k

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

19

k 2 108 165 kInt. Cl. : C07D 498/22, A61K 31/495

11 N´ umero de publicaci´on: 6

51

˜ ESPANA

C12N 1/20, C12P 17/18 //(C07D 498/22, C07D 263:00 C07D 241:00, C07D 221:00 C07D 221:00, C07D 209:00) (C12N 1/20, C12R 1:465) (C12P 7/18, C12R 1:465)

k

12

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

kN´umero de solicitud europea: 93109459.3 kFecha de presentaci´on : 14.06.93 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 574 857 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 22.12.93

T3

86 86 87 87

k

54 T´ıtulo: Compuestos polic´ıclicos 31668P y 31668U, un procedimiento para su producci´ on y su uso

como agentes antibi´ oticos o antitumorales.

k

73 Titular/es: Hoechst Aktiengesellschaft

k

72 Inventor/es: Vertesy, L´ aszlo;

k

74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Alberto

30 Prioridad: 19.06.92 EP 92110366

65926 Frankfurt am Main, DE

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

ES 2 108 165 T3

16.12.97

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.12.97

Aviso:

k k

Betz, Joachim; Fehlhaber, Hans-Wolfram; Helsberg, Matthias; Kogler, Herbert; Limbert, Michael; Sukatsch, Dieter-Andreas; Chandran, Rama Ryer y Ganguli, Bimal Naresh

k

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 108 165 T3 DESCRIPCION Esta invenci´on se refiere a los antibi´ oticos antibacterianos 31668P y 31668U, a sus sales farmac´euticamente aceptables, a un procedimiento para su producci´ on y a su uso. 5

10

15

Los antibi´oticos 31668P y 31668U se pueden describir como antibi´oticos antibacterianos que pertenecen a la clase quin´ onica. Dichos antibi´oticos son activos frente a un gran n´ umero de bacterias tanto gram-positivas como gram-negativas. La clase quin´onica de antibi´ oticos est´a descrita en el CRC Handbook of Antibiotic Compounds por J. Berdy, Vol. III (CRC Press INC. Florida 1980) y Vol XIII, parte 2, p´ aginas 35-78 y 161-230 (CRC Press INC. Florida 1987). Adem´as, dichos antibi´ oticos tienen actividad citot´ oxica. Los compuestos 31668P y 31668U descritos aqu´ı se diferencian de todos los antibi´oticos conocidos en sus f´ ormulas moleculares y por tanto forman el objeto de esta invenci´ on. Adem´ as un extracto qu´ımico de la investigaci´ on en l´ınea realizada con las claves de investigaci´ on del peso molecular y f´ormula molecular confirma la novedad de 31668P y 31668U. Los compuestos 31668P y 31668U tienen las siguientes f´ormulas:

20

25

30

35

40

El microorganismo, n´ umero de cultivo Hoechst India Limited Y-90,31668, de aqu´ı en adelante denominado Y-90,31668 usado para la producci´ on de 31668P y 31668U, fue aislado de una muestra de suelo recogida en Bharatpur Bird Sanctuary, Rajasthan, India. El microorganismo Y-90,31668 pertenece al g´enero Streptomyces. Dicho microorganismo ha sido depositado ante la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Mashcheroder Weg 1 B, D-3300, Braunschweig, cumpliendo las condiciones del tratado de Budapest, el 6 de mayo de 1992 (DSM 7065).

45

Otro objetivo de la presente invenci´ on es proporcionar un procedimiento para la producci´ on de los nuevos antibi´ oticos 31668P y 31668U a partir de una cepa microbiana, a saber la especie de Streptomyces Y-90,31668 (n´ umero de cultivo Hoechst India Limited Y-90,31668), sus mutantes o variantes.

50

Dicho procedimiento consiste en cultivar dicha cepa microbiana, sus mutantes o variantes en un medio nutriente por fermentaci´ on, preferiblemente bajo condiciones aer´ obicas a 26-32◦C y pH 6 a 8 y aislar y purificar los compuestos 31668P y 31668U del caldo de cultivo de forma conocida y si se desea, convertir los compuestos 31668P y 31668U en sus sales farmac´euticamente u ´ tiles de forma conocida.

55

60

El medio nutriente incluye fuentes de carbono tales como almid´ on, glucosa, sacarosa, dextrina, fructosa, molasas, glicerol, lactosa o galactosa. La fuente de carbono preferida es la glucosa. El medio nutriente incluye tambi´en fuentes de nitr´ ogeno tales como harina de soja, harina de cacahuete, extracto de levadura, extracto de carne de vacuno, peptona, extracto de malta, extracto de embri´ on de ma´ız, gelatina o casamino´ acidos. La fuente de nitr´ ogeno preferida es la harina de soja. El medio nutriente incluye tambi´en sales inorg´anicas nutrientes tales como carbonato de calcio y elementos trazas tales como cloruro de cobalto. Particularmente preferida es la fermentaci´ on a 28◦C (± 1◦ C) y pH aproximadamente 7,2.

