Agrociencia ISSN: 1405-3195 [email protected] Colegio de Postgraduados México

Santos Díaz, María S.; Velásquez García, Yesenia; González Chávez, Marco M. Producción de pigmentos por callos de Mammillaria candida Scheidweiler (cactaceae) Agrociencia, vol. 39, núm. 6, noviembre-diciembre, 2005, pp. 619-626 Colegio de Postgraduados Texcoco, México

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=30239605

Cómo citar el artículo Número completo Más información del artículo Página de la revista en redalyc.org

Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS POR CALLOS DE Mammillaria candida SCHEIDWEILER (CACTACEAE) PIGMENT PRODUCTION BY CALLUS OF Mammillaria candida SCHEIDWEILER(CACTACEAE) María S. Santos-Díaz, Yesenia Velásquez-García y Marco M. González-Chávez Centro de Investigación y Estudios de Posgrado de la Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Manuel Nava 6. 78210. San Luis Potosí, México. ([email protected])

RESUMEN

ABSTRACT

Con el fin de obtener colorantes naturales a partir de cactáceas sin afectar las poblaciones naturales, se establecieron cultivos de

In order to obtain natural colors from cacti without affecting natural populations, cultures of highly pigmented callus of

callos de Mammillaria candida altamente pigmentados. Los callos se cultivaron en el medio de Murashige y Skoog con 3 mg L−1 de

Mammillaria candida were established. The calli were cultured in Murashige and Skoog medium with 3 mg L−1 of 2, 4-

ácido 2, 4-diclorofenoxiacético, ácido naftalenacético o ácido clorofenoxiacético, solos o en combinación con 0.1 mg L−1 de cinetina, cinetin ribósido o benciladenina. Aproximadamente 80% de los callos se pigmentó en medios con auxinas y 50% en medios con auxinas y citocininas, (p≤ ≤0.05). La coloración del tejido au-

dichlorophenoxiacetic acid, naphthalene acetic acid, or chlorophenoxiacetic acid, alone or in combination with 0.1 mg L−1 kinetin, kinetin riboside, or benzyladenine. About 80% of the calli were pigmented in media with auxins, and 50% in media with auxins and cytokinins (p≤ ≤0.05). Tissue pigmentation increased

mentó cuatro veces en medios con 50 y 100 g L−1 de glucosa o sacarosa (estrés abiótico) y con extractos de hongos (estrés biótico). El análisis espectrofotométrico mostró que el pigmento corresponde a una betaxantina modificada.

four times in medium with 50 and 100 g L−1 glucose or sucrose (abiotic stress) and with fungal extracts (biotic stress). The spectrophotometric analysis showed that the pigment corresponds a modified betaxanthine.

Palabras clave: Mammillaria candida, cactácea, colorantes, cultivo in vitro.

Key words: Mammillaria candida, cactaceae, colorings, in vitro culture.

INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

éxico es el país con mayor riqueza y diversidad de cactáceas en el mundo (Hernández y Godínez, 1994). Sin embargo, su aprovechamiento industrial no ha excedido el mercado regional. Por ello, es conveniente implementar otras formas de obtener productos y sus derivados con alto valor agregado. El cultivo in vitro de cactáceas es una alternativa para obtener compuestos, entre otros, los colorantes naturales. El cultivo de tejidos se ha utilizado para obtener un gran número de metabolitos secundarios. La productividad de los cultivos puede incrementarse modificando las condiciones ambientales (temperatura, pH, luz), los componentes del medio (metales, sacarosa, aminoácidos) o la densidad del inóculo (Charlwood et al., 1990; Zhong y Yoshida, 1995; Luczkiewcz y Cisowski, 2001). El estrés biótico, inducido por adición de extractos crudos o fracciones purificadas de paredes de hongos y bacterias (potenciadores), promueve la síntesis de metabolitos secundarios (Becker y Sauerwein, 1990). Además, a

