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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 250 360

51 Int. Cl. : C07C 57/03, C07C 57/18

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C07C 321/18, A61K 31/20 A61K 31/201, A61P 3/00 A61P 5/50, A61P 9/10 A61P 9/12

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 01910259 .9

86 Fecha de presentación : 02.03.2001

87 Número de publicación de la solicitud: 1265838

87 Fecha de publicación de la solicitud: 18.12.2002

54 Título: Nuevos análogos de ácidos grasos.

30 Prioridad: 03.03.2000 NO 20001123

73 Titular/es: Thia Medica AS.

Terje Moe, Kalfarveien 57B 5018 Bergen, NO

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.04.2006

72 Inventor/es: Berge, Rolf;

Sydnes, Leiv, K. y Songstad, Jon

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Sanz-Bermell Martínez, Alejandro

ES 2 250 360 T3

16.04.2006

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 250 360 T3 DESCRIPCIÓN Nuevos análogos de ácidos grasos. 5

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Alcance de la invención La presente invención está relacionada con análogos noveles de ácidos grasos. Además, la invención está relacionada con el uso de los análogos noveles de ácidos grasos para el tratamiento o prevención de: síndrome X, obesidad, hipertensión, hígado graso, diabetes, hiperglucemia, hiperinsulinismo (o hiperinsulinemia) y estenosis. La invención está relacionada también con los procesos para la preparación de los análogos noveles de ácidos grasos. Antecedentes de la invención EP 345.038 describe el uso de análogos de ácidos grasos no-β-oxidables de fórmula:

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Alquilo − X − CH2 COOR

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donde el alquilo es una cadena de hidrocarburos saturados o insaturados de 8 a 22 átomos de carbono, X representa un O, S, SO o SO2 , y R es hidrógeno o un grupo alquilo C1 -C4 , para el tratamiento de afecciones hiperlipémicas y para la reducción de la concentración de colesterol y triglicéridos en la sangre de mamíferos. WO-97/03663 describe alquilo-S-CH2 COOR y alquilo-Se-CH2 COOR para la inhibición de la modificación oxidativa del colesterol LDL. Además, esta aplicación describe el uso del compuesto de selenio para el tratamiento de afecciones hiperlipémicas y para la reducción de la concentración de colesterol y triglicéridos. Las publicaciones PCT WO 99/58121, WO 99/58122 y WO 99/58123 describen análogos de ácidos grasos de fórmula (I)

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CH3 − [CH2 ]m − [Xi − CH2 ]n − COOR - donde n es un entero entre 1 y 12, y

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- donde m es un entero entre 0 y 23, y - donde i es un número impar que indica la posición relativa con COOR, y - donde Xi , independientes entre sí, se seleccionan del grupo que comprende O, S, SO, SO2 , Se y CH2 , y

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- donde R representa hidrógeno o alquilo C1 -C4 , - con la condición de que, como mínimo, uno de los Xi no sea CH2 , 45

una sal, un profármaco o un complejo de éstos. Esta fórmula incluye uno o varios grupos X (preferiblemente selenio y azufre) en posiciones 3, 5, 7, 9, etc. Además, estas publicaciones PCT describen varias aplicaciones médicas y nutricionales.

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WO99/58121 describe el uso de los análogos de ácidos grasos [para el] tratamiento o prevención de la obesidad, hipertensión, hígado graso y el síndrome multimetabólico denominado “síndrome metabólico” o “Síndrome X”. Además, la presente aplicación describe un método para el tratamiento o prevención de la obesidad o el sobrepeso y un método para producir una pérdida de peso o una reducción de la masa de grasa en un animal humano o no humano. La aplicación describe también una composición nutricional eficaz para reducir o evitar un aumento en el peso corporal total o en la masa de grasa corporal total en un animal humano o no humano, y también un método para la modificación del contenido y distribución de la grasa de animales para mejorar la calidad de la carne o de productos como leche y huevos. WO 99/58122 describe el uso de análogos de ácidos grasos para el tratamiento o prevención de la diabetes (tipos I y II) y un método para el tratamiento o prevención de la hiperglucemia, el hiperinsulinismo (o hiperinsulinemia) y de la sensibilidad reducida a la insulina. También se divulga una composición nutricional eficaz para reducir o para impedir el aumento de la concentración de glucosa en sangre de un animal humano o no humano, pues es un método para reducir la concentración de glucosa en sangre de un animal humano o no humano.

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WO 99/58123 describe el uso de análogos de ácidos grasos para el tratamiento o prevención de la estenosis primaria o secundaria, de enfermedades provocadas por trauma vascular durante procedimientos, proliferación patológica de células musculares lisas y de mayores niveles de homocisteina en plasma. 2

