Chlamydia pneumoniae-IgG-sELISA medac

Castellano

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430-TMB-VPS/010708

FABRICANTE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Fehlandtstraße 3 D-20354 Hamburg

DISTRIBUCION medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstrasse 6 D-22880 Wedel Tel.: Fax:

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430-TMB-VPS/010708

Chlamydia pneumoniae-IgG-sELISA medac

Enzimoinmunoensayo para la detección de anticuerpos IgG frente a Chlamydia pneumoniae

Cat. no.: 430-TMB PARA USO EXCLUSIVO DE DIAGNOSTICO IN VITRO INTRODUCCION La chlamydia es una bacteria patógena gram negativa. Su ciclo de vida es obligatoriamente intracelular en la superficie de las mucosas, células endoteliales, células del músculo liso y de acuerdo con hallazgos recientes en ciertas estructuras tisulares del sistema nervioso central. Dependen de fosfatos ricos en energía de sus células huésped convirtiéndose, por lo tanto, en parásitos energéticos. El género Chlamydia comprende cuatro especies: C. pneumoniae, C. trachomatis, C. psittaci, y C. pecorum. C. pneumoniae y C. trachomatis son patógenos humanos obligados y C. psittaci es patógena en humanos y en una variedad de especies animales. Hasta el momento C. pecorum ha sido aislada únicamente a partir de muestras de animales. Las infecciones por C. pneumoniae tienen incidencia en todo el mundo. Los síntomas de la enfermedad, además de ser similares a los de la gripe, incluyen sinusitis, faringitis, bronquitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, pneumonía y artritis reactiva. C. pneumoniae está implicada en infecciones asmáticas, sarcoidosis, cancer de pulmón, arterioesclerosis, infarto agudo de miocardio, apoplejía cerebral, esclerosis múltiple y finalmente se está investigando su implicación en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. De acuerdo con Grayston y Saikku (1989), que fueron los primeros en describir esta especie de chlamydia, casi toda la población sufre infecciones y reinfecciones por C. pneumoniae a lo largo de toda su vida. Los síntomas débiles y/o difusos en las infecciones por C. pneumoniae, dificultan su detección e infecciones no detectadas pueden cursar de forma crónica produciendo graves secuelas. El diagnóstico de las infecciones por C. pneumoniae se basa en el aislamiento del patógeno de cultivos celulares, en la detección directa del antígeno, en los test de amplificación de ácidos nucleicos y en la serología. El aislamiento del patógeno a partir de los 430-TMB-VPS/010708

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cultivos celulares normalmente necesita varios pasos consecutivos, esto significa un proceso más largo, restringido a laboratorios especializados y solamente con éxito en raras ocasiones. Los ensayos de inmunofluorescencia directa (IFA) y de enzimoinmunoanálisis para el antígeno (EIA), no han sido ampliamente utilizados, y se ha publicado que tienen baja sensibilidad y especificidad. Para la detección de anticuerpos específicos de especie, la microinmunofluorescencia (MIF) ha sido considerada como el “gold standard”. La MIF es laboriosa, subjetiva, y requiere mucha experiencia. Este sistema de análisis no está estandarizado; la utilización de diferentes antígenos y diferentes criterios de cut-off para infecciones pasadas y recientes o para infecciones actuales, ocasiona variaciones significativas de laboratorio a laboratorio. Chlamydia pneumoniae-sELISA medac utiliza un antígeno altamente purificado y específico. La detección de anticuerpos de IgM, IgA e IgG permite la valoración del estadío de la infección y el seguimiento tras el tratamiento. Chlamydia pneumoniae-sELISA medac engloba los requerimientos para la estandarización, objetividad, reproducibilidad y automatización en la rutina del laboratorio.

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PRINCIPIO DEL ENSAYO

La placa está recubierta con un antígeno altamente purificado de C. Pneumoniae.

Los anticuerpos específicos de C. pneumoniae presentes en las muestras, se unen al antígeno.

