k

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

19

k kInt. Cl. : A61K 38/17

11 N´ umero de publicaci´on:

2 183 220

7

51

˜ ESPANA

A61K 48/00 A61P 17/02

k

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

12

kN´umero de solicitud europea: 97947761.9 kFecha de presentaci´on: 04.12.1997 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 941 108 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 15.09.1999

T3

86 86 87 87

k

54 T´ıtulo: Curaci´ on de heridas y tratamiento de la fibrosis.

k

30 Prioridad: 04.12.1996 GB 9625148

05.12.1996 US 32115 P

Manchester Incubator Building 48 Grafton Street Manchester M13 9XX, GB

k

72 Inventor/es: Ferguson, Mark William James y

k

74 Agente: Manresa Val, Manuel

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.03.2003

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.03.2003

ES 2 183 220 T3

k

73 Titular/es: Renovo Limited

Aviso:

k

O’Kane, Sharon

k

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 183 220 T3 DESCRIPCION Curaci´ on de heridas y tratamiento de la fibrosis. 5

10

15

La presente invenci´on se refiere a la curaci´on de heridas, y tambi´en a la regulaci´on de la fibrosis en el tratamiento de estados en los cuales la fibrosis es un mecanismo principal de reparaci´ on tisular o en los que una fibrosis excesiva da lugar a trastornos y malfuncionamientos patol´ ogicos de tejidos. La curaci´ on de heridas en los adultos es un complicado proceso reparativo. El proceso de curaci´ on comienza con el reclutamiento de una variedad de c´elulas especializadas para su traslado al sitio de la herida, y supone la deposici´ on de matriz extracelular y membrana basal, angiog´enesis, actividad selectiva de proteasa y reepitelizaci´on. Un componente importante del proceso de curaci´ on en los mam´ıferos adultos es la estimulaci´on de fibroblastos para generar la matriz extracelular. Esta matriz extracelular constituye un componente principal del tejido conectivo que se desarrolla parte reparar la zona de la herida. El tejido conectivo que se forma durante el proceso de curaci´ on es a menudo de naturaleza fibrosa, y com´ unmente forma una cicatriz de tejido conectivo (el cual es un proceso llamado fibrosis).

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Una cicatriz es una estructura morfol´ ogica anormal resultante de una lesi´ on o herida previa (como p. ej. una incisi´ on, una escisi´ on o un trauma). Las cicatrices se componen de un tejido conectivo que es predominantemente una matriz de col´ ageno de los tipos 1 y 3 y fibronectina. La cicatriz puede constar de fibras de col´ ageno en una organizaci´on anormal (como se ve en las cicatrices de la piel), o bien puede ser una acumulaci´ on anormal de tejido conectivo (como se ve en las cicatrices del sistema nervioso central). Las cicatrices constan en su mayor´ıa de col´ageno organizado anormalmente y tambi´en de col´ageno en exceso. En el hombre, en la piel las cicatrices pueden formar depresiones bajo la superficie de la piel o elevaciones sobre la superficie de la piel. Las cicatrices hipertr´oficas son una forma m´ as severa de cicatrizaci´on normal, est´an elevadas sobre la superficie normal de la piel y contienen col´ ageno en exceso dispuesto seg´ un una disposici´ on anormal. Un queloide es otra forma de cicatrizaci´on patol´ ogica que no solamente queda elevada sobre la superficie de la piel, sino que se extiende tambi´en hasta m´ as all´ a de los l´ımites de la lesi´on original. En un queloide hay excesivo tejido conectivo que est´ a organizado de manera anormal formando predominantemente bandas vorticiales de tejido de col´ ageno. Hay predisposiciones gen´eticas a formar tanto cicatrices hipertr´ oficas como queloides. Las mismas son particularmente comunes en las razas afrocaribe˜ nas y mongoloides. Hay necesidad de aportar medicamentos que fomenten la curaci´ on de heridas. Por ejemplo, a menudo es deseable incrementar la velocidad de curaci´on en el caso de las heridas agudas (tales como las lesiones penetrantes, las quemaduras, las lesiones neurales o incluso las heridas resultantes de cirug´ıa electiva) y de las heridas cr´ onicas (tales como la ulceraci´on diab´etica, venosa y por dec´ ubito), o para los individuos en los que la curaci´on se ve en general comprometida (como son por ejemplo los ancianos). En estos ejemplos, las heridas pueden influenciar severamente la calidad de vida, o pueden incluso redundar en la muerte, y por consiguiente a menudo es necesario incrementar tanto como sea cl´ınicamente posible la velocidad de curaci´ on. En los casos en los que es incrementada la velocidad de curaci´ on de las heridas, va a menudo asociado a ello un incremento de la formaci´ on de cicatrices, pero esto puede ser de importancia secundaria en comparaci´on con el deseado incremento de la velocidad de curaci´on. En el sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo “herida” se refiere por ejemplo a las lesiones de la piel, aunque no queda limitado a las mismas. Otros tipos de heridas pueden suponer da˜ nos, lesiones o traumas de un tejido u o´rgano interno tal como el pulm´ on, el ri˜ no´n, el coraz´ on, el intestino, los tendones o el h´ıgado. Hay sin embargo otros casos en los que la regulaci´ on de la formaci´ on de las cicatrices es de primordial importancia y la velocidad de curaci´on de las heridas es tan s´ olo de importancia secundaria. Son ejemplos de tales situaciones las cicatrices de la piel en las que una excesiva cicatrizaci´on puede ser perjudicial para la funci´ on tisular, particularmente cuando se produce contractura de la cicatriz (por ejemplo en las quemaduras de la piel y en las heridas que perjudican la flexibilidad de una articulaci´ on). Cuando las consideraciones cosm´eticas son importantes, es tambi´en muy deseable la reducci´ on de la formaci´ on de cicatrices en la piel. En la piel, las cicatrices hipertr´oficas o queloides (particularmente en las razas afrocaribe˜ nas y mongoloides) pueden ocasionar perjuicios funcionales y cosm´eticos, y hay necesidad de impedir que se produzcan. La cicatrizaci´on resultante de los injertos cut´ aneos tanto en los sitios dadores como debido a la aplicaci´on de piel artificial puede ser tambi´en problem´ atica, y es necesario minimizarla o impedirla.

2

ES 2 183 220 T3 Al igual como las cicatrices de la piel, la cicatrizaci´on o fibrosis interna puede ser muy perjudicial, y los ejemplos espec´ıficos de la misma incluyen los siguientes:

5

10

15

20

25

(I) Dentro del sistema nervioso central, la cicatrizaci´on glial puede impedir la reconexi´ on neuronal (p. ej. a continuaci´on de neurocirug´ıa o de lesiones penetrantes del cerebro). (II) La cicatrizaci´on en el ojo puede ser perjudicial. En la c´ ornea, la cicatrizaci´ on puede redundar en una opacidad anormal, y puede dar lugar a problemas de visi´ on o incluso a la ceguera. En la retina, la cicatrizaci´on puede ocasionar alabeo o desprendimiento de la retina, y en consecuencia la ceguera. La cicatrizaci´on que se produce a continuaci´on de la curaci´ on de las heridas en las operaciones para reducir la presi´on en el glaucoma (p. ej. en la cirug´ıa de filtraci´ on del glaucoma) redunda en el fracaso de la cirug´ıa, no siendo drenado el humor acuoso y volviendo por consiguiente el glaucoma. (III) La cicatrizaci´on en el coraz´on (p. ej. a continuaci´ on de cirug´ıa o de un infarto de miocardio) puede dar lugar a una funci´ on card´ıaca anormal. (IV) Las operaciones que interesan al abdomen o a la pelvis a menudo redundan en adherencias entre v´ısceras. Por ejemplo pueden formarse adherencias entre elementos del intestino y la pared corporal, y las mismas pueden ocasionar torsiones del tracto intestinal que ocasionan isquemia y gangrena y hacen que sea necesario tratamiento de emergencia (a no ser que se las trate, pueden incluso resultar fatales). An´ alogamente, los traumas o las incisiones en los intestinos pueden dar lugar a cicatrizaciones, y la contractura de las cicatrices puede dar lugar a estrecheces que ocasionan la oclusi´ on del lumen de los intestinos, lo cual puede asimismo amenazar la vida. (V) La cicatrizaci´ on en la pelvis en la regi´ on de las trompas de Falopio puede provocar infertilidad. (VI) La cicatrizaci´on consecutiva a las lesiones de m´ usculos puede redundar en una contracci´ on anormal y por consiguiente en una mala funci´ on muscular.