ES 2 250 360 T3

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Debido a la sustitución del átomo X (más preferiblemente, azufre o selenio) en la cadena de carbono de los análogos de ácidos grasos antes señalados, estos compuestos no resultarán β-oxidados en la mitocondria más allá de esta posición. Así, la degradación de estas moléculas debe empezar desde el extremo metilo del ácido graso, y éste es un proceso metabólico bastante lento. El catabolismo de estos análogos de ácidos grasos incluye ω-oxidación y acortamiento de la cadena del ácido dicarboxílico por los peroxisomas. Las enzimas del retículo endoplásmico se ωhidroxilarán y oxidarán además el ácido graso hidroxilado en un ácido dicarboxílico. A este ácido se le puede acortar entonces la cadena mediante β-oxidación en los peroxisomas. Estudios realizados en ratas han demostrado que el 50% del TTA análogo se excretó en la orina como ácidos sulfoxi dicarboxílicos cortos dentro de 24 horas siguientes a la administración. En experimentos similares se ha descubierto que en vivo se forma un producto desaturado de TTA. Ello se debe a la enzima microsomal ∆9 -desaturasa que inserta un doble enlace en la posición 9 de los ácidos grasos saturados. Se anticipa que este producto desaturado tiene efectos similares, o transmite los efectos biológicos de los análogos de ácidos grasos saturados. También es probable que los efectos biológicos de los análogos de ácidos grasos se puedan potenciar ralentizando su catabolismo. Este se puede hacer insertando enlaces dobles o triples cerca del extremo metilo de los ácidos grasos, o incorporando halógenos o grupos alquilo en esta parte de la molécula. Esas moléculas, es decir, los compuestos de acuerdo con la presente invención, no serán sustratos para las enzimas microsomales pertinentes.

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Obesidad y enfermedades relacionadas con la obesidad

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La obesidad es una enfermedad crónica de alta prevalencia en la sociedad moderna y se asocia, no sólo con un estigma social, sino también con una vida más corta y numerosos problemas médicos, incluidos un desarrollo psicológico adverso, desórdenes reproductivos (como enfermedad ovárica policística), enfermedades dermatológicas (como infecciones, venas varicosas, acantosis nigricans y eczemas), intolerancia al ejercicio, diabetes mellitus, resistencia a la insulina, hipertensión, hipercolesterolemia, colelitiasis, osteoartritis, lesiones ortopédicas, enfermedad tromboembólica, cáncer y enfermedad coronaria. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es facilitar un régimen de tratamiento que sea útil para devolver el peso corporal de sujetos obesos a un peso corporal ideal normal. Otro objeto es facilitar una terapia para la obesidad que resulte en el mantenimiento de un inferior peso corporal durante periodos de tiempo más prolongados. Además, un objeto es reducir o inhibir la ganancia de peso normalmente inducida por dietas ricas en grasas. Otro objeto más todavía es evitar la obesidad y, una vez iniciado el tratamiento, detener la progresión o evitar la aparición de enfermedades que sean consecuencia de, o secundarias a, la obesidad, como la hipertensión y el hígado graso. Éstos y otros objetos serán evidentes para las personas que tengan conocimientos en la materia.

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La obesidad puede ser debida a cualquier causa, tanto genética como medioambiental. Ejemplos de desórdenes que pueden provocar obesidad o ser causa de obesidad incluyen: alimentación excesiva y bulimia, enfermedad ovárica policistítica, craneofaringioma, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Frohlich, diabetes tipo II, personas con deficiencia de hormona de crecimiento, corta estatura variante normal, síndrome de Turner y otras afecciones patológicas que indiquen una menor actividad metabólica. También es objeto de la presente invención facilitar un régimen de tratamiento que sea útil en la reducción de la presión sanguínea.

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Además, un objeto de la presente invención es facilitar un régimen de tratamiento que sea útil para reducir la concentración de triacilgliceroles en el hígado. Se anticipa que ese régimen proporcionará un efecto inhibidor sobre el desarrollo de afecciones de hígado graso, y también será apto como método para el tratamiento de la enfermedad manifestada. Los compuestos de la presente invención activan la β-oxidación y reducen también la concentración de triglicéridos en el hígado.

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El término “síndrome metabólico” se utiliza para describir un síndrome multimetabólico que está caracterizado, entre otros, por hiperinsulinismo (o hiperinsulinemia), resistencia a la insulina, obesidad, intolerancia a la glucosa, diabetes mellitus tipo 2, dislipidemia o hipertensión.

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Como se ha indicado anteriormente, se anticipa que los compuestos de la presente invención proporcionarán un efecto positivo sobre todas las afecciones antes señaladas, es decir, regulando la homeostasis de la glucosa y de los lípidos, y así se anticipa que los compuestos de la presente invención serán sustancias adecuadas para la regulación de la enfermedad metabólica antes definida (en ocasiones denominada “síndrome X”).

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ES 2 250 360 T3 Diabetes

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Existen dos formas principales de diabetes mellitus. Una es la diabetes tipo I, conocida también como Diabetes Mellitus Insulinodependiente (DMID), y la otra es la diabetes tipo II, que se conoce también como Diabetes Mellitus No Insulinodependiente (DMNID). La mayoría de pacientes con DMID tienen una presentación patológica común: la práctica total desaparición de células beta pancreáticas productoras de insulina, lo que resulta en hiperglucemia. Se han acumulado considerables evidencias que demuestran que la mayoría de DMID es consecuencia de la progresiva destrucción de células beta durante un periodo asintomático que a menudo se prolonga durante muchos años. El periodo prediabético se puede reconocer mediante la detección de autoanticuerpos para células de los islotes y autoanticuerpos contra insulina en circulación. Existe necesidad de un compuesto que no sea tóxico y no tenga efectos secundarios pero que evite la DMID y la DMNID clínicas.

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Diabetes tipo I: diabetes mellitus severa, normalmente de aparición brusca antes de la madurez, caracterizada por un bajo nivel de insulina en plasma, polidipsia, poliuria, mayor apetito, pérdida de peso y quetoacidosis episódica; también se cita como DMID. 20

Diabetes tipo II: una forma a menudo más leve de diabetes mellitus, por lo general de aparición gradual, normalmente en adultos, caracterizada por unos niveles absolutos de insulina en plasma entre normales y altos, que son relativamente bajos en relación con los niveles de glucosa en plasma; también se cita como DMNID. La diabetes tipos I y II, de acuerdo con una clasificación etiológica, se consideran diabetes “primaria”.

