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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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11 N´ umero de publicaci´on: 6

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˜ ESPANA

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2 125 004

A61K 38/05

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 95907743.9 kFecha de presentaci´on : 07.02.95 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 743 953 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 27.11.96

T3

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54 T´ıtulo: Derivados pept´ıdicos de trifluorometilcetona puros, diastereois´ omeros, como inhibidores de

leucocitoelastasa humana.

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30 Prioridad: 11.02.94 GB 9402680

26.10.94 GB 9421550

15 Stanhope Gate London W1Y 6LN, GB

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72 Inventor/es: Pegg, Stephen John;

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74 Agente: D´ avila Baz, Angel

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.02.99

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.02.99

ES 2 125 004 T3

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73 Titular/es: Zeneca Limited

Aviso:

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Sependa, George Joseph; Davies, Elwyn Peter y Veale, Chris Allan

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 125 004 T3 DESCRIPCION Derivados pept´ıdicos de trifluorometilcetona puros, diastereois´ omeros, como inhibidores de leucocitoelastasa humana. 5

La presente invenci´on se refiere a derivados de pirrolidina, y m´ as particularmente al compuesto (S) 1 - [(S) - 2 - (4 - metoxibenzamido) - 3 - metilbutiril] - N - [(S) - 2 - metil - 1 - (trifluoroacetil)propil] pirrolidin - 2 - carboxamida, mostrado por la f´ ormula I (indicada posteriormente aqu´ı)

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y que tiene la configuraci´ on S en los centros quirales identificados por los s´ımbolos ∗ y #, y solvatos del mismo, compuesto que es un inhibidor de leucocito-elastasa humana (HLE), tambi´en conocida como neutr´ ofilo-elastasa humana (HNE), que tiene valor, por ejemplo, como una herramienta de investigaci´on en estudios farmacol´ogicos, de diagn´ ostico y afines y en el tratamiento de enfermedades en mam´ıferos en las que est´ a implicada la HLE. Por ejemplo, la HLE se ha implicado causalmente en la patog´enesis del s´ındrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), la artritis reumatoide, la aterosclerosis, el enfisema pulmonar, y otros trastornos inflamatorios, incluyendo enfermedades inflamatorias de las v´ıas respiratorias caracterizadas por una secreci´on incrementada y anormal en las v´ıas respiratorias, tales como bronquitis aguda y cr´ onica y fibrosis c´ıstica. Adem´ as, la HLE se ha implicado causalmente en ciertas enfermedades vasculares y estados afines (y su terapia) en los que est´a involucrada o implicada la participaci´ on de los neutr´ ofilos, por ejemplo, en la hemorragia asociada con leucemia no linfoc´ıtica aguda, as´ı como en la lesi´on por reperfusi´on asociada con, por ejemplo, la isquemia de miocardio y estados afines asociados con una enfermedad arterial coronaria tales como angina e infarto, isquemia cerebrovascular, tal como ataque isqu´emico transitorio y apoplej´ıa, enfermedad vascular oclusiva perif´erica, tal como claudicaci´on intermitente e isquemia cr´ıtica de los miembros, insuficiencia venosa, tal como hipertensi´ on venosa, venas varicosas y ulceraci´on venosa, as´ı como estados de reperfusi´ on deteriorados tales como los asociados con cirug´ıa vascular reconstructiva, tromb´ olisis y angioplastia. La invenci´on tambi´en trata de m´etodos para tratar uno o m´ as de estos estados de enfermedad y del uso del compuesto (o un solvato del mismo) en la fabricaci´ on de un medicamento para usar en uno o m´ as de dichos estados. La invenci´on trata, adem´ as, de composiciones farmac´euticas que contienen el compuesto, o un solvato del mismo, como ingrediente activo, as´ı como de procesos para la fabricaci´ on del compuesto (o un solvato del mismo), de nuevos productos intermedios u ´tiles en dichos procesos y de m´etodos para la preparaci´ on de dichos productos intermedios. Debido al papel aparente de la HLE, ha habido un esfuerzo de investigaci´ on considerable en los u ´ ltimos a˜ nos hacia el desarrollo de inhibidores de HLE. En la Patente de EE.UU. 4.910.190 se describe una serie de derivados de peptidoil-trifluorometano estructuralmente afines que son inhibidores de HLE. En Tetrahedron Letters, 1992, 33(30), 4279-82 se describe un m´etodo para la preparaci´ on de una peptidil-TFMK en la que los tres centros de la mol´ecula tienen la configuraci´ on S y el sustituyente en el nitr´ ogeno val´ılico es CBZ. Se ha descubierto ahora que el derivado de pirrolidina espec´ıfico nombrado anteriormente es un potente inhibidor de HLE, que posee una ventaja sorprendente ya que es un solo diastereois´ omero que tiene una forma cristalina. Esto proporciona una base para la presente invenci´ on. Usar un inhibidor de HLE que no puede aislarse en una forma cristalina como, o en la formulaci´ on de, un medicamento para tratar los estados de enfermedad mencionados anteriormente plantea problemas significativos, por ejemplo, en la fabricaci´ on del compuesto o la formulaci´ on hasta los niveles de pureza y la uniformidad requeridos para la aprobaci´ on reguladora. Por lo tanto, es altamente deseable encontrar un nuevo inhibidor de HLE cristalino e incluso m´ as deseable obtener un nuevo inhibidor de HLE cristalino que sea un s´olo diastereois´omero. Una ventaja adicional del compuesto de la invenci´ on es que se ha encontrado que posee actividad inhibidora de HLE cuando se administra oralmente. Antes de la presente invenci´ on, el derivado de pirrolidina espec´ıfico nombrado anteriormente no se hab´ıa preparado previamente y por lo tanto no se conoc´ıa nada espec´ıficamente de sus propiedades f´ısicas, qu´ımicas o farmacol´ogicas. De acuerdo con la invenci´ on se proporciona el compuesto (S)-1-[(S)-2-(4-metoxibenzamido)-3metilbutiril]-N-[(S)-2-metil-1-(trifluoroacetil)propil]pirrolidin-2-carboxamida, o un solvato del mismo. 2

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El compuesto de la invenci´on, que tambi´en puede representarse por la f´ ormula Ia

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(en la que una l´ınea engrosada indica un enlace que se proyecta delante del plano del papel), es un solo diastereois´omero, denominado en lo sucesivo aqu´ı el “diastereois´omero SSS de f´ ormula I” o el “diastereois´omero SSS”, para distinguirlo de otros posibles diastereois´ omeros con diferentes configuraciones en los centros quirales indicados por ∗ y # en la f´ormula I, por ejemplo, el diastereois´ omero que, en la f´ ormula I, tiene la configuraci´ on S en los centros quirales marcados con ∗ y la configuraci´ on R en el centro quiral marcado con # (en lo sucesivo denominado el “diastereois´omero SSR de f´ ormula I” o el “diastereois´omero SSR”). El diastereois´ omero SSS de f´ ormula I es un s´ olido cristalino, que existe en una forma que est´ a sustancialmente o esencialmente libre de disolvente (en lo sucesivo denominada aqu´ı la forma “anhidra”), o como una forma solvatada. La forma solvatada puede, por ejemplo, ser una forma hidratada, que puede existir como un gem-diol de la funcionalidad de trifluoroacetona, esto es como un compuesto de la f´ ormula Ib

