se usa como condimento en una relaci´on cuajada seca: condimento de 64:36 presenta el mismo nivel de adherencia a la cuajada que el condimento no cultivado, estabiliziado, comercial, utilizado en la misma relaci´on.

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4. Si cuajada de queso preparada con nata a partes iguales cultivada usando cepa 18-16.01 y manteniendo la calidad tenia mejor sabor (diacetilo) que queso preparado con condimento comercial estabilizado, sin cultivar (guardado a 4-7◦ C). 12

2 002 621 Se obtuvieron de un suministrador local cuajada de reques´ on seca y condimento de nata comercial no cultivado que conten´ıa una mezcla estabilizante constituida por goma guar, carragenina y goma de algarroba, y sorbato pot´ asico inhibidor de hongos. Se compr´ o en un spermercado local nata a partes iguales que no conten´ıa aditivos. 5

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Se lav´ o cajada de reques´ on seca en agua helada ligeramente clorada, y se escurri´o para eliminar el agua en exceso. Una porci´on de nata a partes iguales se trat´ o con vapor (en vapor que flu´ıa libremente en una o con Streptococcus lactis subesp. diacetylactis c´amara) durante 30 minutos, se enfri´ o a 23◦ C y se cultiv´ 18-16.01 (in´oculo al 1% de un cultivo de leche) durante 6 horas a 23◦C. Tras incubar la nata a partes iguales cultivada, se enfri´ o en un bao de hielo. Un cultivo sincrot´ ofico de Pseudomonas fragi PFO, aislado de reques´on da˜ nado se desarroll´ o durante la noche a 24◦C en caldo de Tripticasa-soja. El cultivo en caldo se diluy´ o en tamp´ on de diluci´ on est´eril para obtener de 1 x 106 a 1 x 107 c´elulas por mililitro. Las variables experimentales se fijaron de la siguiente manera: 1. 330 g de cuajada seca + 170 g de condimento comercial. 2. 330 g de cuajada seca + 170 g de nata a partes iguales cultivada con Streptococcus lactis subesp. diacetylactis 18-16.01.

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3. 330 g de cuajada seca + 170 g de nata a partes iguales. 4. 330 g de cuajada seca + 170 g de condimento comercial + c´elulas de Pseudomonas fragi PFO para dar alrededor de 1 x 104 c´elulas por gramo de cuajada.

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5. 330 g de cuajada seca + 170 g de nata a partes iguales + Pseudomonas fragi PFO en aproximadamente 1 x 104 c´elulas por gramo de cuajada. 6. 330 g de cuajada seca + 170 g de nata a partes iguales cultivada con cepa 18-16.01 m´as cepa PFO a˜ nadida en aproximadamente 1 x 104 c´elulas por gramo de cuajada.

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Antes de preparar las muestras de reques´ on, se ensay´ o la viscosidad de nata a partes iguales sin cultivar, nata a partes iguales cultivada y contimento comercial, usando una copa Zahn n◦ 2. Se elabor´ o cuajada condimentada en porciones de 500 g preparada seg´ un en dise˜ no experimental en duplicados, y se distribuy´o en envases de pl´astico duplicados. Se evit´o en todas las operaciones la contaminaci´ on cruzada. Todos los ingredientes se mantuvieron frios en un ba˜ no de hielo durante las diversas operaciones. Los envases empaquetados se llevaron a un enfriador por cuyo interior se pod´ıa circular que estaba controlado a 4◦ C. A intervalos semanales, se examin´o visualmente el deterioro de un conjunto de envases que representaban las variables experimentales y oliendo el desarrollo de sabor de diacetilo o la carencia o p´erdida de sabor de diacetilo desarrollado, y malos sabores. Al final de un per´ıodo de cuatro semanas, se comprob´ o el conjunto sin abrir duplicado de envases que representaban las variables experimentaes, y se anotaron los resultados. Resultados:

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Mediciones de viscosidad: Nata a partes iguales sin cultivar = menos de 100 centipoises Condimento comercial estabilizado = 150 centipoises

