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2. Vida y muerte de los microorganismos 2.1. Crecimiento Es el incremento ordenado de todos los componentes de la célula viva, arribando a la duplicación de todas las estructuras, orgánulos y componentes celulares, así como la biogénesis de mitocondrias y cromoplastos cuando ciertos microorganismos se ven súbitamente expuestos a las condiciones en que dichos orgánulos son esenciales. En la mayoría de los organismos unicelulares, la reproducción es consecuencia del crecimiento y lleva al incremento en el número de individuos de la población, mientras que en los pluricelulares el crecimiento conduce al aumento del tamaño del organismo (1). La figura 1 muestra una curva general del crecimiento de un microorganismo unicelular . Después de la inoculación de una porción de medio con unas pocas células, transcurre un período de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metabólica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanzó una velocidad constante de crecimiento se dice que está en la fase exponencial debido a que el número de células se puede expresar como función de 2n, donde n es el número de ciclos de duplicación experimentado por la población (3). Una bacteria originará cuatro células (2 2 ) después de dos ciclos, dieciseis (24 ) después de cuatro ciclos, etc. Cada célula de bacteria o levadura da, por escisión o gemación, dos células y el número inicial X o de células (en el instante to=0) se convierte, después de n generaciones en un tiempo t, en X = X o. 2n Como n representa el número de divisiones celulares durante el intervalo de tiempo t, el tiempo de generación g = t/n, y X = Xo.2t/g o sea ln X = ln X o + t.ln 2/g * El término ln 2/g es la velocidad específica de crecimiento (µ) de la población o sea µ = 0,69/g La ecuación * puede escribirse bajo la forma lnX

- lnX o = µ.t por lo tanto X = X o.eµt

y dX/dt = µX En el curso de la fase exponencial la velocidad específica de crecimiento alcanza su valor más elevado (µmáx).

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2 En condiciones ideales el tiempo de generación de las bacterias puede ser de 20 minutos, de esta forma una única célula producirá 2.097.152 bacterias al cabo de 7 horas. Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que permanece constante el número de células. Esta fase puede durar mucho tiempo, por ejemplo décadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero siempre será seguida, más temprano o más tarde, por la fase de muerte (3). En los estudios de la cinética del crecimiento individual de los microorganismos pluricelulares, tales como actinomicetos y mohos, se observó que: a) la velocidad de extensión de las hifas cortas es proporcional a la longitud de las mismas y a la velocidad específica de crecimiento, es decir que estas hifas pueden crecer exponencialmente; b) cada ápice hifal puede extenderse a una velocidad independiente de la velocidad de aumento de la biomasa; c) cuando la capacidad de la hifa para extenderse supera las posibilidades brindadas por los puntos de crecimiento existentes, se generan otros nuevos (ramificación) (4).

2.2. Tipos de nutrición Los organismos fotosintéticos y los que obtienen energía por oxidación de compuestos inorgánicos suelen usar generalmente CO2 como fuente única o principal de carbono (autótrofos). Pero, la mayoría de los microorganismos del laboratorio son heterotróficos, es decir necesitan fuentes de carbono orgánico y nitrógeno asimilables, así como sales minerales y en ciertos casos vitaminas. Pueden sintetizar todos sus constituyentes celulares a partir de un único compuesto orgánico que sirve tanto de fuente de carbono y de energía, y de una fuente inorgánica u orgánica de nitrógeno (1). Metabolismo energético de los microorganismos (1) tipo de organismos dependientes de fotótrofos radiación solar fotolitótrofos= autótrofos dadores de electrones inorgánicos fotoorganótrofos dadores de electrones orgánicos quimiótrofos compuestos químicos quimiolitótrofos= autótrofos oxidación de compuestos inorgánicos quimioorganótrofos= heterótrofos oxidación o fermentación de compuestos . orgánicos Algunas bacterias, por ejemplo Azotobacter que vive libre en el suelo, y Rhizobium que crece como simbionte en los nódulos de la raíz de leguminosas, así como cianobacterias, pueden fijar el nitrógeno gaseoso de la atmósfera, es decir reducirlo convirtiéndolo en nitrógeno orgánico. Por otra parte, las formas parásitas obligadas obtienen del hospedador los complejos constituyentes de su materia viva (5). En tanto que los sulfatos pueden ser utilizados por casi todas las bacterias y hongos, los nitratos son a menudo menos adecuados como nutrientes. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos hace uso del amonio como fuente única o principal de nitrógeno. Sin embargo, algunas bacterias requieren fuentes de azufre reducido, tal como sulfuro o tiosulfato. Los organismos vivos necesitan también muchos otros elementos, como fósforo, potasio, magnesio, manganeso, calcio, hierro, cobalto, cobre, cinc y molibdeno (1)

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2.3. Factores de crecimiento Son los compuestos, necesarios en pequeña cantidad, que debe suministrar el medio para que tenga lugar el crecimiento de algunos microorganismos. Los organismos que requieren un determinado factor de crecimiento son auxotróficos para ese compuesto. Por ejemplo, Lactobacillus arabinosus crece normalmente en presencia de 10 -4 µg/mL de biotina, pero no en ausencia de esta vitamina (6).