éxico is the country with the greatest richness and diversity of cactaceae in the world (Hernández and Godínez, 1994). Nevertheless, their industrial exploitation does not transcend the regional market. Therefore, it is convenient to implement other methods to obtain products and their derivatives with high aggregate value. Cactacea in vitro culture is an alternative to obtain compounds, natural colorings among others. The in vitro culture has been utilized to obtain a large number of secondary metabolites. The productivity of cultures can be increased by modifying the environmental conditions (temperature, pH, light), the components of the medium (metals, saccharose, amino acids), or the density of the inoculum (Charlwood et al., 1990; Zhong and Yoshida, 1995; Luczkiewcz and Cisowski, 2001). Biotic stress, induced through addition of crude extracts or purified fractions of fungi and bacteria walls (elicitors), promote the synthesis of secondary metabolites (Becker and Sauerwein, 1990). Besides, through tissue culture, it is possible to obtain compounds of less complexity and eliminate undesirable products (Charlwood et al., 1990).

M

M

Recibido: Mayo, 2004. Aprobado: Agosto, 2005. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 39: 619-626. 2005.

619

AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005

través de cultivo de tejidos se pueden obtener compuestos de menor complejidad y eliminar productos indeseables (Charlwood et al., 1990). Entre los metabolitos secundarios más estudiados se encuentran las antocianinas y las betalaínas. Las betalaínas, compuestos nitrogenados solubles en agua localizadas en las vacuolas de las células, se dividen en betacianinas (rojas) y betaxantinas (amarillas). Las betalaínas adquieren más y más importancia en la industria alimentaria ya que se usan en la producción de yogurt, helados, jaleas, aderezos y bebidas frías (Spears, 1988). La acumulación de betalaínas se ha descrito en Beta vulgaris (Girod y Zryd, 1991), Amaranthus (Elliot, 1979), y Myrtillocactus geometrizans (Colomas et al., 1978). Durante la micropropagación de Mammillaria candida, una cactácea mexicana, se observó la generación de callos pigmentados (Elías-Rocha et al., 1999). Ya que las cactáceas producen betalaínas (Piatelli, 1976), nuestra hipótesis fue que el pigmento formado por M. candida corresponde a esta familia. El objetivo de este estudio fue establecer callos de M. candida productores de pigmentos, y modificar las condiciones de cultivo para incrementar la síntesis del colorante.

MATERIALES Y MÉTODOS

Among the most studied secondary metabolites are the anthocyanins and betalains. The latter, nitrogenous compounds soluble in water, located in the cell vacuoles, are divided into betacyanins (red) and betaxanthines (yellow). Betalains become more and more important in food industry since they are used in the production of yoghurt, ice-cream, jellies, dressings, and cold drinks (Spears, 1988). Betalain accumulation has been described in Beta vulgaris (Girod and Zyrd, 1991), Amaranthus (Elliot, 1979), and Myrtillocactus geometrizans (Colomas et al., 1978). During micropropagation of Mammillaria candida, a Mexican cactus, the generation of pigmented calli was observed (Elías-Rocha et al., 1999). Since cactaceae produce betalains (Piatelli, 1976), it was hypothesized that the pigment formed by M. candida corresponds to this family. The objective of this study was to establish M. candida calluses producers of pigments and modify the culture conditions to increase the synthesis of the coloring.

MATERIALS AND METHODS The experiments were realized in the Biochemistry Laboratory of the Faculty of Chemistry, University of San Luis Potosí, México. The Murashige and Skoog medium, MS, was used (Murashige and Skoog, 1962) added with 116 µM mio-inositol, 1.2 mM thiamine-

