Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale frente a microorganismos patógenos

ADRIANA MARCELA RAMOS PENCUE TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito para optar al título de MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS BACTERIOLOGÍA-MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá D.C. Colombia Mayo de 2013

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Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale frente a microorganismos patógenos

ADRIANA MARCELA RAMOS PENCUE

___________________________ MARIA CONCEPCIÓN PUERTA PhD. Decana Académica Facultad de Ciencias

______________________________ JANNETH ARIAS Directora Carrera de Microbiología Facultad de Ciencias

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Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale frente a microorganismos patógenos

ADRIANA MARCELA RAMOS PENCUE

_______________________ Luis Gonzalo Sequeda M.Sc Director

________________ Jorge Robles PhD Par Académico

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NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Julio de 1994

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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DEDICATORIA Tal vez aún me falte mucho camino por recorrer, tantas cosas que aprender pero sobre todo valoro lo que significan los momentos agradables y los no tan agradables, que han hecho de esta vida universitaria un espacio de desarrollo holístico en el que se aprende a valorar cada persona, cada sentimiento y cada situación que paso, buena o no tan buena, y reflexionar sobre lo que se ha realizado para sacar una muy buena enseñanza de todo. Por los momentos inolvidables, dedico este trabajo de grado a mi familia que aunque no ha estado muy presente cada día conmigo, sabe que somos una unidad y que pese a las dificultades, unidos enfrentamos las adversidades y salimos adelante. A mi madrina, quien ha sido como mi madre, una persona incondicional, siempre está para dar una voz de aliento, esperanzas y para preocuparse por mí. Mis amigos que no me han desamparado que siempre han sido mi apoyo, en los que confío y a los que quiero mucho, a Moni, Diani, Aleja, Lau que han sido las más cercanas en estos momentos, y a los demás que siempre me reciben con un abrazo, confiando en mí y apreciándome como soy. A mi novio Ivan quien durante este tiempo con una sonrisa y una muy buena actitud hace que todo sea una aventura, conociendo conmigo que cada dificultad y cada oportunidad es parte del crecimiento personal; enseñándome que la paciencia y la inteligencia emocional son valores que hacen de cada uno una persona reflexiva.

Adriana Marcela Ramos Pencue Colombiana con pasión

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AGRADECIMIENTOS

Agradezco a Dios por permitirme desarrollar mis capacidades por darme la vida y la fuerza para seguir aun cuando los momentos fueron difíciles, a mi familia quien con esfuerzo logró brindarme los recursos necesarios para asistir a las actividades académicas que debo enfrentar y a las personas incondicionales que han estado apoyándome siempre y con una sonrisa me han hecho sentir que vale la pena vivir en un mundo de caos porque es allí donde se valora lo que se tiene, en medio de las necesidades.

Agradezco al proyecto de productos fitoterapéuticos, por permitirme ser parte de ese inmenso conocimiento generado bajo el apoyo de COLCIENCIAS Agradezco a la Doctora María Claudia Campos Pinilla y a su equipo de Laboratorio, por la colaboración en este proceso Al laboratorio de Química Microbiológica, del departamento de química, por brindar apoyo en cuanto a recursos físicos y técnicos a su alcance. A la profesora Andrea Aguirre quien me brindo ayuda en cuanto estuvo en sus manos

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TABLA DE CONTENIDO

1. Introducción 2. Planteamiento y justificación 3. Marco Teórico 3.1 Generalidades del metabolismo en plantas 3.1.1 Metabolismo Primario 3.1.2 Metabolismo Secundario 3.1.3 Defensa en plantas 3.2 Antimicrobianos 3.2.1 Generalidades 3.2.2 Estructuras y formas de acción 3.2.3 De la resistencia de los microorganismos a los antibióticos 3.3 Plantas con potencial antimicrobiano 3.4 Sobre la obtención de aceites esenciales 3.4.1 Definiciones 3.4.2 Composición de un aceite esencial 3.5 Sobre las plantas a evaluar 3.5.1 Romero, Rosmarinus officinalis 3.5.2 Diente de león, Taraxacum officinale 3.6 De los microorganismos a evaluar 3.6.1 Escherichia coli 3.6.2 Pseudomonas aeruginosa 3.6.3 Bacillus cereus 3.6.4 Staphylococcus aureus 4. Objetivos 5. Metodología 6. Análisis Estadístico 7. Resultados 8. Discusión 9. Conclusiones 10. Recomendaciones 11. Referencias Bibliográficas 12. Anexos

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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema de producción de aceites esenciales a nivel industrial. Figura 2. Comparación de cromatogramas con diclorometano y hexano.

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ÍNDICE DE TABLAS No. Pág Tabla 1. Comparación de contenido de aceites esenciales en diferentes órganos respecto a las familias de vegetales. Tabla 2. Resultados comparativos entre hidrosol de romero y aceite esencial de romero

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RESUMEN Este trabajo se realizó amparado bajo el proyecto: Desarrollo de alternativas de conservación en productos fitoterapéuticos 100% naturales, financiado por COLCIENCIAS, con el fin de observar y determinar el efecto antimicrobiano de aceites esenciales e hidrosoles a partir de dos especies vegetales: Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale contra Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, proporcionadas por el cepario de bacterias de la facultad de Ciencias de Pontificia Universidad Javeriana. Rosmarinus officinalis o comúnmente llamado romero, es una planta ampliamente distribuida en las tierras del mediterráneo, Turquía y en el continente Americano. Los aceites esenciales de esta planta han sido investigados, tanto su actividad antimicrobiana como antioxidante, sin embargo existe un subproducto derivado de la obtención del aceite esencial por hidrodestilación, sobre el cual hay gran interés, el hidrosol. El diente de león es una planta que al igual que el romero, tiene amplia distribución, y posee diversos usos a nivel de medicina tradicional, con diversas aplicaciones tanto gastronómicas como medicinales. El objetivo de este trabajo fue la evaluación antimicrobiana de los hidrosoles y aceites esenciales de Rosmarinus officinalis y de Taraxacum officinale contra 4 bacterias patógenas: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus. El aceite esencial obtenido del romero, se extrajo a partir de hojas de la planta durante 3 horas mediante el uso de un aparato de Clevenger, y el hidrosol como subproducto de la destilación; para diente de león se realizó el mismo procedimiento por hidrodestilación por 3 horas encontrando únicamente hidrosol. Se realizó la evaluación de densidad como parámetro donde la densidad del aceite esencial de romero fue de 0.881g/mL ± 0.016, la densidad del hidrosol de romero fue de 0.9955g/mL ± 0.00098 y la densidad del hidrosol de diente de león fue de 0.9953g/mL ± 0.00065, y el rendimiento en cuanto a la obtención del aceite esencial de Rosmarinus officinalis fue de 0.594 mL/g± 0.04. Complementaria a estas evaluaciones, se realizó la técnica de extracción por microgota, mediante la cual se emplearon 150 µL de hexano y de diclorometano a temperatura ambiente de 20°C y 3000 rpm en 5 mL de hidrosol, y a través de un cromatógrafo de gases acoplado a masas, se determinaron los compuestos presentes en el hidrosol que se encuentran en el solvente. Para la evaluación de la actividad antimicrobiana tanto del aceite esencial como de los hidrosoles, se realizó por difusión de disco en agar, de 3 concentraciones 100ppm, 10ppm y 1 ppm, se realizó la lectura por halos de inhibición. La actividad antimicrobiana no se evidenció con las concentraciones evaluadas.

PALABRAS CLAVES: Rosmarinus officinalis, antimicrobiana, hidrodestilación, CMI, CMT

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Taraxacum

officinale,

Actividad

1. INTRODUCCIÓN

La medicina tradicional hace referencia al uso de conocimientos ancestrales para mantener la salud, es decir que los conocimientos sobre los beneficios de las plantas son tan antiguos como el hombre mismo. En la actualidad los avances científicos y la posibilidad de analizar los componentes presentes en las plantas y demás seres vivos, nos acercan a descubrir soluciones a problemas en el campo de la salud o de aplicación industrial, y teniendo en cuenta la diversidad natural presente en el continente americano se da el impulso hacia la investigación sobre todo en plantas como alternativas medicinales. En regiones tropicales y sub tropicales, o en los países denominados del tercer mundo, la prevalencia de las enfermedades de tipo infeccioso son mayores, y los agentes causales o etiológicos son microorganismos como bacterias o párasitos, por ejemplo la tuberculosis pulmonar o extrapulmonar, meningitis, o malaria (OMS, 2012). Dichas enfermedades infecciosas han comenzado a ser mucho mas difíciles de combatir debido a la naturaleza del agente que mediante mecanismos genéticos, ha cambiado para hacerse resistente a los tratamientos con antibióticos de rutina. (Torres, 2002) A medida que aumenta la población en una región, es más difícil el acceso a servicios de salud pública integral, y es necesario buscar alternativas de atención primaria para suplir dicho déficit. En adición a lo anterior, se suma la dificultad de tratamiento frente a enfermedades de tipo infeccioso que han manifestado variaciones y mutaciones imposibilitando el tratamiento, y por ello se abre una oportunidad para el uso de alternativas naturales para contrarrestar este fenómeno ya que los productos de origen natural son complejos y tienen varias estratégias para combatir dichos agentes infecciosos. Microorganismos como Staphylococcus aureus, quién frecuentemente está involucrado en infecciones de importancia, han sido tratadas con antibióticos de uso común como la meticilina; y según la Organización Mundial de la Salud (2013), hay preocupación porque un alto porcentaje de casos presentan resistencia a este antibiótico generando cepas que dificultan el tratamiento de la infección, prolongando la enfermedad y por lo tanto el tratamiento. Por otra parte, productos como: cosméticos y alimentos, pueden actuar como vehículos o fuente de nutrientes para microorganismos, generando riesgos para la comercialización y el posterior consumo de dichos productos (Kang et al 2013). Tanto los alimentos como los productos farmacéuticos se rigen por normas nacionales dictadas por el INVIMA (Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos) e internacionales como lo son CODEX Alimentarius y Farmacopeas. Compuestos como parabenos (Watanabe et al, 2013), benzoatos y triclosan (Orvos et al, 2002; Tutarazako et al, 2004; Dusalt et al, 2008) son de 11