2.3.1. Factores orgánicos

Algunos microorganismos carecen de la capacidad de sintetizar ciertos aminoácidos, nucleótidos o vitaminas. Éstos son generalmente aportados por los extractos de levadura y carne, agregados al medio (3). A veces son adicionados en cantidades demasiado elevadas interfiriendo en el metabolismo microbiano, por ejemplo, las células de Corynebacterium glutamicum cultivadas en un medio rico en biotina no excretan ácido glutámico, mientras que si son suspendidas en un medio pobre en biotina ocurre lo inverso. Generalmente los microorganismos requieren L-aminoácidos, por ejemplo Leuconostoc mesenteroides, pero algunas bacterias necesitan D-alanina (6). Vitaminas del grupo B ácido nicotínico (niacina) ácido pantoténico riboflavina (B2 ) ácido fólico biotina cobalamina (B12 ) piridoxal- piridoxina (B6 ) tiamina (B1 )

Función (1) precursor de piridín-nucleótidos (NAD y NADP) “ “ coenzima A “ “ flavín-nucleótidos (FMN, FAD) participa en transferencia de grupos metilo “ “ biosíntesis de ácidos grasos, fijación de CO2 “ “ síntesis de desoxirribosa y transferencia de restos monocarbonados “ “ transformaciones de aminoácidos y cetoácidos “ “ α-descarboxilaciones

2.3.2. Factores minerales La ausencia total de metales comporta la muerte o enfermedades carenciales en todos los seres vivos, pero todo es cuestión de dosis pues, el efecto es beneficioso hasta un cierto nivel, traspasado el cual se observan trastornos fisiológicos. Algunos elementos esenciales, por ejemplo cinc, cobre, cobalto, hierro, molibdeno, son necesarios para la actividad de enzimas específicas (1). Además, algunos seres vivos tienen requerimientos minerales especiales, como el silicio que es parte esencial de la pared celular de las diatomeas (7).

2. 4. Transporte de solutos El transporte de nutrientes a través de la membrana citoplasmática es específico porque son captados por la célula solamente aquéllos para los cuales existe un sistema transportador. Existen dos tipos principales de transporte. El primario comprende los procesos que conducen a la transferencia de iones (H +, Na+, K +) produciendo alteraciones en el potencial electroquímico. Las fuerzas que intervienen son el transporte de electrones respiratorio o fotosintético, o las bombas iónicas dependientes del ATP o de la descarboxilación de metabolitos. El transporte secundario está guiado por gradientes en el potencial electroquímico (9). La difusión pasiva o simple esté gobernada por el tamaño molecular y las propiedades lipofílicas del material, permitiendo la entrada de agua, toxinas no-polares y ciertos inhibidores. La difusión facilitada se lleva cabo debido a la presencia de una

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Capítulo 2 permeasa específica para el substrato y depende de la concentración de substrato en el medio. El nutriente no puede ser acumulado dentro de la célula. El transporte activo y la trasladación del grupo se parecen a la anterior en que participan proteínas específicas y difieren en que necesitan la provisión de energía. El nutriente puede ser acumulado dentro de la célula. En el transporte activo la molécula liberada en el interior de la célula es idéntica a la del exterior, mientras que en la trasladación del grupo la molécula fue modificada durante el transporte, por ejemplo por fosforilación en el caso de un azúcar (9). Se distinguen diferentes procesos de transporte activo según la vía por la cual se dispone de la energía necesaria: potencial protón, ATP o fosfoenolpiruvato. El transporte de muchas substancias (azúcares, iones inorgánicos y orgánicos) es empujado por el potencial protón, La célula bacteriana mantiene dicho potencial por bombeo constante de protones y otros iones (Na+) al exterior, en el cual intervienen proteínas de transporte localizadas en la membrana (9). Cada una de estas proteínas tiene una función específica. Por ejemplo, una proteína cataliza el transporte simultáneo de una molécula de azúcar (lactosa, melibiosa o glucosa) y un protón en la misma dirección, lo que se conoce como un simporte de dos (a veces más) substancias. Otras proteínas catalizan el transporte simultáneo de dos substancias en direcciones opuestas, por ejemplo un protón y otro ión (Na+ o un ácido orgánico), lo que se llama antiporte, como se muestra en la figura 2. En las células procarióticas la entrada de azúcares a la célula es favorecida por un simporte acoplado a H +, mientras que en las eucarióticas está casi siempre acoplado a Na+. Además de los sistemas de transporte que dependen del potencial de la bomba de protones hay otros que dependen del ATP, donde intervienen las proteínas del espacio periplásmico en las proteobacterias (8) . Cuando el transporte ocurre mediante trasladación de grupos, la molécula transportada es modificada químicamente. Por ejemplo, la glucosa (manosa, fructosa u otro azúcar) es captada por el sistema fosfotransferasa dependiente del fosfoenolpiruvato y se libera en el interior glucosa-6-fosfato (ver figura 2). En condiciones aerobias y a pH 7,0 la concentración del Fe+++ es a lo sumo 10 -18 moles/L pues se forma el hidróxido férrico casi insoluble, por lo que algunas bacterias excretan substancias que tienden a solubilizar al hierro formando complejos con Fe+++ que permitan transportado. Tales substancias se denominan sideróforos y son compuestos fenólicos e hidroxamatos (9). La levadura de cerveza posee distintos sistemas específicos para la captación de cada ión metálico (Cu++, Fe+++, Mn+, Zn++). En el caso del hierro primero es reducido a

