MÉTODOS DE ESTUDIO EN BIOLOGÍA CELULAR: ASPECTOS HISTÓRICOS. GUIÓN: - Breve reseña histórica de la Biología Celular y Molecular analizando la evolución de técnicas e instrumentos utilizados. - Métodos fundamentales: Morfológicos. Químicos. Fisiológicos. - Conocimiento del material más corriente utilizado en el laboratorio. Enfoque sugerido:  Intentar demostrar cómo la paulatina evolución de la tecnología influyó en los distintos descubrimientos y en el desmembramiento de la Biología en ramas más específicas.  Planteamiento práctico del Seminario, familiarizando especialmente al alumno con el material de laboratorio disponible, para facilitar la posterior realización de las prácticas del Nivel Celular.

1. INVENCIÓN DEL MICROSCOPIO ÓPTICO.

Los inventos muchas veces están condicionados por los sucesos históricos de las épocas en las que se descubren. La invención del microscopio óptico, está muy ligado a la República Holandesa y a los avatares históricos del S XVII. La República Revolucionaria Holandesa se declaró independiente del Imperio Español en 1648, en el reinado de Felipe IV. En respuesta a la declaración de independencia, se cerraron los puertos del imperio Español a los buques holandeses, lo cual hizo que la única posibilidad de supervivencia para la pequeña república fuera comerciar con las naciones del lejano oriente. Las expediciones que se organizaron no promovieron sólo la explotación comercial, sinó que estimularon el conocimiento científico (exploración de nuevas tierras, descubrimiento de nuevas especies botánicas y zoológicas, etc..), el cual, muchas veces, proporcionó nuevas materias para el comercio. Así, Holanda pudo sobrevivir económicamente y hasta tal punto dependía de este comercio, que las rutas comerciales descubiertas por ellos fueron consideradas como secretos de estado hasta finales del siglo pasado.

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En este ambiente, Holanda fomentó el conocimiento científico y desarrolló una gran tolerancia por las opiniones no ortodoxas, convirtiéndose en una de las primeras naciones en las que se impuso la ilustración. En poco tiempo se convirtió en un paraíso para los intelectuales que huían de la censura y del control del pensamiento practicado por la Inquisición en el resto de Europa. Así, en el S. XVII, Holanda fue la nación que acogió a: Espinoza─────── Filósofo Descartes────── Matemático y filósofo Locke────────── Político y de Leeuwenhoek, biólogo. Leeuwenhoek (1632-17239 fue el primero en observar microorganismos, 200 años antes de que pudiera hacerlo ningún otro. No se conoce el instrumento que utilizó para lograr tal observación, pero se está de acuerdo en que fue un microscopio, construido con lentes convergentes a partir de las ideas de los hermanos Jansen. Mediante este instrumento, describió correctamente los glóbulos rojos de la sangre, informó sobre la estructura de los dientes, de la piel y de los cristalinos. Los trabajos que mayores controversias crearon fueron los referidos a los espermatozoides, que fueron descubiertos por él. En el mismo siglo, Robert Hooke describió unos pequeños poros que forman las láminas de corcho y otros materiales vegetales, a los que denominó CÉLULAS. Hooke sólo se dedicó 2 años a la biología cuando contaba 29 años y publicó con sus descubrimientos un libro (titulado Micrografía), cuyas 60 láminas registran numerosos descubrimientos fundamentales de biología. Si tenemos en cuenta que estos primeros microscopios eran de muy difícil manejo, que tenían un campo visual estrecho, que daban imágenes oscuras y alteradas (la superficie de la lente era irregular) y que producían aberraciones cromáticas, sólo entonces se puede entender, porqué las descripciones de Hooke son consideradas como extraordinarias.