origen sintético, y buscan ser reemplazados ya que se han encontrado evidencias científicas de su carácter perjudicial para la salud, sin embargo existe la posibilidad de emplear otro tipo de conservantes como compuestos naturales derivados de plantas que no causen perjuicios a la salud de los seres vivos. Algunos conservantes utilizados en las industrias tanto de alimentos como de cosméticos poseen características nocivas para la salud ocasionando dermatitis foto-alérgica causada por el uso de productos de cuidado personal (PCP) (Biesterbos et al, 2013) como: cremas solares, en las que se encuentran bencenofenonas y cinamatos; o parabenos que están relacionados con cáncer de seno, y unión a receptores de estrógenos y andrógenos, que generan cambios hormonales. Los parabenos se emplean en ambas industrias, tanto en cosméticos como en alimentos. Dichos compuestos son incorporados por piel, en el caso de los productos cosméticos, se eliminan en orina parcialmente (Watanabe et al, 2013), o el uso combinado de colorantes y preservantes como el benzoato de sodio puede generar hiperactividad y cambios de comportamiento en niños (El-Wahab et al, 2013). Debido a lo anterior hay interés por el desarrollo de conservantes naturales para ser usados en industrias como alimentos y el desarrollo de fitoterapéuticos, para industria farmacéutica. Este proyecto tiene como fin evaluar actividad antimicrobiana de los aceites esenciales e hidrosoles de romero y diente de león sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus.

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA – JUSTIFICACIÓN

Algunos conservantes utilizados en las industrias tanto de alimentos como de cosméticos poseen características nocivas para la salud ocasionanado dermatitis foto-alérgica en productos de cuidado personal (PCPs), además que algunos de estos compuestos poseen metales pesados como mercurio o cadmio que generan neurotoxicidad (Biesterbos et al. 2013). Por otra parte, los parabenos tienen un uso extendido tanto para cosméticos como para alimentos, debido a su eficiente acción antimicrobiana y a su fácil eliminación por orina luego de su ingestión, sin embargo estudios como los realizados por Watanabe et al. (2013) indica una relación de este conservante con el cáncer de seno, por la unión a receptores de estrógenos. En alimentos, el uso combinado de colorantes y preservantes como el benzoato de sodio puede generar hiperactividad y cambios de comportamiento en niños (El-Wahab et al, 2013). Y a nivel de salud, el fenómeno de la resistencia de los microorganismos a antibióticos usados constantemente para el tratamiento de infecciones (OMS, 2012). Con base en los inconvenientes anteriores, se genera una oportunidad para la búsqueda de ingredientes de origen natural para la conservación de productos tanto en las industrias 12

farmacéuticas y de cosméticos como de alimentos para encontrar alternativas naturales, económicas y confiables de reemplazo de ingredientes sintéticos e igualmente para el tratamiento de infecciones provocadas por resistencia microbiana. Existen numerosas publicaciones con resultados importantes de actividad antimicrobiana de tipo bactericida, fungicida y actividad antioxidante en distintos extractos vegetales (Sagdic et al 2003; Hu et al 2005; Bradley et el 2006; Celikas et al 2007; Oral et al 2008; Zaovali et al 2010; Okoh et al 2010; Jiang et al 2011; Astafieva et al 2012; Varona et al 2013; Haddouchi et al 2013), en adición a estas utilidades, se le da un uso de conservante natural para la productos como alimentos o cosméticos por dichas capacidades (Galbis, 2004). Otra de las oportunidades se resalta, con relación al desarrollo nacional o regional se encuentra el desarrollo abierto y estandarizado de producción y comercialización de aceites esenciales e hidrosoles, con base en la riqueza en flora y fauna que existe en el país. Rosmarinus officinalis (Romero) es una planta de amplia distribución geográfica, de la que se han realizado estudios sobre actividad antioxidante y antimicrobiana, tanto de los aceites esenciales y extracto etanólico, en diversas partes del mundo, como de hidrosoles (Ojeda et al 2013). Aunque los hidrosoles, que son un subproducto de la obtención de aceites esenciales por hidrodestilación, tienen actividad antimicrobiana (Sagdic, 2003 y 2013), pero se presentan reportes en relación a concentraciones bajas, lo anterior aumenta el interés sobre el estudio de la actividad antimicrobiana de este subproducto. De otro lado, Taraxacum officinale (Diente de león), es una planta de amplia distribción geográfica, crece comúnmente en pastizales, ya sea en el área rural o urbana y según estudios realizados por Bylka en 2010, posee aceite esencial a partir de flores, sin embargo, no se encuentran reportes de hojas, y su actividad antimicrobiana se ha demostrado sobre ese aceite esencial (Bylka et al 2010), dando lugar a una inquietud sobre el hidrosol obtenido por hidrodestilación sobre su actividad antimicrobiana. Este trabajo tiene como fin, la evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale a partir de hojas, contra bacterias patógenas como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus, con el fin de conocer la capacidad inhibitoria que poseen estos extractos a concentraciones determinadas que generen conocimiento científico sobre estas especies y en un futuro sean una alternativa para aditivos naturales en industrias de alimentos, farmacéutica y de cosméticos asi como en el tratamiento de infecciones, contribuyendo al desarrollo regional. 3. MARCO TEÓRICO 3.1 GENERALIDADES SOBRE METABOLISMO EN PLANTAS

3.1.1 Metabolitos Primarios Los seres vivos, están constituidos sobre una unidad fundamental que es la célula, dicha estructura cumple con funciones básicas como: absorción, respiración, reproducción y terminan 13

su ciclo de vida con la muerte celular, que significa que se pierden las anteriores funciones. El metabolismo es el proceso completo a través del cual los seres vivos adquieren y utilizan energía libre para realizar diversas funciones básicas. (Melo, 2007) Los animales, las plantas, los microorganismos y demás organismos poseen un metabolismo primario necesario para cumplir con las funciones básicas de: crecimiento, desarrollo de órganos, respiración, reproducción entre otros, y para ello emplean los nutrientes de los alimentos o suelo en el caso de las plantas. Dentro de este metabolismo se reconocen sustancias o compuestos que sin ellos no podría funcionar una célula, por ejemplo en vegetales, la ausencia de la ruta metabólica de la fotosíntesis ocasionaría la muerte del espécimen, debido a que no sería posible la formación de compuestos de tipo carbonado, orgánico, necesario para estructuras y funciones básicas. (Sadava, 2008) 3.1.2 Metabolismo Secundario Específicamente para las plantas, el metabolismo primario comprende la producción de carbohidratos a partir de carbono fijado por fotosíntesis o para la formación de estructuras de sostén, la producción de ácidos grasos y ácidos nucleicos necesarios para la división celular. Como indica la palabra primario se refiere a los componentes necesarios para la vida (Bonilla 2011), y en contraste se encuentran los metabolítos secundarios provenientes del metabolismo secundario, es decir, no fundamental en la vida del organismo, de manera que luego de los procesos de crecimiento, se llevan a cabo procesos adicionales de los que se generan compuestos usados como ventajas frente a los demás seres en el ecosistema para su supervivencia en el entorno, y algunos son de interés en el uso de productos naturales (Taiz, 2006). En un ecosistema, coexisten mediante diferentes relaciones interespecíficas: microorganismos, insectos, mamíferos y plantas; los cuales por relaciones de predación en el caso de algunos insectos y animales herbívoros al atacar un individuo vegetal, desencadenan una serie de reacciones dentro de la planta en respuesta a esos estímulo y si bien los cambios medioambientales y nutricionales generan de igual forma una adaptación a dichas condiciones, con la formación de compuestos secundarios, es mucho mas probable que les permitan sobrevivir a las plantas frente a ataqes contra su supervivencia, ya sea por predadores o por cambios en el entorno (Anaya, 2003). Los metabolitos secundarios vegetales, pueden dividirse en tres grupos químicamente diferentes: Terpenos, por la unión de varias unidades de isoprenos por la via del ácido mevalónico luego de degradación de ácidos grasos; fenoles, derivado de la degradación de carbohidratos por la via del ácido shikimico, y compuestos que contienen nitrógeno como los alcaloides, derivado de la degradación de aminoácidos (Taiz, 2006). Los metabolitos secundarios, se creía que no cumplían ninguna función, sin embargo se han identificado que protegen a las plantas de la ingestión por herbívoros y de la infección de patógenos microbianos, de otro lado, contribuyen a la polinización, dispersión de semillas y 14