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La diabetes secundaria incluye diabetes pancreática, extrapancreática o endocrina y diabetes inducida por fármacos. Además, algunos tipos de diabetes se clasifican como formas excepcionales. Entre éstas se incluyen la diabetes lipoatrófica, la diabetes miatónica y un tipo de diabetes provocada por trastornos de los receptores de la insulina. 30

Considerando la alta prevalencia de la diabetes en nuestra sociedad y las graves consecuencias asociadas a ella como se ha señalado anteriormente, cualquier fármaco terapéutico potencialmente útil para el tratamiento y prevención de esta enfermedad podría tener un gran efecto beneficioso sobre la salud. Se necesita en la técnica un fármaco que reduzca la concentración de glucosa en la sangre de sujetos diabéticos sin efectos secundarios adversos de importancia.

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Por lo tanto, un objeto de la presente invención es facilitar un régimen de tratamiento que sea útil para reducir la glucosa en sangre y para tratar una afección diabética. Otro objeto más de la invención es facilitar un régimen de tratamiento que sea útil para reducir la concentración de insulina en sangre y para aumentar el efecto de la insulina restante.

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Estenosis

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Se ha descubierto que muchas afecciones patológicas están asociadas a la proliferación de células musculares lisas. Entre esas afecciones se encuentran restenosis, arteriosclerosis, enfermedad cardio-coronaria, trombosis, infarto de miocardio, derrame cerebral, neoplasmas de músculo liso (como leiomioma y leiomiosarcoma de intestino y de útero) y fribroide o fibroma uterino. Cada año se realizan más de medio millón de procedimientos intravasculares de intervención. Aunque estos procedimientos invasivos siguen mejorando día a día, hasta el 30-50% de las intervenciones que se realizan cada año no tienen éxito como consecuencia de la restenosis, es decir, de la formación de estenosis secundaria. Por lo tanto, la reducción de la restenosis, que a menudo se cita como el factor más crítico del superior éxito conseguido en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares utilizando procedimientos intravasculares de intervención, como angioplastias, aterectomías y procedimientos que utilicen stents y tecnología láser. En una angioplastia con balón de dilatación, p.ej., la Angioplastia Coronaria Transluminal Percutánea (ACTP), en una arteria de la pierna o brazo del paciente se practica una pequeña incisión y se introduce un tubo hueco largo denominado catéter guía. Posteriormente, en el catéter guía se introduce un alambre guía grueso y un catéter con balón deshinchado; éstos se hacen avanzar cuidadosamente a través de los vasos sanguíneos del paciente con visualización mediante Rayos X. El balón deshinchado se hace avanzar hasta que alcanza el punto del estrechamiento luminar, punto en el que el médico hincha el balón una o más veces hasta alcanzar una presión de 4-6 atmósferas aproximadamente durante unos 60 segundos. Cuando está hinchado, el balón estalla, fractura la placa y estira la fibra muscular de la pared de la arteria más allá de su capacidad para retroceder completamente. Aunque en este procedimiento no se retira ninguna placa, la fracturación de ésta y el estiramiento de la pared arterial aumenta el lumen del vaso, permitiendo así un mayor flujo sanguíneo.

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La restenosis que acompaña a estos procedimientos se caracteriza por la agregación y adhesión de plaquetas, proliferación de células musculares lisas, estrechamiento del lumen de los vasos, vasodilatación restringida y un aumento de la presión sanguínea. Se ha informado que las células musculares lisas de la capa intimal de la arteria entran en el 4

ES 2 250 360 T3 ciclo de crecimiento en 2-3 días aproximadamente después de estos procedimientos y proliferan durante algunos días a partir de ese momento (hiperplasia intimal). 5

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Los compuestos informados de suprimir la proliferación de músculo liso en vitro pueden tener efectos secundarios farmacológicos no deseados cuando se utilizan en vivo. La heparina es un ejemplo de esos compuestos, que según se informa, inhibe la proliferación de células musculares lisas in vitro, pero cuando se utiliza en vivo tiene el potencial efecto secundario adverso de inhibir la coagulación. Como resulta claro a partir de lo anterior, quedan muchos problemas pendientes de resolver en el uso de fármacos inhibidores para el tratamiento eficaz de la movilización y proliferación de células musculares lisas. Resultaría muy ventajoso desarrollar nuevas composiciones o métodos para inhibir la estenosis, la restenosis y los desórdenes relacionados debidos a la proliferación y movilización de células musculares lisas vasculares tras, por ejemplo, lesión traumática a los vasos producida durante cirugía vascular. Se anticipa que los compuestos según la presente invención serán eficaces en el tratamiento de estas enfermedades. Descripción detallada de la invención La presente invención está relacionada con análogos noveles de ácidos grasos de fórmula general (I):

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R1 − [Xi − CH2 ]n − COOR2 - donde R1 es: 25

- un alqueno C6 -C24 con uno o más enlaces dobles y con uno o más enlaces triples, o - un alquino C6 -C24 , y 30

- donde R2 representa hidrógeno o alquilo C1 -C4 , y - donde n es un entero entre 1 y 12, y - donde i es un número impar e indica la posición relativa con COOR2 , y

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- donde Xi , independientes entre sí, se seleccionan del grupo que comprende O, S, SO, SO2 , Se y CH2 , y - con la condición de que uno de los Xi como mínimo no sea CH2 , y 40

- con la condición de que uno de los enlaces triples carbono-carbono esté situado entre el carbono (ω-1) y el carbono (ω-2), o entre el carbono (ω-2) y el carbono (ω-3), o entre el carbono (ω-3) y el carbono (ω-4), o una sal, un profármaco o un complejo de éstos.