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y/o una forma que incorpora una mol´ecula de agua como parte de la red cristalina. Por ejemplo, el gem-diol Ib puede hidratarse adicionalmente. Puede obtenerse el diastereois´ omero SSS cristalino en el que la relaci´ on de forma anhidra a forma solvatada (por ejemplo, hidratada) es, por ejemplo, aproximadamente 1:1 o mayor, tal como 4:1 o mayor. Cuando el compuesto de la invenci´ on, por ejemplo, se a´ısla sustancialmente o esencialmente libre del disolvente, la relaci´ on de forma anhidra a forma solvatada (por ejemplo, hidratada) es, por ejemplo, aproximadamente 19:1 o mejor, esto es 95 % o m´ as en peso del compuesto est´a en la forma anhidra. Se apreciar´ a que es extremadamente dif´ıcil obtener un compuesto que sea un diastereois´ omero simple completamente libre de las otras posibles formas diastereois´ omeras, particularmente un compuesto que tiene tres centros quirales. La presente invenci´on incluye por lo tanto una forma cristalina del diastereois´omero SSS de f´ ormula I, o un solvato de la misma, que contiene otros posibles diastereois´omeros con diferentes configuraciones en los centros quirales indicados por ∗ y # en la f´ ormula I. Se ha encontrado que puede obtenerse el diastereois´omero SSS cristalino de f´ ormula I, o un solvato del mismo, que contiene 25 % o menos de diastereois´omero SSR de f´ ormula I, esto es el material cristalino tiene una relaci´on de formas SSS:SSR de aproximadamente 3:1 o m´ as. La presente invenci´on incluye por lo tanto una forma cristalina del compuesto de f´ ormula I con un contenido de al menos 75 % del diastereois´ omero SSS. Por ejemplo, puede obtenerse material cristalino que tiene una relaci´on de SSS:SSR de aproximadamente 4:1 (o mayor) y una relaci´ on de formas anhidra:hidratada de aproximadamente 4:1 (o mayor). Preferiblemente, el diastereois´omero SSS cristalino de f´ ormula I, o un solvato del mismo, es sustancialmente o esencialmente puro, es decir, contiene menos de 5 % de uno o m´as de los otros posibles diastereois´omeros, por ejemplo, contiene menos de 5 % del diastereois´omero SSR de f´ ormula I, preferiblemente menos de 3 % del diastereois´omero SSR de f´ ormula I, y m´ as preferiblemente menos del 2 % del diastereois´omero SSR de f´ ormula I.

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Preferiblemente, el diastereois´omero SSS de f´ ormula I est´ a en la forma anhidra, es decir, sustancialmente o esencialmente libre de la forma solvatada (por ejemplo, hidratada). En esta forma, el diastereois´omero SSS tiene la propiedad ventajosa de que es no higrosc´ opico. Tambi´en posee la propiedad ventajosa de que en el estado s´ olido tiene buena estabilidad ep´ımera. As´ı, una forma particularmente preferida de diastereois´ omero SSS de f´ ormula I es una forma que contiene menos de 2 % de diastereois´omero SSS de f´ ormula I y que est´ a 95 % o m´as en la forma anhidra. El punto de fusi´ on del diastereois´omero SSS de f´ ormula I depende generalmente del nivel de pureza y puede determinarse mediante procedimientos convencionales bien conocidos en la industria, por ejemplo, mediante calorimetr´ıa de exploraci´on diferencial (DSC). T´ıpicamente, el diastereois´ omero SSS de f´ ormula I tiene un punto de fusi´ on que est´a en el intervalo 147-151◦C, por ejemplo aproximadamente 148-150◦C, en particular aproximadamente 147-149◦C, cuando est´a sustancialmente o esencialmente en la forma anhidra y sustancialmente o esencialmente libre de diastereois´ omero SSR (velocidad de calentamiento 5◦C/minuto). Sin embargo, cuando existe como una mezcla aproximadamente 1:1 de formas anhidra e hidratada, y est´ a sustancialmente o esencialmente libre del diastereois´ omero SSR, puede obtenerse una forma que tiene t´ıpicamente un punto de fusi´ on de aproximadamente 116-117◦C. El diastereois´ omero SSS de f´ ormula I, cuando est´a sustancialmente o esencialmente en la forma anhidra y sustancialmente o esencialmente libre del diastereois´omero SSR, tiene un patr´ on de difracci´ on de rayos X del polvo que incluye picos espec´ıficos en aproximadamente 2θ = 8,95, 11,17, 11,47, 13,86, 15,49, 17,86, 18,22, 19,24, 21,58 y 21,92◦. El diastereois´ omero SSS de f´ ormula I, cuando existe como una mezcla sustancialmente 1:1 de formas on de anhidra e hidratada que tiene un punto de fusi´ on de aproximadamente 116-117◦C, tiene un patr´ difracci´ on de rayos X del polvo que incluye picos espec´ıficos en aproximadamente 2θ = 6,20, 9,81, 10,29, 12,33, 12,44, 14,22 y 17,92◦. Adicionalmente, el diastereois´ omero SSS de f´ ormula I puede obtenerse en una forma hidratada cristalina que est´ a sustancialmente o esencialmente libre del diastereois´omero SSR y que mediante calorimetr´ıa de exploraci´on diferencial (velocidad de calentamiento 2◦ C/minuto) tiene un suceso endot´ermico con un comienzo a aproximadamente 91-92◦C (con un pico a aproximadamente 99-100◦C), seguido por un suceso exot´ermico con el comienzo a aproximadamente 109-110◦C (con un pico a aproximadamente 111-112◦C), seguido por un suceso endot´ermico adicional con el comienzo a aproximadamente 148-149◦C (con un on de difracci´ on de valor del pico a aproximadamente 150-151◦C). Esta forma hidratada tiene un patr´ rayos X del polvo que incluye picos espec´ıficos en aproximadamente 2θ = 6,62, 10,43, 13,30, 16,17, 19,51, alisis termogravim´etrico (TGA) y los datos 21,37 y 22,80◦. Los datos de DSC, junto con los datos del an´ espectrales de RMN de 19 F, indican que esta forma es sustancialmente el monohidrato de gem-diol (de f´ ormula Ib). Se apreciar´ a que los valores del comienzo y del pico apuntados anteriormente pueden variar ligeramente de acuerdo con la velocidad de exploraci´ on empleada. Por ejemplo, una exploraci´ on de DSC similar llevada a cabo a una velocidad de exploraci´on de 5◦ C/minuto mostraba el comienzo del primer suceso endot´ermico a aproximadamente 95-96◦C (con un pico a 105-106◦C). Los espectros de difracci´on de rayos X del polvo se determinaron usando un difract´ ometro de rayos X Scintag XDS-2000, con un detector de fotones para estado s´ olido EC&G, Serie GLP (germanio) manejado mediante un ordenador Microvax y usando el soporte l´ ogico Diffraction Management System suministrado por Scintag Inc., Sunnydale, California, EE.UU. de A. El tubo de rayos X usado era un K-alfa de Cu con una longitud de onda de 1,5406A a 45KV y 40mA. Las ranuras receptoras se fijaron a 2 y 4 mm y las ranuras divergentes se fijaron a 0,5 y 0,2 mm con respecto a la trayectoria del haz incidente. Los espectros se obtuvieron en el modo de exploraci´on continua con un incremento del interruptor c´ıclico de 0,02. Cada muestra se expuso a 1 grado 2-theta por minuto (el tiempo de desarrollo era 38 minutos) y se recogi´ o de 2 a 40 grados 2-theta, para producir una traza de espaciamientos frente a la intensidad para este intervalo. Para el an´ alisis de difracci´ on las muestras se introdujeron en cubetas de muestra redondas de aleaci´ on de aluminio con un di´ ametro de 25 mm y una profundidad de 2 mm. La muestra de polvo se puso en la cubeta de modo que estuviera presente una cantidad por encima del volumen de la cubeta y posteriormente se nivel´o hasta el borde de la cubeta con un portaobjetos de vidrio de microscopio. Silicio tipo NBS 640b se us´ o como un patr´ on externo. Los espectros de difracci´ on de rayos X del polvo de muestras t´ıpicas del diastereois´ omero SSS de la f´ ormula I, cuando est´a sustancialmente o esencialmente libre de disolvente, cuando es aproximadamente una mezcla 1:1 de formas anhidra e hidratada y cuando est´ a en una forma hidratada (monohidrato de 4

ES 2 125 004 T3 gem-diol), se muestran en las Figuras 1, 2 y 3, respectivamente, posteriormente.