como factores de competencia planta-planta. (Taiz, 2006) Dichos metabolitos, difieren en cuanto a su distribución en el reino vegetal ya que no están presentes en todos los organismos, solamente los metabolitos primarios quienes son necesarios para el funcionamiento básico del organismo es conservado en las plantas (Celis et al y Sadava, 2008). 3.1.3 Defensa en plantas En la defensa de las plantas se encuentran metabolitos secundarios, estos compuestos son derivados de compuestos menos complejos, sin embargo necesarios para el desarrollo de las plantas como los metabolitos primarios; como dichos compuestos no eran tóxicos para la propia planta y su formación no demandaba mayor gasto de energía, la producción no era extenuante, de modo que plantas con estas características escogidas por selección natural, presentaban una ventaja reproductiva frente a las que no poseían este mecanismo de defensa (Taiz, 2006). Los animales herbívoros son los principales responsables de pérdidas de cosechas, ya sean insectos o mamíferos, sin embargo la evolución trajo consigo un desarrollo de sustancias que favorecen la subsistencia del vegetal, debido a su incapacidad para movilizarse, algunos compuestos son de sabor desagradable que alejan los depredadores, o de alta viscosidad que impiden que los insectos avancen por la planta evitando la destrucción total del individuo. En algunos casos estas propiedades de protección son atribuidas a aceites esenciales o gomas producidos por la planta y que pueden ser aprovechados por el ingenio humano para industrias o aplicaciones medicinales (Celis et al, 2008). La competencia es una relación que se da entre individuos de diferente especie y tiene lugar en un ecosistema diverso, de allí la competencia por luz, y nutrientes de los componentes bióticos, en plantas, por ejemplo la familia de las Piperaceas sintetizan productos naturales o metabolitos secundarios que tienen acción directa sobre el crecimiento de otras plantas, algunas de interés agrícola por ser competencia que retardan cultivos agrícolas de interés; esta propiedad inhibitoria es denominada relación alelopática (Celis et al, 2008), ya que las plantas adyacentes a las siembras, limítan los nutrientes en suelo, por lo que los cultivos no absorben adecuadamente los nutrientes necesarios para la formación de frutas, hortalizas, raíces o tubérculos que generan detrimento en la cosecha en cuanto a tamaño del fruto o al desarrollo de la planta de interés (Anaya, 2003). 3.2. ANTIMICROBIANOS 3.2.1 Generalidades El término antimicrobiano, se refiere a cualquier agente que interfiera con el crecimiento y la actividad de los microorganismos, y dependiendo del grupo de microorganismos sobre los que se ejerza control recibe un nombre específico, asi por ejemplo para las bacterias será bactericida y para hongos, fungicida. (Montoya, 2008).

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Los mecanismos de acción de dichos agentes son diversos, entre los cuales se encuentra la acción bactericida, entendida como la acción mediante la cual se eliminan los microorganismos de una matriz, y en contraste, el término bacteriostático, se refiere únicamente a la supresión del crecimiento y desarrollo bacteriano, de tal modo que mientras el agente antimicrobiano este en contacto con el microorganismo se impide la proliferación. (Montoya, 2008). 3.2.2 Formas de acción Existen diversas clasificaciones de los compuestos que tienen acción inhibitoria sobre bacterias y otros microorganismos, es decir antibióticos, que se clasifican con base en características comunes entre ellos: fuente de obtención, espectro o capacidad de acción, composición química, familias de antibióticos o por carga eléctrica. Los compuestos bactericidas, que inhiben el crecimiento y acaban con la población de microorganismos, pueden ser de dos clases, los que son activos solamente en fase activa de multiplicación bacteriana (crecimiento exponencial), como las penicilinas, cefalosporinas, rifamicinas, fosfomicinas, y las que son activas igualmente sobre bacterias con metabolismo lento como los aminosidos y polimixina-colistina. (De la rosa, 2003) Si se dividen los antimicrobianos por fuente encontramos, hongos y bacterias, dentro de los hongos algunos ejemplos son la penicilina, producida por Penicilium sp., fumagilina, producida por Aspergillus fumigatus o bacteriana por especies de Bacillus sp. como la bacitracina y polimixina-colistina, Otro importante grupo de microorganismos productores de este tipo de compuestos son los actinomicetos, quienes producen una gran cantidad como por ejemplo la estreptomicina (Linares, 2002). Si la clasificación se refiere al lugar de ataque sobre el microorganismo, existen antibióticos que inhiben por diferentes mecanismos como los siguientes: inhiben la síntesis de los mucopéptidos de la pared celular bacteriana, como las penicilinas, cefalosporinas, bacitracina, novobiocina, vancomicina. Si alteran la membrana celular citoplasmática bacteriana, está la anfotericina, bacitracina, canidina, colicina, polimixinas entre otras. Existen antibióticos que inhiben los mecanismos de replicación y transcripción del ARN, como el cloranfenicol, gentamicina, novobiocina, entre otros, sin embargo, por otra parte se encuentran bacterias y microorganismos que poseen ADN, y algunos antibióticos atacan la replicación y transcripción de éstos, como la novobiocina, actidione, polofiromixina. Cuando se atacan específicamente funciones como la síntesis de proteínas, se encuentran las tetraciclinas, streptomicina, spectinomicina, los antimicrobianos que actuan inhibiendo la respiración celular, como la pioacianina o que inhiben la fosforilación oxidativa bacteriana como la rutamicina, colicina; sin embargo como es de observarse hay varios compuestos que tienen diferentes formas de acción como la novobiocina o la bacitracina y están en varios de los grupos de clasificación. (De la Rosa, 2003) Las acciones que poseen los antimicrobianos, lo deben a posiciones y componentes estructurales que le permiten acceder al microorganismo, y algunos se agrupan por especificidad con diferentes formas químicas como las siguientes: Los betalactámicos, en las que se incluyen penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbapenémicos y monobactamas, los cuales comparten 16

en su estructura, la presencia de un enlace betalactamico incorporado a un anillo central de 4 ßLactam, donde su principal modo de acción es la inhibición de síntesis de la pared celular. Anillos adicionales a la estructura o grupos agregados al anillo ß-Lactam determina si el agente es penicilina, cefem, carbapenem, o monobactam. (Koneman 2006). Por otra parte se encuentran los aminoglucósidos, entre los que encontramos la amikacina, netilmicina, tobramicina, gentamicina, estreptomicina y kanamicina, quienes están constituidos por dos o más aminoazúcares unidos por enlaces glucosidicos a un nucleo de hexosa y se diferencian por los amioazúcares unidos al núcleo de hexosa (Linares, 2002). Las quinolonas y fluorquinolonas, son un grupo de antibióticos que poseen un grupo carboxilo en la posición 3 del anillo básico, un sustituyente fluorinado en la posición 8 y muchos tienen un grupo piperazina en la posición 7; algunos ejemplos de estos antimicrobianos son ácido nalidixico, ácido pipemídico, acido oxonílico, en cuanto a quinolonas y para las fluorquinolonas, encontramos ciprofloxacino, norfloxacino, enoxacino aminofloxacino entre otros que no han sido aprobados por la FDA (Linares, 2002). Los glucopéptidos son otro grupo de antimicrobianos entre los que encontramos la vancomicina, y el teicoplanin. Por otra parte se encuentran las tetraciclinas, que son derivados de la naftacenocarboxamida policíclica. El núclo de la molécula esta formada por 4 anillos carboxílicos y cada miembro difiere según la naturaleza de sus sutituyentes, es importante tener en cuenta que este tipo de antimicrobianos han cambiado su potencia y espectro de acción, sobre lo cuál se encuentran diferentes antibióticos pertenecientes a esta familia que son de diversas generaciones, por ello, compuestos como la tetraciclina, clortetraciclina y oxitetraciclina son de primera generación. Otra de las familias de importancia se encuentra la de los macrólidos, que posee un anillo de lactona de muchos miembros al que se unen uno o más deoxiazúcares y ejemplos de este tipo de compuestos se encuentran la metimicina, azitromicina, eritroicina y oleandomicina, entre otros (Linares 2002). A través del desarrollo de la industria farmacéutica, se han generado antibióticos a partir de los primeros ensayos como el realizado por Alexander Fleming, dando lugar a la primera generación de antibióticos. El término generaciones es ampliamente usado en la industria farmacéutica en cuanto a antibióticos se refiere, para resaltar las ventajas de los nuevos antibióticos frente a los anteriores en orden de aparición; por ejemplo, las cefalosporinas de segunda generación aumentan la actividad sobre los estafilococos, las cefalosporinas de tercera generación aumentan la actividad frente a microorganismos Gram negativos y las cefalosporinas de cuarta generación pueden poseer actividad antianaerobia y frente a Pseudomonas aeruginosa. 3.2.3 De la resistencia de los microorganismos a los antibióticos Los microorganismos poseen diversos mecanismos naturales que les permiten resistir a las condiciones de su entorno, a lo que se denomina resistencia intrínseca o natural, dicha resistencia es conservada entre especies de la misma familia, asi por ejemplo es de saberse que la Pseudomonas es resistente a la penicilina o a la vancomicina. Sin embargo, en adicion a lo 17

anterior, los microorganismos son sensibles a otro tipo de antibióticos, que evita su multiplicación o que los elimina por completo, de modo que se dieron mutaciones a nivel genético, y se desarrollaron microorgaismos mutagenicos con capacidad de crecimiento en presencia de los antimicrobianos que antes eran tóxicos para ellos, a esta resistencia se le denomina resistencia adquirida. (Forbes, 2009). Existen diversas vías de resistencia, las siguientes son las frecuentes en cuanto a resistencia enzimática: 1. 2. 3. 4. 5.