Anticuerpos anti IgG humana conjugados con peroxidasa se unen a los anticuerpos IgG (P = peroxidasa).

Incubación con el substrato TMB(*). La reacción, se para por la adición de ácido sulfúrico. La absorbancia se lee fotométricamente.

Ventajas del ensayo ) Elevada sensibilidad y especificidad. ) Las tiras de la microplaca contienen permitiendo un uso eficiente del test.

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pocillos

separables,

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COMPONENTES DEL KIT Cat. no.: 430-TMB 1.

MTP Microplaca: 12 x 8 pocillos, identificados en color rosa, (con el soporte y el desecante, sellado al vacío en bolsa de aluminio), divisibles, forma-U, recubiertos con antígeno específico de C. pneumoniae y FCS, lista para usar.

2.

CONTROL Control negativo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano, listo para usar, teñido en azul, conteniendo NBCS, fenol, ProClinTM 300 y sulfato de gentamicina.

3.

CONTROL + Control positivo: 1 vial con 1,5 ml de suero humano, listo para usar, teñido en azul, conteniendo BSA, fenol, ProClinTM 300 y sulfato de gentamicina.

4.

WB Solución de lavado: 1 botella con 100 ml de PBS/Tween (10x), pH 7,2 - 7,4, conteniendo ProClinTM 300.

5.

BAC-DIL Diluyente de la muestra: 1 botella con 110 ml de PBS/Tween/NBCS, pH 7,0 - 7,2, listo para usar, teñido en azul, conteniendo ProClinTM 300.

6.

CON Conjugado: 4 viales, cada uno con 4,5 ml de inmunoglobulina de cabra anti IgG humana conjugado con peroxidasa (HRP), listo para usar, teñidos en verde, conteniendo BSA, fenol, ProClinTM 300 y sulfato de gentamicina.

7.

TMB TMB-substrato: 1 vial con 10 ml, listo para usar.

8.

STOP Solución de parada: 2 viales, cada uno con 11 ml de ácido sulfúrico 0,5 M (H2SO4), listo para usar.

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1.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

Material/Reactivo Kit Microplaca

Estado sin abrir abierto

Controles Solución de lavado

abierto diluida Diluyente de la muestra abierto Conjugado abierto TMB-substrato abierto Solución de parada abierto

Almacenamiento 2...8 °C 2...8 °C en bolsa con desecante 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C 2...8 °C

Estabilidad fecha de caducidad 12 semanas

12 semanas 12 semanas 12 semanas 12 semanas 12 semanas fecha de caducidad

No utilizar estos reactivos después de la fecha de caducidad. 2.

REACTIVOS Y MATERIALES REQUERIDOS QUE NO SE PROPORCIONAN

2.1. Agua bidestilada. La utilización de alterar el procedimiento de la técnica.

agua

desionizada

puede

2.2. Micropipetas ajustables. 2.3. Contenedores de cristal o de plástico limpios para la dilución de la solución de lavado y de las muestras. 2.4. Sistemas apropiados para el lavado de la microplaca (e.j. pipeta multicanal o lavador de ELISA). 2.5. Incubador de 37 °C. 2.6. Lector de microplaca con filtros para 450 nm y 620 - 650 nm. 3.

PREPARACION DE LOS REACTIVOS

Antes de comenzar con el procedimiento de la técnica, componentes del kit deben alcanzar la temperatura ambiente.

todos

los

Calcular el número de pocillos que se necesiten. 3.1. Microplaca La bolsa de aluminio debe cerrarse herméticamente junto con el desecante cada vez que se separen pocillos. El almacenamiento y la estabilidad de los pocillos se indican en punto 1.

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3.2

Solución de lavado Mezclar un volumen de solución de lavado (10x) con 9 volúmenes de agua bidestilada (p. ej., 50 ml de solución de lavado (10x) con 450 ml de agua). Para 8 pocillos, se requieren 10 ml de solución de lavado diluída. Si se observan cristales en la solución de lavado (10x), deberan de disolverse por calentamiento (max. a 37 °C), y/o agitación a temperatura ambiente.