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Los espectros infrarrojos se obtuvieron para muestras t´ıpicas del diastereois´ omero SSS de la f´ ormula I cuando est´a sustancialmente o esencialmente libre de disolvente, cuando es una mezcla aproximadamente 1:1 de formas anhidra e hidratada, y cuando es el monohidrato de f´ ormula Ib. Los espectros infrarrojos se obtuvieron mediante la t´ecnica de colada de disolvente bien conocida en la industria, a partir de coladas con acetonitrilo de una muestra sobre una ventana de sal (por ejemplo ZnSe o KBr) para el an´ alisis mediante transmisi´ on directa. Los espectros infrarrojos se determinaron sobre el intervalo de n´ umeros de ondas de 4000 a 400 cm−1 .

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El espectro infrarrojo de una muestra del diastereois´ omero SSS de la f´ ormula I cuando est´a sustancialmente o esencialmente libre de disolvente se muestra en la Figura 4. El espectro de la Figura 4 incluye picos agudos a aproximadamente 2968, 1761, 1629, 1607, 1533, 1503, 1443, 1259, 1209, 1178, 1158, 1032, omero SSS de la f´ ormula I cuando es 845 y 767 cm−1 . El espectro infrarrojo de una muestra de diastereois´ una mezcla aproximadamente 1:1 de formas anhidra e hidratada y el de una muestra del monohidrato del gem-diol de f´ ormula Ib no eran significativamente diferentes de aqu´el de la Figura 3 debido a la naturaleza de la t´ecnica de colada de disolvente y el disolvente empleado.

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Se entender´a que los valores de 2θ de los patrones de difracci´on de rayos X del polvo y las longitudes de onda de los espectros infrarrojos pueden variar ligeramente de una m´ aquina a otra y as´ı los valores apuntados no deben considerarse como absolutos.

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Se apreciar´ a que los a´tomos de hidr´ ogeno de los grupos hidroxilo del gem-diol de f´ ormula Ib son a´cidos y que tales compuestos pueden formar por lo tanto sales cristalinas farmac´euticamente aceptables, usando procedimientos convencionales, por ejemplo con bases que proporcionan cationes fisiol´ogicamente aceptables, por ejemplo sales de metales alcalinos (tales como sodio o potasio), metales alcalinot´erreos o aminas org´anicas. La invenci´on incluye por lo tanto sales cristalinas farmac´euticamente aceptables de un gem-diol de f´ ormula Ib o un hidrato del mismo.

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El diastereois´ omero SSS de f´ ormula I, o los solvatos del mismo, pueden obtenerse mediante los siguientes procesos, que son aspectos separados adicionales de la invenci´on.

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El diastereois´ omero SSS cristalino que contiene menos de 25 % de diastereois´ omeros SSR puede obtenerse a partir de una mezcla diastereois´ omera no cristalina (amorfa) de los diastereois´ omeros SSS y SSR, que contiene los diastereois´ omeros SSS y SSR en cantidades aproximadamente iguales (es decir, una relaci´on de SSS:SSR de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:2), mediante cristalizaci´ on a partir de un disolvente no polar adecuado, tal como ´eter diet´ılico, ´eter di-n-prop´ılico o ´eter di-n-but´ılico, o una mezcla de disolventes, tal como una mezcla de metil-terc-butil-´eter y hexano o, preferiblemente, una mezcla de acetato de etilo y hexano. Para iniciar la cristalizaci´ on, se requiere la siembra con diastereois´omero SSS cristalino. Uno de tales procesos de cristalizaci´on preferidos comprende reducir el volumen de la soluci´on de una mezcla diastereois´omera no cristalina de los diastereois´omeros SSS y SSR en acetato de etilo mediante evaporaci´on o destilaci´on, a˜ nadir hexano a la soluci´ on caliente y mantener una soluci´on transparente, sembrando con diastereois´ omero SSS sustancialmente puro y dejando enfriar gradualmente. Una modificaci´ on de este proceso incluye el uso de una soluci´on de la mezcla diastereois´omera no cristalina de los diastereois´omeros SSS y SSR en un disolvente de punto de ebullici´ on inferior al del acetato de etilo (tal como metil-terc-butil-´eter), por ejemplo como puede obtenerse directamente a partir del tratamiento de la preparaci´ on de la mezcla no cristalina (seg´ un se analiza anteriormente) e intercambiando el disolvente por acetato de etilo a˜ nadiendo acetato de etilo y concentrando la soluci´ on mediante evaporaci´on o destilaci´on a presi´ on atmosf´erica, antes de la adici´ on del hexano.

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Dependiendo del disolvente empleado y las condiciones precisas usadas para la cristalizaci´on, el producto puede aislarse inicialmente como una mezcla de diastereois´omeros anhidro e hidratado, por ejemplo, que tiene una relaci´on de formas anhidra:hidratada de aproximadamente 1:1 o mayor. Puede obtenerse, por ejemplo, un producto cristalino que tiene una relaci´ on de formas anhidra:hidratada de aproximadamente 4:1. El diastereois´ omero SSS cristalino de f´ ormula I, sustancialmente o esencialmente puro, sustancialmente o esencialmente en la forma anhidra, por ejemplo, que contiene aproximadamente 5 % o menos de la forma hidratada, puede obtenerse mediante la recristalizaci´ on repetida de diastereois´ omero SSS cristalino que contiene diastereois´ omero SSR. Un disolvente no polar que forma un aze´otropo con agua se emplea generalmente para este prop´osito. Esto facilita la retirada de agua del sistema cuando el diastereois´omero SSS de f´ ormula I, que contiene diastereois´omero SSR, se disuelve mediante calentamiento o 5

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ebullici´on en un disolvente de cristalizaci´on, preferiblemente con concentraci´on de la soluci´on, antes de la adici´on de un segundo disolvente si se requiere, y permitiendo que tenga lugar la cristalizaci´ on. El tolueno es un disolvente particularmente adecuado para este prop´ osito, o una mezcla de acetato de etilo y hexano en la que el hexano se a˜ nade despu´es de la retirada azeotr´ opica de agua de la soluci´on de acetato de etilo. El diastereois´ omero SSS cristalino que es sustancialmente o esencialmente puro y est´a sustancialmente o esencialmente en la forma anhidra tambi´en puede recristalizarse posteriormente en disolventes alternativos, incluyendo acetato de n-butilo, acetato de isopropilo, 1,2-dimetoxietano, 2,2-dimetoxipropano, terc-butanol, terc-amil-metil-´eter y mezclas de diclorometano y hexano, metil-etil-cetona y hexano, N,Ndimetilformamida y metil-terc-butil-´eter, ´eter diprop´ılico y acetonitrilo, 1,4-dioxano y hexano, metiletil-cetona e isohexano, tetrahidrofurano y ciclohexano, acetato de etilo e isohexano, tetrahidrofurano y hexano, tetrahidrofurano e isohexano, ´eter diet´ılico y acetato de etilo, y terc-amil-metil-´eter y acetonitrilo. Una sola cristalizaci´ on en cualquiera de los disolventes anteriores puede ser suficiente para obtener diastereois´omero SSS que contiene 5 % o menos del diastereois´ omero SSR. En todas las cristalizaciones, se prefiere la iniciaci´on de la cristalizaci´on mediante siembra.