Degradacion enzimática o medificación del agente antimicrobiano Disminución de la captación o la acumulación del agente antimicrobiano Alteración del sitio de acción del antimicrobiano Evación de las consecuencias del efecto antimicrobiano Desconexión de las interacciones agente – sitio de acción y de los efectos resultantes sobre el metabolismo bacteriano 6. Cualquier combinación de los anteriores mecanismos (Forbes, 2009) 3.3 PLANTAS CON POTENCIAL ANTIMICROBIANO Estudios llevados a cabo en Turquía (Sagdic et al 2003, 2013) hacen referencia de plantas como la lavanda, que ha mostrado efectividad contra la adherencia de E. coli O157:H7 que es un conocido microorganismo patógeno con un impacto importante sobre la salud de los seres humanos a nivel mundial, debido a que es el agente etiológico causante de intoxicación alimentaria por la producción de verotoxina, generando una infección enterohemorrágica, que ocasionalmente produce falla renal. Recientes estudios como el realizado en Argelia, indicó que plantas del genero Ruta, y sus aceites esenciales han tenido actividad antimicrobiana tanto contra bacterias como contra hongos (Haddouchi et al 2013). Las plantas como orégano, tomillo, laurel, romero, pimienta o azafrán usadas como condimentos poseen compuestos que son de interés, como ácidos orgánicos o aceites esenciales, que proporcionan un agradable sabor y aroma a los alimentos. Dentro de la familia de las Lamiaceas se encuentran especies como el romero (Rosmarinus offcinalis), el orégano (Origanum vulgare) y el tomillo (Thymus vulgaris) que son de interés y se han evaluado sus capacidades tanto antimicrobianas como antioxidantes (Celikas, 2007; Jamshidi, 2009). 3.4. SOBRE LA OBTENCIÓN DE ACEITES ESENCIALES 3.4.1. Definiciones Hidrodestilación, método de separación químco-físico, en el que el material vegetal, su estado puede ser molido, cortado, entero o en diferentes combinaciones, está en contacto con el agua, en el que el uso de vapor de agua saturado a presión atmosférica producido luego de un calentamiento hasta el cambio de estado del agua, se usa para arrastrar el aceite proveniente del 18

material, debido a su comportamiento volátil en las condiciones de temperatura usadas, donde el generador de calor no hace parte del recipiente donde se almacena la materia prima (Cerpa 2007).

Figura 1. Esquema industrial general de la producción de aceites esenciales (Tomado de Cerpa 2007). En el que se evidencia el sistema de funcionamiento en una industria, mostrando que a escala de laboratorio se tienen proporciones diferentes; sin embargo es el mismo principo de acción del método de extracción de aceites esenciales. Arrastre por vapor, se llama al proceso de extracción de aceites esenciales mediante el cual vapor de agua sobrecalentado se inyecta a flujo constante y su presión es superior la atmosférica; sin embargo el vapor que fluye y entra en contacto con el material está presión atmosférica, que es la presión fuera del equipo principal, es decir, a diferencia de la hidrodestilación, el vapor de agua entra por un desprendimientmo lateral del recipiente que contiene el material vegetal y realiza la extracción de los aceites volátiles (Cerpa 2007). Hidrosol, en química significa dilución en agua, del latin hydro que significa agua y sol que significa solución; en ocasiones es usado como sinónimo del hidrolato (Catty 2001), sin embargo para este trabajo se tomó como: sub-producto de la obtención del aceite esencial por el método de hidrodestilación, es el vapor de agua condensado y recogido al final junto con el aceite esencial, es decir es la fracción acuosa de la obtención del aceite esencial. Hidrolato, sub producto, de la ontencion de aceite esencia, también llamado té; es decir, la fracción de agua que está en contacto con el material vegetal sin evaporar (Catty 2001). Agua aromática, Tambien llamado hidrolato, es la fracción que esta en contacto con el material vegetal luego de la obtención del aceite esencial y de hidrosol (Catty 2001). 19

3.4.1. Composición de un aceite esencial Los aceites esenciales e hidrosoles son mezclas homogéneas de compuestos químicos orgánicos, provenientes de una misma familia química los terpenoides (Parry, 1921; Muñoz 2002, Peter, 2004). Estos terpenoides tienen la propiedad en común de generar diversos aromas, en condiciones ambientales son líquidos menos densos que el agua, pero más viscosos que esta, poseen un color amarillo o transparente (Günther, 1948; Teushcer et al., 2005), Los terpenoides son una familia de hidrocarburos oxigenados o no, con uno o varios anillos insaturados y formados de la condensación de isoprenos, donde se encuentran 10 o más carbonos en su estructura. Son inflamables, no tóxicos, inocuos mientras la dosis suministrada no supere los límites de toxicidad. Por otro lado los aceites esenciales son mezclas de compuestos complejos alrededor de 20 a 60 componentes en diferentes proporciones (Cerpa, 2007). Y según Bakkali F, et al (2008), por ejemplo, carvacrol (30%) y timol (27%) son los componentes principales del aceite esencial de Origanum compactum, linalol (68%) del aceite esencial de Coriandrum sativum, 1-γβ-thuyone (57%) y alcanfor (24%) de aceite esencial de la Artemisia herba-alba, 1,8-cineol (50%) del aceite esencial de Cinnamomum camphora, one-felandreno (36%) y limoneno (31%) de la hoja y carvona (58%) y limoneno (37%) del aceite esencial de las semillas de Anethum graveolens, mentol (59%) y mentona (19%) de aceite esencial de Mentha piperita (Mentha =· Piperita) (Bakkali et al 2008). De modo que, son diversos los compuestos y sus proporciones dentro de estas especies vegetales. Los aceites esenciales, son sensibles y pueden sufrir degradación química en presencia de la luz solar, aire, calor, ácidos y álcalis fuerte, son solubles en disolventes orgánicos comunes y casi inmiscibles en disolventes polares asociados como agua o amoniaco (Cerpa, 2007). Tabla 1. Principales estructuras vegetales donde se localiza los productos aromáticos (Bonilla 2011) Estructura celular

Ejemplos

Pelos glandulares

Labiatae, Verbenaceae, Geraniacea

Cavidades esquizógenas (células seoaradas Myrtaceae, Gramineae, asteraceae unas de otras) Canales lisígenos (Espacios resultantes por Rutaceae disolución celular) Canales resinosos

Coniferae

Canales gomosas

Cistaceae, Burseraceae

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3.5 SOBRE LAS PLANTAS A EVALUAR

3.5.1 Romero, Rosmarinus officinalis El romero es un arbusto perenne perteneciente a la familia de las Lamiaceas, en esta familia se encuentra el orégano y la menta. Sus condiciones óptimas de cultivo son de altitud entre 0 a 3000 msnm, con precipitación anual de 250 a 2500 mm, con un pH de suelo de 4,5 a 8,7; crece en suelos arenosos, es decir, suelos secos, y pedregosos y con buen drenaje. (Villamil, 2010). A lo largo de muchos años se ha trabajado tradicionalmente con esta planta en la parte culinaria, sin embargo, en esta última década se han realizado diversos estudios, principalmente en Turquía, mediante investigaciones se ha encontrado que los aceites esenciales como los hidrosoles poseen actividad antimicrobiana (Sadig et al, 2013) y antioxidante (Ojeda et al, 2013). 3.5.2 Diente de león, Taraxacum officinale Esta es una planta perteneciente a la familia Asteraceae, en la que se encuentran las margaritas, los girasoles y la caléndula. Posee una gran capacidad de adaptabilidad, crece en zonas urbanas, en orillas de las carretas y son considerados maleza para los cultivos, se cree que es originaria de Grecia, sin embargo, su aparición es extendida en las diferentes regiones del mundo; dicha planta tiene historia a nivel de tradición oral en el continente europeo, por diferentes beneficios como sus propiedades de regulación hepática, sin embargo en Colombia es considerada en general como maleza. Dentro de sus aplicaciones se encuentra su acción anti-inflamatoria por la presencia de sesquiterpen lactonas (Williams et al 1995), actividad antioxidante (Hu et al 2005), protección contra lipopolisacárido inducido por lesión pulmonar en ratones (Liu et al 2010) también posee βsitosterol y β-cumarina usados para tratar disminuir colesterol en sangre y disminuir problemas cardiacos (Simandi et al 2002).

3.6 DE LOS MICROORGANISMOS A EVALUAR Los microorganismos poseen diversos mecanismos que generan interés y a nivel industrial tienen un amplio potencial, para el desarrollo de nuevos productos, sin embargo solo un pequeño porcentaje de los microorganismos son patógenos, generando problemas a nivel sanitario. Las enfermedades infecciosas son causadas por microorganismos entre los que se distinguen 4 grupos; los virus, los parásitos, los hongos y las bacterias. Las bacterias están presentes constantemente en los seres vivos, y, en los humanos, se estima que 3 kilogramos aproximadamente de nuestro peso corporal son bacterias, ya que ellas viven en piel, en la capa externa, en el tracto digestivo, y algunas son eliminadas en la evacuación.

