Aferentes colinérgicas al locus coeruleus y noradrenérgicas al septo medial intervienen en el reforzamiento de la LTP en el giro dentado por estimulación de la amígdala. Jorge A. Bergado ( [email protected]), Sabine Frey, Jeffrey López, William Almaguer-Melian, Julietta U. Frey Centro Internacional de Restauración Neurológica, La Habana, Cuba Introducción La potenciación sináptica duradera (LTP) es una forma de plasticidad neural que representa un mecanismo celular común a muchas formas de aprendizaje y está ganando reconocimiento como posible mecanismo de recuperación funcional después de daño al cerebro. La importancia de factores afectivos (motivación, emociones) para la consolidación de la memoria está bien establecida sobre bases empíricas y sustentada por una extensa investigación animal. Esta modulación afectiva es mediada por estructuras límbicas, como la amígdala. Una modulación semejante afecta la adquisición de habilidades motoras y la recuperación de las funciones mentales en pacientes con infartos cerebrales, así como la formación de memoria en animales con lesión cerebral provocada. De modo que la modulación afectiva pudiera ser considerada como un mecanismo universal, no restringido a una forma particular de plasticidad o región del cerebro. La LTP puede ser también modulada por factores afectivos. Un ejemplo de esto es la trasformación de una LTP temprana en una LTP tardía con una duración mayor de 4 horas, por la acción de un acto conductual de alto valor motivacional. Este reforzamiento conductual (BR) de la LTP es mediado por la síntesis de proteínas y depende de la función de la BLA como se demostró en experimentos usando animales con inactivación temporal permanente de esta estructura límbica1, 2. Además, estimulando la BLA dentro de una ventana temporal específica, antes o después de la inducción de la LTP empleando un tétanos moderado (BLA-R, ver Métodos) mimetiza los efectos del reforzamiento conductual 3. En otras palabras, un efecto de reforzamiento puede ser obtenido estimulando la BLA (BLA-R). El efecto de reforzamiento de la BLA sobre la LTP en el giro dentado (DG) parece implicar la inervación aferente noradrenérgica y colinérgica.

Esto sugiere la participación del locus coeruleus (LC) y el septo medial (MS) en estos procesos por cuanto son las fuentes principales de inervación noradrenérgica y colinérgica al DG. En este sentido, recientemente hemos demostrado que la LTP en el DG puede ser reforzada por estimulación de MS y el LC. Sin embargo, en nuestros estudios farmacológicos previos los antagonistas fueron aplicados intracerebroventricularmente (icv), por lo que surge la pregunta de dónde en el cerebro se originan los efectos farmacológicos observados. En este trabajo utilizamos un método de aplicación tópica de antagonistas en las estructuras de interés: el DG, la BLA, el LC y el MS. Los resultados sugieren la existencia de un circuito funcional para BLA-R que involucra aferentes colinérgicas al LC, una proyección noradrenérgica desde el LC al DG y al MS y, finalmente, la proyección colinérgica del MS al DG. Materiales y métodos Se emplearon ratas Wistar macho que pesaban entre 250-300 g (8 semanas de edad) al inicio del estudio. Después de la cirugía los animales fueron colocados en cajas plásticas translúcidas individuales con acceso libre al agua y los alimentos y condiciones ambientales controladas (12 luz/oscuridad, temperatura y humedad) durante todo el experimento. Las ratas fueron anestesiadas con Nembutal (40 mg/Kg, ip) y montadas en un marco estereotáctico. La preparación estándar incluyó la implantación de un electrodo monopolar de acero inoxidable para registro en el giro dentado (DG), un electrodo bipolar de acero inoxidable en la vía perforante medial (PP) y un electrodo monopolar en la amígdala basolateral (BLA). Cánulas de guía para la inyección de sustancias fueron colocadas en el locus coeruleus (LC), el septo medial (MS), la BLA o el DG. Una semana después de la cirugía los animales fueron probados y habituados a la cámara de registro por no menos de 4 h. Se construyó una curva estímulo-respuesta estimulando la PP (100-800 A) para determinar la intensidad de estimulación que sería usada en cada animal (40% de la espiga poblacional máxima). Los experimentos fueron realizados al día siguiente. El diseño general incluyó el registro de una línea de base durante 1 h seguidos por la inducción de una LTP temprana por un tétanos débil a la PP. Diez minutos después del tétanos se aplicaron las sustancias tópicamente en el LC, el MS, la BLA o el DG. La BLA fue estimulada 15 minutos