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Las realizaciones más preferentes de la presente invención están relacionadas con compuestos de fórmula (I) donde en la posición 3 se dispone un azufre o un selenio. La presente invención también está relacionada con el uso de un compuesto de fórmula (II)

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R1 − [Xi − CH2 ]n − COOR2 - donde R1 es:

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- un alqueno C6 -C24 con uno o más enlaces dobles o con uno o más enlaces triples, o - un alquino C6 -C24 , o

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- un alquilo C6 -C24 sustituido en una o varias posiciones por uno o más sustitutos elegidos del grupo formado por fluoruro, cloruro, hidroxi, alkoxi C1 -C4 , alquiltio C1 -C4 o aciloxi C2 -C5 , y - donde R2 representa hidrógeno o alquilo C1 -C4 , y - donde n es un entero entre 1 y 12, y

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- donde i es un número impar e indica la posición relativa con COOR2 , y - donde Xi , independientes entre sí, se seleccionan del grupo que comprende O, S, SO, SO2 , Se y CH2 , y 5

ES 2 250 360 T3 - con la condición de que, como mínimo, uno de los Xi no sea CH2 , y

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- con la condición de que si R1 es un alquino, entonces uno de los enlaces triples carbono-carbono esté ubicado entre el carbono (ω-1) y el carbono (ω-2), o entre el carbono (ω-2) y el carbono (ω-3), o entre el carbono (ω-3) y el carbono (ω-4), o una sal, profármaco o complejo de éstos, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una afección seleccionada entre el grupo que comprende síndrome X, obesidad, hipertensión, hígado graso, diabetes, hiperglucemia, hiperinsulinemia y estenosis, o para disminuir la concentración de colesterol y triglicéridos en la sangre de mamíferos, o para inhibir la modificación oxidativa de lipoproteínas de baja densidad, o para producir pérdida de peso o una reducción de la masa de grasa en un animal humano o no humano que lo necesite. La presente invención está relacionada también con una composición nutricional que incluye un compuesto de fórmula (I), siendo eficaz la mencionada composición para reducir o para prevenir el aumento del peso corporal total o la masa de grasa corporal total en un animal humano o no humano. Leyenda de las figuras La Figura 1 muestra un esquema para la síntesis del compuesto ácido (Z) 3-Tia-heptadec-9-enoico.

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La Figura 2 muestra un esquema para la síntesis de 3-Tia-15-heptadecina. Administración de los compuestos de la presente invención 25

Como medicamento farmacéutico, los compuestos de la presente invención se pueden administrar directamente al animal mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo parenteral, intranasal, oral o mediante absorción por la piel. Se pueden administrar de forma local o sistemática. La ruta específica de administración de cada sustancia dependerá, por ejemplo, del historial médico del animal.

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La invención se comprenderá en su totalidad mediante referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no se deben interpretar como limitadores del alcance de la invención. Sección experimental

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Los métodos descritos a continuación se utilizaron como sistemas de ensayo para los compuestos descritos en la técnica anterior y se tienen que utilizar también para ensayar los efectos biológicos de los compuestos actuales. Ratas Zucker obesas (fa/fa)

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Las ratas Zucker obesas (fa/fa) utilizadas en este estudio se criaron en la instalación animal U 465 INSERM a partir de parejas suministradas originariamente por el laboratorio Harriet G. Bird (Stow, MA, EE.UU.). Salvo que se indique de otra forma, los animales fueron mantenidos bajo un ciclo constante de luz-oscuridad (luz desde las 7:00 am hasta las 7:00 pm) a 21 ± 1ºC y se les facilitó libre acceso a comida y agua. Cada jaula contenía tres ratas. Las ganancias de peso se registraron diariamente.

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Ratas Wistar

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Se compraron ratas Wistar (Charles River) macho que pesaban 280-358 a Anlab Ltd. (Praga, República Checa) y se colocaron en jaulas de tela metálica en una sala con temperatura (22 ± 1ºC) y luz (luz desde las 7:00 am hasta las 7:00 pm) controladas. Se les dio libre acceso a comida y agua. En cada jaula había tres ratas. La ganancia de peso y la ingestión de comida se registraron diariamente. Pruebas de tolerancia a glucosa intravenosa

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Las ratas Zucker macho (fa/fa) (de 5 semanas de edad) se anestesiaron después de 5 horas de ayuno, mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg). A las ratas se les inyectó glucosa (0,55 g/kg) en la vena safena y se tomaron muestras de sangre de la vena de la cola en tubos heparinizados a intervalos de 5, 10, 15, 20 y 30 minutos tras la carga de glucosa. Las muestras se mantuvieron en hielo, se centrifugaron y el plasma se almacenó a -20ºC hasta los análisis.