Los experimentos se realizaron en el laboratorio de Bioquímica, de la Facultad de Química, Universidad de San Luis Potosí, México. Se usó el medio de Murashige y Skoog, MS (Murashige y Skoog, 1962) adicionado con mio-inositol 116 µM, tiamina-HCl 1.2 µM y 30 g L−1 de sacarosa. Para preparar el medio sólido se añadieron 3.5 g L−1 de Phytagel. Después de adicionar las auxinas y las citocininas el pH del medio se ajustó a 5.7. Los medios se esterilizaron a 120 °C por 20 min. Los callos y las suspensiones se mantuvieron a 25 °C con fotoperiodo de 16 h de luz por 8 h de obscuridad. Los callos se generaron en el medio MS con benciladenina 22.15 µM y ácido naftalenacético 5.37 µM (Elías-Rocha et al., 1999). Se colocaron 3 g de tejido en medio MS con 3 mg L−1 de ácido 2, 4diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido naftalenacético (ANA) o ácido clorofenoxiacético (CFA), solos o en combinación con 1 mg L−1 de

HCI, and 30 g L−1 saccharose. In order to prepare solid medium 3.5 g L−1 Phytagel were added. After adding auxins and cytokinins, the pH of the medium was adjusted to 5.7. The media were sterilized at 120 °C for 20 min. The calli and the suspensions were kept at 25 °C with a photoperiod of 16 h light per 8 h of dark. The callus were generated in the MS medium with 22.15 µM benzyladenine and 5.37 µM naphthalene acetic acid (Elías-Rocha et al., 1999). Three gram of tissue were placed in MS medium with 3 mg L−1 of 2, 4- dichlorophenoxiacetic acid (2, 4-D), naphthalene acetic acid (ANA), or chlorophenoxiacetic acid (CFA), alone or in combination with 1 mg L −1 kinetin (C), kinetin riboside (CR), or benzyladenine (BAP). The keys of the utilized media are shown in Table 1. The percentage of friable and pigmented calluses was measured (more than 50% of pigmented tissue) after

cinetina (C), cinetin ribósido (CR) o benciladenina (BAP). En el Cuadro 1 se muestran las claves de los medios usados. Se midió el porcentaje de callos friables y pigmentados (más de 50% de tejido pigmentado) después de seis semanas. El estrés abiótico se indujo cultivando los callos en medio D3 con 50 g (50G), 100 g (100G) de glucosa, 50 g (50S) o 100 g (100S) de sacarosa L−1. Para generar el estrés biótico se transfirió 1 g de callo a 10 ml de medio líquido 50G conteniendo 200 µL de extracto del hongo Fusarium sp. Los callos se mantuvieron con el potenciador durante 15 d. Fusarium se cultivó en agar-papa-dextrosa y se lisó por adición de 12 mL de Tris-HCl 200 mM, 0.2% de SDS, 1% de Triton X-100, pH 6.8 (amortiguador de extracción, AE) por caja. Después de 15 min el extracto se centrifugó a 4700 rpm por 30 min. La pastilla se resuspendió en 4 mL de AE y se congeló a −10 °C. La muestra se

six weeks. Abiotic stress was induced culturing the calluses in D3 medium with 50 g (50G), 100 g (100G) glucose, 50 g (50S), or 100 g (100S) saccharose L−1. In order to generate biotic stress, 1 g of callus was transferred to 10 ml of 50G liquid medium containing 200 µL of Fusarium sp. fungus extract. The calli were kept with the elicitors during 15 d. Fusarium was cultured in potato-dextrose-agar and smoothed by addition of 12 mL Tris-HCl 200 mM, 0.2% SDS, 1% Triton X-100, 6.8 pH (extraction buffer, AE) per Petri dish. After 15 min, the extract was centrifuged at 4700 rpm for 30 min. The pellet was resuspended in 4 mL of AE and frozen at −10 °C. The sample was sonicated three times (Brown Sonic Sonicator) for 2 min and centrifuged at 4700 rpm for 30 min. The supernatant was diluted with 2 mL of AE and sterilized in autoclave. In the extract, the carbohydrate

620

VOLUMEN 39, NÚMERO 6

PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS POR CALLOS DE Mammillaria candida SCHEIDWEILER (CACTACEAE)