después de la inducción de la LTP (es decir, 5 minutos después de la administración de sustancias ) usando un patrón idéntico al tétanos débil. El curso temporal de la LTP fue seguido por 8 horas con registros cada 15 minutos. Un registro adicional fue hecho 24 h después de la tetanización. El protocolo de tétanos débil empleado para inducir la LTP en las sinapsis PP-DG y para estimular la amígdala consistió en 3 trenes de 15 impulsos cada uno a 200 Hz (pulsos cuadrados bifásicos de 0.2 ms). El intervalo entre trenes fue de 10 s. El mismo patrón fue empleado para estimular la BLA usando una corriente constante de 400 A. Al finalizar los experimentos los animales fueron perfundidos por vía transcardiaca con formalina bajo narcosis con Nembutal. Los cerebros fueron extraídos y post-fijados. Se hicieron cortes de 400 m por congelación de rebanadas contentivas de las regiones de interés que fueron teñidas con azul de toluidina. La localización de las cánulas fue estimada por inspección directa del daño local en el tejido circundante. Los animales que mostraron una localización errónea de la cánula o el electrodo fueron rechazados y no considerados para el análisis grupal final. Resultados El análisis histológico nos permitió seleccionar solo aquellos animales que mostraron un emplazamiento correcto de las cánulas. La admnistración de atropina en el DG produjo un bloqueo de las fases tardías de la potenciación reforzada por estimulación de la amígdala (BLA-R) lo que se expresó en un decrecimiento retardado de la LTP, que comienza a las 4-5 horas y alcanzó significación a las 7-8 horas después de la inducción de la LTP (ANOVA). El propranolol también mostró una influencia negativa sobre BLA-R, pero ese efecto fue mucho más temprano y aparentemente bifásico. El nivel de potenciación después de BLA-R en el grupo de propranolol estuvo reducido significativamente 1-2 horas y a las 7-24 horas después de la inducción. La inyección de lidocaina en el LC abolió el efecto reforzador de estimular la amígdala sobre la LTP en el DG. Diferencias significativas entre los grupos se aprecian desde las 2 horas. La administración de atropina tuvo efectos semejantes mientras que el propranolol no tuvo efectos.

La inactivación de el MS por aplicación tópica de lidocaina causó el bloqueo del efecto reforzador de la BLA sobre la LTP en DG mostrando un declinar de la potenciación que difiere de los controles con salina. La administración tópica de propranolol en esta estructura causó un declinar muy rápido y sostenido de la LTP, mientras que la atropina en esta estructura no tuvo efecto. Discusión Nuestros resultados indican que tanto la aplicación tópica de propranolol como de atropina en el DG bloquean los efectos reforzadores de estimular la amígdala (BLA-R). Estos resultados son, en términos generales, similares a los reportados previamente por nuestro grupo con administración intracerebroventricular de atropina y propranolol, y sugieren que los efectos antagónicos de ambas sustancias se deben, al menos en parte, a una acción directa en el DG. Sin embargo, en el caso del propranolol el efecto es mucho más rápido cuando la sustancias se aplica directamente al DG. La diferencia en el tiempo en que la inervación noradrenérgica y la colinérgica interfieren con BLA-R sugieren que la NA es requerida para mantener una fase intermedia de la LTP, que vincula la E-LTP con la L-LTP mientras que la acetilcolina actúa aparentemente sobre mecanismos involucrados en fases más tardía. Esto también pudiera explicar nuestros resultados previos con aplicación de agonistas de NA y ACh sobre la LTP, y que mostraron que la epinefrina fue capaz de mimetizar BLA-R, mientras que un agonista muscarínico (oxotremorina) fue incapaz de provocar ese efecto 4. La falta de acción del agonista muscarínico puede depender de la necesidad de una activación previa de las proyecciones noradrenérgicas al DG. Estos resultados sugieren la participación del LC y el MS (el origen de la inervación con NA y ACh al DG) en BLA-R, lo cuál se ve sustentado por los resultados de la aplicación directa de ambas sustancias en ambos blancos. Un LC funcional parece necesario para BLA-R, por cuanto la inactivación de LC abole el reforzamiento de la LTP en DG. Este efecto es mediado por aferentes colinérgicas por cuanto la atropina en el LC provoca un bloqueo semejante. Aferentes noradrenérgicas a este lugar no parecen importantes considerando la falta de efecto del propranolol. Sin embargo, la participación de otras aferencias al LC no puede ser descartada. Una cautela semejante se requiere en relación con la especificidad de las sustancias aplicadas al LC. Considerando la pequeña talla de esta estructura y el volumen inyectado, la posibilidad de