2

ES 2 108 165 T3 La fermentaci´on se lleva a cabo preferiblemente durante 40 a 60 horas hasta que se encuentra que se ha obtenido un rendimiento o´ptimo del antibi´ otico de la presente invenci´on.

5

10

15

20

25

De forma particularmente preferida, la fermentaci´ on se lleva a cabo durante aproximadamente 48 horas bajo condiciones de sumersi´ on en frascos con agitaci´on oscilante as´ı como en fermentadores de laboratorio. El progreso de la fermentaci´ on y la formaci´ on del antibi´ otico de la presente invenci´on se puede detectar por cromatograf´ıa l´ıquida de alta presi´ on (HPLC) y midiendo la bioactividad del caldo de cultivo frente a especies de Staphylococcus y Escherichia por el conocido m´etodo de ensayo de difusi´ on microbiana en placa de ´agar. Los cultivos preferidos son Staphylococcus aureus 209P y Escherichia coli 9632. Los compuestos 31668P y 31668U se pueden aislar del caldo de cultivo por adsorci´ on directa sobre R (resina de alta porosidad con base de coadsorbentes adecuados como carb´ on activado, Diaion HP-20 R (repol´ımero de poliestireno-divinilbenceno, Mitshubishi Chemical Industries, Japan) o Amberlite XAD sina porosa con base de poliestireno-´ester de ´acido acr´ılico, Rohm & Haas Co., U.S.A.). El adsorbente R . Los compuestos 31668P y 31668U se pueden eluir de estos adsorbentes preferido es Diaion HP-20 usando fases m´ oviles tales como agua, metanol, acetona o acetonitrilo o sus combinaciones conteniendo aditivos adecuados tales como una sal o un a´cido. El eluyente preferido es metanol acuoso conteniendo ´acido. Los eluatos activos antes mencionados que contienen 31668P y 31668U se concentran y se pueden purificar adicionalmente de varias formas. Por ejemplo, por un procedimiento de readsorci´on y eluci´ on R R , Diaion HP-20 ; por filtraci´ on por gel con Sephadex LHcon carb´ on activado, Amberlite XAD-4 y 7 R R o geles de la serie Sephadex G (Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden) usando agua, metanol, 20 acetona o sus combinaciones como eluyentes; por cromatograf´ıa de cambio i´onico con IRC-50 (H+ ), SR R Fast Flow (Pharmacia) o Fractogel EMD SO-. El m´etodo de purificaci´ on preferido incluye Sepharose MPLC sobre S-Sepharose FF usando como eluyente soluci´on tamp´ on de fosfato con pH adecuado.

30

La presente invenci´on se refiere tambi´en a los equivalentes qu´ımicos de los compuestos 31668P y 31668U; dichos equivalentes son las sales con los aniones de otros ´acidos org´ anicos o inorg´ anicos tales actico, ´acido succ´ınico o ´acido ac´etico, que se pueden producir de forma como H2 SO4 , ´acido c´ıtrico, ´acido l´ conocida.

35

Las propiedades f´ısico-qu´ımicas y espectrales de los compuestos 31668P y 31668U se dan a continuaci´ on:

40

45

50

31668P

31668U

Color

Amarillo oscuro

Naranja

Naturaleza

B´asica

B´asica

F´ ormula molecular

[C21 H28 N3 O5 ]+ Cl− (HR FAB-MS)

[C21 H26 N3 O5 ]+ Cl− (HR FAB-MS)

M´ aximo en UV

292 nm (tamp´ on de PO4 , pH 5)

268 nm (MeOH)

Propiedades biol´ ogicas de 31668P y 31668U: 55

60

La actividad antibacteriana de los compuestos 31668P y 31668U expresada como valor de concentraci´on m´ınima inhibitoria requerida para inhibir el crecimiento de varias bacterias se muestra en la Tabla 1. Dichos antibi´oticos inhiben el crecimiento de las c´elulas Hela en cultivos celulares en concentraci´on < 1 microgramo/ml. El cultivo de c´elulas vero muestra un efecto citost´ atico notable en un intervalo de concentraci´on de 0,01-3,6 microgramos/ml.

3

ES 2 108 165 T3 TABLA 1 Las concentraciones m´ınimas inhibitorias de los antibi´ oticos 31668P y 31668U determinadas por los ensayos de diluci´ on en caldo frente a cepas seleccionadas de bacterias (microgramos por ml). 5

10

15

20

25

30

31668P

31668U

Staph. aureus SG 511