Estructura de Macromoléculas. Dpto. de Química Física. Facultad de Ciencias. Universidad de Granada.

4.- INTERACCIONES POR ENLACES O PUENTES DE HIDRÓGENO. 4.1 Introducción. El “enlace” de hidrógeno fue reconocido como tal por primera vez por Latimer y Rodebush en 1920. La estructura y propiedades de los biopolímeros así como la del agua, el disolvente biológico universal, están determinadas por este tipo de interacción. En general el enlace de hidrógeno es una atracción inter e intramolecular en la que participa siempre el H. Un enlace entre un hidrógeno y un átomo electronegativo como el F, O o N es muy polar, por lo que el hidrógeno es casi un núcleo desnudo, es decir la densidad electrónica alrededor del núcleo de hidrógeno será muy pequeña; si además tenemos en cuenta su reducido tamaño la molécula podrá acercarse mucho al átomo electronegativo de una molécula vecina con carga parcial negativa o pares electrónicos sin compartir (usualmente átomos de F, O o N), por ello, de entre todas las interacciones electrostáticas que no involucran la formación de iones, aquellas en las que participa el hidrógeno son las más fuertes. Un ejemplo clásico es el enlace de hidrógeno entre moléculas de agua que se ilustra en la siguiente figura:

Figura e.h.1 Izquierda: densidad de carga en la molécula de agua, polarización de los enlaces O-H. Derecha: Enlace de hidrógeno entre dos moléculas de agua. Principales características de los enlaces de Hidrógeno: 1º.- La energía de los enlaces de hidrógeno cae en el intervalo de 4 kJ/mol a 25 kJ/mol, es decir, son más débiles que los enlaces covalentes, pero son mayores que las interacciones dipolo-dipolo o las fuerzas de dispersión. 2º.- En él interviene siempre el H, produciéndose la interacción entre un grupo donador D y uno aceptor A; este último con un par de electrones libres y ambos deben ser electronegativos: D–H + :A δ- δ+ δ-

D–H δ- δ+

A δ-

Representamos el enlace de H por una línea discontinua para distinguirlo del enlace covalente.

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3º.- El enlace de hidrógeno tiende a ser lineal, es decir aceptor, hidrógeno y donador alineados, en cuyo caso la interacción alcanza la máxima estabilidad. θ = 180º D

A H

El valor del ángulo θ puede adoptar valores menores de 180º, pero conforme el ángulo disminuye la fuerza de la interacción también disminuye; se estima que una desviación de 20º produce una disminución de la energía del enlace del 10%. Para valores del ángulo de 90º o menores no hay enlace de hidrógeno. 4º.- Los puentes de hidrógeno poseen una longitud de enlace característica, entre 2´5 Å y 4 Å que depende de la geometría y de la distribución electrónica de lo grupos moleculares implicados, ver tabla e.h.1. En todos los casos las longitudes de los enlaces de hidrógeno son superiores a las longitudes características de los enlaces covalentes y mas pequeñas que las que podemos calcular con los radios de van der Waals. 5º.- Los puentes de hidrógeno son predominantemente interacciones electrostáticas que generan un gran carácter dipolar, sin que necesariamente se llegue al estado iónico. Como dijimos anteriormente D y A deben ser electronegativos , así el enlace covalente D-H debe estar polarizado y polarizado estarán los orbitales no enlazantes del aceptor. Es decir, el enlace de hidrógeno es básicamente una interacción dipolar; no obstante tiene un cierto carácter covalente pues como hemos visto las longitudes de enlace son menores que las distancia de van der Waals. 6º.- Los enlaces de hidrógenos pueden se inter e intramoleculares. Así la formación de un puente de hidrógeno entre las moléculas de agua y la cadena polipeptidica de una proteína, entre dos cadenas diferentes (subunidades) de una proteína, entre un ácido nucleico y una proteína, etc. , son ejemplos de puentes de hidrógeno intermoleculares. La formación de puentes de hidrógeno en los elementos de estructura secundaria en proteínas, enlaces terciarios en ARNs, etc., son ejemplos de enlaces de hidrógeno intracatenarios. Además existen enlaces bifurcados y aceptores compartidos: R