Cuadro 1. Reguladores de crecimiento y concentraciones utilizados para obtener cultivos in vitro de M. candida. Table 1. Growth regulators and concentrations used to obtain in vitro cultures of M. candida. Reguladores de crecimiento 2, 4-D ANA CFA 2, 4-D 2, 4-D 2, 4-D 2, 4-D 2, 4-D 2, 4-D 2, 4-D 2, 4-D

−1

18 µM (3 mg L ) 16 µM (3 mg L−1) 16 µM (3 mg L−1) 18 µM + CIN 0.46 µM (0.1 mg L−1) 18 µM + CR 0.28 µM (0.1 mg L−1) 18 µM + BAP 0.44 µM (0.1 mg L−1) 18 µM + 50 g L−1 sacarosa 18 µM + 100 g L−1 sacarosa 18 µM + 50 g L−1 glucosa 18 µM + 100 g L−1 glucosa 18 µM + 50 g L−1 glucosa + extracto fúngico

Clave D3 N3 C3 C0.1 CR0.1 B0.1 50S 100S 50G 100G 50G-P

content was measured and the concentration was adjusted to an equivalent of 5 mg mL−1 of glucose. In order to extract the pigment, 1 g of callus was homogenized in 20 mL of 3% ethanol-HCl (1:1), transferring the material to tubes with screw tops, which were shaken at 1400 rpm for 24 h at 26 °C. The tubes were centrifuged at 3000 rpm for 10 min separating the surpernatant. An absorption spectrum of the extracts between 300-700 nm was run (Shimadzu 160A® spectrophotometer). Commercial betanine (Warner Jenkinson®) and a purified beet extract (Redibeets, Internatural Inc., lot No. 0760454®) were utilized as standards. The absorbance was quantified at 538 nm and 477 nm in the ethanol extracts and in the culture medium. The pigment was analyzed in a gas chromatograph connected to a mass spectrometer (model HP 5890). A column of Ultra 1- methyl silicon was used and helium as gas carrier. The temperature program was 100 °C for 5 min, increments of 20 °C per min up to 250 °C, 5 min at

sometió a sonicación tres veces (Sonicador Brown Sonic) 2 min y se centrifugó a 4700 rpm por 30 min. El sobrenadante se diluyó con 2 mL de AE y se esterilizó en autoclave. En el extracto se midió el contenido de carbohidratos y se ajustó la concentración a un equiva-

250 °C, increments of 20 °C per minute until reaching 310 °C, and 20 min at 310 °C. Chromatograms were compared with the data of a chemistry library data bank Wiley 138.L (2 Wiley NBS LB, National Bureau of Standards Library No. G1035A) and NIST 98 (National Institute of Standards and Technology 98).

lente de glucosa de 5 mg mL−1. Para extraer el pigmento se homogeneizó 1 g de callo en 20 mL de etanol-HCl 3 % (1:1) transfiriendo el material a tubos con tapón de rosca, que se agitaron a 1400 rpm por 24 h a 26 °C. Los tubos se centrifugaron a 3000 rpm por 10 min separando el sobrenadante. Se corrió un espectro de absorbancia de los extractos entre 300-700 nm

All the tests were carried out in triplicate, considering this as one repetition, and two repetitions were made. For data analysis, a completely randomized design was used, and they were subjected to an analysis of variance and to the Tukey test (p≤0.05). The Instat 2 program (Graphpad software Tm, V2.02) was employed to compare the data means.