30

35

40

45

50

(VII) La cicatrizaci´on o fibrosis que se produce a continuaci´ on de lesiones de los tendones y ligamentos puede redundar en una severa p´erdida de funci´ on. Est´ a relacionado con lo expuesto anteriormente el hecho de que hay una serie de estados m´edicos denominados trastornos fibr´ oticos en los cuales la fibrosis excesiva conduce a des´ ordenes patol´ ogicos y malfuncionamientos del tejido. Los trastornos fibr´ oticos est´an caracterizados por la acumulaci´ on de tejido fibroso (predominantemente col´ agenos) de manera anormal dentro del tejido. La acumulaci´ on de tales tejidos fibrosos puede producirse como resultado de los de una variedad de procesos morbosos. Estas enfermedades no necesariamente tienen que ser causadas por la cirug´ıa, por lesiones traum´ aticas o por heridas. Los trastornos fibr´ oticos son habitualmente cr´onicos. Los ejemplos de trastornos fibr´ oticos incluyen la cirrosis del h´ıgado, la fibrosis del h´ıgado, la glomerulonefritis, la fibrosis pulmonar, la esclerodermia, la fibrosis mioc´ ardica, la fibrosis consecutiva al infarto de miocardio, la fibrosis del sistema nervioso central que se produce a continuaci´ on de un ataque o de trastornos neurodegenerativos (como p. ej. la Enfermedad de Alzheimer), la vitreorretinopat´ıa proliferativa (PVR) y la artritis. Hay por consiguiente tambi´en necesidad de medicamentos que puedan ser usados para el tratamiento de tales afecciones a base de regular (es decir, de impedir, inhibir o revertir) la fibrosis/cicatrizaci´ on en estos trastornos fibr´ oticos. Si bien las anteriores consideraciones pueden ser principalmente de aplicaci´ on a las afecciones, los trastornos o las enfermedades del hombre, se apreciar´ a que la curaci´ on de heridas, la cicatrizaci´ on y los trastornos fibr´ oticos pueden ser tambi´en problem´ aticos en otros animales, y particularmente en los animales que son tratados en el ´ambito veterinario o en los animales dom´esticos (como p. ej. los caballos, el ganado bovino, los perros, los gatos, etc.). Por ejemplo, las heridas o adherencias abdominales constituyen una importante raz´ on para tener que sacrificar caballos (y en particular caballos de raza), as´ı como lo son las lesiones de los tendones y ligamentos que dan lugar a cicatrizaci´on o fibrosis.

55

Ha habido varios desarrollos recientes en los campos de la curaci´on de heridas, la cicatrizaci´ on y los trastornos fibr´ oticos. Algunos de estos desarrollos giran en torno a la reciente noci´on de que las de un conjunto de citoquinas y los de un conjunto de factores de crecimiento est´an ´ıntimamente implicadas e implicados en la reparaci´on de tejidos.

60

La WO-A-92/17206 describe el uso de agentes neutralizantes para los factores de crecimiento que fomentan la fibrosis que pueden ser usados para inhibir la formaci´ on de cicatrices durante la curaci´ on de heridas. Por ejemplo, la WO-A-92/17206 demuestra que composiciones que inhiben espec´ıficamente la 3

ES 2 183 220 T3 actividad de los Factores Transformadores de Crecimiento β1 y β2 y del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas son particularmente beneficiosas para reducir la formaci´ on de cicatrices.

5

La WO-A-93/19769 describe el uso de factores de crecimiento no fibr´ oticos tales como los Factores Transformadores de Crecimiento β3, del que se comprob´ o sorprendentemente que fomenta la curaci´ on de una herida sin inducir fibrosis. La GB-A-2.288.118 describe el uso de anticuerpos espec´ıficos generados contra factores de crecimiento y que mejoran la curaci´on potenciando las acciones de dichos factores de crecimiento.

10

Otro desarrollo supone el uso de manosa-6-fosfato en el tratamiento de trastornos fibr´ oticos asociados a la acumulaci´on de matriz extracelular y con elevados niveles de Factores Transformadores de Crecimiento β1 o β2 (GB-A-2.265.310). Se cree que el manosa-6-fosfato interfiere en la conversi´ on de formas latentes de estos Factores Transformadores de Crecimiento en su forma activa. 15

En la WO-A-95/26203 est´an descritas otras composiciones que influyen la eficacia de los factores de crecimiento y fomentan la curaci´on de heridas.

20

25

30

35

40

45

50

55

A pesar de tales adelantos, sigue habiendo necesidad de seguir desarrollando medicamentos que puedan ser usados para modular la curaci´ on de heridas, la cicatrizaci´on y la fibrosis. Hay en particular necesidad de medicamentos que no comprometan la velocidad de curaci´on de las heridas o la calidad de la cicatriz en favor una de la otra. Como se expone m´as ampliamente a continuaci´on, la invenci´ on se refiere en su aspecto m´ as amplio al uso de compuestos que modulan la asociaci´on y organizaci´ on de actina para el tratamiento de heridas. Todas las c´elulas eucari´oticas, tanto si son sencillos organismos unicelulares como sin son c´elulas de tejido humano, contienen actina. La actina puede encontrarse en forma de actina filamentosa (actina F), que es un componente proteico principal del citoesqueleto de la c´elula. El citoesqueleto influye muchas funciones celulares y es particularmente relevante en la regulaci´on de la motilidad, los cambios de forma, la quimiotaxis y la secreci´on. La actina F es un pol´ımero que consta de una h´elice compacta de mon´omeros de actina orientados uniformemente. Estos mon´omeros son expresados en la c´elula como prote´ınas globulares polipept´ıdicas singulares a las que se denomina actina globular (actina G). La polimerizaci´ on de los mon´ omeros de actina G para su transformaci´ on en actina F tiene lugar dentro del citoplasma de la c´elula. La actina F es una estructura din´ amica, y el tama˜ no del filamento puede ser regulado seg´ un las necesidades funcionales de la c´elula. Esto puede hacerse, por ejemplo, a base de alterar la velocidad a la cual los mon´omeros de actina G son a˜ nadidos al filamento o retirados del mismo, o bien a base de inhibir o fomentar la degradaci´ on de la actina F. Adem´ as de formar parte del citoesqueleto, la actina F puede ser tambi´en organizada en estructuras celulares, tales como finos filamentos en el m´ usculo, cada una de las cuales puede tener una funci´ on celular espec´ıfica. Muchas prote´ınas reguladoras influyen la asociaci´on y organizaci´ on de actina F. Las de una clase de este tipo de estas prote´ınas reguladoras son aqu´ellas que se fijan a los mon´ omeros de actina, rematan el extremo r´apidamente creciente de los filamentos de actina y rompen los filamentos de actina. Los ejemplos de las de esta clase de prote´ınas reguladoras incluyen la gelsolina, la villina, la CapG, la adseverina, la flightless-1 (N. del T.- flightless-1 = prote´ına codificada por el gen llamado “flightless I”, o “fliI”. En la mosca Drosophila melanogaster, la presencia de alelos d´ebiles de fliI incapacita a las moscas adultas para el vuelo. De ah´ı el t´ermino ingl´es “flightless”, que significa “incapaz de volar” y por razones de coherencia ha sido mantenido en la presente) y la advillina. La gelsolina es una prote´ına de 82 kDa que se encuentra naturalmente en c´elulas tales como plaquetas, fibroblastos, neutr´ ofilos y macr´ ofagos y puede cortar por la mitad un filamento de actina de 1 µm en tan s´olo un segundo. Una memoria acad´emica de Witke et al. (Cell vol. 81 pp. 41-51, 1995) ha establecido usando como modelo un rat´ on que hab´ıa sido manipulado para no expresar gelsolina (siendo dicho rat´ on tambi´en llamado rat´ on Gsn o rat´ on con alelo nulo de gelsolina) que la motilidad de los neutr´ ofilos y los fibroblastos es deteriorada in vitro e in vivo en las c´elulas que no expresan gelsolina.

60

Esta memoria no contempla el uso de gelsolina y compuestos similares para el tratamiento de heridas, y sorprendentemente los inventores han establecido que los compuestos que modulan la asociaci´on y 4

ES 2 183 220 T3 organizaci´ on de actina son u ´tiles para la curaci´ on de heridas.