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Alternativamente, una forma hidratada sustancialmente o esencialmente pura (cuyos datos indican que es un monohidrato de gem-diol) puede obtenerse mediante la recristalizaci´ on repetida de diastereois´omero SSS cristalino que contiene diastereois´ omero SSR usando una mezcla de acetona y agua o una mezcla de terc-butanol y agua como disolvente. 20

Cuando se llevan a cabo las cristalizaciones o recristalizaciones mencionadas anteriormente, preferiblemente la relaci´on de volumen de disolvente (en ml) a peso de diastereois´ omero SSS que contiene diastereois´omero SSR (en gramos) est´ a, por ejemplo, en el intervalo de 2:1 a 5:1, y convenientemente de aproximadamente 6:1 a 10:1. 25

Una mezcla diastereois´omera no cristalina (amorfa) de diastereois´ omeros SSS y SSR seg´ un se menciona anteriormente puede obtenerse seg´ un se describe en el Ejemplo 20 de la Patente de EE.UU. N◦ 4.910.190 o mediante el proceso an´alogo ilustrado en el Esquema 2. 30

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Alternativamente, puede usarse el nuevo proceso ilustrado en el Esquema 2, en el que el nuevo producto intermedio N-(4-metoxibenzoil)-L-valil-L-prolina (o una sal del mismo), que es un aspecto adicional de la invenci´on, se acopla con 3-amino-4-metil-1,1,1-trifluoro-2-pentanol, seguido por la oxidaci´ on convencional del producto alcoh´ olico en la correspondiente cetona. Procedimientos convencionales para reacciones de acoplamiento y oxidaci´on similares se describen aqu´ı y en USP 4.910.190. Una ventaja de este proceso es que permite la incorporaci´ on del aminoalcohol en una fase posterior. El nuevo producto intermedio puede obtenerse usando las etapas convencionales de desprotecci´ on selectiva, acoplamiento y desprotecci´ on (Esquema 2, etapas (a)-(c)), seg´ un se ilustra en el Procedimiento 1 posteriormente aqu´ı. Alternativamente, N-terc-butiloxicarbonilvalina se acopla con el ´ester benc´ılico de prolina, por ejemplo, usando N-hidroxibenztriazol y diciclohexilcarbodiimida en diclorometano a 0◦ C, seguido por la retirada del grupo protector terc-butiloxicarbonilo usando a´cido trifluoroac´etico para dar ´ester benc´ılico de Lvalil-L-prolina. Este se acopla a continuaci´on con, por ejemplo, cloruro de aniso´ılo en diclorometano a aproximadamente temperatura ambiente en presencia de trietilamina, y el grupo protector bencilo se retira a continuaci´ on mediante hidrogen´ olisis. La mezcla diastereois´omera obtenida usando estos procesos tiene una relaci´ on de SSS:SSR de aproximadamente 1:1 a 3:1 y s´ olo se ha aislado en una forma no cristalina, tal como una espuma o un aceite. Alternativamente, un proceso particularmente ventajoso para la fabricaci´ on del nuevo producto intermedio N-(4-metoxibenzoil)-L-valil-L-prolina, que es otro aspecto de la presente invenci´on, se caracteriza por las siguientes etapas:

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(i) la reacci´on de L-valil-L-prolina (o una sal de la misma) con un tri-alquil(de 1 a 4 ´atomos de carbono)halogenosilano (por ejemplo, trimetilclorosilano) o una bis(tri-alquil(de 1 a 4 a´tomos de carbono)silil)acetamida (tal como bis(trimetilsilil)acetamida) para dar ´ester tri-alquil(de 1 a 4 a´tomos de carbono)sil´ılico de L-valil-L-prolina (por ejemplo ´ester trimetilsil´ılico de L-valil-L-prolina); seguido por 55

(ii) la reacci´ on del ´ester tri-alquil(de 1 a 4 a´tomos de carbono)-sil´ılico de L-valil-L-prolina con un derivado activado de a´cido 4-metoxibenzoico (por ejemplo, un cloruro de a´cido tal como cloruro de 4-metoxibenzo´ılo (tambi´en conocido como cloruro de aniso´ılo) o un anh´ıdrido), para dar ´ester tri-alquil(de 1 a 4 a´tomos de carbono)-sil´ılico de N-(4-metoxibenzoil)-L-valil-L-prolina; seguido por 60

(iii) retirada del grupo protector tri(alquil de 1 a 4 a´tomos de carbono)-sililo.

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La etapa (i) se lleva a cabo convenientemente en un disolvente o diluyente inerte adecuado, por ejemplo acetato de etilo, un disolvente o diluyente et´ereo (tal como tetrahidrofurano o dioxano) o un disolvente hidrocarbonado tal como tolueno, en presencia de una base org´ anica, tal como, por ejemplo, trietilamina, piridina o, preferiblemente, N-metilmorfolina, o una base inorg´ anica, tal como carbonato s´odico o pot´ asico. La reacci´on se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo, por ejemplo, de -10 a 50◦C, y preferiblemente entre 0 y 30◦ C. Preferiblemente, se usan aproximadamente dos equivalentes de base por equivalente de L-valil-L-prolina (o se emplean 3 equivalentes de base si se usa una sal, tal como hidrocloruro de L-valil-L-prolina). Preferiblemente, se usan aproximadamente 2 equivalentes o m´ as del agente sililante por equivalente de L-valil-L-prolina.

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La etapa (ii) se lleva a cabo bajo condiciones anhidras usando un m´etodo convencional. Por ejemplo, se usa cloruro de 4-metoxibenzo´ılo y se emplean condiciones similares a la etapa (i). En este caso, se usa aproximadamente un equivalente de cloruro de a´cido para un equivalente de base (o un ligero exceso). Preferiblemente, el producto de la etapa (i) no se a´ısla, sino que se hace reaccionar in situ mediante la adici´on de un equivalente adicional de la misma base que se usa en la etapa (i), seguido por un equivalente del cloruro de a´cido. La etapa (iii) se lleva a cabo usando un procedimiento convencional para la desprotecci´on de un grupo protector sililo, por ejemplo mediante hidr´olisis bajo condiciones acuosas. Convenientemente, el grupo protector sililo se retira durante el procedimiento de tratamiento de la etapa (ii). Se apreciar´a que otros agentes sililantes convencionales pueden usarse en la etapa (i) para formar el correspondiente ´ester sil´ılico de L-valil-L-prolina, que puede usarse a continuaci´ on en la etapa (ii) y el grupo protector sililo retirarse a continuaci´ on como la etapa (iii). Para obtener una mezcla diastereois´ omera no cristalina (amorfa) de diastereois´ omeros SSS y SSR, para usar como materia prima para preparar el compuesto de la invenci´ on, las etapas (i)-(iii) pueden ser seguidas por: (iv) la reacci´on de N - (4 - metoxibenzoil) - L - valil - L - prolina con 3 - amino - 4 - metil - 1,1,1 - trifluoro - 2 - pentanol para dar (S) - 1 - [(S) - 2 - (4 - metoxibenzamido) - 3 - metilbutiril] - N - [2 - metil - 1 - (2,2,2, - trifluoro - 1 - hidroxietil)propil]pirrolidin - 2 - carboxamida; seguida por (v) la oxidaci´ on de (S) - 1 - [(S) - 2 - (4 - metoxibenzamido) - 3 - metilbutiril] - N - [2 - metil - 1 - (2,2,2, trifluoro - 1 - hidroxietil)propil]pirrolidin - 2 - carboxamida, correspondientes a las etapas (d) y (e) en el Esquema 2. La etapa (iv) se lleva a cabo usando un m´etodo convencional para acoplar un a´cido carbox´ılico a una amina para formar un enlace amida, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. 4.910.190. Particularmente adecuado es el uso de un cloroformiato, por ejemplo un cloroformiato de alquilo (tal como cloroformiato de isobutilo) en presencia de una amina terciaria (tal como trietilamina o, preferiblemente N-metilmorfolina), en un disolvente o diluyente adecuado, por ejemplo un disolvente o diluyente clorado tal como diclorometano, un disolvente o diluyente et´ereo tal como tetrahidrofurano o metil-terc-butil-´eter, o un disolvente o diluyente hidrocarbonado tal como tolueno. Puede usarse una mezcla de disolventes o diluyentes, por ejemplo una mezcla de tolueno y tetrahidrofurano. La reacci´ on se lleva a cabo generalmente a una temperatura en el intervalo, por ejemplo, de -15◦C a 30◦ C, y preferiblemente entre -10◦C on inversa del anh´ıdrido mixto preformado a una suspensi´ on del y 20◦C. Tambi´en puede usarse una adici´ aminoalcohol, por ejemplo usando metil-terc-butil-´eter como disolvente. La etapa (v) se lleva a cabo usando un agente oxidante convencional para la conversi´ on de un grupo hidroxi en un grupo cetona. Agentes oxidantes y condiciones adecuados incluyen, por ejemplo, el uso de cloruro de oxalilo, dimetilsulf´oxido y una amina terciaria; el uso de anh´ıdrido ac´etico y dimetilsulf´oxido; el uso de complejo de tri´oxido de cromo-piridina en diclorometano; el uso de un reactivo de yodo hipervalente, tal como 1,1,1-triacetoxi-2,1-benzoxidol-3(3H)-ona, con a´cido trifluoroac´etico en diclorometano; el uso de dimetilsulf´ oxido en exceso y una carbodiimida soluble en agua en presencia de a´cido dicloroac´etico; o soluci´on acuosa alcalina de permanganato pot´asico. Agentes oxidantes particularmente adecuados son los dos u ´ ltimos nombrados, especialmente soluci´on acuosa alcalina de permanganato pot´asico, por ejemplo una mezcla de hidr´ oxido s´ odico y permanganato pot´ asico. El 3-amino-4-metil-1,1,1-trifluoro-2-pentanol puede obtenerse como se describe en la Patente de EE.UU. N◦ 4.910.190 o como se ilustra en los Ejemplos. Alternativamente, si la (S)-1-[(S)-2-(4-metoxibenzamido)-3-metilbutiril]-N-[(S)-2-metil-1-((R)-2,2,2,7