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2. TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA ÓPTICA. En el año 1880 el microscopio fue mejorado por Nobel, que le dio la forma actual. A principios del S. XIX, la demanda de colorantes para teñir los productos de la industria textil condujo a un período fértil para la química orgánica. Se observó que algunos de los colorantes teñían los tejidos biológicos y que, sorprendentemente, a menudo mostraban una preferencia por determinados componentes de la célula (el núcleo o las membranas, por ejemplo), lo cual permitía observar con mayor claridad la estructura interna de ésta. En 1833 el botánico Brown, utilizando estas técnicas de tinción, descubrió el núcleo celular. Antes de poder teñirse, la mayoría de tejidos biológicos han de fijarse. La fijación permeabiliza las células a los colorantes, estableciendo puentes cruzados entre sus macromoléculas, de modo que éstas quedan estabilizadas y bloqueadas en su posición original. Esto se consigue mediante una breve exposición de la célula a aldehídos como el formaldehído. La mayoría de los tejidos son demasiado gruesos para que sus células sean examinadas directamente a gran aumento. Por consiguiente, los tejidos deben ser cortados primero en finas rebanadas (secciones), cada una de las cuales es depositada luego sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio. Las secciones se obtienen con un micrótomo, una máquina que funciona de manera parecida a un cortafiambres. Por lo general, los tejidos son demasiado blandos para ser cortados directamente en secciones finas. Por ello, después de la fijación suelen ser incluidos en una cera líquida o una resina plástica que penetra y rodea todo el tejido. Este medio de inclusión es posteriormente endurecido (generalmente por enfriamiento) para formar un bloque sólido que pueda ser cortado fácilmente por el micrótomo. Un método alternativo que también puede utilizarse es el seccionamiento de los tejidos tras la congelación rápida de los mismos, lo cual hace innecesarios la fijación y la inclusión.

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3. TEORÍA CELULAR DE LOS SERES VIVOS. Gracias a estas mejoras instrumenrtales y técnicas, en 1824 Dutrochet formuló por primera vez en la historia de la Biología que todos los animales y plantas estaban constituidos por células de diferentes clases. Sin embargo, fueron los científicos alemanes M.J. Schleiden (botánico) y T. Schwann (zoólogo) quienes en 1838 y 1839 elaboraron la teoría celular de los seres vivos. Esta teoria, que constituye una de las más trascendentales generalizaciones biológicas, sostiene que la célula es:  la UNIDAD MORFOLÓGICA, es decir, es la unidad anatómica que integra el cuerpo de todos los seres vivos. Los organismos pueden estar formados por una célula o por varias.  y es la UNIDAD FISIOLÓGICA, esto es, las reacciones químicas que constituyen el metabolismo tienen lugar en las células. Años más tarde (1855), esta teoría fue completada por Virchow cuando proclamó que toda célula procede de otra célula. Con esta nueva idea, se puede decir que :  la célula es la UNIDAD DE ORIGEN. Sin embargo, algunos científicos europeos de gran prestigio consideraban que la teoría celular de los seres vivos no era aplicable al tejido nervioso, pues éste tenía una particular constitución reticular. Fue Santiago Ramón y Cajal quien con su proverbial inteligencia, su tenacidad y sus indudables cualidades técnicas supo demostrar la individualidad neuronal (que más tarde confirmaría la microscopía electrónica) derribando así el último reducto que quedaba para la aceptación de la validez universal de la teoría celular.

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4. PERFECCIONAMIENTO DE LAS TÉCNICAS MICROSCÓPICAS. Durante la segunda mitad del siglo XIX fueron desarrolladas nuevas técnicas que permitieron establecer las bases de la microscopía descriptiva. En concreto, Santiago Ramón y Cajal diseñó nuevos métodos de tinción que le permitieron describir el tejido nervioso con una precisión que aún no ha sido superada por ningún especialista en microscopía óptica. Zeiss, aplicando nuevas leyes físicas, mejoró el método para producir lentes, lo cual permitió la fabricación de microscopios con una resolución que estaba muy cerca del máximo teórico. Hasta la 2ª Guerra Mundial la casa Zeiss (situada en Alemania) fabricó los mejores microscopios (con 1500 aumentos), sin embargo, una vez finalizado el conflicto, Alemania fue separada en dos estados a causa de su derrota en la guerra (formación de la República Democrática Alemana y de la República Federal Alemana). Con la división, parte de los técnicos de la marca Zeiss se trasladaron al Este y otra parte permaneció en el Oeste, constituyendo dos empresas diferentes para la fabricación de lentes. Los conocimientos técnicos fueron con los científicos que desde entonces, separados, nunca pudieron desarrollar lentes con características tan inmejorables como las de antes de la guerra. En 1990, con la distensión de la era Gorbachov, la dos Alemanias se han reunificado; tal vez ahora, se puedan fabricar de nuevo, los aquellos microscopios ópticos.

5. EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO. Por muy alta que sea la perfección de las lentes, los microscopios ópticos no pueden superar un cierto límite de resolución, ya que nunca será posible estudiar detalles estructurales que sean mucho más pequeños que la propia longitud de onda de la luz. Sin embargo, utilizando electrones en lugar de fotones, se puede ampliar este límite de resolución, ya que los electrones tienen una longitud de onda más reducida. Con esta idea, Ruska y sus colaboradores, construyeron en 1931, el primer microscopio electrónico. El diseño general del microscopio electrónico de transmisión es parecido al del microscopio óptico. La fuente de iluminación es un filamento o cátodo situado en la parte superior de una columna cilíndrica de unos dos metros de altura, y que emite electrones. Para poder conseguir un haz uniforme de electrones, se produce previamente el vacío, y por medio de unas bobinas magnéticas se focalizan hacia la muestra que se desea observar. Algunos de los electrones que pasan a través de la muestra son dispersados, según la densidad local del material, y los restantes son focalizados formando una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla fluorescente. Puesto que los electrones dispersados no aparecen en la imagen, las regiones densas de la muestra aparecen como áreas de bajo flujo electrónico y viceversa. Puesto que los electrones tienen un poder de penetración muy limitado, la muestra a 5

observar debe cortarse en secciones muy finas y para ello debieron desarrollarse técnicas especiales. Mediante el microscopio electrónico de barrido se pueden obtener imágenes tridimensionales de cualquier preparación. Esta técnica consiste en vaporizar un metal, proyectándolo desde un ángulo determinado sobre la muestra que se desea visualizar. Sobre cualquier estructura de ésta muestra, se depositará más metal en aquel lado expuesto al vapor que en el opuesto. Cuando, en el microscopio electrónico, un haz de electrones incide sobre la preparación, el metal depositado hace que los electrones se reflejen, formando una imagen sobre una pantalla de televisión. Esta imagen presenta los diversos componentes celulares con un lado muy perfilado (aquel en el que la deposición de metal es más gruesa) y con el otro sombreado, produciendo una sensación espacial tal, que se puede averiguar la forma y el tamaño de los componentes celulares visualizados. Una técnica que ha permitido visualizar tridimensionalmente el interior de las células ha sido el de la microscopía electrónica con fractura con congelación (criofractura). En primer lugar, las células se congelan a la temperatura del nitrógeno líquido (-196ºC) y luego el bloque congelado se fracciona con la hoja de una cuchilla. Las caras de fractura resultantes se metalizan con platino, se elimina por disolución el material orgánico y las replicas se observan al microscopio electrónico.

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El poder de resolución de los microscopios electrónicos es 1000 veces mayor que el de los mejores microscopios ópticos.

6. ESTUDIO DE LOS COMPONENTES CELULARES POR FRACCIONAMIENTO DE CÉLULAS Y ULTRACENTRIFUGACIÓN. Una vez que la microscopía ha permitido conocer la disposición de los diferentes orgánulos celulares, los estudios se han encaminado hacia el descubrimiento de la estructura de estos. Para ello ha sido necesario recurrir al análisis bioquímico, el cual implica la previa destrucción de las células y la separación de sus componentes. Las células pueden disgregarse de varias maneras: por shock osmótico, por vibración ultrasónica, moliendolas o haciéndolas pasar a través de un tamiz. Estos procedimientos rompen muchas de las membranas de la célula, sin embargo, si se toman una serie de precauciones, algunos orgánulos celulares permanecen intactos. De este modo una gran cantidad de células queda reducida a un extracto soluble que contiene una espesa suspensión de partículas. La separación de los diversos componentes de esta mezcla se realiza con un instrumento conocido como ultracentrifugadora, en la que los extractos de células rotas son expuestas a altas velocidades de giro. A una velocidad relativamente reducida, los componentes grandes, como los núcleos y las células enteras, sedimentan rápidamente, formando un precipitado en el fondo del tubo de la centrífuga. Si se separa el sobrenadante y es sometido a una nueva centrifugación a velocidad media, se deposita un precipitado de mitocondrias. Si, de nuevo se separa el sobrenadante y esta vez se somete a una centrifugación a velocidades aún más altas y durante más tiempo, se pueden recoger primero las pequeñas vesículas y luego los ribosomas. Si se desea un mayor grado de separación se puede actuar de otro modo: se coloca el extracto de células en la parte superior de una solución salina en el interior del tubo de centrífuga. Para evitar la mezcla del extracto y la solución, ésta se hace con una densidad creciente hacia el fondo del recipiente. En estas condiciones, una vez hecha la centrifugación, los diferentes componentes aparecen en bandas y pueden recogerse por separado. Esta separación se ha producido debido a que cada componente, según la forma y el tamaño, se desplaza a lo largo del tubo a una velocidad diferente y al terminar el proceso, aquellos componentes de mayor tamaño aparecen en el fondo del tubo y los más pequeños cerca de la superficie.