5

Seg´ un un primer aspecto de la presente invenci´ on, se aporta el uso de un compuesto que modula la asociaci´on y organizaci´ on de actina intracelular y/o extracelularmente para la fabricaci´ on de un medicamento para el tratamiento de la fibrosis en tejido o heridas no pulmonares.

10

Seg´ un la invenci´ on, los inventores han establecido que compuestos que modulan la asociaci´on y organizaci´on de actina pueden ser usados para tratar heridas para mejorar la calidad de la cicatriz formada y tambi´en para mejorar la velocidad de curaci´ on de las heridas. Los compuestos pueden ser tambi´en usados para tratar estados en los cuales hay fibrosis inadecuada. Los compuestos son eficaces para modular la asociaci´ on y organizaci´ on de la actina intracelular y/o de la actina ubicada extracelularmente (que puede ser liberada por c´elulas muertas o da˜ nadas, por ejemplo).

15

20

Los compuestos que modulan la asociaci´on y organizaci´ on de actina pueden ser usados seg´ un la invenci´on en las situaciones o en los estados en los que sea necesario impedir o reducir la cicatrizaci´on, tal como en los casos siguientes: (I) all´ı donde las cicatrices de la piel puedan ser excesivas y/o perjudiciales para la funci´on tisular, y particularmente cuando se produzca o pueda producirse contractura de la cicatriz (por ejemplo en las quemaduras de la piel y en las heridas que perjudiquen la flexibilidad de una articulaci´ on y particularmente en la cicatrizaci´on en los ni˜ nos); (II) en la cicatrizaci´on de la piel cuando sean importantes las consideraciones cosm´eticas;

25

(III) cuando puedan producirse cicatrices hipertr´oficas o queloides (particularmente en las razas afrocaribe˜ nas y mongoloides) que puedan ocasionar deterioro funcional y cosm´etico;

30

(IV) en la cicatrizaci´on resultante de los injertos cut´ aneos tanto en los sitios dadores como debido a la aplicaci´on de piel artificial; (V) en la cicatrizaci´on dentro del sistema nervioso central (p. ej. a continuaci´ on de neurocirug´ıa o de lesiones penetrantes del cerebro), donde por ejemplo la cicatrizaci´on glial puede impedir la reconexi´ on de las neuronas cortadas;

35

40

(VI) en la cicatrizaci´on en el ojo y particularmente de la c´ ornea (la cicatrizaci´on puede redundar en una opacidad anormal y provocar problemas de visi´ on o incluso la ceguera), en la retina (la cicatrizaci´ on puede ocasionar alabeo o desprendimiento de la retina y en consecuencia la ceguera) y en la cicatrizaci´on consecutiva a la curaci´on de heridas en las operaciones realizadas para reducir la presi´on en el glaucoma (p. ej. en la cirug´ıa de filtraci´ on del glaucoma) que puede redundar en el fracaso de la cirug´ıa al no drenarse el humor acuoso y al volver por consiguiente el glaucoma; (VII) en la cicatrizaci´on en el coraz´on (p. ej. a continuaci´ on de cirug´ıa o de infarto de miocardio) que puede dar lugar a una funci´ on card´ıaca anormal;

45

50

55

(VIII) en la cicatrizaci´on del intestino tal como la que puede producirse a continuaci´ on de operaciones que interesen el abdomen o la pelvis redundando en adherencias entre v´ısceras (pueden formarse adherencias entre elementos del intestino y la pared corporal, y las mismas pueden ocasionar torsiones del tracto intestinal que ocasionan isquemia y gangrena y hacen que sea necesario tratamiento de emergencia, pues en caso de no ser tratadas pueden resultar incluso fatales); pudiendo an´ alogamente los traumas o las incisiones en los intestinos dar lugar a cicatrizaciones y contracturas de las cicatrices o estrecheces que pueden ocasionar la oclusi´on del lumen de los intestinos, lo cual puede asimismo resultar amenazador para la vida; (IX) en la cicatrizaci´on en la pelvis en la regi´ on de las trompas de Falopio, la cual puede conducir a la infertilidad; (X) en la cicatrizaci´on consecutiva a lesiones de los m´ usculos, que puede redundar en una contracci´on anormal y por consiguiente en una mala funci´ on muscular;

60

(XI) en la cicatrizaci´on o fibrosis consecutiva a lesiones de los tendones y ligamentos, que puede redundar en severas p´erdidas de funci´ on. 5

ES 2 183 220 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Los compuestos pueden ser tambi´en usados para el tratamiento o la prevenci´ on de la fibrosis. Por ejemplo, los compuestos pueden ser usados para tratar trastornos fibr´ oticos tales como la cirrosis del h´ıgado, la fibrosis del h´ıgado, la glomerulonefritis, la fibrosis pulmonar, la esclerodermia, la hibernaci´ on mioc´ardica, la fibrosis consecutiva al infarto de miocardio, la fibrosis del sistema nervioso central a continuaci´ on de un ataque o de trastornos neurodegenerativos (como p. ej. la Enfermedad de Alzheimer), la vitreorretinopat´ıa proliferativa (PVR) y la artritis. Los compuestos son u ´tiles para reducir o prevenir la fibrosis en las enfermedades fibr´ oticas y para reducir o prevenir la formaci´ on de fibrosis que se manifiesta en forma de cicatrizaci´on hipertr´ ofica o queloides (particularmente de la piel). Los compuestos que modulan la asociaci´on y organizaci´ on de actina incrementan tambi´en la velocidad de curaci´ on, am´en de mejorar la calidad de las cicatrices o de tratar la fibrosis. Hemos descubierto que estos compuestos son capaces de acelerar la velocidad a la que se cura una herida. As´ı, tales compuestos ser´ an u ´ tiles para las heridas agudas (tales como las lesiones penetrantes, las quemaduras, las lesiones neurales, las lesiones de ligamentos o tendones o incluso las heridas resultantes de cirug´ıa electiva) y para las heridas cr´onicas (tales como la ulceraci´ on diab´etica, venosa y por dec´ ubito y las llagas por compresi´on) o para los individuos en los que se ve en general comprometida la curaci´ on (como por ejemplo los ancianos). Los compuestos son particularmente u ´ tiles para tratar heridas de la piel (es decir, heridas d´ermicas). Las heridas anteriormente descritas pueden influenciar severamente la calidad de vida, o pueden incluso redundar en la muerte, y por consiguiente puede ser necesario incrementar tanto como sea cl´ınicamente posible la velocidad de curaci´on. Un compuesto preferido en grado sumo para ser usado seg´ un la invenci´ on es la gelsolina. Los inventores han llevado a cabo estudios que demuestran que los compuestos que modulan la asociaci´on y organizaci´ on de actina influyen la curaci´ on de heridas. Por ejemplo, los inventores han descubierto que la curaci´on de las heridas es empeorada y la calidad de las cicatrices es reducida en un modelo consistente en un Rat´ on con Alelo Nulo de Gelsolina. Adem´ as, la adici´on de compuestos tales como la gelsolina originarios de una fuente ex´ogena mejora la calidad de las cicatrices y la velocidad de curaci´ on de las heridas en comparaci´on con la curaci´ on que es observada en el caso de las heridas no tratadas. M´ as all´ a de la memoria de Witke et al., los inventores han descubierto sorprendentemente que los compuestos que modulan la asociaci´on y organizaci´ on de actina son particularmente eficaces para el tratamiento de heridas para reducir la formaci´on de cicatrices y tambi´en para incrementar la velocidad de curaci´ on de las heridas. A pesar de que los solicitantes no desean circunscribirse a una hip´ otesis determinada, creen que los compuestos tales como la prote´ına reguladora gelsolina son eficaces para reducir la cicatrizaci´on porque han descubierto que estos compuestos no solamente modulan la motilidad de las c´elulas, sino que influyen tambi´en la movilidad de las c´elulas dentro de una herida y llevan a efecto la secreci´on de componentes de la matriz extracelular, y regulan con ello la fibrosis y la formaci´on de cicatrices. Los inventores creen que estas funciones son reguladas por la remodelaci´ on de la actina F dentro y fuera de estas c´elulas. Adem´as, los inventores creen que los compuestos llevan a efecto la orientaci´on de los fibroblastos dentro de la herida. La orientaci´ on de los fibroblastos influencia tambi´en la naturaleza, organizaci´ on y orientaci´ on de la matriz extracelular que es depositada por los fibroblastos, y por consiguiente influye la cicatriz de tejido conectivo que repara la zona herida. Los inventores han descubierto que la deposici´on de col´ ageno dentro de la matriz es particularmente influenciada por los compuestos. Los inventores han demostrado tambi´en que la gelsolina extracelular soluble se fija a y retira la actina extracelular liberada por las c´elulas degenerativas en el sitio de la herida, y que esta limpieza de desechos celulares puede constituir un mecanismo importante para acelerar la curaci´ on de las heridas cr´ onicas. Los inventores creen por consiguiente que la aplicaci´ on a una herida de compuestos usados seg´ un la invenci´ on mejora la calidad y el aspecto finales de la herida e incrementa la velocidad de curaci´ on de la herida como se ha descrito anteriormente. Si bien la gelsolina es el compuesto preferido, pueden ser tambi´en usados seg´ un la invenci´ on otros compuestos tales como la villina, la CapG, la adseverina, la flightless-1 y la advillina o derivados de los mismos. Los compuestos usados seg´ un la invenci´ on pueden ser prote´ınas. Tales prote´ınas pueden ser f´ acilmente modificadas (por ejemplo por medio de adici´ on, sustituci´ on o eliminaci´on de amino´ acidos) para formar derivados que conserven la capacidad de fijarse a los mon´ omeros de actina, rematar el extremo r´apidamente creciente de los filamentos de actina o romper los filamentos de actina. Por consiguiente, los derivados 6