R N

H

O

C

R R O

R

C

O

R R

H

R R N

O

H

R

R

Aceptor compartido

C

Enlace de Hidrógeno bifurcado

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El agua juega un papel muy importante como disolvente en los sistemas biológicos y presenta un amplio conjunto de propiedades físicas anómalas. Muchas de estas propiedades se explican en términos de la extraordinaria capacidad del agua para formar puentes de hidrógeno intermoleculares. Bien conocida es la estructura hexagonal del hielo donde los puentes de hidrógeno son la interacción predominante que mantiene ordenadas a las moléculas formando un cristal molecular como se representa en la figura e.h.2.

Figura e.h.2. El hielo hexagonal es la forma normal del hielo. Podemos considerar que los cristales de hielo consisten en capas apiladas donde la estructura básica que forma cada capa es un hexámero en forma de silla (planos horizontales) o forma de bote (planos verticales). Las seis moléculas de agua en el hexámero forman enlaces de hidrógeno con las dos moléculas vecinas, tres de ellas participan a su vez en enlaces de hidrógeno con la capa inmediata por debajo y otras tres con la capa por encima.

4.2. El enlace de Hidrógeno en proteínas y ácidos nucleícos. En la tabla e.h.1. se muestran los principales tipos de enlace de hidrógeno y sus longitudes de enlace características que se dan en los biopolímeros. Los enlaces de hidrógeno intramoleculares es una de las fuerzas no covalentes que juegan un papel muy importante en las estructuras de las proteínas, especialmente a nivel de estructura secundaria donde aparecen siguiendo un patrón periódico bien definido. La periodicidad de estos enlaces en los elementos de estructura secundaria radica en la repetición del grupo peptídico a lo largo de la cadena y el doble carácter de aceptor y donador de este grupo; ver figura e.h.3. Así en las hélices α se forman puentes de hidrógeno en los que el oxígeno del grupo carbonilito de un resto i actúa de aceptor y el nitrógeno amida del resto i + 4 actúa de donador; ver figura e.h.4. donde también se indica el esquema de formación de puentes de hidrógeno para las hélices π o 310. La figura e.h.5 muestra un modelo de bolas y barras de una hélice α donde se indican los puentes de hidrógeno con líneas de trazo discontinuo.

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Tabla e.h.1 Principales tipos de enlaces de hidrógeno en biomacromoléculas. Distancia Donor-Aceptor (Å)

Tipo Hidroxilo-Hidroxilo R

O

H

Reducción respecto a radios de van der Waals.

R

O

2´8 ± 0´1

25%

2´8 ± 0´1

20 %

2´9 ± 0´1

20 %

2´9 ± 0´1

20 %

3´1 ± 0´2

15 %

3´7

10 %

H Hidroxilo-carbonilo R

O

H

R

O

C R

Amida-carbonilo R

N

H

R O

R

R Amida-hidroxilo R N

H

C

R O

R H Amida-N imidazolico R N

H

N

R Amida-sulfuro R N R

H

NH

R S H

El otro elemento de estructura secundaria donde los enlaces de hidrógeno aparecen con una distribución repetitiva o periódica es la láminas β, paralela o antiparalela. Como podemos apreciar en la lámina paralela de la figura e.h.6. los puentes de hidrógeno, aunque no son la única fuerza en juego, mantienen unidas las diferentes hebras de la lámina, formándose entre el oxigeno carbonilico de una hebra, aceptor, y en nitrógeno amídico de la hebra vecina, donador. Un esquema de formación de enlaces de hidrógeno análogo se produce en las láminas β antiparalelas, con los enlaces de hidrógeno más paralelos entre sí y mas perpendiculares a la dirección de las hebras.