una difusión parcial fuera del blanco no puede descartarse. Sin embargo, en este caso la sustancia alcanzaría primero la región periLC que contiene las dendritas periféricas de las neuronas del LC y que es, funcionalmente, una zona receptiva del LC. El LC es la fuente principal de inervación noradrenérgica al cerebro anterior y la formación del hipocampo, pero no recibe en si mismo proyecciones noradrenérgicas. Esto puede explicar la ausencia de efecto del propranolol aplicado a esta estructura sobre BLA-R. El LC recibe aferentes desde la amígdala central, principalmente en la región peri LC, pero esta proyección no parece contener fibras colinérgicas. Se han descrito proyecciones colinérgicas al LC desde núcleos cercanos de tronco encefálico, como el núcleo pedúnculo pontino, o el núcleo tegmental laterodorsal que forman contactos dendro-dendrítico en el LC y la región periLC. Aparentemente, el fuerte efecto de desconectar el LC con lidocaina, o la administración tópica de atropina es mediada por una proyección indirecta desde la BLA hacia alguna de esas regiones posibles, desde donde se origina la proyección colinérgica al LC. Las implicaciones funcionales de la proyección colinérgica sobre la actividad del LC no está bien caracterizada, aunque nuestros resultados sugieren una acción activadora y moduladora. De modo semejante, un MS funcional en el momento de estimular la BLA parece necesario para lograr el reforzamiento; considerando los resultados de su inactivación con lidocaina. Sin embargo, en esta estructura los efectos parecen mediados por aferentes noradrenérgicas y no por fibras colinérgicas, porque el propranolol en este sitio abole totalmente BLA-R, mientras que la atropina no tuvo efecto. El LC envía una fuerte proyección noradrenérgica al MS que forma sinapsis con las neuronas colinérgicas en el cerebro basal anterior y que proyectan a la corteza y el hipocampo. Nuestros resultados pueden ser interpretados dentro de un marco funcional (ver figura) en el cuál la activación de la BLA refuerza la LTP en el DG mediante una activación colinérgica indirecta del LC, quien envía una proyección noradrenérgica al DG, importante para mantener el estado de potenciación en la transición entre la E-LTP y la L-LTP. Adicionalmente, el LC proyecta al MS y activa la proyección colinérgica de este al hipocampo, cuya actividad parece responsable de la consolidación de la L-LTP. También pudiera existir una activación del MS por proyecciones directas desde la BLA.