ES 2 183 220 T3 que conservan las caracter´ısticas funcionales de las prote´ınas que se dan de manera natural son tambi´en compuestos preferidos de la invenci´ on. Los ejemplos de tales derivados incluyen fragmentos funcionalmente activos de prote´ınas que se dan de manera natural e incluso precursores de prote´ınas que se dan de manera natural (como p. ej. proprote´ınas) que son activados in situ. 5

10

15

Las composiciones para la curaci´on de heridas que son usadas seg´ un la invenci´ on pueden adoptar las de una serie de distintas formas en dependencia en particular de c´ omo deban ser usadas. As´ı por ejemplo, dichas composiciones pueden estar en forma de un l´ıquido, una pomada, una crema, un gel, un hidrogel, un polvo o un aerosol. Todas las composiciones de este tipo son adecuadas para aplicaci´on t´ opica a la piel, que constituye una manera preferida de administrar los compuestos de la invenci´ on a un sujeto (una persona o un animal) que necesite tratamiento. La composici´ on puede preverse en un ap´ osito o parche est´eril que puede ser usado para cubrir o incluso obturar una herida a tratar. Como alternativa, la composici´ on de la invenci´ on puede ser una soluci´ on inyectable, o bien puede estar en forma de un colirio. Se comprender´ a que el veh´ıculo de la composici´ on de la invenci´ on deber´ a ser un veh´ıculo que sea bien tolerado por el paciente y permita la liberaci´ on del compuesto activo a la herida. Tal veh´ıculo es preferiblemente biodegradable, biorresoluble, biorreabsorbible y/o no inflamatorio.

20

25

30

35

40

45

La composici´on puede ser usada seg´ un la invenci´ on de una serie de maneras. As´ı por ejemplo, una composici´ on puede ser aplicada en y/o en torno a una herida de un paciente para regular la curaci´ on de la herida. Si la composici´on debe ser aplicada a una herida “existente”, el veh´ıculo farmac´euticamente aceptable ser´a entonces un veh´ıculo que sea relativamente “inofensivo”, es decir un veh´ıculo que sea biocompatible, biodegradable, biorresoluble y no inflamatorio. Es tambi´en posible usar composiciones seg´ un la invenci´ on antes de la cirug´ıa (y en particular antes de la cirug´ıa electiva) para que proporcionen una regulaci´on de la curaci´ on de la herida quir´ urgica que ser´ a posteriormente formada. En este caso el veh´ıculo de una composici´ on que sea aplicada t´ opicamente puede tener que ser un veh´ıculo que sea capaz de atravesar la capa queratinosa de la piel. Los ejemplos de veh´ıculos adecuados para esta finalidad incluyen el sulf´ oxido de dimetilo y el a´cido ac´etico. Tal uso profil´ actico es un uso preferido de los compuestos seg´ un la invenci´ on. Las composiciones son adecuadas para ser usadas para acelerar la curaci´on y reducir o moderar la cicatrizaci´on resultante de operaciones quir´ urgicas en el ojo (como p. ej. la cirug´ıa por l´ aser en la c´ornea). En este caso la composici´ on o el medicamento puede estar en forma de un colirio. Las composiciones pueden ser usadas en las de una gama de aplicaciones de curaci´ on de heridas internas. As´ı por ejemplo, las composiciones pueden ser formuladas para inhalaci´ on para ser usadas en la curaci´ on de heridas de los pulmones o para la prevenci´ on o el tratamiento de fibrosis y estrecheces en el pulm´ on. Se comprender´ a que la cantidad de un compuesto que modula la asociaci´ on y organizaci´ on de actina y que debe ser aplicada al sitio de la herida depende de una serie de factores tales como la actividad biol´ ogica y la biodisponibilidad del compuesto, que a su vez depende del modo de administraci´ on y de las propiedades fisicoqu´ımicas del compuesto. Otros factores incluyen los siguientes: A) La vida media del compuesto en el sujeto tratado.

50

B) La afecci´on espec´ıfica a tratar. C) La cuesti´ on de si se desea una curaci´ on r´ apida o una cicatrizaci´ on reducida. D) La edad del sujeto.

55

La frecuencia de administraci´ on estar´ a tambi´en influenciada por los factores anteriormente mencionados, y en particular por la vida media del compuesto dentro del sujeto que se trate.

60

En general, cuando las composiciones sean usadas para tratar heridas o trastornos fibr´ oticos existentes, el compuesto deber´a ser administrado en cuanto se haya producido la herida o en cuanto haya sido diagnosticado el trastorno. La terapia con la composici´ on deber´ a continuar hasta que la herida se haya curado a satisfacci´on del cl´ınico, o bien, en el caso de un trastorno fibr´ otico, hasta que haya sido 7

ES 2 183 220 T3 eliminado el riesgo o la causa de formaci´on de tejido fibroso anormal.

5

10

15

20

25

30

Las composiciones para aumentar la velocidad de curaci´ on de las heridas deber´ an ser aplicadas a una herida lo antes posible tras haberse formado la herida. Para las heridas agudas y las heridas de sujetos que son competentes en materia de curaci´on (como p. ej. los j´ ovenes), la aplicaci´ on de la composici´on se har´ a idealmente en el momento de ser producida la herida, preferiblemente dentro de un per´ıodo de una horas a partir del momento en el que se produjo la herida, y no cuando haya transcurrido un per´ıodo de tiempo de m´ as de unos pocos d´ıas a partir del momento en el que fue producida la herida. Para las heridas cr´onicas o las heridas en los sujetos en los que se ve comprometida la curaci´on (como p. ej. los ancianos), la administraci´ on deber´ a ser efectuada lo antes posible. Las composiciones que modulan la cicatrizaci´on y/o los trastornos fibr´ oticos deber´ an ser tambi´en aplicadas a una herida lo antes posible tras haberse formado la herida. Sin embargo, las cicatrices y la fibrosis pueden desarrollarse a lo largo de d´ıas o incluso de semanas. Por consiguiente, el sujeto tratado puede ser sin duda beneficiado por la administraci´ on de un compuesto (tal como gelsolina) incluso si el mismo es administrado tras haber transcurrido d´ıas o incluso semanas desde el momento en el que se produjo la herida o en el que se desarroll´ o (o fue diagnosticado) el trastorno. Cuando sean usadas como profil´ actico (p. ej. antes de cirug´ıa o cuando haya riesgo de que se desarrolle un trastorno fibr´ otico), las composiciones deber´an ser administradas en cuanto se haya detectado el riesgo de fibrosis indeseable o la posibilidad de que sea desfavorable la velocidad de curaci´ on de una herida (como puede suceder en el caso de los sujetos ancianos). Por ejemplo, una crema o una pomada que contenga gelsolina puede ser aplicada a un sitio de la piel de un sujeto en el que deba ser llevada a cabo cirug´ıa electiva y cuando se desee que sea subsiguientemente incrementada la velocidad de curaci´on de la herida. En este caso, la composici´on puede ser aplicada durante la preparaci´ on preoperatoria del sujeto, o bien puede ser incluso deseable aplicar la composici´on en las horas o en los d´ıas que precedan a la cirug´ıa (en dependencia del estado de salud y de la edad del sujeto, as´ı como del tama˜ no de la herida que deba ser formada). La frecuencia de administraci´ on depender´ a de la vida media biol´ ogica del compuesto usado. T´ıpicamente, una crema o una pomada que contenga un compuesto deber´ a ser administrada a un tejido de destino de forma tal que la concentraci´ on del compuesto en el sitio de la herida o en el tejido afectado por un trastorno fibr´ otico sea mantenida a un nivel que sea adecuado para obtener un efecto terap´eutico. Esto puede requerir una administraci´on diaria o incluso varias veces al d´ıa.