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trifluoro-1-hidroxietil)propil]pirrolidin-2-carboxamida (que puede obtenerse, por ejemplo, usando procedimientos an´alogos a los mostrados en el Esquema 1 ´o 2, pero usando el aminoalcohol resuelto 2(R),3(S)3-amino-4-metil-1,1,1-trifluoro-2-pentanol, obtenido ´el mismo como se describe en USP 4.910.190 o como se describe en los Ejemplos posteriormente aqu´ı) se oxida, entonces el material amorfo aislado puede cristalizarse para proporcionar diastereois´omero SSS cristalino sustancialmente o esencialmente puro como una mezcla de formas anhidra e hidratada (por ejemplo, si se usa ´eter diet´ılico como disolvente de cristalizaci´on), o sustancialmente la forma anhidra (por ejemplo, si el material se cristaliza o recristaliza en tolueno). La oxidaci´on puede llevarse a cabo usando condiciones an´alogas a las descritas en la etapa (v) anteriormente. Un procedimiento particularmente ventajoso para la fabricaci´ on del diastereois´omero SSS de f´ ormula I, que es una aspecto adicional m´as de la presente invenci´ on, se caracteriza por calentar una mezcla diastereois´omera no cristalina (amorfa) de diastereois´ omeros SSS y SSR de f´ ormula I con una base adecuada, por ejemplo una base terciaria tal como una N-alquil(de 1 a 4 a´tomos de carbono)-morfolina (por ejemplo, N-metilmorfolina), una N-alquil(de 1 a 4 a´tomos de carbono)-piperidina (por ejemplo, N-etilpiperidina), piridina o pentaisopropilguanidina, en un disolvente o diluyente no polar adecuado, por ejemplo, metilterc-butil-´eter, hexano o, preferiblemente, una mezcla de hidrocarburos que tiene un punto de ebullici´on on de petr´ oleo, p.e. 100-120◦C, tal como “ESSOCHEM en el intervalo 100-120◦C (por ejemplo, una fracci´ 30” (una marca registrada)), o mezclas de los mismos, o una mezcla de acetato de etilo y hexano. A medida que la soluci´on se deja enfriar gradualmente, el diastereois´ omero SSS cristaliza en la soluci´ on y tiene lugar la epimerizaci´on de la mezcla diastereois´omera entonces enriquecida en SSR que permanece en la soluci´on caliente o templada, con lo que se produce diastereois´omero SSS adicional que cristaliza. As´ı, el equilibrio se desplaza en favor del diastereois´ omero SSS. Este proceso de epimerizaci´on/cristalizaci´on, por lo tanto, permite la conversi´ on de diastereois´omero SSR en diastereois´ omero SSS, o el reciclado de las aguas madres enriquecidas en el diastereois´omero SSR, para producir cantidades adicionales de diastereois´omero SSS. El proceso, por lo tanto, tiene la ventaja de que puede llevarse a cabo usando una mezcla diastereois´omera enriquecida en SSS o SSR. Una base preferida para usar en el proceso de epimerizaci´on/cristalizaci´on es la N-metilmorfolina. Dependiendo del disolvente o diluyente empleado, se lleva a cabo generalmente el calentamiento, por ejemplo, a una temperatura en el intervalo de 5-130◦C, y convenientemente, por ejemplo, inicialmente a la temperatura de reflujo del disolvente o diluyente, antes de permitir que la mezcla de reacci´ on se enfr´ıe gradualmente y tenga lugar la cristalizaci´ on del diastereois´omero SSS. Es preferible que la mezcla de reacci´on se caliente a fin de que se produzca la destilaci´on del disolvente, antes de enfriar. Un disolvente o diluyente no polar miscible en el que el diastereois´ omero SSS es menos soluble puede a˜ nadirse a la soluci´on calentada para ayudar a la cristalizaci´ on. Esta adici´ on puede llevarse a cabo convenientemente mientras est´a teniendo lugar la destilaci´on del disolvente o diluyente inicial, para evitar la cristalizaci´ on prematura del producto. Alternativamente, el disolvente inicial en el que la mezcla diastereois´ omera y la base se calientan puede reemplazarse sustancialmente por un disolvente no polar miscible de punto de ebullici´on superior en el que el diastereois´ omero SSS es menos soluble, antes del enfriamiento gradual. Por ejemplo, cuando se usa metil-terc-butil-´eter como disolvente, una mezcla de hidrocarburos que tiene nadirse (por ejemplo, una fracci´ on de petr´ oleo, un punto de ebullici´ on en el intervalo 100-120◦C puede a˜ on de uno o m´ as de otros de tales p.e. 100-120◦C, tal como ESSOCHEM 30), opcionalmente con la adici´ disolventes, tales como tolueno, con retirada simult´anea del disolvente de punto de ebullici´ on inferior mediante destilaci´on, antes de enfriar. Se apreciar´a que esta modificaci´on permite que se use una mezcla diastereois´omera que se a´ısla inicialmente como una soluci´ on en un disolvente sustancialmente no polar para obtener diastereois´ omero SSS cristalino.

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Para iniciar la cristalizaci´ on, se requiere la siembra con diastereois´omero SSS cristalino, preferiblemente, la cristalizaci´on se lleva a cabo permitiendo que la temperatura de la mezcla se enfr´ıe lentamente hasta temperatura ambiente, por ejemplo permitiendo que la temperatura caiga en etapas de 10◦ C y manteniendo a cada temperatura durante aproximadamente una hora. Preferiblemente, se usan 0,1-1 equivalentes de base por equivalente de materia prima amorfa, especialmente aproximadamente 1 equivalente. Una modificaci´ on de este proceso de epimerizaci´on/cristalizaci´on que puede usarse para preparar el diastereois´omero SSS de f´ ormula I es la cristalizaci´on de una mezcla no cristalina de los diastereois´ omeros SSS y SSR en un disolvente no polar adecuado (como los mencionados anteriormente), tal como una mezcla de acetato de etilo y hexano, en presencia de una cantidad catal´ıtica (por ejemplo, aproximadamente 10 % en moles) de una base (como la definida anteriormente), por ejemplo N-metilmorfolina. 8

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Usando el proceso de epimerizaci´on/cristalizaci´on, el material cristalino aislado inicialmente es diastereois´omero SSS cristalino que contiene menos de 25 % de diastereois´omero SSR, por ejemplo se obtiene generalmente material cristalino con una relaci´ on de SSS:SSR de 4:1 o mejor. El material se a´ısla inicialmente generalmente como una mezcla de formas anhidra e hidratada. El diastereois´ omero SSS cristalino de f´ ormula I, sustancialmente o esencialmente puro, sustancialmente o esencialmente en la forma anhidra, por ejemplo, que contiene aproximadamente 5 % o menos de la forma hidratada, o una forma hidratada cristalina, puede obtenerse mediante la recristalizaci´on de este material seg´ un se describe anteriormente aqu´ı.