No mezclar los reactivos específicos del ensayo procedentes de diferentes lotes del kit (microplaca, controles, conjugado). En contraste con esto, el diluyente de la muestra, el tampón de lavado, el substrato-TMB y la solución de parada, son en general reactivos que pueden intercambiarse en todos los kits de medac para Chlamydia y Mycoplasma por ELISA. En general, no se recomienda la utilización de reactivos procedentes de otros fabricantes. Solamente se obtienen resultados válidos y reproducibles si se realiza el ensayo ajustándose fielmente al protocolo. 4.

MUESTRAS

4.1. El ensayo plasma.

es

apropiado

para

muestras

de

suero

pero

no

para

4.2. No se necesita pretratamiento del suero, como p. inactivación. Sin embargo, no debería estar contaminado microorganismos ni contener glóbulos rojos.

ej. con

4.3. Los sueros deben diluirse 1:50 con el diluyente de la muestra. 5.A. PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA 5.1. Cortar la bolsa de aluminio por la parte superior del cierre en cremallera y extraer el número de pocillos de la microplaca que se requieran (ver 3.1.). Los pocillos de la necesitan prelavado. 5.2. Pipetear 50 µl del blanco (ver 6.A.), control positivo y determinaciones en

microplaca

están

listos

para

usar

y

no

diluyente de la muestra en el pocillo A1 como y 50 µl del control negativo en duplicado, del de las muestras diluídas de los pacientes para simple.

Si es necesario, los pocillos de la microplaca pueden almacenarse en una cámara húmeda hasta 30 minutos a temperatura ambiente antes del inicio de la técnica. 430-TMB-VPS/010708

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5.3. Incubar los pocillos de la microplaca durante 60 min (± 5 min) a 37 °C (± 1 °C) en una cámara húmeda o alternativamente cubrir la placa con un adhesivo. 5.4

Transcurrido el tiempo de incubación, lavar tres veces de los pocillos de la microplaca con 200 µl de solución por pocillo. Verificar que todos los pocillos estén Después del ciclo de lavado, sacudir la microplaca secante.

cada uno de lavado rellenos. en papel

¡No dejar secar los pocillos! ¡Proceder inmediatamente! 5.5. Añadir el conjugado (teñido en verde) a cada pocillo. Si el ensayo se realiza manualmente, pipetear 50 µl del conjugado a cada pocillo. Tener en cuenta: Cuando se trabaja con aparatos automatizados, se deben pipetear 60 µl de conjugado a cada pocillo debido a la alta evaporación que se produce en las cámaras de incubación de estos procesadores. Durante la evaluación del test se confirmó la posibilidad de su automatización. Sin embargo, se recomienda verificar la compatibilidad del test con los aparatos utilizados en el laboratorio. 5.6. Incubar nuevamente durante 60 min (± 5 min) a 37 °C (± 1 °C) en una cámara húmeda o alternativamente cubrir la placa con un adhesivo. 5.7. Transcurrido el tiempo de incubación, pocillos de la microplaca (ver 5.4.).

lavar

nuevamente

los

5.8. Añadir 50 µl de TMB-substrato a cada pocillo e incubar en oscuridad durante 30 min (± 2 min) a 37 °C (± 1 °C) en una cámara húmeda o cubierta con un adhesivo en oscuridad. Las muestra positivas viran a azul. 5.9. La reacción se para añadiendo 100 µl de solución de parada a cada pocillo. Las muestras positivas viran a amarillo. Limpiar los pocillos de la microplaca por debajo antes de la lectura fotométrica y asegurarse de que no haya burbujas en el interior de los pocillos. La lectura debe realizarse en los 15 minutos siguientes a la adición de la solución de parada.