35

Procedimientos conocidos tales como los empleados convencionalmente por la industria farmac´eutica (como p. ej. la experimentaci´ on in vivo, las pruebas cl´ınicas, etc.) pueden ser utilizados para establecer las formulaciones espec´ıficas de las composiciones y los reg´ımenes terap´euticos precisos (tales como las dosis diarias de los compuestos y la frecuencia de administraci´on). 40

En general, las composiciones seg´ un la invenci´ on contendr´ an 50-1000 nM del compuesto (p. ej. gelsolina), y con la m´axima preferencia, 100-500 nM.

45

Puramente a t´ıtulo de ejemplo, una composici´on que contenga 100-500 µg/ml de gelsolina es adecuada para su aplicaci´ on a una herida existente (es decir, a una herida “abierta”).

50

A t´ıtulo de ejemplo convencional, una composici´ on que deba ser usada preoperativamente para impedir que se produzca cicatrizaci´ on o para mejorar la velocidad de curaci´ on de una herida resultante de cirug´ıa subsiguiente puede contener 500-1000 nM de gelsolina para tener el efecto deseado en la curaci´ on de la herida.

55

60

Una adecuada dosis diaria de un compuesto que module la asociaci´ on y organizaci´ on de actina depende de los factores que han sido expuestos anteriormente, as´ı como del tama˜ no de la herida, o de la cantidad de tejido afectado por fibrosis que deba ser tratado. T´ıpicamente, la cantidad de un compuesto que se requiere para el tratamiento de heridas o trastornos fibr´ oticos estar´a situada dentro de la gama de cantidades que va desde 1 ng hasta 100 g del compuesto activo/24 horas, en dependencia del tama˜ no de la herida o del grado de fibrosis, entre otros varios factores. Se comprender´ a tambi´en que los compuestos usados seg´ un la invenci´ on pueden ser aislados a partir de la naturaleza o sintetizados qu´ımicamente. Tales compuestos no tienen que ser necesariamente prote´ınas o incluso estructuralmente similares a las prote´ınas que se dan de manera natural, pero tienen sin embargo los mismos efectos en la asociaci´on y organizaci´ on de actina. Estos compuestos son tambi´en compuestos 8

ES 2 183 220 T3 preferidos para ser usados seg´ un la invenci´ on.

5

Las prote´ınas y los derivados de las mismas que sean usados como compuestos para modular la asociaci´on y organizaci´ on de actina pueden ser preparados por cualquier m´etodo conveniente, incluyendo la ligaci´on de p´eptidos y la s´ıntesis de prote´ınas completas. Como alternativa, dichas prote´ınas y dichos derivados de las mismas pueden ser obtenidos por purificaci´ on a partir de fuentes naturales. Por ejemplo, la gelsolina puede ser aislada a partir de neutr´ ofilos, plaquetas o fibroblastos que expresen la prote´ına (p. ej. por los m´etodos de Bryan J. Methods in Enzymology vol. 215 pp. 88-99, Academic Press, Londres, 1992).

10

Una manera preferida de preparar prote´ına y derivados de la misma para su uso en la invenci´on consiste en la preparaci´on por medio de la expresi´on a partir de un sistema de DNA recombinante (DNA = acido desoxirribonucleico). ´ 15

20

25

La tecnolog´ıa del DNA recombinante proporciona unos medios convenientes por medio de los cuales pueden ser formadas cantidades suficientes de tales prote´ınas y de derivados de las mismas para su uso en la fabricaci´ on de medicamentos en cantidades deseables. Muchos m´etodos conocidos para administrar compuestos a un tejido relevante tienen la desventaja de que puede resultar dif´ıcil alcanzar niveles sostenidos del compuesto activo en un sitio de herida o sitio de fibrosis a lo largo del transcurso de incluso unos pocos d´ıas porque los agentes activos tienen habitualmente vidas medias muy cortas in vivo. Las vidas medias de los compuestos tienden a ser cortas por una serie de razones entre las que se incluyen las siguientes: (I) La degradaci´ on por proteasas y agentes similares. (II) La remoci´on por parte de prote´ınas de fijaci´ on (como p. ej. la macroglobulina α2).

30

35

40

(III) La fijaci´ on e inhibici´ on de la actividad del agente por parte de mol´eculas de la matriz extracelular tales como las de decorina y fibronectina. Adem´as, los compuestos para la curaci´ on de heridas y/o el tratamiento de la cicatrizaci´ on/fibrosis tienen que ser administrados en un veh´ıculo adecuado, y a menudo est´an presentados en forma de una composici´ on que comprende el compuesto y el veh´ıculo. Como se ha rese˜ nado anteriormente, tales veh´ıculos son preferiblemente no inflamatorios, biocompatibles y biorreabsorbibles, y no deben degradar ni inactivar el compuesto activo (tanto en almacenamiento como en uso). Sin embargo, a menudo puede resultar dif´ıcil prever un veh´ıculo satisfactorio para suministrar compuestos espec´ıficos a un tejido a tratar. Una manera conveniente de poder obviar o mitigar estos problemas es la de aportar en un sitio de herida (o sitio de fibrosis) una cantidad terap´euticamente eficaz y que sirva para la curaci´on de la herida de un compuesto que module la asociaci´ on y organizaci´ on de actina por medio de terapia gen´etica.

45

Seg´ un un cuarto aspecto de la presente invenci´ on, se aporta un sistema de suministro destinado a ser usado en una t´ecnica de terapia gen´etica, comprendiendo dicho sistema de suministro una mol´ecula de DNA que codifica para una prote´ına que modula la asociaci´on y organizaci´ on de actina, siendo dicha mol´ecula de DNA capaz de ser transcrita para conducir a la expresi´on de dicha prote´ına.

50

Seg´ un un quinto aspecto de la presente invenci´ on, se aporta el uso de un sistema de suministro como el definido en el p´ arrafo precedente y destinado a ser usado en la fabricaci´on de un medicamento destinado a ser usado en el tratamiento de heridas o fibrosis.

55

El uso de los sistemas de suministro seg´ un la invenci´ on es muy adecuado para alcanzar niveles sostenidos de un compuesto que module la asociaci´ on y organizaci´ on de actina en un sitio de herida o sitio de fibrosis a lo largo de un per´ıodo de tiempo m´as largo que el que es posible para la mayor´ıa de los sistemas de suministro convencionales. La prote´ına puede ser expresada continuamente desde c´elulas del sitio de herida o sitio de fibrosis que hayan sido transformadas con la mol´ecula de DNA de la invenci´on. Por consiguiente, incluso si la prote´ına tiene una vida media muy corta como agente in vivo, desde el tejido tratado pueden ser expresadas continuamente cantidades terap´euticamente eficaces de la prote´ına.

60

Adem´as, el sistema de suministro puede ser usado seg´ un la invenci´ on para aportar la mol´ecula de DNA (y con ella la prote´ına que es un agente terap´eutico activo) sin necesidad de usar veh´ıculos farmac´euticos 9

ES 2 183 220 T3 convencionales tales como los que se requieren en las pomadas y las cremas que son puestas en contacto con la herida.