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Nata a partes iguales que no contenia estabilizante y cultivada con cepa 18-16.01 = 180 centipoises

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(Ver tabla en p´ agina siguiente). 60

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2 002 621 Estudio de almacenamiento Almacenamiento a 4◦ C 5

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Experimental

1 Semana

2 Semanas

3 Semanas

4 Semanas

1

Sin sabor Sin da˜ no Alto sabor Sin da˜ no Sin sabor Sin da˜ no

Sin sabor Sin da˜ no Buen sabor Sin da˜ no Parcialmente da˜ nado (afrutado) Sin sabor Sin da˜ no Da˜ nado Buen sabor, sin da˜ no

Da˜ nado

Da˜ nado

Ins´ıpido, sin sabor Acido, sin da˜ no Completamente da˜ nado

Acido, ins´ıpido Sin da˜ no Gravemente da˜ nado

Sin sabor Sin da˜ no Da˜ nado Ins´ıpido, sin sabor Acido, sin da˜ no

Ins´ıpido da˜ nado Da˜ nado mal sabor ligeramente rancio, sin da˜ no

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3

4 20

5 6

Sin sabor Sin da˜ no Da˜ nado Sabor ligero, sin da˜ no

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Los resultados mostraron que cultivar con cepa 18-16.01 proteg´ıa el queso de da˜ no sicrot´ ofico (variable 5 frente a variable 6). El cultivo con cepa 18-16.01 mejoraba tambi´en el sabor (variables 1 y 4 frente a variables 2 y 6). Una protecci´ on comparable frente al da˜ no por P. fragi PFO entre las variables 4 y 6 puede atribuirse a la presencia de sorbato pot´ asico en el condimento comercial. La nata a partes iguales cultivada no conten´ıa ning´ un sorbato y la totalidad de la actividad inhibidora era debida a S. lactis subesp. diacetylactis.

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Los envases no abiertos examinados despu´es de 4 semanas presentaban resultados similares al conjunto examinado a intervalos semanales.

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La nata a partes iguales cultivada ten´ıa tan buena viscoisdad y prpiedad adherente a la cuajada como la mezcla de formaci´on de nata comercial sin cultivar. El uso de Streptococcus lactis subesp. diacetylactis 18-16.01 mucoide elimina la acci´on de estabilizantes en la mezcla de formaci´on de nata. Adicionalmente, proporciona buen sabor de adiacetilo y una duraci´on de almacenamiento aumentada. Las cepas pueden usarse tambi´en en reques´on que contenga frutas o pur´e de frutas. La calidad mucoide puede formar una barrera alrededor de la cuajada y mantenerla separada de cualquier fruta usada en el reques´on, e impedir la p´erdida de humedad de la cuajada debida a presi´ on osm´otica diferencial entre la fruta y la cuajada de queso. Recientemente, se ha expedido una patente (Vedamuthu, E.R. et al., Patente de los EE.UU. N◦ 4.382.097 (1983)) para la aplicaci´ on de cepas correosas de Streptococcus lactis y/o Streptococcus cremoris en combinaci´on con cultivos no mucoides en proporciones espec´ıficas, para la producci´on de productos l´acteos cultivados no correosos que posean buena viscosidad y de mucho cuerpo. Se dispone actualmente en los Estados Unidos de cultivos concentrados comercialmente que contienen estreptocos l´acticos correosos y no correosos para la producci´ on de leche descremada cultivada y leche cortada. Tales cultivos en combinaci´on ayudan a mantener un cuerpo considerable y espeso en productos l´ acteos fermentados sin el uso de estabilizantes hidrocoloides o fortificaci´on s´olidos de leche. Las cepas resistentes a fagos y productoras de sustancias mucoides de la presente invenci´on pueden usarse en estos cultivos mezclados. Se apreciar´ a que el pl´ asmido de 18,5 Mdal puede introducirse en la cepa sensible por transformaci´ on o transducci´on o por conjugaci´ on bacteriana. Estos m´etodos son muy conocidos por los expertos en la t´ecnica.