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Pinza euglicémica hiperinsulinémica

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Tras 21 días con sus dietas respectivas (véase punto anterior), las ratas fueron anestesiadas mediante inyección de hidrocloruro de xilacina (Rometar SPOFA, Praga, República Checa, 10 mg/ml) e hidrocloruro de ketamina (Narkamon SPOFA, Praga, República Checa, 75 mg/ml) y se les implantó cánulas crónicas en la arteria carótida y en la vena yugular como describe Koopmans et al. (Koopmans, S.J., et al,. Biochim Biophys Acta, 1115, 2130-2138 1992). A las ratas canuladas se les dejó recuperarse durante dos días tras la cirugía antes de los estudios de pinzamiento, que se llevaron a cabo según Kraegen et al. (Kraegen, E.W., et al., Am J Physiol, 248, E353-E362 1983). Así, al tercer día tras 6

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la cirugía, a ratas conscientes sin restricción se les dio una infusión continua de insulina porcina (Actrapid, Novo Nordisk, Dinamarca) con una dosis de 6,4 mU por kg y minuto para alcanzar niveles de insulina en plasma en el intervalo fisiológico superior. La concentración de glucosa en la sangre arterial se pinzó a nivel de ayuno basal mediante infusión variable de una solución de glucosa w/v al 30% (Leciva, Praga, República Checa). Cada 15 minutos a partir del inicio de la infusión de glucosa se tomaron muestras de sangre para determinar la glucosa en sangre y las concentraciones de insulina. Transcurridos 90 minutos, las ratas fueron desconectadas de la infusión y decapitadas inmediatamente; se tomó sangre para la separación de plasma y se diseccionaron y pesaron plastrones de tejido adiposo epididimal. Medición de los parámetros del plasma

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Utilizando métodos enzimáticos se midió la concentración de glucosa (GLU, Boehringer Mannheim, Alemania), de ácidos grasos libres (NEGA, kit C ACS-ACOD; Wako Chemical, Dalton, EE.UU.) y de b-hidroxibutirato (kit 310-A; Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, EE.UU.). Las concentraciones de insulina se determinaron con radioinmunoensayo (CIO Bio Internacional, Gif sur Yvette, Francia) utilizando insulina para ratas como estándar en las ratas Zucker. En las ratas Wistar Charles River, las concentraciones de glucosa en plasma se midieron con ayuda del Analizador de Glucosa Beckman (Fullerton, CA, EE.UU.). Los niveles de insulina en plasma se midieron usando un kit RIA de Linco Research Inc. (St. Charles, MO, EE.UU.). Los fosfolípidos se midieron mediante el método enzimático de Bio Merieux (Marcy-l’Etoile, Francia), El triacilglicerol con el método Technicon nº SA9-0329L90, EE.UU., y el colesterol con el método Technicon nº SA4-0305L90, EE.UU.

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Preparación de fracciones postnucleares y mitocondriales y medición de la actividad de las enzimas

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Se homogeneizaron hígados frescos aislados de individuos de ratas Zucker viejas en tampón de sucrosa enfriado en hielo (0,25 M sucrosa, 10 mM HEPES (pH 7,4) y 2 mM EDTA). Las fracciones postnucleares y mitocondriales se prepararon utilizando centrifugación diferencial preparativa de acuerdo con DeDuve et al. (De Duve, C., et al., Biochem, J., 60, 604-617 1955). Las modificaciones, pureza y rendimiento fueron como se ha descrito anteriormente (Garras, A., et al., Biochim, Biophys. Acta, 1255, 154-160 1995). Los productos solubles en ácido se midieron en fracciones enriquecidas postnucleares y mitocondriales utilizando [1-14 C]-palmitoil-CoA y [1-14 C]-palmitoil-L-carnitina (Radio-Chemical Centre, Amersham, Inglaterra) como sustratos según se ha descrito anteriormente (Willumsen, N., et al., J. Lipid Res., 34, 13-22 1993). En las fracciones postnucleares y mitocondriales se midió la actividad de las carnitina palmitoil transferasas I y II básicamente como describe Bremer (Bremer, J., Biochim. Biophys. Acta, 665, 628-631 1981), y la síntesis de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA se midió en las fracciones mitocondriales de acuerdo con Clinkenbeard et al., (Clinkenbeard, K.D., et al., J. Biol. Chem, 250, 4108-3116 1975). Análisis del ARN La extracción del ARN (Chomczynski, P., et al., Anal. Biochem., 162, 156-159 1987), los análisis Northern (“Northen blot”) y “spot blotting” del ARN sobre filtros de nilón y la hibridización a ARN inmovilizado se realizaron como se ha descrito anteriormente (Vaagenes, H., et al., Biochem. Pharmacol., 56, 1571-1582 1998). Los siguientes fragmentos de cADN se utilizaron como sondas: CPT-I, (Esser, V. et al., J. Biol. Che., 268, 5817-5822 1993), CPT-II (Woeltje, K.F., et al., J. Biol. Chem., 265, 10720-10725 1990), síntesis de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (Ayté, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87, 3874-3878 1990) y lipasa sensible a las hormonas (Hola, C., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1006, 193-197 1989). Los niveles relativos de expresión de ARN se calcularon como las cantidades de sonda radiactiva hibridizada a los respectivos niveles de rARN 28S.