5

10

15

20

25

30

35

El sistema de suministro de la presente invenci´ on es tal que la mol´ecula de DNA es capaz de ser expresada (al ser el sistema de suministro administrado a un paciente) para producir una prote´ına que directa o indirectamente tiene actividad para la curaci´on de heridas y/o el tratamiento de la fibrosis o la cicatrizaci´on a base de modular la asociaci´on y organizaci´ on de actina. Mediante la utilizaci´ on del vocablo “directamente” nos referimos a que el producto de expresi´on gen´etica tiene per se la actividad requerida para la curaci´ on de heridas y/o la regulaci´ on de la fibrosis o la cicatrizaci´ on. Mediante la utilizaci´on del vocablo “indirectamente” nos referimos a que el producto de expresi´on gen´etica experimenta o media (p. ej. como una enzima) al menos una reacci´on adicional para proporcionar un agente eficaz para el tratamiento de heridas y/o para la regulaci´ on de la fibrosis o la cicatrizaci´ on a base de modular la asociaci´on y organizaci´ on de actina. Se prefiere que la mol´ecula de DNA codifique para gelsolina o para un fragmento o derivado de la misma que sea biol´ogicamente equivalente a la misma. La mol´ecula de DNA puede tambi´en codificar para compuestos tales como los llamados villina, CapG, adseverina, flightless-1 y advillina, o derivados de los mismos. Como alternativa, la mol´ecula de DNA puede codificar para una prote´ına que incremente indirectamente la expresi´on de compuestos tales como la gelsolina. Por ejemplo, la mol´ecula de DNA puede codificar para una enzima, un factor de transcripci´ on o compuestos similares que fomenten la expresi´on de gelsolina. La mol´ecula de DNA puede estar contenida dentro de un vector adecuado para formar un vector recombinante. El vector puede ser por ejemplo un pl´ asmido, un c´osmido o un fago. Tales vectores recombinantes son muy u ´tiles en los sistemas de suministro de la invenci´on para transformar c´elulas con la mol´ecula de DNA. Los vectores recombinantes pueden incluir tambi´ en otros elementos funcionales. Por ejemplo, los factores recombinantes pueden estar dise˜ nados de forma tal que el vector se replique aut´ onomamente en el n´ ucleo de la c´elula. En este caso pueden requerirse en el vector recombinante elementos que induzcan la replicaci´on del DNA. Como alternativa, el vector recombinante puede ser dise˜ nado de forma tal que el vector y la mol´ecula de DNA recombinante se integren en el genoma de una c´elula. En este caso son deseables secuencias de DNA que favorezcan la integraci´on dirigida (p. ej. por recombinaci´ on hom´ ologa). Los vectores recombinantes pueden tambi´en tener DNA que codifique para genes que puedan ser usados como marcadores seleccionables en el proceso de clonaci´on. El vector recombinante puede tambi´en comprender adicionalmente un promotor o regulador para controlar la expresi´ on del gen seg´ un se requiera.

50

La mol´ecula de DNA puede (aunque no necesariamente) ser una mol´ecula que quede incorporada en el DNA de las c´elulas del sujeto tratado. C´elulas indiferenciadas pueden ser transformadas de manera estable conduciendo a la producci´ on de c´elulas hijas modificadas gen´eticamente. Cuanto ´este es el caso, puede requerirse una regulaci´on de la expresi´ on en el sujeto p. ej. con factores de transcripci´ on o activadores gen´eticos espec´ıficos, o m´as preferiblemente con promotores inducibles que transcriban el gen en respuesta a una se˜ nal que se encuentre espec´ıficamente en un sitio de herida. Como alternativa, el sistema de suministro puede ser dise˜ nado para favorecer la transformaci´ on inestable o transitoria de c´elulas diferenciadas en el sujeto tratado. En este caso, la regulaci´on de la expresi´on puede ser menos importante porque la expresi´ on de la mol´ecula de DNA cesar´a cuando las c´elulas transformadas mueran o dejen de expresar la prote´ına (idealmente cuando haya sido tratada o prevenida la herida, la fibrosis o la cicatrizaci´on).

55

El sistema de suministro puede aportar la mol´ecula de DNA al sujeto sin que la misma est´e incorporada en un vector. Por ejemplo, la mol´ecula de DNA puede estar incorporada dentro de un liposoma o de una part´ıcula viral. Como alternativa, la mol´ecula de DNA “desnuda” puede ser insertada en las c´elulas de un sujeto mediante un medio adecuado, como p. ej. la captaci´on endocit´ otica directa.

40

45

60

La mol´ecula de DNA puede ser transferida a las c´elulas de un sujeto a tratar por transfecci´ on, infecci´on, microinyecci´ on, fusi´ on celular, fusi´ on de protoplastos o bombardeo bal´ıstico. Por ejemplo, la transferencia puede ser mediante transfecci´ on bal´ıstica con part´ıculas de oro recubiertas, liposomas que contengan la mol´ecula de DNA, vectores virales (como p. ej. adenovirus) y medios para producir una captaci´on de DNA directa (como p. ej. la endocitosis) mediante aplicaci´ on de DNA plasm´ıdico directamente a la zona de la herida t´ opicamente o mediante inyecci´on. 10

ES 2 183 220 T3

5

10

La prote´ına expresada desde la mol´ecula de DNA puede ser una prote´ına que directa o indirectamente d´e lugar a la curaci´on de las heridas con una cicatrizaci´ on reducida, una prote´ına que d´e lugar a un incremento de la velocidad de curaci´on de las heridas redundando posiblemente al mismo tiempo en una incrementada formaci´ on de cicatrices, o una prote´ına que sirva para regular (inhibir, prevenir o revertir) la fibrosis. Se comprender´ a que el sistema de suministro seg´ un el cuarto aspecto de la invenci´ on puede ser usado seg´ un los aspectos quinto o sexto de la invenci´ on para tratar cualquiera de los estados anteriormente descritos. Se describe a continuaci´on m´ as ampliamente la presente invenci´on en el siguiente Ejemplo no limitativo que hace referencia a los dibujos acompa˜ nantes, en los cuales:

15

La Figura 1 es un gr´ afico de la anchura lineal de las heridas practicadas en los ratones con alelo nulo de gelsolina y en los ratones de tipo salvaje del Ejemplo 1; la Figura 2 es un gr´ afico de la reepitelizaci´on porcentual de las heridas en los ratones con alelo nulo de gelsolina y en los ratones de tipo salvaje del Ejemplo 1; y

20

la Figura 3 es un gr´ afico de la anchura de la cicatriz en la parte media de la herida en las heridas practicadas en los ratones con alelo nulo de gelsolina y en los ratones de tipo salvaje del Ejemplo 1. Ejemplo 1 25

La influencia de la gelsolina en la curaci´ on de heridas fue evaluada en ratones con alelo nulo de gelsolina (KO - sin expresi´on de gelsolina) y en ratones normales “de tipo salvaje” (WT - que expresaban gelsolina). En los procedimientos experimentales fueron usados ratones con alelo nulo de gelsolina generados seg´ un los procedimientos experimentales descritos en Witke et al. (Cell vol. 81 pp. 41-51, 1995). 30

1.1 M´etodos 1.1.1 Tratamientos 35

40

48 ratones macho adultos fueron divididos en seis grupos de ocho: cuatro con alelo nulo y cuatro de control. Los ratones fueron anestesiados usando inyecci´ on intraperitoneal de Avertina, la superficie dorsal fue afeitada, y fueron efectuadas dos incisiones de 1 cm que atravesaban la piel bajando hasta e incluyendo el m´ usculo del panniculus carnosus en sitios anat´ omicos espec´ıficos. Las heridas se dejaron sin suturar, y los animales fueron devueltos a las jaulas individuales. Los animales fueron sacrificados al haber transcurrido 1 d´ıa, 3 d´ıas, 5 d´ıas, 7 d´ıas, 14 d´ıas y 70 d´ıas a partir del momento en el que fueron efectuadas las heridas, y las heridas fueron recolectadas. La mitad de cada herida recolectada fue fijada en soluci´ on salina normal, y la otra mitad fue embebida en medio OCT y congelada con nitr´ ogeno l´ıquido. Se llevaron registros fotogr´ aficos de las heridas en cada punto en el tiempo, para permitir la comparaci´ on de los resultados microsc´ opicos y macrosc´opicos.

45

1.1.2 Evaluaci´ on Histol´ ogica Fueron utilizadas coloraciones con Hematoxilina y Eosina (H&E) y con Tricromo de Masson para determinar la celularidad y el contenido de col´ ageno de las heridas, respectivamente. 50

1.1.3 Puntuaci´ on de las Cicatrices a los 70 D´ıas de Haber Sido Efectuadas las Heridas

55

Las secciones histol´ogicas fueron puntuadas utilizando una Escala Anal´ ogica Visual (VAS) que constaba de una l´ınea de 10 cm en la que el 0 representa la piel normal y el 10 representa una cicatriz hipertr´ ofica/queloide, y utilizando por separado una escala de puntuaci´ on de 0 a 5 en la que el 0 representa la piel normal y el 5 representa una cicatriz hipertr´ ofica/queloide y el 3 es la puntuaci´ on para una cicatriz de control. 1.1.4 Inmunohistoqu´ımica

60

Las heridas de 1, 3, 5 y 7 d´ıas fueron coloreadas utilizando varios anticuerpos que inclu´ıan:

11

ES 2 183 220 T3 1. Fibronectina antirrat´ on.