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Fe++ por las reductasas de la membrana citoplasmática, luego interviene un sistema de baja afinidad para su incorporación a las células con hierro, pero cuando hay una deficiencia limitante del crecimiento actúa otro sistema de captación de alta afinidad. La levadura también tiene dos sistemas de captación para la incorporación de manganeso. Por otra parte, en algunas bacterias patógenas la virulencia depende de la capacidad del microorganismo para obtener iones metálicos del hospedador. El conocimiento de los genes que generan los sistemas de captación de iones metálicos de los microorganismos permite obtener vegetales transgénicos que aprovechan mejor los nutrientes del suelo o secuestran metales tóxicos como, por ejemplo unas plantas donde se había expresado un gen que les posibilitó convertir el Hg++ en Hgo (11).

2.5. Factores ambientales El suelo, o material de la superficie terrestre en el que se sustenta la vida vegetal, es uno de los sitios más dinámicos en interacciones biológicas de la naturaleza. Comprende organismos vivos, minerales disgregados, agua, aire y materia orgánica muerta. El agua y el aire representan aproximadamente la mitad del volumen del suelo (12).

2.5.1. Agua y presión osmótica

La disponibilidad de agua en el ambien te se expresa indirectamente en términos de

actividad del agua (aw), la que se define como la razón entre la presión de vapor de

agua del substrato o solución (p ) y la presión de vapor del agua pura (po) a la misma temperatura, es decir, aw = p/p o Este concepto se asocia al de humedad relativa de la atmósfera en equilibrio con el sistema, de la siguiente manera HRE = aw . 100 La mayor parte de las bacterias no crecen a una a w por debajo de 0,91 mientras que los mohos pueden desarrollarse con cifras de 0,80. Los valores más bajos obtenidos para arqueobacterias halófilas son del orden de 0,75 mientras que los mohos xerófilos (amantes de la sequedad) y las levaduras osmófilas (que prefieren presiones osmóticas elevadas) se multiplican muy lentamente aún con valores de 0,65 y 0,60 respectivamente. Los límites de aw dentro de los cuales hay crecimiento, son más amplios a la temperatura óptima de multiplicación. La capacidad de los organismos para crecer a una temperatura dada, disminuye a medida que se reduce al aw . La presencia de ciertos elementos nutritivos amplía los límites de aw dentro de los cuales los organismos pueden sobrevivir (3). La presión osmótica (θ) está relacionada con la actividad del agua a través una

expresión

θ = -RT.ln aw/v que comprende a la constante de los gases (R ), la

temperatura absoluta (T), el logaritmo natural de la actividad del agua (aw) y el volumen molar parcial del agua (v ) (3). El potencial agua de un suelo ψ es la suma de los potenciales osmótico, matricial (o capilar) y gravitacional. La humedad relativa de la fase vapor en equilibrio con el suelo es también una medida indirecta del potencial agua. El potencial osmótico de la solución del suelo (π ) puede expresarse mediante la

π = -RT ρ υ m φ /109 donde ρ es la densidad del agua, υ los iones por molécula de soluto, m la molalidad, φ el coeficiente osmótico a la molalidad m y la temperatura T°K. El potencial matricial (τ) está dado por la ecuación τ = (RT ρ ln p/p o) /106 M donde M es el peso molecular del agua. ecuación