(espectrofotómetro Shimadzu 160A®). Como estándares se utilizaron betanina comercial (Warner Jenkinson®) y un extracto de betabel purificado (Redibeets, Internatural Inc., lot No. 0760454®). Se cuantificó la absorbancia a 538 nm y 477 nm en los extractos etanólicos y en el medio de cultivo. El pigmento se analizó en un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas (modelo HP 5890). Se usó una columna de Ultra 1-metil silicón y helio como gas acarreador. El programa de temperatura fue 100 °C por 5 min, aumentos de 20 °C por min hasta 250 °C, 5 min a 250 °C, aumentos de 20 °C por min hasta llegar a 310 °C, y 20 min a 310 °C. Se compararon los cromatogramas con los datos de un banco de datos de una biblioteca química Wiley 138.L (2 Wiley NBS LB, National Bureau of Standards Library No. G1035A) y NIST 98 (National Institute of Standards and Technology 98). Todas las pruebas se realizaron por triplicado, considerando ésto como una repetición, y se hicieron dos repeticiones. Para el análisis de los datos se utilizó un diseño completamente al azar, y éstos se sometieron a un análisis de varianza y a la prueba de Tukey (p≤0.05). Se empleó el programa Instat 2 (Graphpad software Tm, V2.02) para comparar las medias de los datos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Efecto de las auxinas y las citocininas sobre la formación de pigmentos Los callos de M. candida se transfirieron a medios con 3 mg L−1 de ANA (N3), CFA (C3) ó 2, 4-D (D3)

RESULTS AND DISCUSSION Effect of auxins and cytokinins on pigment formation M. candida calli were transferred to media with 3 mg L−1 of ANA (N3), CFA (C3), or 2, 4-D (D3) in order to determine the auxin type, which might induce the most friable and pigmented callus. Approximately 80% of the calli kept in media with auxins were friable and pigmented (Figure 1a), compared to those cultured in MS medium (20%). There were no differences among auxins (p>0.05) and, generally, the calli were moderately pigmented. As the calli presented better appearance in the medium with 2, 4-D , this auxin was utilized to propagate the material. The synthesis of betalains is regulated by light, temperature, abscisic acid, and cytokinins. Betalain accumulation increases in the presence of cytokinins, and this effect is greater with light than in the dark ((Reznig, 1980). Therefore, the effect of CIN, CR, and BAP on callus pigmentation was evaluated. Friability was similar in the media with cytokinins, however, pigmentation was lower (Figure1b). Due to the fact that pigment production did not increase with cytokinins, these were left out of the medium, and the callus was cultured in the medium with 2, 4-D.

SANTOS-DÍAZ et al.

621

AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005

Interaction between cytokinins and auxins is complex and includes co-action among them, modulation of cytokinin response by auxins (effects on velocities of glucosilation or ribosilation), and synergic or antagonistic activity (Quelhazi et al., 1994). In the present research, cytokinins had an antagonistic effect, since their addition to the medium reduced pigment synthesis. Similar results were obtained with the mesophyll cells of Zinnia elegans. The addition of auxins induced the synthesis of the transcript p48h-10 at 24 h; however, in presence of cytokinins a delay in the transcription of the RNAm was observed (Ye and Varner, 1994). Antagonism has also been described between cytokinins and brassinosteroids in mutants of Arabidopsis (Clouse et al., 1996). Preliminary studies in our laboratory indicate that M. candida calli synthesize campesterol and sitosterol (data not shown), which are precursors of brassinosteroids. It