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Los primeros, son altamente incidentes en infecciones como la gripe, asociados a cáncer, como el de cuello uterino o a enfermedades graves y difíciles de controlar como el VIH/SIDA. Los parásitos, generan actualmente preocupaciones sobre todo en lugares donde no se tiene acceso a agua potable y alcantarillado o en zonas endémicas como las selvas de las Americas donde está presentes la malaria y la enfermedad de chagas. Las bacterias son los microorganismos sobre los que se trabaja habitualente y de los que se tienen mayores reportes de resistencia a antibioticos, y los hongos que son microorganismos eucariotas sobre los que se tiene interés por su potencial biotecnológico, además de ser causantes de pérdidas en cultivos, cuando son fitopatógenos u oportunistas en algunas infecciones dadas en mamíferos. Los microorganismos evaluados en el presente estudio se encuentran en el grupo de los procariotas, teniendo en cuenta los microorganismos de diferentes características, Gram positivas y negativas, fermentadoras y no fermentadoras de glucosa, de forma bacilar, cocobacilar y cocos. 3.6.1 Escherichia coli Un representante de interés tanto alimentario como sanitario es la presencia de Escherichia coli, este microorganismo es Gram negativo, perteneciente a la familia de las enterobacterias, es el representante del grupo de los coliformes, y es constituyente de la flora intestina normal de los seres humanos, por ello su clasificación familiar, sin embargo cuando se encuentra en un lugar inadecuado, es decir fuera del intestino, puede generar infecciones como lo que ocurre en las urinarias, generadas por este microorganismo (Koneman, 2008); no es un microorganismo muy exigente de modo que es cultivable en un medio básico con fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo. Esta relacionado con meningitis en neonatos, con manifestaciones normales de infección en diichos pacientes, septicemia e infecciones (Baker, 2009). 3.6.2 Pseudomonas aeruginosa Este microorganismo es un bacilo Gram negativo, no fermentador de lactosa, es causante de infecciones en pabellones de quemados, pacientes con fibrosis quística, leucemia aguda, transplantes de órganos y adicción a drogas intravenosas, también en un fenómeno denominado “oído de nadador”. Al igual que E. coli genera infecciones unrinarias y respiratorias (Koneman, 2008). Causa frecuente de neumonía asociada con cuidados asistenciales en adultos, se encuentra en las heridas quirúrgicas asociadas a cuidados asistenciales. (Baker, 2009). 3.6.3 Bacillus cereus Este microorganismo posee un gran impacto a nivel de salud pública y por estar relacionado en intoxicaciones en alimentos por la producción de toxina exogénica (Koneman, 2008). Forma estructuras de resistencia, como esporas, que sobreviven en los alimentos, usándolos como vehículos para el ingreso al sistema digestivo.

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3.6.4 Staphylococcus aureus Éste microorganismo esta involucrado en infecciones de importancia a nivel clínico, y es de evaluación constante en la industria de alimentos. Uno de los fenómenos que le ocurren a los microorganismos es la resistencia adquirida frente a los antibióticos de uso común para el tratamiento de infecciones, es el caso de los S. aureus meticilín resistentes, que han generado preocupación desde la OMS.Los factores de riesgo para las infecciones graves por S. aureus son enfermedades crónicas como diabetes mellitus y cirrosis, inmundeficiencias, trastornos nutricionales, cirugía y trasplantes.

4. OBJETIVOS 4.1 General Evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale contra Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. 4.2 Específicos  



Obtener aceites esenciales e hidrosoles a partir de hojas tanto de Rosmarinus officinalis y de Taraxacum officinale. Determinar parámetros fisicoquímicos de densidad, absorbancia en UV-visible y composición mediante GC/MS, de los aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale. Determinar la concentración mínima inhibitoria de los aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale.

5. METODOLOGÍA



Colecta del material vegetal

Las plantas de Rosmarinus officinalis (Romero) se recolectaron a las afueras de Bogotá en Chía (Cundinamarca), de enero a mayo del 2013 y Taraxacum officinale (Diente de León), en la localidad de Kennedy de Bogotá, en el barrio la Floresta Sur, entre los meses de febrero a mayo de 2013. Para realizar la recolección de las plantas se tuvo en cuenta que estuvieran frescas, sin signos de enfermedades evidentes como pigmentos café, amarillos u oscuros en las hojas, presencia de hojas sin flores para Taraxacum officinale. Seguido de esto se llevaron al Herbario de la universidad Nacional de Colombia, con certificado de identificación de las plantas y corrobora su clasificación taxonómica, de Taraxacum officinale, voucher No COL. 568243. 23



Obtención de aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale por medio de la técnica de hidrodestilación.

Los aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale fueron obtenidos por medio de la técnica de hidrodestilación, con el uso de un aparato de Clevenger. Aproximadamente 300 g de cada planta, fueron colocados en un balón de 5 L y fueron adicionados 1000 mL de agua destilada por cada 100 gramos de material. La mezcla fue calentada a temperatura constante de 93-95°C durante 3 horas de extracción, los aceites esenciales e hidrosoles se separararon por diferencia de densidades. Los extractos obtenidos se depositaron en frascos color ámbar, los cuales se rotularon y almacenaron a 4º C, hasta su evaluación (Cerpa, 2007). 

Determinación de parámetros fisicoquímicos de los aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale.

Para determinar la densidad, en los hidrosoles, se empleó un picnómetro de 10mL, mientras que para el caso del aceite esencial, se pesó en viales de 0,5mL adicionando diferentes volúmenes en microlitros y con base en su relación masa/volumen se determinó la densidad del aceite. Adicional a lo anterior, para los hidrosoles por medio de la técnica de extracción por microgota bajo la interacción con dos solventes: hexano y diclorometano, se realizó la extracción con volúmenes de 50µL, 100 µL y 150 µL en 5 mL de hidrosol durante diferentes periodos de tiempo: 10, 15 y 30 segundos en vortex a 3000rpm. La identificación de los compuestos químicos fue realizado, en un cromatógrafo de gases acoplado un espectrómetro de masas (GC/MS), 6850 Series II / 5975B (Agilent Tech., USA). Usando una columna capilar de sílice fundida (fase estacionaria): HP-5MS (Agilent Tech., USA), de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm. El GC/MS fue operado bajo condiciones programadas de temperatura, y consistió en 50°C por 1 minuto y desde 50° hasta 250°C a 8°C/min, y de 250°C a 300°C a 35°C/minuto. El gas portador fue helio, con un caudal de 1,2 mL/min. La temperatura del inyector fue 250ºC. Los parámetros del detector selectivo de masas (MSD), incluyeron un rango de masas de 40 a 350 uma. 

Identificación de la capacidad antimicrobiana de los aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale.

Para identificar la capacidad antimicrobiana de los hidrosoles de romero y de diente de león, además del aceite esencial de romero, se pesaron 10 mg de aceite esencial, en un balón aforado de 10mL para generar una solución stock de 1000 ppm, el solvente usado fue diclorometano. A partir de la anterior concentración se realizaron 3 tratamientos con 3 concentraciones diferentes para cada extracto de 1, 10 y 100 ppm (Farmacopea, 2008) y se evaluaron mediante un ensayo por difusión en disco de papel (Whatman N.1) de 0.5 cm de diámetro, se tomaron 3 controles (agua desionizada, cloranfenicol para S. aureus, B. cereus y E. coli, para S. aeruginosa se utilizó estreptomicina y diclorometano para todas las evaluaciones). Los discos, 3 por cada tratamiento, 24

se situaron en una caja de Petri, la cual ya había sido inoculada (Masivo) con la bacteria correspondiente (S. aureus ATCC 25923, B. cereus ATCC 10876, P. aeruginosa CMPUJ 055 y E. coli ATCC 5789) a una concentración de 3x108 UFC/mL. Las cajas de Petri primero tuvieron un tratamiento over nigth a 4°C de 12 horas y posteriormente, un tiempo de incubación a 37°C por 12 horas. Cada prueba tuvo tres repeticiones y tres réplicas en el tiempo. La lectura se realizó a las 24 horas luego del tratamiento completo, midiendo el halo de inhibición de las bacterias.

6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis estadístico se evaluó mediante el cálculo del valor medio, teniendo en cuenta la desviación estándar entre los datos, de 3 ensayos independientes.

7. RESULTADOS Al realizarse la hidrodestilación de las hojas frescas de Rosmarinus officinalis se obtuvo aceite esencial con un rendimiento de 0.594 % ± 0.047mL/g, junto con hidrosol de aproximadamente 100mL en las 3 horas de tratamiento; por otro lado al realizarse la hidrodestilación para Taraxacum officinale no se obtuvo aceite esencial a partir de las hojas, sin embargo se obtuvo 150 mL de hidrosol. El pH en el hidrosol de romero fue de 6.8 y de diente de león fue de 6.7. La densidad del aceite esencial de romero fue de 0.881 ± 0.016 g/mL, la densidad del hidrosol de romero fue de 0.9955 ± 0.00098 g/mL y la densidad del hidrosol de diente de león fue de 0.9953 ± 0.00065 g/mL (Anexos 1, 2 y 3). En el análisis realizado por cromatografía de gases acoplado a masas del aceite esencial de romero, se encuentran compuestos como camfor, camfeno, alfa pipeno, entre otros que se evidencian en la tabla 2. Para el análisis realizado a los hidrosoles por medio de la técnica de extracción por microgota, se realizó la detección de compuestos. Anterior a las extracciones con solventes de los hidrosoles de cada una de las plantas, se realizó una evaluación de los compuestos obtenidos en el aceite esencial, en la tabla 2 se evidencian dichos compuestos. Se realizó la extracción de compuestos afines con los solventes usados a partir de los hidrosoles de romero y diente de león, con hexano y diclorometano mediante la técnica de microgota. En la tabla 2, se encuentran compuestos comunes extraidos por los dos solventes, en el hidrosol de romero como el eucaliptol, vervenona, y camfor que son componentes mayoritarios. Para el hidrosol de diente de león solo un compuesto cumplió con el criterio de coincidencia de más del 90%, llamado elemol.