5

2. Gelsolina antirrat´on, para confirmar la correcta genotipificaci´ on de los ratones con alelo nulo de gelsolina y para determinar la inmunolocalizaci´ on de la gelsolina en las heridas de los animales de tipo salvaje. 3. Faloidina marcada con TRITC (TRITC = isotiacianato de tetrametil-rodamina). La faloidina es extra´ıda del hongo amanita phalloides y se fija a la actina filamentosa (actina F), por lo cual es u ´til para localizar y distinguir entre la actina F extracelular e intracelular.

10

15

Fue llevada a cabo coloraci´on doble con antigelsolina (detectado con un anticuerpo secundario marcado con FITC) (FITC = isotiocianato de fluoresceina) y con faloidina marcada con TRITC para determinar si la actina extracelular observada en la herida estaba colocalizada con la gelsolina extracelular, puesto que la gelsolina pl´ asmica liberada por el sistema sangu´ıneo puede ser responsable de la remoci´on de actina extracelular en las heridas. 1.1.5 An´ alisis de las im´ agenes

20

Fue llevado a cabo un an´ alisis de las im´ agenes utilizando un sistema de captura de im´agenes basado en PC (PC = ordenador personal) (’PC Image’), y fueron medidos los par´ ametros siguientes a fin de cuantificar las diferencias entre las heridas con alelo nulo y de tipo salvaje: 1. Anchura de la herida (tanto lineal entre los bordes de la herida como el per´ımetro real)

25

2. Retracci´ on del m´ usculo del panniculus carnosus 3. Anchura en la parte media de la herida 4. Reepitelizaci´on

30

5. Anchura de la cicatriz en 3 puntos: la base, la parte media y la parte superior 6. Espesor del nuevo epitelio 35

40

Todas las heridas fueron medidas para determinar la anchura de la herida y la retracci´ on del m´ usculo del panniculus carnosus, y las otras mediciones fueron efectuadas en los apropiados puntos en el tiempo. El an´ alisis estad´ıstico de las mediciones fue llevado a cabo utilizando el programa Simfit escrito por el Dr. W Bardsley, de la Universidad de Manchester. Las dos pruebas estad´ısticas utilizadas fueron la prueba de Mann-Whitney U y la prueba de Kolgomorov-Smirnov para comparar los resultados de los animales de control de tipo salvaje y de los animales con alelo nulo (v´ease la Tabla 1). 1.2. Resultados

45

50

55

60

1.2.1 Histolog´ıa Las diferencias m´as patentes entre los ratones de control (WT = “de tipo salvaje”) y los ratones con alelo nulo (KO) fueron observadas a los 5 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas. A las 24 h, las heridas de los ratones con alelo nulo presentaban un aspecto similar al de las heridas de control: las heridas de todos los ratones eran anchas y conten´ıan grandes cantidades de c´elulas inflamatorias (v´ease la Fig. 1). A los 3 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas, las heridas normales estaban casi reepitelizadas, con escaras a´ un presentes y con signos de neovascularizaci´on y formaci´ on de col´ ageno en la zona de la herida. Las heridas de los ratones con alelo nulo de gelsolina presentaban una reepitelizaci´on muy variable, asemej´andose algunas a las heridas de control, mientras que otras no estaban reepitelizadas en absoluto. Algunas de las heridas de los ratones con alelo nulo segu´ıan siendo muy inflamatorias, otras no eran muy celulares, y en todos los casos hab´ıa un nivel reducido de formaci´ on de nuevo col´ageno. A los 5 d´ıas, las heridas de los ratones con alelo nulo de gelsolina segu´ıan siendo en su mayor´ıa muy anchas y en su mayor´ıa no se hab´ıan reepitelizado completamente, en comparaci´ on con los controles de tipo salvaje, en los que en la mayor´ıa de los casos se hab´ıa producido reepitelizaci´on (Figs. 2, 3; Tabla 1). A los 7 d´ıas las heridas eran de nuevo heterog´eneas, ya que algunas de las heridas de los ratones con alelo nulo se hab´ıan reepitelizado y conten´ıan relativamente pocas c´elulas inflamatorias, mientras 12

ES 2 183 220 T3

5

10

15

20

que otras eran a´ un bastante anchas y celulares y ten´ıan escaras en la superficie. Hab´ıa agrupaciones de c´elulas inflamatorias y fibroblastos dentro de algunas de las heridas de los ratones con alelo nulo. En esta etapa las heridas de control estaban en su mayor´ıa reepitelizadas y ten´ıan altos niveles de nuevo col´ ageno depositado. Las heridas de los ratones con alelo nulo tanto a los 5 como a los 7 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas presentaban niveles muy bajos de col´ ageno que presentaba un aspecto desigual y estaba depositado seg´ un una disposici´ on marcadamente lineal perpendicular al epitelio. Esta agrupaci´ on de c´elulas y col´ageno desigual surgi´ o como resultado del hecho de haber sido alterada en los ratones con alelo nulo de gelsolina la remodelaci´on normal de actina. A los 14 d´ıas, las heridas de los ratones con alelo nulo ten´ıan en su mayor´ıa c´elulas inflamatorias persistentes y segu´ıan siendo muy anchas, si bien en esta fase todas ellas se hab´ıan reepitelizado. La cantidad de col´ ageno formado era variable. A los 70 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas, los animales con alelo nulo ten´ıan cicatrices anchas similares a las de los animales de control, pero parec´ıa haber gran cantidad de fibroblastos en las cicatrices de los animales con alelo nulo. Dos cicatrices de ratones con alelo nulo presentaban una notable acumulaci´ on local de fol´ıculos pilosos que eran inmediatamente adyacentes a las cicatrices y las rodeaban. En general, las cicatrices de los animales con alelo nulo eran en este punto en el tiempo similares a las cicatrices de los animales de tipo salvaje, pero de peor calidad. Estos resultados fueron sorprendentes y ponen de manifiesto que la gelsolina mejora la calidad de las cicatrices (vistas despu´es de haber transcurrido 70 d´ıas) y mejora tambi´en la velocidad de curaci´ on (seg´ un ejemplifican las observaciones a los 5 d´ıas). Por consiguiente, los compuestos seg´ un la invenci´ on pueden ser usados para tratar heridas, y son particularmente u ´tiles porque aceleran la curaci´on y reducen o impiden la formaci´ on de cicatrices. TABLA 1

25

Resumen de los Datos del An´ alisis de Im´ agenes de las Heridas de los Ratones con Alelo Nulo de Gelsolina y de Tipo Salvaje TABLA 1a 30

Anchura de la Herida (lineal)

35

40

45

50

55

∗

60

Las heridas con alelo nulo eran significantemente m´as anchas que las heridas de tipo salvaje. Significante a p < 0,05 (Prueba de Mann-Whitney U).

13

ES 2 183 220 T3 TABLA 1b Anchura de la Herida (per´ımetro) 5

10

15

20

TABLA 1c Anchura del Panniculus Carnosus

25

30

35

40

45

50

55

60

∗

El panniculus carnosus tiende a quedar m´ as retra´ıdo en las heridas de tipo salvaje en comparaci´ on con las heridas con alelo nulo, p < 0,05 (Prueba de Mann-Whitney U). 14

ES 2 183 220 T3 TABLA 1d Anchura en la Parte Media de la Herida 5

10

15

20

25

∗

30

Heridas con alelo nulo significantemente m´ as anchas que las heridas de tipo salvaje. Significante a p < 0,05 (Kolgomorov-Smirnov) y p < 0,01 (Prueba de Mann-Whitney U). TABLA 1e Reepitelizaci´ on Porcentual

35

40

45

50

55

60

15

ES 2 183 220 T3 TABLA 1f Espesor Epitelial en la Parte Media (a los 5-14 d´ıas solamente) 5

10

15

20

25

TABLA 1g Anchura de la Cicatriz (a los 14 y 70 d´ıas solamente)

30

35

40

45

50

55

60

16

ES 2 183 220 T3 TABLA 2 Puntuaciones para las Cicatrices a los 70 D´ıas en los Animales de Tipo Salvaje (WT) y en los Animales con Alelo Nulo de Gelsolina (KO) 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1.1.2 Inmunocitoqu´ımica La doble coloraci´ on de secciones de herida de ratones con alelo nulo y de tipo salvaje con antigelsolina y faloidina-TRITC fue analizada en el microscopio confocal Biorad MRC600 para hacer uso de la superior separaci´ on de longitudes de onda. Esto impidi´ o todo corrimiento del FITC o del TRITC al otro canal.