120

a 100

%

80 60 40 20 0

MS

C3

N3

D3

120 Callos friables Callos pigmentados

100

b

80 %

para determinar el tipo de auxina que indujera los callos más friables y pigmentados. Aproximadamente 80% de los callos mantenidos en medios con auxinas fueron friables y pigmentados (Figura 1a), en comparación con los cultivados en el medio MS (20%). No se presentaron diferencias entre las auxinas (p>0.05) y, en general, los callos fueron moderadamente pigmentados. Dado que los callos presentaron mejor aspecto en el medio con 2, 4-D, se utilizó éste para propagar el material. La síntesis de betalaínas está regulada por la luz, la temperatura, el ácido abscísico y las citocininas. La acumulación de betalaínas aumenta en presencia de las citocininas, y este efecto es mayor con luz que en obscuridad (Reznig, 1980). Por ello se evaluó el efecto de la CIN, CR y BAP sobre la pigmentación de los callos. La friabilidad fue similar en los medios con citocininas; sin embargo, la pigmentación fue menor (Figura 1b). Debido a que la producción de pigmento no aumentó con las citocininas, éstas se omitieron del medio, y el callo se cultivó en el medio con 2, 4-D. La interacción entre citocininas y auxinas es compleja e incluye coacción entre ellas, modulación de la respuesta de las citocininas por las auxinas (efectos sobre las velocidades de glucosilación o ribosilación) y actividad sinérgica o antagónica (Ouelhazi et al., 1994). En la presente investigación, las citocininas tuvieron un efecto antagónico, ya que su adición al medio redujo la síntesis del pigmento. Resultados similares se obtuvieron con células del mesófilo de Zinnia elegans. La adición de auxinas indujo la síntesis del transcrito p48h-10 a las 24 h; sin embargo, en presencia de citocininas se observó un retraso en la transcripción del ARNm (Ye y Varner, 1994). También se ha descrito antagonismo entre citocininas y brasinoesteroides en mutantes de Arabidopsis (Clouse et al., 1996). Estudios preliminares en nuestro laboratorio indican que los callos de M. candida sintetizan campesterol y sitosterol (datos no mostrados) que son precursores de brasinoesteroides. Es posible que estos compuestos afecten la respuesta de citocininas en M. candida.

60 40 20

Inducción del pigmento por estrés biótico y abiótico Para inducir mayor pigmentación en los callos, se indujo estrés osmótico aumentando la concentración de glucosa o sacarosa en el medio. La fuente de carbono proporciona la energía requerida para el crecimiento y mantenimiento del metabolismo intermediario. Así, se espera que un aumento en la concentración de azúcares genere un incremento proporcional en la biomasa o en los metabolitos. Además, un alto nivel de carbono, incrementa la fuerza osmótica del medio, originando un estrés osmótico (Zhong y Yoshida, 1995). En la literatura

622

VOLUMEN 39, NÚMERO 6

0

MS

C3

N3

D3

Figura 1. Efecto de las auxinas y citocininas sobre la friabilidad y pigmentación de callos de M. candida. a) Callos en medios con 3 mg L−1 de CPA (C3), ANA (N3) o 2, 4-D (D3). b) Callos en medio D3 en combinación con 0.1 mg L−1 de BAP (B0.1), CIN (C0.1) o CR (CR0.1). Las barras corresponden a la desviación estándar (DE). Figure 1. Effect of auxins and cytokinins on friability and pigmentation of M. candida callus. a) Calluses in media with 3 mg L−1 of CPA (C3), ANA (N3), or 2, 4-D (D3). b) Calluses in D3 medium in combination with 0.1 mg L−1 of BAP (B0.1), CIN (C0.1) or CR (CR0.1). The bars correspond to standard deviation (DE).

PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS POR CALLOS DE Mammillaria candida SCHEIDWEILER (CACTACEAE)