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Resultados En los ejemplos siguientes, el ejemplo 1A) representa un ejemplo de referencia que no forma parte de la invención. 50

Ejemplo 1 Síntesis de compuestos noveles de ácidos grasos A) Análogo de ácido graso no-β-oxidable con un enlace doble carbono-carbono

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La síntesis de un compuesto de acuerdo con la presente invención se elabora representativamente con referencia a la síntesis del ácido tia-heptadec-9- enoico. 60

(Z)HO(O)C − CH2 − S − (CH2 )5 − CH = CH − C7 H15 (Z) designa una configuración cis. 1. Preparación de 1-bromo-5-hidroxi-pentano

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Se trató pentano-1,5-diol, HO-(CH2 )5 -OH con HBr en benceno y se ascendió químicamente durante 24 horas. La mezcla de productos se cromatografió, primero, con una mezcla 85:15 DE hexano-dietil éter para eliminar la dibromida, y después con una mezcla 70:30. Rendimiento de 1-bromo-5-hidroxi-pentano: 80%. 7

ES 2 250 360 T3 1

H-NMR: 1,81(-CH2 -CH2 OH), 1,44(-CH2 -), 3,35(-CH2 -Br), 3,55(-CH2 -OH), 3,32(-OH), 1,51(-CH2 -CH2 -Br).

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C-NMR: 31,43-32,30(C2 ,C4 ), 24,24(C3 ), 33,64(C5 ), 62,11(C1 ).

2. Preparación de 5-(tetrahidropiraniloxi)-1-bromopentano Se dejó reaccionar este compuesto con 3,4-dihidro-2H-pirano en CH2 Cl2 a 0ºC. Como catalizador se utilizaron 2 gotas de HCl conc. Tras retirar el disolvente, se cromatografió el producto de la reacción en 95:5 de hexano-dietil éter. El rendimiento de 5-(tetrahidropiraniloxi)-1-bromopentano fue 77%.

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H-NMR: 1,45-1,63(-CH2 -), 1,83(-CH2 -CH2 O-), 3,38(-CH2 -Br), 3,27-3,79(-CH2 -O-), 4,52(-O-CH-O).

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20

C-NMR: 24,9-32,92(C2 -C4 ), 33,61(C5 ), 62,26(C6 ), 98,83(C1 en THP).

3. Preparación de 7-(tetrahidropiraniloxi)-1-heptina El producto del paso 2 se trató con el complejo EDA de acetilida de litio en sulfóxido de dimetilo seco a 0ºC bajo argón. Transcurridas 4 horas a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se hidrolizó con agua y productos orgánicos extraídos con dietil éter. El residuo tras retirar el éter se cromatografió en 97:3 hexano-dietil éter, con un rendimiento de 7-(tetrahidropiraniloxi)-1-heptina del 62%. 1

H-NMR: 1,45-1,66(-CH2 -), 3,45-3,82(-CH2 -O), 2,16(-CH2 -C=), 1,90(HC=C-), 4,53(-O-CH-O-).

13

C-NMR: 18,27-30,66(C3 -C6 ), 62,21(C7 ), 68,14(C1 ), 84,40(C2 ).

25

4. Preparación de 1-(tetrahidropiraniloxi)-tetradec-6-yne

30

A una solución 1,6 M de BuLi en hexano disuelta en THF a 0ºC bajo argón y el producto de 3 se añadió una mezcla de 1-bromoheptano y N,N-dimetil-propileneurea. Tras la hidrólisis, extracción y cromatografía se aisló 1(tetrahidropiraniloxi)-tetradec-6-yne con un rendimiento del 60%. 1

H-NMR: 0,85(CH3 -), 1,22-1,57(-CH2 -), 2,10(-CH2 -C=), 3,30-3,84(-CH2 O-), 4,55(-O-CH-O).

13

C-NMR: 14,02(C14 ), 22,60-31,73(C2 -C13 ), 18, 69-18,71(C5 og C8 ), 62,23(C1 ), 79,91-80,32(C6 og C7 ).

35

5. Preparación de 1-(tetrahidropiraniloxi)-tetradec-6-ene

40

El tetradec-6-yne sustituido del paso 4 se redujo con hidrógeno en presencia del catalizador Lindlar en etanol. La reducción duró 4 horas. Apareció (tetrahidropiraniloxi)-tetradec-6-ene suficientemente puro para el paso 6 sin purificación adicional, pero se pudo aislar en un rendimiento del 89% tras cromatografía. 1

H-NMR: 0,90(CH3 -), 1,27-1,61(-CH2 -), 3,39-3,89(-CH2 -O), 2,04(-CH2 -C=), 4,59(-O-CH-O-), 5,37(-HC=CH-).

13

C-NMR: 14,07(C14 ), 22-65-31,85(C2 -C13 ), 62,27(C1 ), 27,13-27,19(C5 y C8 ), 129,60-130,04(C6 y C7 ).

45

6. Preparación de 1-bromotetradec-6-ene El producto de 5 se brominó con CBr4 a 0ºC en diclorometano en presencia de Ph3 P. La mezcla de reacción se agitó durante toda la noche. El resultado de 1-bromotetradec-6-ene fue cuantitativo. 50 1

H-NMR: 0,87(CH3 -), 1,27-1,52(-CH2 -), 2,01(-CH2 -C=), 3,39(-CH2 -Br), 1,45(-CH2 -CH2 -Hr), 1,85(-CH2 -CH2 C=), 5,34(-HC=CH-). 13

C-NMR: 14,00(C14 ), 22,60-32,68(C2 -C13 ), 26, 97-27,24(C5 y C8 ), 33,75(C1 ), 129,15-132,32(C6 y C7 ).