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5.B. TABLA PARA EL PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA Blanco (A1) Diluyente de la muestra Control negativo Control positivo Muestra

50 µl -

Control negativo 50 µl -

Control positivo 50 µl -

Muestra 50 µl

Incubar durante 60 min a 37 °C, lavar 3 x con 200 µl solución de lavado Conjugado

50/60 µl*)

50/60 µl*)

50/60 µl*)

50/60 µl*)

Incubar durante 60 min a 37 °C, lavar 3 x con 200 µl solución de lavado. TMB-substrato

50 µl

50 µl

Incubar durante 30 min a 37 Solución de parada

100 µl

o

50 µl

50 µl

C en oscuridad

100 µl

100 µl

100 µl

Leer fotométricamente a 450 nm (ref. 620 - 650 nm) *) Procedimiento manual/automático (ver 5.5.)

6.A. CALCULO DE LOS RESULTADOS (VALIDACION) ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗

Leer los valores de la D.O. a 450 nm (longitud de onda de referencia 620 - 650 nm). Restar el valor del blanco (pocillo A1) de todos los demás valores de la D.O. El valor de la D.O. del blanco, debe de ser menor de 0,100. La media del valor de la D.O. del control negativo tiene que ser menor que 0,100. El valor de la D.O. del control positivo, tiene que ser superior a 0,800. Cut-off = la media de los valores de la D.O. del control negativo + 0,380 Zona dudosa = cut-off ± 10 % Repetir el ensayo especificaciones.

si

los

resultados

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no

cumplen

con

las

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6.B. EVALUACION DE LOS RESULTADOS

6.B.1.

6.B.2.

CUALITATIVO Resultado

Evaluación

D.O. < zona dudosa D.O. del Cut-off ± 10 % D.O. > zona dudosa

negativo dudosa positivo

SEMICUANTITATIVO

Indice Cut-off:

D.O. muestra D.O. Cut-off

< 0,9 0,9 - 1,1 > 1,1

Evaluación negativo dudosa positivo

∗

Las muestras con valores de la D.O. dentro de la zona dudosa, deberían ensayarse nuevamente junto con otra muestra reciente tomada 14 días después, con el objeto de determinar un cambio en el título.

∗

Los resultados deberían interpretarse en relación con IgG e IgM y los datos clínicos y el resto de parámetros del diagnóstico.

∗

Concentraciones elevadas de hemoglobina, bilirrubina y de lípidos en el suero, no influyen en los resultados.

∗

En casos puntuales, no pueden excluirse reacciones cruzadas con anticuerpos antinucleares, anticuerpos heterófilos y anticuerpos frente a C. trachomatis y C. psittaci.

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6.C. INTERPRETACION ESPECIFICA DE IgG/IgA Posibles Resultados IgG IgA

Interpretación

1. +

+ 2.

+

-

3. +

+/-

4. +/-

-

5. -

+

-

+/-

6.

7. +/-

+

8. -

-

IgG e IgA positivo; indica infección. Otras conclusiones dependen del título y de los síntomas. Solamente IgG positiva; indica una infección pasada. En caso de sospecha clínica, comprobar si existe un incremento de 4 veces en el título de la IgG entre dos muestras de suero y retestar la IgA. IgG positiva, IgA en zona dudosa; puede significar una infección reciente; retestar la IgA transcurridos 10 - 14 días. Solamente IgG en zona dudosa; no puede excluirse la posibilidad de una infección pasada. En caso de sospecha clínica, retestar la IgG e IgA transcurridos 10 14 días. Solamente IgA positiva; posibilidad de una infección en un estadío temprano, o persistencia de IgA. Retestar la IgG e IgA transcurridos 10 - 14 días. Solamente IgA en zona dudosa; posibilidad de un estadío muy temprano de infección. Retestar la IgA e IgG transcurridos 10 14 días. IgG en zona dudosa, IgA positiva; posibilidad de infección activa en un estadío temprano. Retestar la IgA e IgG transcurridos 10 - 14 días. IgG e IgA negativas; no indica infección. En caso de sospecha clínica justificada debería realizarse una detección directa del antígeno así como retestar la IgA e IgG transcurridos 10 - 14 días.