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O O

H C

R

CH2 O

R

CH3 H

C

CH O

OH

CH

C CH

OH

NH2

NH2

N

O

H

Ser

Thr O

O

-

CH2

C

C

CH

O

NH2

OH

H

O

O

O

-

CH2

C CH2

C

CH2 CH2

O

NH2 CH2

C OH

CH NH2

Gln

O N

O

C

Asp

OH

CH

Glu

H N

C

C

CH

CH

NH2

OH

HC

O

H N

CH2

H

N

C

C

CH

O

NH2

H

OH

H

His

H

O

H N

+

CH2 CH2

CH2 CH2

C CH

OH

NH2

Lys

Asn

O CH HC H

C O

H

+

N H

C CH

CH

NH2

OH

CH

Tyr

H N

H

CH2 C

O

O

C

CH2 N

CH2 CH2

H

CH HC

C CH

OH

HC

C CH

NH2

CH2 C

C

C

CH

CH

NH2

OH

N H

Trp Arg Figura e.h.3. Grupos donores (flechas azules) y aceptores ( flechas rojas) para enlaces de hidrógeno en el grupo peptídico y en las cadenas laterales de los aminoácidos.

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310

R

π

CH3

H

O

R

H

O

R

H

O

CH

N

C

CH

N

C

CH

N

C

R

N

C

CH

N

C

CH

N

C

CH

N

H

O

R

H

O

R

H

O

R

H

α

Figura e.h.4. Esquema de conexión por puentes de hidrógeno de una cadena polipeptídica para los tres tipos de hélice α, π o 310.

Figura e.h.5. Hélice α y especificación de los puentes de hidrógeno entre los grupos amida de los grupos peptídicos, como donadores, y los carbonílicos de los grupos peptídico como aceptores.

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Figura e.h.6. Modelo de bolas y barras de una región de una proteína que muestra cuatro hebras de una lámina â paralela donde los enlaces de hidrógeno están indicados por líneas de trazo discontinuo.

Además de los enlaces de hidrógeno asociados al grupo peptídico, tan importantes para la formación y estabilidad de los elementos de estructura secundaria, un buen número de cadenas laterales de los aminoácidos tienen capacidad de formar enlaces de hidrógeno; en la figura e.h.3 podemos observar que 11 de los 20 aminoácidos proteicos tienen cadenas laterales con grupos donadores y aceptores. Estos aminoácidos pueden formar puentes de hidrógeno intramoleculares que contribuyan a la estabilidad de la estructura terciaria de la proteína. Pueden intervenir en la interacción entre una proteína y un ligando, por ejemplo la formación de enlaces de hidrógeno entre algunos restos del sitio activo de una enzima y su sustrato o un inhibidor. También pueden intervenir en la interacción Macromolécula-Macromolécula, formando puentes de hidrógeno en las interfacies de unión de dímeros, trímeros, tetrámeros u otros oligomeros de mayor número de subunidades. Los enlaces de hidrógeno también juegan un papel importante en las estructuras secundadioas de DNA y RNA. Las hélices de polinucleotidos tienen un mínimo de dos cadenas unidas mediante fuerzas no covalentes entre las que destacan los enlaces de hidrógeno que se producen entre las bases para formar pares, tripletes, incluso cuadrupletes. En el ADN genomico de la mayoría de las células se unen dos cadenas mediante el apareamiento de dos bases para formar un “duplex”. El modelo universalmente aceptado para este duplex, propuesto por Watson y Crick, implica la formación de pares de bases dG – dC y dA – dT, como se ilustra en la figura e.h.7; se dice que G y C por un lado, y A y T por otro, son bases complementarias.

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Figura e.h.7. Arriba: Interacción por enlaces de hidrógeno de las bases Guanina y Citosina de los nucleotidos GMP y CMP según el modelo de Watson y Crick. Abajo: Interacción por enlaces de hidrógeno de las bases Adenina y Timina de los nucleotidos AMP y TMP según el modelo de Watson y Crick.