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Es preferible retirar cualquier base residual del producto aislado del proceso de epimerizaci´ on/cristalizaci´on antes de la purificaci´ on adicional mediante recristalizaci´ on, para evitar la epimerizaci´on del producto de nuevo hasta una mezcla diastereois´ omera. Esto se alcanza, por ejemplo, lavando el producto aislado con ´acido acuoso diluido, por ejemplo a´cido clorh´ıdrico diluido o a´cido sulf´ urico diluido. 15

La utilidad del compuesto de la invenci´ on puede demostrarse mediante pruebas y estudios cl´ınicos est´andar, incluyendo los descritos posteriormente. Medidas de la Inhibici´ on: 20

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La potencia del compuesto de la invenci´on para actuar como un inhibidor de leucocito-elastasa humana (HLE) sobre el sustrato pept´ıdico de bajo peso molecular metoxi-succinil-alanil-alanil-propil-valinap-nitroanilida se determina seg´ un se describe en la Patente de EE.UU. 4.910.190. La potencia del compuesto se eval´ ua obteniendo una determinaci´ on cin´etica de la constante de disociaci´on, Ki , del complejo formado a partir de la interacci´ on del inhibidor con HLE. Se encontr´ o que el compuesto de la invenci´on ten´ıa una Ki de 6,7 nM. Modelo de Lesi´ on Aguda de Pulm´ on:

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Modelos animales de enfisema incluyen la administraci´ on intratraqueal (i.t.) de una proteasa elastol´ıtica para provocar una lesi´ on destructiva, lentamente progresiva, del pulm´ on. Estas lesiones se eval´ uan normalmente de unas pocas semanas a unos pocos meses despu´es del da˜ no inicial. Sin embargo, estas proteasas tambi´en inducen una lesi´ on que es evidente en las primeras pocas horas. La lesi´on inicial es en primer lugar hemorr´ agica, progresa hasta una lesi´ on inflamatoria al final de las primeras 24 horas y se resuelve en la primera semana despu´es del da˜ no. Para adquirir ventajas de esta lesi´ on inicial, puede usarse el siguiente modelo: H´amsteres son ligeramente anestesiados en primer lugar con Brevital. Soluci´on salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, sola o que contiene leucocito-elastasa humana (HLE), se administra a continuaci´ on directamente en la tr´ aquea. Veinticuatro horas despu´es los animales son sacrificados y los pulmones son extra´ıdos y recortados cuidadosamente de tejido extra˜ no. Despu´es de la determinaci´on del peso pulmonar en h´ umedo, los pulmones se lavan con PBS y se determinan los gl´ obulos rojos y blancos lavables totales recuperados. Los valores para los pesos pulmonares en h´ umedo, los gl´ obulos rojos lavables totales y los gl´obulos blancos lavables totales se elevan de una manera dependiente de la dosis despu´es de la administraci´on de HLE. Los compuestos que son inhibidores de elastasa eficaces pueden prevenir o disminuir la gravedad de la lesi´ on inducida por enzima dando como resultado un peso pulmonar en h´ umedo inferior y valores reducidos para los gl´obulos lavables totales, tanto rojos como blancos, en relaci´ on a la administraci´on de HLE sola. Los compuestos pueden evaluarse administr´andolos intratraquealmente como soluciones o suspensiones en PBS, con o en varios momentos antes de la estimulaci´on de HLE (400 µg), o dosific´ andolos intravenosamente u oralmente como soluciones diversos momentos antes de la estimulaci´on con HLE (100 µg) para determinar su utilidad para prevenir una lesi´ on por HLE. Una soluci´ on del compuesto de la invenci´on se prepara convenientemente usando polietilenglicol 400 al 10 %/PBS. Ensayo Hemorr´ agico Agudo:

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Este ensayo se basa en controlar s´olo la cantidad de hemorragia en el pulm´ on despu´es de la administraci´on intratraqueal de neutr´ ofilo-elastasa humana (HNE). La hemorragia se cuantifica rompiendo los eritrocitos recuperados en fluido de lavado pulmonar y compar´ andolos con diluciones de sangre de h´ amster entera. El procedimiento de rastreo, similar al descrito en Fletcher y otros, American Review of Respiratory Disease (1990), 141, 672-677, es como sigue. Compuestos que se demuestra que son inhibidores de HNE in vitro se preparan convenientemente para dosificar como se describe anteriormente para el Modelo de Da˜ no Pulmonar Agudo. H´ amsteres sirios macho (en ayunas durante 16-18 horas antes de 9

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usar) son anestesiados ligeramente con Brevital s´odico (30 mg/kg i.p.). Los compuestos se dosifican a continuaci´on intravenosamente u oralmente a los h´amsteres en un tiempo fijado, tal como 30 o´ 90 minutos, antes de la administraci´ on intratraqueal de 50 µg/animal de HNE en 300 µl de soluci´on salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4. Cuatro horas despu´es de la administraci´on de la enzima, los animales fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital s´ odico, el t´ orax se abri´ o y los pulmones y el coraz´on se extrajeron y los pulmones se depuraron de material extra˜ no. Los pulmones extirpados se lavan con tres cambios de 2 ml de PBS a trav´es de una c´ anula traqueal. Los lavados recuperados se re´ unen, los vol´ umenes (aproximadamente 5 ml) se registran y los lavados se almacenan a 4◦ C hasta que se ensayan. Para el c´ alculo de la cantidad de sangre en cada muestra, los lavados descongelados y una muestra de sangre entera de h´ amster se someten a sonicaci´on para romper los eritrocitos y se diluyen apropiadamente en pocillos individuales de una placa de microvaloraci´ on de 96 pocillos. Las densidades ´opticas (DO) de los lavados sometidos a rotura y las muestras de sangre se determinan a 540 nm. Los (µl de equivalentes de sangre/(ml de lavado) se determinan comparando la DO de las muestras de prueba con la DO de la curva est´andar preparada a partir de sangre entera de h´ amster. Los µl de equivalentes totales de sangre recuperados se determinan multiplicando el volumen de lavado recuperado por los (µl de equivalentes de sangre)/(ml de lavado) para cada muestra. Los resultados se presentan como % de inhibici´ on de la hemorragia inducida por HNE con respecto a los controles tratados con PBS cuando el compuesto de prueba se administra con una dosis y un tiempo especificados antes de la administraci´ on de HNE. Se encontr´ o que las ED50 para el compuesto de la invenci´on era 5,2 mg/kg despu´es de la dosificaci´on oral y 0,59 mg/kg despu´es de la administraci´on i.v. No se observ´ o toxicidad evidente cuando el compuesto de la invenci´on se administraba en las pruebas in vivo anteriores.