Nota: En casos de infecciones agudas recientes de chlamydia el resultado serológico de los anticuerpos podría ser negativo, a pesar de los síntomas clínicos y el resultado positivo en la detección antigénica. Si se requiere una confirmación serológica de un resultado positivo para el antígeno, o si se requiere seguimiento, se recomienda testar nuevamente transcurridos 10 - 14 días para confirmar seroconversión. 430-TMB-VPS/010708

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7.

CARACTERISTICAS DEL ENSAYO

Durante la evaluación en el diagnóstico, siguientes características del ensayo.

se

determinaron

las

7.A. ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD Se investigaron sueros de pacientes sin síntomas de infección respiratoria para la determinación de la especificidad. No se detectaron anticuerpos frente a C. pneumoniae por MIF. Se investigaron sueros de pacientes con sospecha de infección respiratoria para la determinación de la sensibilidad. Se detectaron anticuerpos frente a C. pneumoniae por MIF en todos los sueros.

Grupo de Pacientes

Especifidad

Pacientes sin infección respiratoria; no se detectaron anticuerpos frente a C. pneumoniae por MIF.

IgA

IgG

93 % (n=86)

95 % (n=42)

Grupo de Pacientes

Sensibilidad

IgA

Pacientes con infección respiratoria; se detectan anticuerpos frente a C. pneumoniae en todos los casos por MIF.

IgG

95 % (n=74) 99 % (n=117)

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7.B. PRECISION Muestra

CN CB CP N° 1 N° 2

Variación intra-ensayo Media D.O. 0,032 0,772 1,990 1,951 0,731

DS

CV (%)

n

0,009 0,038 0,062 0,098 0,030

28 5 3 5 4

21 21 21 21 21

Muestra

CN CB CP N° 3 N° 4

Variación interensayo (n = 11) Media DS CV (%) D.O. 0,035 0,004 11 0,824 0,073 9 2,133 0,149 7 1,655 0,140 8 1,027 0,087 8

CN = control negativo; CB = control intermedio (no se incluye en el kit);CP = control positivo

ADVERTENCIAS GENERALES SOBRE LA MANIPULACION ∗ Para evitar contaminaciones entre muestras, viales y los tapones de muestras diferentes.

no

intercambiar

los

∗ Los reactivos deben cerrarse herméticamente, inmediatamente después de utilizarse para evitar la evaporación y contaminaciones microbianas. ∗ Tras su utilización, los reactivos deben almacenarse como se ha indicado para garantizar su vida media. ∗ Tras su utilización, todos los componentes del kit deberían guardarse en su envase original; con objeto de evitar intercambiarlos con reactivos de otro tipo de ensayos o de otros lotes (ver punto 3). INFORMACION SOBRE SEGURIDAD E HIGIENE ∗ Debe cumplirse la normativa sobre seguridad e higiene en el trabajo de cada país. ∗ Los reactivos de origen humano han sido testados y se ha encontrado que son negativos para Ag HBs, para anticuerpos frente a VIH-1/2 y para VHC. A pesar de ello, está altamente recomendado que estos materiales así como aquellos de origen animal (ver contenido del kit) sean siempre manipulados como potencialmente infeccioso y utilizados con todas las precauciones necesarias. CONSIDERACIONES SOBRE ELIMINACION DE LOS RESIDUOS Los residuos químicos y de las preparaciones se consideran en general como material peligroso. La eliminación de estos residuos está regulada a través de las leyes nacionales y regionales y de sus normativas. Contactar con las autoridades locales o con las compañías de gestión homologadas, que aconsejarán del modo en el que se deben eliminar los residuos peligrosos. Fecha de revisión: 01.07.2008 430-TMB-VPS/010708

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