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Tabla 2. Compuestros presentes en el aceite esencial e hidrosol de Rosmarinus officinalis, mediante el análisis por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas. Aceite esencial de Romero

Hidrosol de Romero

Porcentaje de abundancia

Porcentaje de correlación con bibliotecas*

Porcentaje de abundancia

Porcentaje de correlación con bibliotecas*

Camfor

22.21%

98%

30.3%

98%

Eucaliptol

17.9%

96%

27.1%

99%

α-pineno

9,7%

97%

-

-

Camfeno

7.86%

97%

-

-

β-pineno

7.17%

97%

-

-

Bornil acetato

4.38%

98%

0.183%

98%

Borneol

4.26%

90%

5.3%

91%

α-pelandreno

2,2%

91%

-

-

γ-Terpineno

2.1%

95%

-

-

Verbenona

1.84%

98%

30.88%

98%

α-Terpineol

1.43%

90%

1.95%

90%

(+)4-careno

1.23%

97%

-

-

α-Cariofinelo

0.85%

99%

-

-

Cis-β-Terpineol

0.6%

97%

-

-

Geraniol

-

-

1.16%

93%

Linalol

-

-

1.1%

90%

Compuesto

* Biblioteca Nist5 y Wiley7 Los valores resaltados corresponden a compuestos comúnes entre el hidrosol y el aceite esencial. Luego de la realización de los ensayos correspondientes a los diferentes tiempos y volúmenes de solvente, se encuentra que con 150 µL y 30 segundos en el vortex a 3000rpm es donde se obtiene una gota estable para ser analizados los compuestos presentes en ésta, por cromatografía de gases 26

acoplada a espectrofotometría de masas, dicho pocedimiento se realizó en un cromatógrafo de gases acoplado un espectrómetro de masas (GC/MS), 6850 Series II / 5975B (Agilent Tech., USA). Usando una columna capilar de sílice fundida (fase estacionaria): HP-5MS (Agilent Tech., USA), de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm. En la figura 2 se evidencia la comparación entre los compuestos encontrados en el hidrosol de romero con los dos solventes luego del uso de la técnica de extracción por microgota. Es importante resaltar que todos los compuestos que se evidencian en la tabla 2 cumplieron con el criterio de coincidencia superior al 90% teniendo en cuenta las bases de datos del equipo, bibliotecas Nist5 y Wiley7, usadas. Se realizó la comparación entre los compuestos obtenidos en cuanto a proporción por muestra, de cada uno de los solventes utilizados.

Figura 2. Comparación entre los compuestos obtenidos luego de la extracción por microgota en hidrosol de romero con diclorometano (negro) y hexano (azul). En el eje independiente se encuentra el tiempo (minutos) en condiciones generales y en el eje dependiente la abundancia del compuesto en la muestra. Es importante resaltar que no todos los compuestos que se evidencian en la tabla 2, cumplieron con el criterio de coincidencia superior al 90% teniendo encuenta la base de datos del equipo usado, y se evidencia que corresponden a los mismos compuestos extraídos en cada uno de los solventes usados.

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8. DISCUSIÓN La medición de la densidad del aceite esencial es inferior a la del agua medida que fue de 0,999 g/mL, respecto a la del aceite esencial de romero que fue de 0.881 ± 0.016 g/mL. Para la densidad de los hidrosoles, se encuentra una correlación con la matriz, dando como resultado la densidad del hidrosol de romero fue de 0.9955 ± 0.00098 g/mL y la densidad del hidrosol de diente de león fue de 0.9953 ± 0.00065 g/mL. La técnica de extracción por microgota ha comenzado a ser una alternativa económica y eficaz para identificar presencia de compuestos de interés (Farajzadeh et al 2013; Kaykhaii 2013); y se uso para determinar los compuestos presentes en la gota de cada uno de los solventes. Las características de los solventes. La tabla 2 muestra los compuestos que están presentes tanto en el aceite esencial como en el hidrosol del romero, siendo los siguientes: el camfor, bonil acetato y la verbenona. Mediante el análisis por cromatografía se encuentran 3 compuestos mayoritarios mostrados en la tabla 2, y que en el hidrosol fueron encontrados bajo las mismas condiciones de evaluación con hexano y diclorometano, dichos compuestos según Bakkali et al (2008) y Ojeda et al (2013), son componentes mayoritarios del aceite esencial; de allí su aparición en el hidrosol. Los resultados encontrados para hidrosol de diente de león mediante diclorometano y hexano solo refieren un resultado y es la extracción de un compuesto llamado elemol que apenas alcanzó al 91% de coincidencia con la base de datos del equipo, sin embargo ni su porcentaje en la muestra ni su porcentaje de asertividad fueron notables. Los aceites esenciales están compuestos por monoterpenos y son producto del metabolismo secundario de las plantas y está sujeto a las condiciones del medio ambiente ya que su producción esta relacionada con las condiciones adversas de crecimiento por tal razón se debe tener en cuenta las condiciones medio ambientales a las que se encuentre sometido el organismo (Bonilla, 2011). Por otro lado las condiciones nutricionales que aporta el suelo son parte importante del desarrollo vegetal; altas concentraciones de nitrógeno aumenta la susceptibilidad de las plantas a las enfermedades ya que causa una alta demanda de carbono dejando poco para la síntesis de metabolitos secundarios (Arauz, 1998), teniendo en cuenta lo anterior, este tipo de variables son de gran impacto por lo que en la medida de lo posible, evaluarlas daría un mayor control sobre los metabolitos secundarios. En cuanto a los componentes del aceite esencial del romero, éstos pueden cambiar su proporción o tipo, de una variedad a otra o en plantas de la misma especie y especialmente cercanas. Estudios relacionados con este fenómeno, sobre dos variedades de romero en las que variaban las proporciones de compuestos presentes en los aceites esenciales, realizado por Ojeda et al (2013). Los aceites típicos de romero tienen componentes como borneol y verbenona (Bradley 2006), en plantas de Turquia, Túnez e Italia el 1,8-cineol está alrededor del 40% del aceite, se encuentra en menor medida en Francia, España y Grecia junto a α-pineno y camfor. 28

Respecto a la actividad antimicrobiana del aceite esencial y de los hidrosoles de romero es atribuido a las condiciones específicas de crecimiento y desarrollo del vegetal, ya que bajo las condiciones del ensayo no se evidenciaron resultados concluyentes. Cambios climáticos, nutricionales y genéticos son factores determinantes en las características de los metabolitos secundarios, ya que se encuentran variaciones significativas (Ojeda 2013), en cuanto a composición de los aceites esenciales de R. officinalis relacionado con las ubicaciones geográficas (Ojeda 2013), y en adición otras variables como el tiempo de cosecha, la etapa de desarrollo de las plantas, el método de extracción y las metodologías utilizadas para evaluar sus actividades biológicas generan variaciones en los resultados. (Ojeda, 2013; Burt, 2004; Celikas et al 2007; Jamshidi, Afzali y Afzali, 2009; Okoh, Sadimenko, y Afolayan, 2010; Zaouali, Bouzaine, y Boussaid 2010). Por otra parte las concentraciones sobre las que se ha reportado actividad para el caso del aceite esencial, está relacionado con relaciones de 0.4 a 40 µL /mL que representa un rango de 3524 ppm a 35240 ppm (Ojeda 2013); siendo esta una concentración muy superior a la requerida por la farmacopea debido a que puede causar toxicidad, de manera que si la aplicación de aceite esencial como conservante potencial en la industria de alimentos, es de gran importancia evidenciar que a una menor concentración de compuesto con una acción inhibitoria similar a la presentada por un conservante químico, se genera un mayor interés por su obtención e investigación (Farmacopea, 2008). De la planta de diente de león, según la investigación realizada por Astafieva A et al (2012), se encuentra la determinación de péptidos con presencia de puentes disulfuro ubicados en las flores del vegetal, y al ser evaluado genera inhibición de crecimiento de microorganismos, en contraste con lo anterior, en el presente estudio se tomaron principalmente hojas como órganos a evaluar, a fin de tener diferencias entre los metabolitos acumulados en la planta, se realizaron ensayos en hojas de Taraxacum officinale en dos estadios, en etapa de no florecimiento y en etapa de florecimiento, a fin de evaluar si el estadio influía sobre la obtención del aceite, concluyendo que afectaba en las características de olor del subproducto, hidrosol, sin embargo no se encontraba aceite esencial en dicho órgano. Con base a las pruebas toxicológicas es necesario realizarse una evaluación de las concentraciones actualmente aprobadas para la implementación de romero como aditivo regular en alimentos y cosméticos, ya que el uso constante de romero es tóxico, por lo que representa un riesgo para la salud (Bakkali 2008). Se hace necesario realizar un estudio interrelacionado entre las condiciones ambientales, otros métodos de evaluación de actividad antimicrobiana. 8. CONCLUSIONES. Al obtener aceite esencial de romero e hidrosoles de diente de león y de romero, se encuentra que no hay aceite esencial en las hojas de diente de león. La técnica de microgota es una gran opción para la identificación de compuestos naturales, y su composición química; encontrando que en

29

comparación entre los dos solventes el diclorometano, tiene una mayor capacidad de extracción a las condiciones dadas en el ensayo y por los componentes que se encuentran en dicho extracto. Respecto a la actividad antimicrobiana, mediante las concentraciones de ensayo a las que se sometiéron los microorganismos, no hay una respuesta de inhibición. 9. RECOMENDACIONES. Debido a la importancia de las condiciones de crecimiento de las plantas, se sugiere que con base en la asociación empresa- universidad, que ampara el proyecto, se recolecten los especímenes con base en un tipo de recolección y a fin de controlar las variables para asegurar una población homogénea de prueba, además de tener encuenta si hay una aplicación industrial de estos resultados sean lo mayormente controlables. De otro lado se recomienda realizar una comparación entre el método de pozos y el de difusión en agar con el fin de generar una visión más completa sobre la reacción de los extractos respecto a las diferentes condiciones de ensayo, como los componentes del medio y las diferencias entre las reacciones de los microorganismos, así como incluir hongos como microorganismos a evaluar. Y finalmente modificar condiciones con el fin de identificar los compuestos de aceite esencial e hidrosol de Taraxacum officinale. 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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34