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La velocidad de sedimentación de cada componente puede expresarse en forma de un coeficiente conocido como valor S, el cual puede ser utilizado como un indicador del peso molecular del componente valorado. El coeficiente de sedimentación o valor S es determinado por la siguiente relación: dx / dt --------w2 x x = distancia en centímetros, desde el lugar donde se ha recogido el componente, hasta el centro de rotación. dx/dt = velocidad de sedimentación en centímetros por segundo. w = rotación angular del rotor de la centrífuga en radianes por segundo. Debido a que estos coeficientes son numeros extremadamente pequeños, suelen transformarse en unidades Svedberg (S), siendo 1S = 1 x 10-13 seg. Algunos coeficientes de sedimentación típicos son: Lisosoma──────────────9400 S Ribosoma────────────── 80 S ARN t ──────────────── 4 S

7. CROMATOGRAFÍA.

La cromatografía es uno de los métodos de más utilidad para la separación de componentes de bajo peso molecular, como los azucares, aminoácidos o proteínas. Consiste en aplicar una gota de la muestra, en un punto, sobre una hoja de papel absorbente (cromatografía sobre papel) o sobre una lámina de plástico o de cristal recubierta de una fina capa de material absorbente inerte, como celulosa o gel de sílice (en la cromatografía en capa fina). Luego se deja que una mezcla de disolventes, como por ejemplo agua y alcohol, impregne la hoja desde uno de sus extremos. A medida que la mezcla de disolventes se desplaza a través de la hoja, arrastran consigo a aquellas moléculas que son solubles en ella, separándose estas según su peso molecular.

8. ELECTROFORESIS.

Como las proteínas suelen tener una carga neta positiva o negativa a causa de los restos de algunos aminoácidos, si se aplica un campo eléctrico a una solución que contenga moléculas proteícas de este tipo, éstas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo, a una velocidad que depende de su carga neta y también de su tamaño y de su forma. Si tenemos una mezcla de proteínas en solución acuosa libre o en soluciones mantenidas sobre una matriz porosa sólida como el almidón, podemos utilizar esta técnica 8

para separar a las diferentes proteínas.

9. UTILIZACIÓN DE ÁTOMOS RADIACTIVOS. Un elemento radiactivo emite radiaciones que se manifiestan, por lo tanto es detectable sea cual fuere su localización en el organismo. Se puede realizar la síntesis de cualquier compuesto, colocando un elemento radiactivo en un punto seleccionado de su molécula. Una vez que esta molécula ha entrado en el organismo, de una manera u otra, puede seguirsele su trayectoria. Con este método se ha podido descubrir el destino de las moléculas dentro del metabolismo. RESEÑA HISTÓRICA DE INSTRUMENTOS Y TÉCNIICAS. 1590.- Primeros microscopios compuestos. 1770.- Hill inventa nuevos métodos para la coloración y conservación de muestras examinadas con el microscopio. 1780.- Adams y otros inventan el microtomo. 1860.- Primera coloración biológica selectiva. 1895.- Empleo de Rayos X por Cannon. 1926.- Ultracentrífuga (Svedberg). 1933.- Microscopio electrónico (Ruska). 1934.- L´Heritier y Teisier idean el método de la "caja de población" para investigar la evolución. 1935.- Marcadores radiactivos para investigar los procesos metabólicos (Schoenheimer). 1953.- Microscopio de contraste de fases.

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