55

7. Preparación de ácido (Z) tia-heptadec-9-enoico

60

65

El bromodecano del paso 6 en metanol se añadió a 3 equivalentes de KOH y 1,5 equivalentes de HS-CH2 -C(O) OH en metanol bajo argón durante 30 minutos. Después de agitar a temperatura ambiente durante 4 horas se ascendió químicamente durante otras 12 horas, seguida de hidrólisis y extracción con dietil éter, acidificándose después a pH 12, el producto, el compuesto título, se aisló en forma de aceite viscoso en un rendimiento del 60%. Se ha realizado los siguientes análisis: IR, 600 MHz 1H y 13C NMR, MS, GC, GC-MS del éster de metilo. Los resultados NMR se facilitan más abajo. Todos los datos son en partes por millón (ppm). No se pudo detectar ninguna traza del compuesto E. 1

H-NMR: 0,86(CH3 -), 1,16-1,60(-CH2 -), 1,99(-CH2 -C=), 2,64(-CH2 -S-), 3,22(-S-CH2 -C(O)OH), 5,33(HC=CH). 8

ES 2 250 360 T3 13 C-NMR: 176,63(C1 ), 33,34(C2 ), 32,69(C4 ), 22, 63-31,83(C5 -C7 , C12 -C16 ), 129,32 y 130,24(C9 , C10 ), 26,98 y 27,19(C8 , C11 ), 14,08(C17 ).

B) Análogo de ácido graso no-β-oxidable con un enlace triple carbono-carbono 5

La síntesis de un compuesto de acuerdo con la presente invención se elabora representativamente con referencia a la síntesis de 3-Tia-15-heptadecina como se ilustra en la figura 1. 1. Preparación de 11-Bromo-1(tetrahidro-2-piraniloxi)undecano 10

Se disolvió piridina tolueno 4-sulfonato (1,0 g 4,0 mmol) y 11-Bromo-1-undecanol (10,0 g, 400 mmol) en CH2 CH2 seco (200 ml) a temperatura ambiente, y se añadió 3,4-dihidro-2H-pirano (5,0 g, 60 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de flash en gel de sílice eluido con CH2 Cl2 . El rendimiento de 11-Bromo-1(tetrahidro-2-piraniloxi)undecano fue 10,7 g (80%). 15

2. Preparación de 14-(tetrahidro-2-piranoil)-2-tetradecina

20

Se hirvió gas propino a través de una solución de MeLi en dietil éter (0,8 M, 60 ml, 51,2 mmol) en una rata adaptada para garantizar el ascenso químico del éter. Cuando ya no hubo desarrollo térmico, la reacción se consideró finalizada (suspensión acuosa espesa blanca). A esta solución se añadió gota a gota 11-Bromo-1(tetrahidro-2-piraniloxi)undecano (producto 2) (13,0 g, 38,8 mmol) durante un periodo de 20 minutos. La reacción se agitó durante la noche y se añadía agua (50 ml) gota a gota a esta solución. La mezcla se diluyó con dietil éter y se lavó con agua (5x); (MgSO4 ) deshidratado y el disolvente se evaporaron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía de flash con CH2 Cl2 como eluyente. El rendimiento de 14-(tetrahidro-2-piranoil)-2-tetradecina fue 8,5 g (74%).

25

3. Preparación de 12-Tetradecina-1-ol

30

Se disolvió piridina tolueno 4-sulfonato (0,3 g, 1,2 mmol) y el alquino (producto 3) en etanol (25 ml) y se calentó a 50ºC durante la noche. El disolvente se evaporó y distribuyó entre agua y CH2 Cl2 . La fase acuosa se lavó con agua; (MgSO4 ) deshidratado y el disolvente se evaporaron. El producto crudo se purificó con cromatografía de flash con CH2 Cl2 como eluyente. El rendimiento de 12-Tetradecina-1-ol fue 1,5 g (78%). 4. Preparación de 19-Bromo-2-tetradecina

35

Se disolvió 12-tetradecina-1-ol (5,0 g, 23,8 mmol) en hexano (50 ml) y se añadieron 10 gotas de piridina. A esta mezcla se añadió PBr3 . La mezcla se calentó a 60ºC durante tres horas, se enfrió y se añadió agua gota a gota. La mezcla se lavó con agua; (MgSO4 ) deshidratado y el disolvente se evaporaron. El producto crudo se purificó con cromatografía de flash con hexano como eluyente hasta 2,5% EtOAc en hexano. El rendimiento de 12-Tetradecina-1ol fue 1,5 g (78%). El rendimiento de 14-Bromo-2-tetradecina fue 2,2 g (34%).