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Se apreciar´ a que las implicaciones de la actividad de un compuesto en el Modelo de Da˜ no Pulmonar Agudo o el Ensayo Hemorr´ agico Agudo no se limitan al enfisema sino que en cambio la prueba proporciona una evidencia de una inhibici´ on general in vivo de HLE. De acuerdo con una caracter´ıstica adicional de la invenci´ on, se proporciona una composici´ on farmac´eutica que comprende una cantidad farmac´euticamente eficaz del compuesto de la invenci´on, o un solvato del mismo, y un diluyente o portador farmac´euticamente aceptable. Seg´ un se apunta anteriormente, otra caracter´ıstica de la invenci´on es un m´etodo para usar el compuesto de la invenci´ on, o un solvato del mismo, en el tratamiento de una enfermedad o un estado en un mam´ıfero, especialmente un ser humano, en el que est´a implicado la HLE, tales como aqu´ellos mencionados anteriormente aqu´ı, y particularmente bronquitis aguda y cr´ onica, enfisema pulmonar, da˜ no por reperfusi´ on, s´ındrome de dificultad respiratoria del adulto, fibrosis c´ıstica o da˜ no vascular perif´erico (tales como isquemia cr´ıtica de los miembros o claudicaci´on intermitente). El compuesto de la presente invenci´on puede administrarse a un animal de sangre caliente, particularmente un ser humano, que necesite del mismo para el tratamiento de una enfermedad en la que est´a implicada la HLE, en la forma de una composici´on farmac´eutica convencional, por ejemplo seg´ un se describe generalmente en la Patente de EE.UU. 4.910.190. Un modo de administraci´ on puede ser a trav´es de un aerosol en polvo o l´ıquido. En un aerosol en polvo, el compuesto de la invenci´ on puede administrarse de la misma manera que la cromolina s´odica a trav´es de un dispositivo turbo-inhalador “Spinhaler” (una marca comercial) obtenido de Fisons Corp. de Bedford, Massachusets, en un grado de aproximadamente 0,1 a 50 mg por c´apsula, administr´ andose de 1 a 8 c´ apsulas diariamente para un ser humano medio. Cada c´apsula que ha de usarse en el turbo-inhalador contiene la cantidad requerida del compuesto de la invenci´on, siendo el resto de la c´apsula de 20 mg un portador farmac´euticamente aceptable tal como lactosa. En un aerosol l´ıquido, el compuesto de la invenci´on puede administrarse usando un nebulizador tal como, por ejemplo, un nebulizador “Retec” (marca comercial), en el que la soluci´ on se nebuliza con aire comprimido. El aerosol puede administrarse, por ejemplo, en un grado de una a aproximadamente ocho veces por d´ıa como sigue: Un nebulizador se carga con una soluci´ on del compuesto, por ejemplo 3,5 ml de soluci´ on que contiene 10 mg/ml; la soluci´ on en el nebulizador se nebuliza con aire comprimido; y el paciente respira normalmente (volumen total) durante ocho minutos con el nebulizador en su boca.

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Alternativamente, el modo de administraci´ on puede ser parenteral, incluyendo un dep´osito subcut´ aneo por medio de una bomba osm´ otica o, preferiblemente, oral. El compuesto de la invenci´ on puede formularse convencionalmente en una forma de dosificaci´on oral o parenteral combinando de aproximadamente 10 a 250 mg por unidad de dosificaci´ on con un veh´ıculo, un excipiente, un aglutinante, un conservante, un estabilizante, un aroma o similares, convencionales, seg´ un se requiere por la pr´ actica farmac´eutica aceptada, por ejemplo, seg´ un se describe en la Patente de EE.UU. 3.755.340. Para la administraci´ on parenteral, se administrar´ıa una inyecci´on intravenosa, intramuscular o subcut´ anea de 1 a 10 ml que 10

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contuviera de aproximadamente 0,02 mg a 10 mg/kg de peso corporal del compuesto de la invenci´ on 3 o´ 4 veces al d´ıa. La inyecci´on contendr´ıa el compuesto de la invenci´on en una soluci´ on o suspensi´ on acuosa, isot´ onica y est´eril, opcionalmente con un conservante tal como un fenol o un agente solubilizante tal como ´acido etilendiaminotetraac´etico (EDTA). Para la administraci´on parenteral o el uso en un aerosol, puede prepararse una formulaci´ on acuosa, por ejemplo, disolviendo el compuesto en polietilenglicol 400 al 5-10 %/soluci´ on salina tamponada con fosfato, seguido por filtraci´ on as´eptica, y almacenamiento est´eril usando procedimientos est´ andar. En general, el compuesto de la invenci´ on se administrar´ a en seres humanos en una dosis diaria en el intervalo de, por ejemplo, 5 a 10 mg del compuesto mediante aerosol o de 50 a 1000 mg intravenosamente u oralmente, o una combinaci´ on de las mismas. Sin embargo, se entender´a f´ acilmente que puede ser necesario variar la dosis del compuesto administrado de acuerdo con la pr´ actica m´edica bien conocida para tener en cuenta la naturaleza y la gravedad de la enfermedad bajo tratamiento, la terapia simult´ anea, la edad, el peso y el sexo del paciente que recibe el tratamiento. De forma similar, se entender´ a que tambi´en pueden usarse cantidades generalmente equivalentes de una forma solvatada (por ejemplo, hidratada) del compuesto. Procedimientos para la administraci´ on de un inhibidor de HLE y la evaluaci´ on de los pacientes se describen en las Solicitudes de Patente Europea con los N´ umeros de Publicaci´ on 458535, 458536, 458537 y 463811 para el tratamiento o la prevenci´ on de fibrosis c´ıstica, ARDS, bronquitis, y hemorragia asociada con leucemia no linfoc´ıtica aguda o su terapia, respectivamente; y el compuesto de la invenci´on puede usarse de forma similar, o preferiblemente usarse mediante administraci´ on oral, para el tratamiento de esas enfermedades y estados s´olo o en combinaci´on con otro agente terap´eutico indicado normalmente para el tratamiento del estado particular. Para el tratamiento terap´eutico o profil´ actico de una enfermedad vascular o estado af´ın en un mam´ıfero, en el que est´an envueltos o implicados los neutr´ ofilos, un compuesto de la invenci´ on puede administrarse convenientemente mediante una ruta oral o parenteral, s´ olo o simult´ aneamente o secuencialmente con otros agentes terap´euticamente activos administrados normalmente para el estado. La utilidad del compuesto de la invenci´ on en tal tratamiento de enfermedades vasculares y estados afines puede demostrarse usando los procedimientos descritos en la Solicitud de Patente Internacional, Publicaci´ on N◦ WO 92/22309. Los diversos aspectos de la invenci´on se ilustrar´an ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos, en los que, a no ser que se indique otra cosa: (i) las temperaturas se dan en grados Celsius (◦ C); las operaciones se llevaron a cabo a temperatura normal o ambiente, esto es, a una temperatura en el intervalo de 18-25◦C;

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(ii) las soluciones org´anicas se secaron sobre sulfato magn´esico anhidro; la evaporaci´ on del disolvente se llev´o a cabo usando un evaporador giratorio bajo presi´ on reducida (600-4000 pascales; 4,5-30 mm de Hg) con una temperatura del ba˜ no de hasta 60◦C; 40

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(iii) cromatograf´ıa significa “cromatograf´ıa de desarrollo r´ apido” (m´etodo de Still) llevada a cabo sobre Merck Kieselgel (Art 9385 de E. Merck, Darmstadt, Alemania), la eluci´ on usando gradientes tanto escalonados como bruscos se indica mediante el t´ermino entre par´entesis “gradiente” seguido por las relaciones de disolventes inicial y final; la cromatograf´ıa en capa fina (TLC) se llev´ o a cabo sobre placas de s´ılice, por ejemplo placas GHLF de gel de s´ılice de 0,25 mm (Art 21521 de Analtech, Newark, DE, EE.UU. de A.); (iv) en general, el transcurso de las reacciones fue seguido por TLC y los tiempos de reacci´ on se dan para ilustraci´ on solamente;

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(v) los puntos de fusi´ on est´ an sin corregir y (desc) indica descomposici´on; los puntos de fusi´ on dados son los obtenidos para los materiales preparados seg´ un se describe; el polimorfismo puede dar como resultado el aislamiento de materiales con diferentes puntos de fusi´on en algunas preparaciones; (vi) los productos finales ten´ıan espectros de resonancia magn´etica nuclear (RMN) satisfactorios; y, cuando se examinaban, eran sustancialmente puros mediante HPLC; (vii) los rendimientos se dan para ilustraci´ on solamente y no son necesariamente los que podr´ıan obtenerse mediante un desarrollo del proceso diligente; las preparaciones se repitieron si se requer´ıa m´ as material;