55

60

No hab´ıa gelsolina presente en las heridas de los ratones con alelo nulo ni cuando se hizo una sola coloraci´on ni cuando se hizo una doble coloraci´ on con faloidina-TRITC. En las heridas de los ratones de tipo salvaje al haber transcurrido 1 d´ıa y 3 d´ıas despu´es de haber sido efectuadas las heridas, hab´ıa un alto nivel de inmunocoloraci´ on para faloidina-TRITC, y este nivel disminu´ıa de manera temporal hasta los 7 d´ıas. Hab´ıa inmunocoloraci´ on de gelsolina en las heridas de tipo salvaje en todos los puntos en el tiempo en los que fueron efectuados an´alisis, lo cual parec´ıa incrementarse particularmente en las heridas de 7 d´ıas, si bien esto puede ser debido a la concomitante disminuci´ on de actina marcada con faloidina-TRITC. Hab´ıa cantidades crecientes de inmunocoloraci´on para faloidina-TRITC en las heridas 17

ES 2 183 220 T3

5

de los ratones con alelo nulo de gelsolina hasta los 7 d´ıas despu´es de haber sido efectuadas las heridas, lo cual puede explicarse por la falta de gelsolina (tanto citopl´ asmica como pl´asmica). Esta ausencia de remoci´on de actina extracelular (liberada por las c´elulas degenerativas) en las heridas de los ratones con alelo nulo de gelsolina puede explicar la retardada curaci´on de las heridas, y por consiguiente la adici´ on de gelsolina ex´ogena puede acelerar esta remoci´on y por lo tanto acelerar la curaci´on de las heridas. 1.2.3 An´ alisis de Im´ agenes

10

Los resultados del an´ alisis de im´agenes corroboraron la observaci´on de que hab´ıa diferencias de reepitelizaci´on entre las heridas de los ratones con alelo nulo y las heridas de los ratones de tipo salvaje, y de que las diferencias m´as significantes eran las que se daban entre las heridas a los 5 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas. Para un resumen de los resultados, v´ease la Tabla 1 y la Fig. 2. 1.3 Resumen

15

1.3.1 Efecto en la cicatrizaci´ on y/o fibrosis

20

25

30

Los resultados de esta investigaci´ on de heridas de ratones con alelo nulo de gelsolina evidencian que una falta de gelsolina redunda en una orientaci´ on desordenada de los fibroblastos en las heridas y en una subsiguiente mala calidad de las cicatrices resultantes. Esto indica que la orientaci´ on inicial de los fibroblastos constituye un factor importante para determinar la calidad final de una cicatriz. Por consiguiente, los compuestos que influyen la asociaci´on y organizaci´ on de actina, tales como la gelsolina, son u ´ tiles para tratar heridas y particularmente para mejorar o prevenir la formaci´ on de cicatrices. 1.3.2 Efecto en la velocidad de curaci´ on de las heridas Los datos aqu´ı presentados para la anchura de la herida a los 5 d´ıas de haber sido efectuada la herida demuestran adem´ as que para incrementar la velocidad de curaci´ on de la herida (es decir, para reducir la anchura de la herida) se requieren gelsolina y otros compuestos que influencien la asociaci´on y organizaci´on de actina. 1.3.3 Generalidades

35

Los resultados obtenidos de los ratones con alelo nulo de gelsolina aportan la prueba de que la prevenci´on de la contracci´on inicial de la herida no necesariamente redunda en una mejor cicatriz, y puede de hecho ser perjudicial, y de que el retardar la curaci´ on de la herida no mejora la cicatrizaci´ on. Los resultados indican tambi´en que la adici´ on ex´ogena de compuestos tales como la gelsolina que rompen o retiran los desechos extracelulares puede ser u´til para acelerar la curaci´ on de heridas, y especialmente de heridas cr´onicas (como p. ej. las u ´ lceras venosas, las u ´ lceras diab´eticas o las llagas por compresi´on).

40

45

Adem´as, estos datos demuestran que los compuestos que modulan la asociaci´on y organizaci´ on de actina pueden ser usados para tratar ambos aspectos de la curaci´ on de heridas (es decir, para reducir la ´ cicatrizaci´on y para al mismo tiempo incrementar la velocidad de curaci´ on de las heridas). Este es un efecto sorprendente porque los de la mayor´ıa de los tratamientos convencionales para heridas reducen la cicatrizaci´on o incrementan la velocidad de curaci´ on de las heridas, y muy a menudo el tratamiento de un aspecto (como p. ej. la cicatrizaci´ on) va en detrimento del otro aspecto (como p. ej. la velocidad de curaci´ on). Ejemplo 2

50

2.1 M´etodos

55

Fue repetido el Ejemplo 1 usando 11 miembros de una misma camada de tipo salvaje (WT) y 11 miembros transg´enicos (KO) de una misma camada. Los tejidos de las heridas fueron recolectados a los 5 d´ıas (8 WT y 8 KO) y a los 7 d´ıas (3 WT y 3 KO) de haber sido efectuadas las heridas, dado que ´estos eran los puntos en el tiempo en los que en el Ejemplo 1 fueron observadas diferencias significantes entre las curaciones en los ratones con alelo nulo y las curaciones en los ratones de control. 2.2 Resultados

60

Los an´alisis de la anchura del per´ımetro de las heridas y de reepitelizaci´on est´an resumidos en las Tablas 3 y 4. 18

ES 2 183 220 T3

2.2.1 Anchura de las Heridas

5

10

15

La Tabla 3 representa la anchura del per´ımetro de las heridas para los ratones con alelo nulo de gelsolina (KO) y para los ratones de control (WT) a los 5 y 7 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas. A los 5 d´ıas, las heridas de los ratones KO eran m´ as anchas (con una anchura media de 2521,7 µm) y m´ as celulares que las heridas de control (con una anchura media de 1310,91 µm). Se observaba poco col´ageno nuevo, y las c´elulas estaban en agrupaciones dentro de la zona de la herida. El an´ alisis estad´ıstico (efectuado usando el programa Simfit escrito por el Dr. W. Bardsley, de la universidad de Manchester) demostr´o que las diferencias entre las anchuras de las heridas de los ratones WT y las anchuras de las heridas de los ratones KO eran muy significantes a los 5 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas. Las diferencias entre las anchuras de las heridas de los ratones WT y las anchuras de las heridas de los ratones KO a los 7 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas no eran significantes. 2.2.2 Reepitelizaci´ on

20

A los 5 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas hab´ıa reepitelizaci´on m´ınima (un 63,4 %) en las heridas de los ratones transg´enicos (KO) en comparaci´on con las heridas de los ratones de tipo salvaje (WT) (un 95,4 %), y estaban presentes grandes escaras. El an´alisis estad´ıstico demostr´ o que las diferencias entre las anchuras de las heridas de los ratones WT y las anchuras de las heridas de los ratones KO eran muy significantes a los 5 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas.

25

A los 7 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas, las heridas de los ratones con alelo nulo de gelsolina (KO) se hab´ıan reepitelizado casi todas (la reepitelizaci´on de promedio era de un 95,03 %, con solamente una herida no completamente reepitelizada) y conten´ıan algo de nuevo col´ ageno. Sin embargo, el col´ ageno estaba depositado de manera muy irregular y desigual, de manera similar a la descrita en el Ejemplo 1.

30

A los 7 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas, las heridas de los ratones de control de tipo salvaje estaban todas reepitelizadas y ten´ıan altos niveles de nuevo col´ ageno.

35

Las diferencias entre la reepitelizaci´on porcentual de los ratones WT y la reepitelizaci´on porcentual de los ratones KO a los 7 d´ıas de haber sido efectuadas las heridas no eran significantes. Sin embargo eran notables las diferencias observadas en la composici´on del col´ageno. TABLA 3 Anchura de la Herida (per´ımetro)

40

45

50

55

An´ alisis estad´ıstico de los datos en la Tabla 3: (i) 60

5 D´IAS∗

1. Prueba de las Dos Muestras de Kolgomorov-Smirnov H0:F(WT) es igual a G(KO) contra: 19

ES 2 183 220 T3 H1:F(WT) no es igual a G(KO) p=0.0007 (muy significante) H0 contra H3:F(WT)