40

5. Preparación de 3-Tia-15-heptadecina

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55

Se disolvió KOH (2,76 g, 49,0 mmol) en metanol (30 ml) y se añadió ácido tioglicólico (2,04 g, 22,1 mmol) en metanol (25 ml) gota a gota. Transcurridos 10 minutos se añadió cuidadosamente gota a gota 14-Bromo-2-tetradecina (5,5 g, 20,1 mmol), y la mezcla se calentó a 50ºC durante la noche. La mezcla se enfrió hasta 0ºC y se añadió 30 ml de HCl (pH = 1). El precipitado se filtró y lavó con agua (2x). El material sólido se disolvió en cloroformo (100 ml) y se lavó con agua (1x); (MgSO4 ) deshidratado y el disolvente se evaporaron. El rendimiento del compuesto 14-Bromo2-tetradecina fue 4,4 g (77%). 1 H NMR (300 MHz, CDCl3 ) δ: 1,25 (10 H, sharp m), 1,3-1,4 (4 H, m), 1,46 (2 H, quint, J = 7,0 Hz, = CCH2 CH2 -), 1,60 (2 H, quint, J = 7.0 Hz, -CH2 CH2 S-), 1,77 (3 H, t, J = 2,6 Hz, CH3 C=), 2,10 (2 H, tq, J = 2,6, 7,0 Hz, =CCH2 -), 2,65 (2 H, t, J = 7,3 Hz, -CH2 S-), 3,25 (2 H, s„ -SCH2 COOH), 1,40 (1 H, broad s, -COOH). 13 C NMR (75 MHz, CDCl3 ) δ: 3,35 (CH2 C=), 18,61 (=CCH2 -), 28,50, 28,78, 28,78, 28,97, 29,04, 29,04, 29,34, 29,38, 29,40, 32,70 (-CH2 CH2 S-), 33,3 (-SCH2 CO), 75,20 (MeC=C), 79,31 (MeC=C), 176,42 (CO).

C) Análogos de ácidos grasos no-β-oxidables sustituidos en una o varias posiciones 60

65

Uno o varios de los grupos hidrógeno de la cadena del ácido graso se puede sustituir por uno o más de los compuestos seleccionados del grupo que incluye fluoruro, cloruro, hidroxi, C1 -C4 alkoxi, C1 -C4 alquiltio, C2 -C5 aciloxi o C1 -C4 alquilo. Los sustitutos se pueden incorporar por ejemplo en el compuesto de fórmula (I) seleccionando otros sustratos en los pasos 1-4 anteriores. Finalmente, los compuestos preparados en el anterior paso (C) se pueden convertir en compuestos saturados con una reacción tradicional de hidrogenación, aportando así un grupo R1 que está completamente saturado (es decir, un alquilo), pero sustituido en una o más posiciones.

9

ES 2 250 360 T3 Ejemplo 2 Estudio de toxicidad de TTA 5

Los estudios de toxicidad y la prueba de actividad mutagénica se realizarán según se describe en PCT/N099/00135. Ejemplo 3

10

La actividad biológica de los compuestos noveles de acuerdo con la presente invención se determinará como se ha descrito en el anterior apartado experimental, o como se divulgó en las publicaciones arriba citadas.

15

20

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10

ES 2 250 360 T3 REIVINDICACIONES 1. Análogos de ácidos grasos de fórmula (I) general: 5

R1 − [Xi − CH2 ]n − COOR2

(I)

- donde R1 es: - un alqueno C6 -C24 con uno o más enlaces dobles y con uno o más enlaces triples, o

10

- un alquino C6 -C24 , y - donde R2 representa hidrógeno o alquilo C1 -C4 , y 15

- donde n es un entero entre 1 y 12, y - donde i es un número impar e indica la posición relativa con COOR2 , y - donde X1 , independientes entre sí, se seleccionan del grupo que comprende O, S, SO, SO2 , Se y CH2 , y

20

- con la condición de que uno de los X1 como mínimo no sea CH2 , y - con la condición de que uno de los enlaces triples carbono-carbono esté situado entre el carbono (ω-1) y el carbono (ω-2), o entre el carbono (ω-2) y el carbono (ω-3), o entre el carbono (ω-3) y el carbono (ω-4), 25

o una sal, un profármaco o un complejo de éstos. 2. Análogos de ácidos grasos de acuerdo con la reivindicación 1, donde la mitad R1 comprende un enlace triple carbono-carbono.

30

3. Análogos de ácidos grasos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el X1=3 es azufre. 4. Análogos de ácidos grasos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el X1=3 es selenio. 5. Uso de un compuesto de fórmula (II):

35

R1 − [Xi − CH2 ]n − COOR2

(II)

- donde R1 es: 40

- un alqueno C6 -C24 con uno o más enlaces dobles y con uno o más enlaces triples, o - un alquino C6 -C24 , o - un alquilo C6 -C24 sustituido en una o varias posiciones por uno o más sustitutos seleccionados del grupo que comprende fluoruro, cloruro, hidroxi, alkoxi C1 -C4 , alquiltio C1 -C4 o aciloxi C2 -C5 , y

45

- donde R2 representa hidrógeno o alquilo C1 -C4 , y - donde n es un entero entre 1 y 12, y 50

- donde i es un número impar e indica la posición relativa con COOR2 , y - donde X, independientes entre sí, se seleccionan del grupo que comprende O, S, SO, SO2 , Se y CH2 , y - con la condición de que uno de los X como mínimo no sea CH2 , y

55

- con la condición de que si R1 es un alquino, entonces uno de los enlaces triples carbono-carbono esté situado entre el carbono (ω-1) y el carbono (ω-2), o entre el carbono (ω-2) y el carbono (ω-3), o entre el carbono (ω-3) y el carbono (ω-4), 60

65

o una sal, profármaco o complejo de estos, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una afección seleccionada entre el grupo que comprende síndrome X, obesidad, hipertensión, hígado graso, diabetes, hiperglucemia, hiperinsulinemia y estenosis, o para disminuir la concentración de colesterol y triglicéridos en la sangre de mamíferos, o para inhibir la modificación oxidativa de lipoproteínas de baja densidad, o para producir pérdida de peso o una reducción de la masa de grasa en un animal humano o no humano que lo necesite. 6. Una composición nutricional que incluye análogos de ácidos grasos de la fórmula general (I) de la reivindicación 1. 11

ES 2 250 360 T3

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ES 2 250 360 T3

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