se han descrito efectos inhibitorios y de estimulación del crecimiento en presencia de altas concentraciones de azúcares. Por ejemplo, en células de Anchusa officinalis una alta concentración de sacarosa favorece la producción de ácido rosmarínico (Su y Humphrey, 1990), y en Catharantus roseus aumentaron los niveles de ajmalicina, serpentina y triptamina (Merillon et al., 1984). Pero en cultivos de Aralia cordata el cambio de 9 a 12 % de sacarosa redujo el crecimiento y la pigmentación (Yakamoto et al., 1994). En el presente estudio, para inducir un estrés osmótico se utilizó el medio D3 con 30 g L−1 (testigo), 50 g L−1 o 100 g L−1 de sacarosa o con 50 g L−1 o 100 g L−1 de glucosa. No se observaron diferencias estadísticas (p>0.05) en cuanto a la friabilidad de los callos en los medios con diferente fuente de carbono (Cuadro 2). Sin embargo, la pigmentación fue menor en los medios con sacarosa con un máximo de 87%, en comparación con los que contenían glucosa, que alcanzaron hasta 95%. El efecto fue independiente de la concentración de glucosa. Dado que muchos pigmentos naturales son O-glucósidos (Piatelli, 1976), es posible que el pigmento de M. candida corresponda a este tipo de moléculas. Para exponer uniformemente el tejido al potenciador, el callo se transfirió a medio líquido con extracto fúngico. Dado que las betaxantinas absorben a 477-486 nm y las betacianinas betacianinas a 538-552 nm (Piatelli, 1976), se calculó la relación 538/477 nm en el medio (pigmento liberado) y en los extractos etanólicos (pigmento en el tejido). La cantidad de pigmento liberado al medio en presencia de 2, 4-D, en los medios con altas concentraciones de glucosa y con glucosa-potenciador fue tres, siete y nueve veces mayores, respectivamente, en comparación con el medio MS (Cuadro 3). No hubo diferencias entre los medios 50G y 100G (p>0.05). La cantidad de pigmento liberado del tejido por extracción alcohólica fue superior en los callos mantenidos en medios con glucosa y potenciador. Cuadro 2. Efecto de la fuente de carbono sobre la pigmentación y la friabilidad de callos de M. candida†. Table 2. Effect of the carbon source on pigmentation and friability of M. candida callus†. Fuente de carbono (g L−1) Sacarosa 30 Sacarosa 50 Sacarosa 100 Glucosa 30 Glucosa 50 Glucosa 100 †

Pigmentación (%)

Friabilidad (%)

87.48b 87.37b 80.85b 95.00a 95.37a 98.74a

97.7a 97.9a 100.0a 100.0a 98.75a 98.75a

Tratamientos con distinta letra en una columna difieren estadísticamente (p≤0.05) ❖ Treatments with different letters in one column are statistically different (p≤0.05).

is possible that these compounds affect the response of cytokinins in M. candida. Pigment induction through biotic and abiotic stress In order to obtain higher pigmentation in the calli, an osmotic stress was induced by increasing the concentration of glucose or saccharose in the medium. The carbon source provides the required energy for growth and maintenance of intermediary metabolism. Thus, it is to be expected that an increase in the concentration of sugars may generate a proportional increment in biomass or metabolites. Furthermore, a high carbon level increases the osmotic strength of the medium, originating osmotic stress (Zhong and Yoshida, 1995). In literature, inhibition and stimulation effects on growth have been described in the presence of high sugar concentrations. For example, in Anchusa officinalis cells, high saccharose concentration promoted the production of rosmarinic acid (Su and Humphrey, 1990), and in Catharanthus roseus increased the levels of ajmalicine, serpentine, and triptamine (Merillon et al., 1984). But in cultures of Aralia cordata, the change from 9 to 12% saccharose reduced growth and pigmentation (Yakamoto et al., 1994). In the present study, the D3 medium with 30 g L−1 (control), 50 or 100 g L−1 of saccharose, or with 50 or 100 g L−1 of glucose was utilized to induce an osmotic stress. Statistical differences (p>0.05) were not observed with respect to friability of the calluses in the media with different carbon source (Table 2). However, pigmentation was lower in media with saccharose by a maximum of 87%, compared to those containing glucose, which reached up to 95%. The effect was independent of glucose concentration. As many natural pigments are Oglucosides (Piatelli, 1976), it is possible that the M. candida pigment corresponds to this type of molecules. In order to expose the tissue uniformly to the elicitor, the callus was transferred to liquid medium with fungal extract. Since betaxanthines absorb at 477486 nm, and betacyanins at 538-552 nm (Piatelli,1976), the 538/477 nm relation was calculated in the medium (released pigment) and in ethanol extracts (pigment in tissue). The amount of pigment released in the medium in presence of 2, 4-D, in media with high glucose concentrations, and in medium with glucose and elicitor, was three, seven, and nine times greater, respectively, when compared to the MS medium (Table 3). There were no differences between the 50G and 100G media (p>0.05). The quantity of pigment released from tissue through alcoholic extraction was greater in the calli kept in media with glucose and elicitor.