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(viii) cuando se dan, los datos de RMN est´ an en la forma de valores delta para los protones de diagn´ ostico principales, dados en partes por mill´ on (ppm) relativas al tetrametilsilano (TMS) como un 11

ES 2 125 004 T3 patr´ on interno, determinados a 250 MHz usando DMSO-d6 como disolvente; se usan abreviaturas convencionales para la conformaci´ on de la se˜ nal; para espectros AB se presentan los desplazamientos observados directamente; 5

(ix) los s´ımbolos qu´ımicos tienen sus significados habituales; se usan unidades y s´ımbolos del SI; (x) las presiones reducidas se dan como presiones absolutas en pascales (Pa); las presiones elevadas se dan como presiones manom´etricas en bares;

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(xi) las relaciones de disolventes se dan en t´erminos de volumen:volumen (v/v); (xii) los espectros de masas (MS) se desarrollaron con una energ´ıa electr´onica de 70 electronvoltios en el modo de ionizaci´on qu´ımica usando una sonda de exposici´ on directa; cuando se indica la ionizaci´ on se efectuaba mediante impacto electr´ onico (EI) o bombardeo at´ omico r´ apido (FAB); generalmente, s´olo se presentan los picos que indican la masa principal; y

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(xiii) se us´o HPLC para establecer la relaci´ on de diastereois´omeros SSS:SSR de f´ ormula I en material aislado, usando una columna de 10 cm x 4,6 mm, Hypersil C18, 3 µm, y una fase m´ ovil de fosfato de tetrabutilamonio 0,02M/acetonitrilo (75:25) a pH 7,5. El caudal era 1,5 ml/minuto, el volumen de inyecci´ on era 20 µl mediante v´alvula y la longitud de onda de detecci´ on era 254 nm. El tiempo de retenci´ on para el diastereois´omero SSS es t´ıpicamente 12-13 minutos, y para el diastereois´omero SSR es t´ıpicamente 20-21 minutos. Alternativamente, puede usarse una columna de 25 cm x 4,6 mm, en fase inversa, SUPELCO LC-18, con agua:acetonitrilo (60:40) como eluyente, con un caudal de 1,0 ml/minuto.

25

Ejemplo 1

30

Una mezcla diastereois´omera cristalina de diastereois´omero SSS y diastereois´ omero SSR (0,67 g), en una relaci´ on de SSS:SSR de aproximadamente 85:15, se a˜ nadi´ o a tolueno (4,5 ml) y se calent´o hasta on transparente. La soluci´ on se enfri´o hasta 55◦C durante 30 minutos y se 80◦C para dar una soluci´ sembr´o con diastereois´omero SSS puro. La soluci´ on se dej´ o enfriar a continuaci´on hasta 25◦ C durante 1 hora y a continuaci´ on se enfri´ o en un ba˜ no de hielo durante otra hora. El producto cristalino se recogi´ o o para mediante filtraci´ on, se lav´ o con tolueno fr´ıo (2 ml) y se sec´o a 50◦ C. Este procedimiento se repiti´ dar diastereois´omero SSS cristalino de f´ ormula I (0,43 g) que conten´ıa menos de 2 % de diastereois´omero SSR mediante an´alisis por HPLC;

35

40

25 [alfa]D -90◦ (c=1,50 en etanol); p.f. 147-148,5◦C; RMN (d6 -DMSO): 0,92 (m,12H), 1,75(m,1H), 1,81-2,15(m,5H), 3,61(m,1H), 3,80(s,3H), 3,91(m,1H), 4,44(m,2H), 4,62(t,1H), 6,96(d,2H), 7,91(d,2H), 8,34(d,1H), 8,60(d,1H);

RMN (d6 -DMSO/D2 O): 0,75(d,3H), 0,89(m,9H), 1,70-2,19(m,6H), 3,56(m,1H), 3,75(s,3H), 3,84(m,1H), 3,98(d,1H), 4,37(m,2H), 6,94(d,2H), 7,76(d,2H); espectro de masas (ionizaci´on qu´ımica): 500 (M+H); microan´alisis, encontrado: C,57,72; H,6,62; N,8,36 %; C24 H32 F3 N3 O5 requiere: C,57,70; H,6,45; N,8,41 %.

45

Usando calorimetr´ıa de exploraci´ on diferencial, este material mostraba un cambio inicial a aproximadamente 149,5◦C, con un pico a aproximadamente 151◦C.

50

55

[Un resultado similar se obtuvo usando una mezcla diastereois´omera cristalina que tiene una relaci´on de SSS:SSR de 76:24, y recristalizando dos veces en tolueno. Un resultado similar tambi´ en se obtuvo usando una mezcla de acetato de etilo y hexano como disolvente. La mezcla diastereois´omera cristalina de diastereois´omeros SSS y SSR se disolvi´ o en acetato de etilo, el volumen se redujo mediante destilaci´ on o con hexano, manteniendo una soluci´ on transparente. La soluci´ on y la soluci´on caliente (60◦ C) se diluy´ o enfriar. Las proporciones de se enfri´ o hasta 50◦ C, se sembr´o con diastereois´omero SSS puro y se dej´ materia prima y disolventes usadas eran similares a las usadas en el Ejemplo 5]. La mezcla diastereois´omera cristalina de diastereois´omeros SSS y SSR usada como materia prima se obtuvo como se describe en el Ejemplo 4 o´ 5 posteriormente.

60

Ejemplo 2 Soluci´ on de hidr´ oxido s´ odico 0,6M (260 ml) se a˜ nadi´ o a una soluci´ on de (S) - 1 - [(S) - 2 - (4 12

ES 2 125 004 T3

5

10

15

20

metoxibenzamido) - 3 - metilbutiril] - N - [(S) - 2 - metil - 1 - ((R) - 2,2,2, - trifluoro - 1 - hidroxietil)propil]pirrolidin - 2 - carboxamida (25,7 g) en una mezcla de t - butanol (205 ml) y agua (255 ml) on de permanganato pot´ asico (24,2 g) en agua (385 ml) se a˜ nadi´ o gota a gota con a 0◦C. Una soluci´ agitaci´ on, durante una hora, y la mezcla de reacci´ on resultante se agit´ o durante otra hora a 0◦ C. Se a˜ nadi´ o a continuaci´on metanol (100 ml) y la mezcla se agit´o a 0◦ C durante otras dos horas. La mezcla de reacci´on se filtr´ o a trav´es de tierra diatom´ acea y el filtrado todav´ıa enfriado se acidific´o con ´acido clorh´ıdrico 1M (200 ml), lo que daba como resultado la formaci´ on de un precipitado blanco voluminoso. Cloruro s´ odico s´ olido se a˜ nadi´ o a la mezcla hasta el punto de saturaci´ on, seguido por ´eter diet´ılico (200 ml) y acetato de etilo (200 ml). La mezcla se agit´o hasta que todo el s´ olido se hab´ıa disuelto. La fase org´ anica se separ´ o y la capa acuosa se extrajo con ´eter diet´ılico:acetato de etilo (1:1). Las fases org´anicas on combinadas se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4 ) y el disolvente se retir´o mediante evaporaci´ bajo vac´ıo. La espuma resultante se disolvi´ o en tolueno templado (150 ml) y se dej´ o reposar durante 16 horas a temperatura ambiente. El s´ olido que cristalizaba se recogi´o mediante filtraci´ on, se lav´ o con ´eter omero SSS cristalino de f´ ormula diet´ılico y se sec´o bajo vac´ıo a 40◦ C durante 3 horas para dar diastereois´ I (16,5 g) que conten´ıa