ANEXOS Anexo 1. Datos para determinación de densidad del aceite esencial. Determinación de Densidad ACEITE ESENCIAL Romero Replica 1

Replica 2

Replica 3

Peso Densidad Peso Densidad Peso Densidad (mg) ul AE (mg/ul) (mg) ul AE (mg/ul) (mg) ul AE (mg/ul) 9.6 10 0.960 8.5 10 0.850 9.2 10 0.920 18.8 20 0.940 17.7 20 0.885 17.5 20 0.875 27.4 30 0.913 26.4 30 0.880 26.1 30 0.870 36.5 40 0.913 34.9 40 0.873 35.1 40 0.878 44.1 50 0.882 44.2 50 0.884 43.7 50 0.874 52.7 60 0.878 52.7 60 0.878 52.3 60 0.872 60.9 70 0.870 61.8 70 0.883 59.6 70 0.851 70.1 80 0.876 70.5 80 0.881 67.3 80 0.841 78.8 90 0.876 79.5 90 0.883 75.9 90 0.843 87.2 100 0.872 87.2 100 0.872 84.3 100 0.843

Promedio

Densidad definitiva

0.910 0.900 0.888 0.888 0.880 0.876 0.868 0.866 0.867 0.862

DS

%CV

0.056 0.035 0.023 0.022 0.005 0.004 0.016 0.022 0.021 0.017

6.118 3.889 2.556 2.456 0.601 0.439 1.820 2.516 2.445 1.942

0.881 0.016 1.788

Anexo 2. Datos para la determinacion de la densidad de los hidrosoles, tanto de Romero como de diente de león. Determinación de densidad de Hidrosoles Tiempo total de destilación 40°C T cte

2h30min

Romero Picnometro (ml) 0.025ml error

Peso (g) Densidad Peso (g) 9.9839 0.9984 9.9814 9.9558 0.9956 9.9647 9.9107 0.9911 9.9433 9.9606 0.9961 9.9765 9.9600 0.9960 9.9416 9.9650 0.9965 9.9543 9.9509 0.9951 9.9538 9.9778 0.9978 9.9451 9.9544 0.9954 9.9372 9.9637 0.9964 9.9407

10

Densidad (mg/ul) Peso (g) Densidad Promedio 0.9981 9.9320 0.9932 0.9966 0.9965 9.9436 0.9944 0.9955 0.9943 9.9552 0.9955 0.9936 0.9977 9.9760 0.9976 0.9971 0.9942 9.9534 0.9953 0.9952 0.9954 9.9482 0.9948 0.9956 0.9954 9.9589 0.9959 0.9955 0.9945 9.9669 0.9967 0.9963 0.9937 9.9480 0.9948 0.9947 0.9941 9.9585 0.9959 0.9954

DS 0.00293 0.00106 0.00230 0.00090 0.00093 0.00085 0.00041 0.00167 0.00087 0.00121

%CV 0.293700 0.106411 0.231859 0.090652 0.093669 0.085420 0.040686 0.167114 0.087400 0.121169

0.9955

0.00098

0.098757

Densidad Definitiva

35

Tiempo total de destilación 40°C Tcte

Picnometro Diente (ml) de león 0.025ml error

2h30min

Peso (g) Densidad 9.9467 0.9947 9.9607 0.9961 9.9488 0.9949 9.9474 0.9947 9.9514 0.9951 9.9627 0.9963 9.9406 0.9941 9.9483 0.9948 9.9618 0.9962 9.9481 0.9948

Peso (g) 9.9586 9.9349 9.9547 9.9655 9.9646 9.9577 9.9638 9.9502 9.9462 9.9517

Densidad (mg/ul) 0.9959 0.9935 0.9955 0.9966 0.9965 0.9958 0.9964 0.9950 0.9946 0.9952

10

Peso (g) Densidad Promedio DS %CV 9.9703 0.9970 0.99585 0.00118 0.11849 9.9311 0.9931 0.99422 0.00161 0.16199 9.9216 0.9922 0.99417 0.00177 0.17759 9.9527 0.9953 0.99552 0.00093 0.09347 9.9624 0.9962 0.99595 0.00071 0.07101 9.9286 0.9929 0.99497 0.00184 0.18508 9.9739 0.9974 0.99594 0.00171 0.17144 9.9609 0.9961 0.99531 0.00068 0.06825 9.9597 0.9960 0.99559 0.00085 0.08503 9.9644 0.9964 0.99547 0.00086 0.08602 Densidad Definitiva

0.9953 0.00065 0.06570

Anexo 3. Datos recolectados para rendimiento

Datos de rendimientos Peso de material vegetal (g)

310 472.4 250 500

mL de aceite obtenidos

% de rendimiento

Promedio

2 0.64516129 2.5 0.52921253 1.5 0.6 3

0.594

0.6

36

Desviación Estándar

%CV

0.04791045 8.07125579

Anexo 4. Evaluación de la actividad anrtimicrobiana Escherichia coli.

a.

Control de solventes y de sensibilidad de la cepa

b. Evaluación de las 3 concentraciones de hidrosol

d. Evaluación de las 3 concentraciones de hidrosol de diante de león c. Evaluación de las 3 concentraciones de aceite esencial

37

Pseudomonas aeruginosa.

a.

c.

Control de solventes y de sensibilidad de la cepa

b.

Evaluación de las 3 concentraciones de aceite esencial

Evaluación de las 3 concentraciones de hidrosol de romero

d. Evaluación de las 3 concentraciones de hidrosol de diente de león

38

Bacillus cereus

a.

Control de solventes y de sensibilidad de la cepa

c.

Evaluación de las 3 concentraciones de aceite esencial

b.

Evaluación de las 3 concentraciones de hidrosol de romero

d. Evaluación de las 3 concentraciones de hidrodol de Diente de león

39

Staphylococcus aureus

a.

d.

b.

Control de solventes y de sensibilidad de la cepa

Evaluación de las 3 concentraciones de hidrosol de romero

d. Evaluación de las 3 concentraciones de hidrodol de Diente de león

Evaluación de las 3 concentraciones de aceite esencial

40

ANEXO 2 CARTA DE AUTORIZACIÓN DE LOS AUTORES (Licencia de uso) Bogotá, D.C., Señores Biblioteca Alfonso Borrero Cabal S.J. Pontificia Universidad Javeriana Cuidad Los suscritos: Adriana Marcela Ramos Pencue

, con C.C. No , con C.C. No , con C.C. No

1018442906

En mi (nuestra) calidad de autor (es) exclusivo (s) de la obra titulada: Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale frente a microorganismos patógenos (por favor señale con una “x” las opciones que apliquen) Tesis doctoral Trabajo de grado X Premio o distinción: Si No X cual: presentado y aprobado en el año 2014 , por medio del presente escrito autorizo a la Pontificia Universidad Javeriana para que, en desarrollo de la presente licencia de uso parcial, pueda ejercer sobre mi (nuestra) obra las atribuciones que se indican a continuación, teniendo en cuenta que en cualquier caso, la finalidad perseguida será facilitar, difundir y promover el aprendizaje, la enseñanza y la investigación. En consecuencia, las atribuciones de usos temporales y parciales que por virtud de la presente licencia se autorizan a la Pontificia Universidad Javeriana, a los usuarios de la Biblioteca Alfonso Borrero Cabal S.J., así como a los usuarios de las redes, bases de datos y demás sitios web con los que la Universidad tenga perfeccionado un convenio, son: AUTORIZO (AUTORIZAMOS) 1. La conservación de los ejemplares necesarios en la sala de tesis y trabajos de grado de la Biblioteca. 2. La consulta física (sólo en las instalaciones de la Biblioteca) 3. La consulta electrónica – on line (a través del catálogo Biblos y el Repositorio Institucional) 4. La reproducción por cualquier formato conocido o por conocer 5. La comunicación pública por cualquier procedimiento o medio físico o electrónico, así como su puesta a disposición en Internet 6. La inclusión en bases de datos y en sitios web sean éstos onerosos o gratuitos, existiendo con ellos previo convenio perfeccionado con la Pontificia Universidad Javeriana para efectos de satisfacer los fines previstos. En este evento, tales sitios y sus usuarios tendrán las mismas facultades que las aquí concedidas con las mismas limitaciones y condiciones

SI

NO

X X X X X

X

De acuerdo con la naturaleza del uso concedido, la presente licencia parcial se otorga a título gratuito por el máximo tiempo legal colombiano, con el propósito de que en dicho lapso mi (nuestra) obra sea explotada en las condiciones aquí estipuladas y para los fines indicados, respetando siempre la titularidad de los derechos patrimoniales y morales correspondientes, de PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Junio de 2013