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La doble hélice en el ADN existe en tres formas conocidas como A-ADN, BADN y Z-ADN; de éstas la forma B es la estructura mas frecuente en ADN mientras que en ARN la forma mas frecuente es semejante a la forma A-ADN. En la figura e.h.8. se muestra una representación de la forma B-ADN indicando los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias.

Figura e.h.8. Forma B de la doble hélice de ADN. Los enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias se indican con líneas de trazo discontinuas.

4.3.- Contribución de los enlaces de hidrógeno a la estabilidad de las estructuras plegadas de los biopolímeros. Una macromolécula biológica, sea una proteína, en estado completamente desplegado expone gran parte de la superficie molecular, tanto del esqueleto como de las cadenas laterales. Aquellos grupos capaces de actuar de donador o aceptor de enlaces de hidrógeno formaran tales enlaces con las moléculas de agua, en una alta proporción. La razón para explicar esta aseveración es la abundancia de las moléculas de disolvente y como consecuencia, una mayor probabilidad de choques bimoleculares. Cuando con la participación de todas las fuerzas no covalentes se produce el plegamiento hacia la estructura terciaria promedio, los grupos donadores y aceptores al ubicarse en un interior predominantemente apolar, con pocas o ninguna molécula de agua, rompen los enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua y forman nuevos entre ellos. Surge entonces la pregunta ¿contribuyen favorablemente la formación de los puentes de hidrógeno a la estabilidad global de las estructuras secundarias y terciarias de los biopolímeros?. Para responder a esta pregunta vamos a analizar un caso de dimerización por puentes de hidrógeno de un compuesto modelo, la N-metilacetamida, NMA.

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La NMA se dimeriza formando dos puentes de hidrógeno tal como se representa en la figura e.h.9. El grado de dimerización es función de la concentración y depende de la capacidad del disolvente para formar puentes de hidrógeno.

Figura e.h.9. Dimerización de la N-metilacetamida (NMA) mediante dos puentes de hidrógeno. ( Figura tomada del texto “Principles of Physical Biochemistry” de K. E. van Holde, W. C. Jonson y P. S. Ho. Ed. Prentice may.) Habrá un equilibrio químico monómero-dímero: M +M ⇔ D El grado de dimerización o fracción de moléculas en el estado dimérico será: α=

n º de moléculas enforma D 2[D ] = [M ] + 2[D] n º moléculas totales

Midiendo α en tres disolventes diferentes, tetracloruro de carbono, dioxano y agua, se obtiene una tendencia a la dimerización marcadamente diferente, figura e.h.10. Observamos una asociación más fuerte en Cl4C, disolvente con el que la NMA no puede formar enlaces de hidrógeno. La asociación más débil corresponde al 46

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disolvente agua, que actúa como un fuerte competidor por el grupo donador y aceptor del NMA. El dioxano presenta un comportamiento intermedio porque tiene dos oxígenos con pares de electrones libre que actúan como aceptores. Midiendo la dependencia con la temperatura del grado de dimerización en los tres casos, es posible obtener los parámetros termodinámicos correspondientes a la formación del dímero que aparecen en la tabla e.h.2.

Figura e.h.10. Grado de asociación por dimerización de N-metilacetamida (NMA) en tetracloruro de carbono, dioxano y agua.( figura tomada del texto “Biophysical Chemistry” de C. R. Cantor y P. R. Schimmel, Ed. W. H. Freeman and Company)

Tabla e.h.2 Parámetros termodinámicos para la asociación de N-metilacetamida a 25 ºC

El proceso transcurre sin aumento neto del número de enlaces de hidrógeno, forma que si la energía de un enlace de hidrógeno NMA-H2O es similar a correspondiente a un enlace NMA-NMA, el cambio de entalpía de dimerización agua, ∆Hº, deberá ser nulo. En Cl4C habrá una formación neta de 2 enlaces hidrógeno y esto da lugar a un ∆Hº = - 17 kJ.mol-1

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El ∆Sº en H2O y en Cl4C debe ser