El conjunto de sinapsis aminérgicas-colinérgicas pudieran ser parte de un sistema neural extendido involucrado en la modulación afectiva de la plasticidad. Tal sistema neural también tiene sentido en condiciones fisiológicas. La información sensorial es distribuida desde el tálamo hasta la corteza y la amígdala. Desde campos corticales de orden superior la señal alcanza la corteza entorrinal desde donde es transferida al DG y almacenada temporalmente por mecanismos de plasticidad a corto plazo (por ejemplo una E-LTP). La misma información es procesada en paralelo por el sistema límbico (representado por la BLA) el cuál, mediante el sistema neural antes descrito, refuerza los mecanismos de almacenamiento (modulación) convirtiendo la ELTP en una L-LTP. Nótese que partes del sistema pueden ser activadas de forma independiente en otras circunstancias. Por ejemplo una señal sensorial fuerte puede activar al LC como parte del sistema atencional lo cual podría tener resultados similares sobre los cambios plásticos que ocurre en las sinapsis responsables del almacenamiento de la memoria. Estamos conscientes de que los componentes del circuito aquí presentado muy probablemente estén incompletos. Se ha descrito que el sistema neural que controla el ritmo theta incluye otros núcleos como el del rafe en el tronco encefálico y el núcleo supramamilar del hipotálamo. Finalmente, los efectos reforzadores de factores afectivos y estructuras sobre la neuroplasticidad no se restringe a la LTP en el giro dentado. Existen reportes que demuestran el papel esencial de la proyección colinérgica del cerebro basal anterior sobre la plasticidad cortical en áreas sensoriales y motoras. Recientemente, hemos demostrado que la estimulación de la BLA acelera los cambios plásticos implicados en la adquisición de una habilidad motora 5. Esto pudiera significar que el sistema neural que proponemos para explicar el reforzamiento de la LTP en el giro dentado puede actuar sobre otras formas de plasticidad en amplias zonas corticales. Se necesitan otros estudios para confirmar el sistema hipotético que aquí proponemos, así como para completar la lista de estructuras y transmisores involucrados en la modulación afectiva de la neuroplasticidad. Conclusiones Existe un Sistema Neural de Reforzamiento de procesos de plasticidad sináptica que es activado por la amígdala.

El locus coeruleus y su proyección noradrenérgica al septo medial, así como la proyección colinérgica septo-hipocampal, son componentes importantes en el Sistema Neural de Reforzamiento de procesos de plasticidad sináptica. 6. Recomendaciones Estudiar la posible participación de otras estructuras cerebrales profundas y neurotransmisores como el núcleo del rafé (serotonina) y el núcleo accumbens en el Sistema Neural de Reforzamiento de la plasticidad sináptica. Referencias bibliográficas 1. Almaguer-Melian,W., Martínez-Martí,L., Frey,J.U., & Bergado,J.A. The amygdala is part of the behavioral reinforcement system modulating long-term potentiation in rat hippocampus. Neuroscience 119, 319-322 (2003). 2. Bergado,J.A., Almaguer-Melian,W., Kostenko,S., Frey,S., & Frey,J.U. Behavioral reinforcement of long-term potentiation in rat dentate gyrus in vivo is protein synthesisdependent. Neurosci Lett. 351, 56-58 (2003). 3. Frey,S., Bergado-Rosado,J., Seidenbecher,T., Pape,H.C., & Frey,J.U. Reinforcement of early long-term potentiation (early-LTP) in dentate gyrus by stimulation of the basolateral amygdala: heterosynaptic induction mechanisms of late-LTP. J. Neurosci. 21, 3697-3703 (2001). 4. Almaguer-Melian,W. et al. Long-term potentiation in the dentate gyrus in freely moving rats is reinforced by intraventricular application of norepinephrine, but not oxotremorine. Neurobiol. Learn. Mem. 83, 72-78 (2005). 5. Bergado,J.A., Rojas,Y., Capdevila,V., Gonzalez,O., & Almaguer-Melian,W. The stimulation of the basolateral amygdala improves the acquisition of a motor skill. Restor. Neurol. Neurosci. 24, 115-121 (2006).

Representación esquemática del sistema neural de reforzamiento de la LTP en el giro dentado del hipocampo (hippocampal formation). Thalamus: tálamo; Sensory inputs: ingresos sensoriales; norepinephrine: noradrenalina. Explicación en el texto