1

acuerdo con los usos honrados, de manera proporcional y justificada a la finalidad perseguida, sin ánimo de lucro ni de comercialización. De manera complementaria, garantizo (garantizamos) en mi (nuestra) calidad de estudiante (s) y por ende autor (es) exclusivo (s), que la Tesis o Trabajo de Grado en cuestión, es producto de mi (nuestra) plena autoría, de mi (nuestro) esfuerzo personal intelectual, como consecuencia de mi (nuestra) creación original particular y, por tanto, soy (somos) el (los) único (s) titular (es) de la misma. Además, aseguro (aseguramos) que no contiene citas, ni transcripciones de otras obras protegidas, por fuera de los límites autorizados por la ley, según los usos honrados, y en proporción a los fines previstos; ni tampoco contempla declaraciones difamatorias contra terceros; respetando el derecho a la imagen, intimidad, buen nombre y demás derechos constitucionales. Adicionalmente, manifiesto (manifestamos) que no se incluyeron expresiones contrarias al orden público ni a las buenas costumbres. En consecuencia, la responsabilidad directa en la elaboración, presentación, investigación y, en general, contenidos de la Tesis o Trabajo de Grado es de mí (nuestro) competencia exclusiva, eximiendo de toda responsabilidad a la Pontifica Universidad Javeriana por tales aspectos. Sin perjuicio de los usos y atribuciones otorgadas en virtud de este documento, continuaré (continuaremos) conservando los correspondientes derechos patrimoniales sin modificación o restricción alguna, puesto que de acuerdo con la legislación colombiana aplicable, el presente es un acuerdo jurídico que en ningún caso conlleva la enajenación de los derechos patrimoniales derivados del régimen del Derecho de Autor. De conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, “Los derechos morales sobre el trabajo son propiedad de los autores”, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. En consecuencia, la Pontificia Universidad Javeriana está en la obligación de RESPETARLOS Y HACERLOS RESPETAR, para lo cual tomará las medidas correspondientes para garantizar su observancia. NOTA: Información Confidencial: Esta Tesis o Trabajo de Grado contiene información privilegiada, estratégica, secreta, confidencial y demás similar, o hace parte de una investigación que se adelanta y cuyos resultados finales no se han publicado. Si No X En caso afirmativo expresamente indicaré (indicaremos), en carta adjunta, tal situación con el fin de que se mantenga la restricción de acceso. NOMBRE COMPLETO Adriana Marcela Ramos Pencue

No. del documento de identidad 1018442906

FIRMA

FACULTAD: Ciencias Básicas PROGRAMA ACADÉMICO: Microbiología Industrial

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ANEXO 3 BIBLIOTECA ALFONSO BORRERO CABAL, S.J. DESCRIPCIÓN DE LA TESIS O DEL TRABAJO DE GRADO FORMULARIO TÍTULO COMPLETO DE LA TESIS DOCTORAL O TRABAJO DE GRADO

Evaluación de la actividad antimicrobiana de aceites esenciales e hidrosoles de Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale frente a microorganismos patógenos SUBTÍTULO, SI LO TIENE

Apellidos Completos Ramos Pencue

AUTOR O AUTORES

Nombres Completos Adriana Marcela

DIRECTOR (ES) TESIS O DEL TRABAJO DE GRADO Apellidos Completos Nombres Completos Sequeda Castañeda Luis Gonzalo

Pregrado X

FACULTAD Ciencias PROGRAMA ACADÉMICO Tipo de programa ( seleccione con “x” ) Especialización Maestría

Doctorado

Nombre del programa académico Microbiología Industrial Nombres y apellidos del director del programa académico Janeth del Carmen Arias Palacios TRABAJO PARA OPTAR AL TÍTULO DE: Microbióloga Industrial PREMIO O DISTINCIÓN (En caso de ser LAUREADAS o tener una mención especial): CIUDAD

AÑO DE PRESENTACIÓN DE LA TESIS NÚMERO DE PÁGINAS O DEL TRABAJO DE GRADO Bogotá D.C. 2014 40 TIPO DE ILUSTRACIONES ( seleccione con “x” ) Tablas, gráficos y Dibujos Pinturas Planos Mapas Fotografías Partituras diagramas X SOFTWARE REQUERIDO O ESPECIALIZADO PARA LA LECTURA DEL DOCUMENTO Nota: En caso de que el software (programa especializado requerido) no se encuentre licenciado por la Universidad a través de la Biblioteca (previa consulta al estudiante), el texto de la Tesis o Trabajo de Grado quedará solamente en formato PDF.

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1

MATERIAL ACOMPAÑANTE TIPO

DURACIÓN (minutos)

CANTIDAD

FORMATO CD

DVD

Otro ¿Cuál?

Vídeo Audio Multimedia Producción electrónica Otro Cuál? DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVE EN ESPAÑOL E INGLÉS Son los términos que definen los temas que identifican el contenido. (En caso de duda para designar estos descriptores, se recomienda consultar con la Sección de Desarrollo de Colecciones de la Biblioteca Alfonso Borrero Cabal S.J en el correo [email protected], donde se les orientará). ESPAÑOL INGLÉS

Rosmarinus officinalis, Taraxacum officinale, Actividad antimicrobiana Hidrodestilación CMI, CMT

Rosmarinus officinalis, Taraxacum officinale, antimicrobial activity, hydrodistilation, CMI, CMT

RESUMEN DEL CONTENIDO EN ESPAÑOL E INGLÉS (Máximo 250 palabras - 1530 caracteres)

Resumen Este trabajo se realizó amparado bajo el proyecto: Desarrollo de alternativas de conservación en productos fitoterapéuticos 100% naturales, financiado por COLCIENCIAS, con el fin de observar y determinar el efecto antimicrobiano de aceites esenciales e hidrosoles a partir de dos especies vegetales: Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale contra Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, proporcionadas por el cepario de bacterias de la facultad de Ciencias de Pontificia Universidad Javeriana. Rosmarinus officinalis o comúnmente llamado romero, es una planta ampliamente distribuida en las tierras del mediterráneo, Turquía y en el continente Americano. Los aceites esenciales de esta planta han sido investigados, tanto su actividad antimicrobiana como antioxidante, sin embargo existe un subproducto derivado de la obtención del aceite esencial por hidrodestilación, sobre el cual hay gran interés, el hidrosol. El diente de león es una planta que al igual que el romero, tiene amplia distribución, y posee diversos usos a nivel de medicina tradicional, con diversas aplicaciones tanto gastronómicas como medicinales. El objetivo de este trabajo fue la evaluación antimicrobiana de los hidrosoles y aceites esenciales de Rosmarinus officinalis y de Taraxacum officinale contra 4 bacterias patógenas: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus. El aceite esencial obtenido del romero, se extrajo a partir de hojas de la planta durante 3 horas mediante el uso de un aparato de Clevenger, y el hidrosol como subproducto de la destilación; para diente de león se realizó el mismo procedimiento por hidrodestilación por 3 horas encontrando únicamente hidrosol. Se realizó la evaluación de densidad como parámetro donde la densidad del aceite esencial de romero fue de 0.881g/mL ± 0.016, la densidad del hidrosol de romero fue de 0.9955g/mL ± 0.00098 y la densidad del hidrosol de diente de león fue de PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Junio de 2013

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0.9953g/mL ± 0.00065, y el rendimiento en cuanto a la obtención del aceite esencial de Rosmarinus officinalis fue de 0.594 mL/g± 0.04. Complementaria a estas evaluaciones, se realizó la técnica de extracción por microgota, mediante la cual se emplearon 150 μL de hexano y de diclorometano a temperatura ambiente de 20°C y 3000 rpm en 5 mL de hidrosol, y a través de un cromatógrafo de gases acoplado a masas, se determinaron los compuestos presentes en el hidrosol que se encuentran en el solvente. Para la evaluación de la actividad antimicrobiana tanto del aceite esencial como de los hidrosoles, se realizó por difusión de disco en agar, de 3 concentraciones 100ppm, 10ppm y 1 ppm, se realizó la lectura por halos de inhibición. La actividad antimicrobiana no se evidenció con las concentraciones evaluadas. Abstract This work was done under the project: Development of alternatives of conservation in 100% natural fitoterapeutics products, funded by COLCIENCIAS, the objective was to observe and determine the antimicrobial effect of essential oils and hydrosols from two vegetables species: Rosmarinus officinalis y Taraxacum officinale against Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, the species were provided by Bacteria conservation of Faculty of Science of Pontificia Javeriana University. Rosmarinus officinalis or commonly called rosemary, is a plant widely distribued in many lands of the Mediterranean, Turkey and American continent. The essential oils of this plant have been investigated, both its antimicrobial activity and its antioxidant, however it exists a subproduct derived of the obtaining of essential oil by hydrodistilation, which has a lot of scientifically interest, the hydrosol. The dandelion is a plant that as well as the rosemary, is widely distributed, and has many uses in traditional medicine, with different applications both gastronomic and medicinal. The objective of this work was the antimicrobial evaluation of hydrosols and essentials oils of Rosmarinus officinalis and Taraxacum officinale against 4 pathogenic bacterial: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus. The essential oil obtained from rosemary was extracted from leaves of the plant, during 3 hours, it was used a Clevenger system, and hydrosol was obtained as a subproduct of distillation. For the dandelion the same procedure was used, by hydrodistilation, 3 hours, but only we found hydrosol. A density evaluation was made as a parameter where the density of rosemary was 0.881g/mL ± 0.016, the density of rosemary hydrosol was 0.9955g/mL ± 0.00098 and the density of dandelion hydrosol was 0.9953g/mL ± 0.00065, the yield by extraction of the essential oil of Rosmarinus officinalis was 0.594 mL/g± 0.04. Complementary to these experiments, the extraction by “micro droplet” technic was used. I was used 150 µL of hexane and dichloromethane at 20°C and 3000 rpm in 5 mL of hydrosol. Through a gas chromatograph with a masas spectrometer, it was evaluated the components of the hydrosol presents in the solvent. For the evaluation of antimicrobial activity, both its essential oil and its hydrosols, a diffusion in agar plate was used, 3 concentrations were tested: 100ppm, 10ppm and 1 ppm, the reading was made by inhibition of halos. The antimicrobial activity was not found in these conditions.

PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Junio de 2013

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