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2 002 621 REIVINDICACIONES 1. Un m´etodo para impartir resistencia a fagos a bacterias Streptococcus que comprende: 5

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(a) proporcionar una bacteria sensible a fagos del g´enero Streptotoccus grupo N que se lisa por un fago hom´ ologo; y (b) introducir un pl´ asmido transferido en la bacteria sensible a fagos, para producir por ello una bacteria resistente a fagos que es resistente al fago hom´ ologo, en el que el pl´ asmido transferido contiene ADN derivado de un pl´ asmido progenitor que codifica la producci´ on de una sustancia mucoide alrededor del exterior de Streptococcus cremoris (MS) NRRL-B-15995. 2. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el que el pl´asmido progenitor es llevado en Streptococcus cremori NRRL-B-15995 (MS).

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3. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el que el pl´asmido transferido se introduce en la bacteria sensible a fagos por apareamiento con una cepa que contiene el pl´ asmido progenitor. 20

4. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el que la bacteria sensible se selecciona del grupo constituido por Streptococcus lactis, Streptococcus lactis subesp. diacetylactis y Streptococcus cremoris. 5. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el que un Lac-pl´ asmido que codifica la fermentaci´on de lactosa es cotransferido a la bacteria sensible con el pl´asmido transferido que codifica la sustancia mucoide.

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6. El m´etodo de la reivindicaci´ on 5, en el que los pl´ asmidos transferidos son llevados en un Streptococcus lactis que se aparea con la bacteria sensible. 7. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el que el pl´asmido progenitor es llevado en Streptococcus cremoris NRRL-B-15995 (MS) y en el que la bacteria sensible se selecciona de un Streptococcus lactis y en el que el pl´ asmido progenitor es transferido por apareamiento. 8. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el que el pl´ asmido transferido es llevado en un Streptococcus lactis que se aparea con la bacteria sensible, en el que la bacteria sensible se selecciona de un Streptococcus lactis subesp. diacetylactis y en el que el pl´ asmido transferido se transfiere por apareamiento.

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9. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el que la bacteria sensible es un Streptococcus lactis subespecie diacetylactis. 40

10. El m´etodo de la reivindicaci´on 1, en el que la bacteria resistente se selecciona entre Streptococcus lactis NRRL-B-15996, Streptococcus lactis subesp. diacetylactis NRRL-B-15994 (SLA 3.2501) y Streptococcus lactis subesp. diacetylactis NRRL-B -15997. 11. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, que incluye la etapa adicional de curar por calor la bacteria de manera que se pierde la capacidad para producir la sustancia mucoide y se conserva la resistencia a fagos.

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12. El m´etodo de la reivindicaci´ on 1, en el que el pl´ asmido transferido se usa como marcador para seleccionar bacterias transconjugantes de bacterias sensibles a fagos. 50

13. Un m´etodo para aumentar el espesor de productos l´ acteos sin adici´on de estabilizantes, que comprende:

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(a) proporcionar en un producto que contiene leche una bacteria derivada de las especies Streptococcus lactis o Streptococcus lactis subesp. diacetylactis que contiene pl´ asmido transferido que contiene ADN derivado de un pl´ asmido progenitor que codifica una sustancia mucoide de Streptococcus cremoris (MS) NRRL-B-15995; y (b) incubar el producto que contiene leche con la bacteria resistente a fagos para desarrollar una sustancia mucoide y aumentar el espesor del producto que contiene leche.

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14. El m´etodo de la reivindicaci´on 13, en el que la bacteria se selecciona entre Streptococcus lactis NRRL-B-15996 y Streptococcus lactis subesp. diacetylactis NRRL-B-15994 y NRRL-B-15997.

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2 002 621 15. El m´etodo de la reivindicaci´on 13, en el que el producto que contiene leche es una mezcla de formaci´ on de nata de reques´ on. 16. El m´etodo de la reivindicaci´on 13, en el que las bacterias derivadas son resistentes a fagos. 5

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