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El término capacidad de campo se refiere al contenido en agua de un suelo, drenado después de la saturación, cuando la velocidad de la pérdida de agua debida a la gravedad es pequeña. No es una medida precisa (12). Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio, y están protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presión osmótica interna (1). En contraposición a la diversidad de concentraciones de potasio y sodio en los distintos ambientes, los organismos vivos contienen potasio a una concentración más elevada que la del medio externo. Además de neutralizar las cargas negativas de la célula y de regular la función enzimática, el potasio actúa como un soluto implicado en la regulación osmótica de algunos organismos Algunos organismos halófilos que viven en ambientes de alta salinidad sódica, por ejemplo Halobacterium, son la excepción a esta regla (10). Los organismos que son capaces de crecer a elevadas concentraciones de azúcar se denominan osmófilos. Basados en sus respuestas, o tolerancia, a la sequedad los microorganismos se pueden distribuir entre tres grupos definidos por el potencial agua (ψ) óptimo y mínimo para el crecimiento: grupo 1. óptimo –0.1 MPa, mínimo alrededor de –2MPa; contiene algunos hongos y una variedad de bacterias Gram-negativas; grupo 2. óptimo alrededor de –1 MPa, mínimo alrededor –5MPa; contiene principalmente zigomicetos, bacterias Gram-negativas y actinomicetos; grupo 3. óptimo alrededor de –1MPa, mínimo –10 a –15 MPa; contiene una variedad de ascomicetos y basidiomicetos y bacterias Gram-positivas (12).

2.5.2. Tensión superficial

La tensión superficial de los medios de cultivo afecta al desarrollo de un microorganismo. Por ejemplo BaciIIus subtilis tiende a crecer en la superficie a modo de película o velo en los medios corrientes con una tensión superficial entre 57 y 63 dinas, pero si se disminuye a menos de 40 dinas por el agregado de un detergente crece en forma difusa (13). La humectabilidad es función de la tensión superficial. Las soluciones de detergentes pueden penetrar en grietas y espacios muy pequeños e incluso hasta el centro de los agregados de bacterias, donde el agua quedaría por encima sin mostrar penetración alguna.

2.5.3. pH

El pH del medio puede influir sobre la expresión de genes y regular el transporte de protones, la degradación de los aminoácidos, la adaptación a condiciones acídicas o básicas y aún la virulencia. Las células perciben los cambios del pH ambiente a través de diferentes mecanismos. La protonacíón y desprotonación de los aminoácidos inducida por el pH, puede alterar la estructura proteínica secundaria y por lo tanto la función que señala el cambio. La célula puede responder sólo a una de las formas de las moléculas de señal. Por ejemplo, los ácidos orgánicos atraviesan la membrana citoplasmática solamente en la forma protonada y un aumento de la concentración intracelular indicaría un incremento en la acidez ambiental. El gradiente de protones a través de la membrana puede servir, por sí mismo, como un sensor para ajustar los procesos dependientes de la energía (8). El pH intracelular puede ser mantenido sobre un valor crítico en el cual las proteínas internas se desnaturalizan irreversiblemente. En Salmonella typhimurium hay tres mecanismos para mantener el pH interno compatible con la vida: la respuesta homeostática, la respuesta de tolerancia al ácido y la síntesis de proteínas de ‘shock’ acídico (14). A pH ambiental mayor que 6,0 las células bacterianas ajustan su pH interno a través de la respuesta homeostática modulando la actividad de las bombas de protones,

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antiportes y simportes, para aumentar la velocidad a la cual los protones son expelidos del citoplasma. El mecanismo homeostático es constitutivo y funciona en presencia de inhibidores de la síntesis proteica. La respuesta de tolerancia al ácido es iniciada por un pH externo de 5,5 a 6,0. Este mecanismo es sensible a los inhibidores de la síntesis proteica y puede mantener el pH interno por sobre 5,0 teniendo el pH externo valores tan bajos como 4,0. La pérdida de la actividad ATPasa, causada por las mutaciones que desorganizan genes o los inhibidores metabólicos, anula la respuesta de tolerancia al ácido pero no el mecanismo homeostático. Esta respuesta también puede conferir protección cruzada frente a otros agentes ambientales de estrés. La síntesis de proteínas de ‘shock’ acídico es la tercera vía por la que la célula regula el pH interno. Esta síntesis es generada por un pH ambiental de 3,0 a 5,0 proveyendo un conjunto de proteínas reguladoras distintas de las proteínas de la respuesta de tolerancia al ácido.

Bacterias Thiobacillus thiooxidans Azotobacter sp. Erwinia carotovora Clorobium limicola Thermus aquaticus Nitrobacter spp. Hongos Aspergillus oryzae Fusarium oxysporum Penicillium italicum Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Aspergillus niger

Rango de pH para el crecimiento (2) límite inferior óptimo 0,5 2,0-3,5 5,5 7,0-7,5 5,6 7,1 6,0 6,8 6,0 7,5-7,8 6,6 7,6-8,6 1,6 1,8 1,9 2,5