SANTOS-DÍAZ et al.

623

AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005

Cuadro 3. Pigmento liberado al medio y presente en el tejido calloso de M. candida†. Table 3. Pigment released to the medium and present in callus tissue of M. candida†. Absorbancia 538/477 nm Medio Pigmento liberado MS D3 50G 100G 50G-P

0.136 ± 0.01 0.333 ± 0.03 0.745 ± 0.08 0.783 ± 0.04 0.904 ± 0.10

Pigmento en el tejido d c b b a

Rendimiento de colorante (%)

Total

0.135 ± 0.02 0.243 ± 0.01 0.396 ± 0.06 0.415 ± 0.08 0.295 ± 0.04

c cd bc a bd

0.271 ± 0.04 0.576 ± 0.02 1.141 ± 0.13 1.198 ± 0.08 1.199 ± 0.13

a b a a a

1.00 2.12 4.21 4.42 4.42

†

Tratamientos con distinta letra en una columna difieren estadísticamente (p≤0.05) ❖ Treatments with different letters in one column are statistically different (p≤0.05).

La formación del pigmento se incrementó cuatro veces en comparación con el medio basal, aunque no hubo diferencias en el rendimiento del colorante usando estrés biótico y abiótico. Después de la extracción etanólica, parte del colorante quedó unido al tejido. Los tratamientos con ácidos, álcalis, detergentes y solventes orgánicos tampoco removieron la totalidad del pigmento (datos no mostrados). Es posible que el colorante quede unido firmemente a la pared. Esta estructura es muy compleja, ya que está constituida por microfibrillas de celulosa, pectinas y hemicelulosa y posee muchos sitios con carga negativa que podrían interactuar con las betalaínas y afectar su liberación. Además, la estructura del callo podría dificultar la liberación del colorante. Es difícil encontrar un callo compuesto sólo de células parenquimatosas. Se ha afirmado que es posible solubilizar compuestos unidos a la pared celular usando enzimas como liticasa y celulasa o por autólisis, es decir, por digestión de las enzimas presentes en la pared (Quintero-Higuera et al., 1997). Estas estrategias podrían usarse para tratar de liberar el pigmento unido a los residuos celulares.

Pigment formation increased four times compared to the basal medium, though there were no differences in coloring yield, using biotic and abiotic stress. After ethanol extraction, part of the coloring remained attached to the tissue. The treatments with acids, alkalis, detergents, and organic solvents did not remove the total of pigment, either (data not shown). It is possible that the coloring remains firmly adhered to the cell wall. This structure is highly complex since it is made up of cellulose microfibrils, pectines, and hemicellulose, and possesses many sites with negative charge, which could interact with betalains and affect their release. Furthermore, the structure of the callus might hinder the coloring release. It is difficult to find a callus composed only of parenchymatous cells. It has been stated that it is possible to solubilize compounds adhered to the cell wall using enzymes like lyticase and cellulase, or by autolysis, this is, by digestion of the enzymes present in the cell wall (Quintero-Higuera et al., 1997). These strategies could be used to attempt to release the pigment adhered to cellular residues.

Análisis del pigmento

624

VOLUMEN 39, NÚMERO 6

1.6 1.4 Absorbancia

El análisis del extracto mostró la presencia de un pico a 300 nm que también estuvo presente en el estándar de betanina y en el extracto de betabel (Figura 2). Las betacianinas y betaxantinas contienen al menos un residuo aromático acilado (ácido cinámico) cuyo pico de absorbancia está entre 280-300 nm (Reznig, 1980); nuestros datos indican que las tres muestras contienen betalaínas aciladas. La betanina y el extracto de betabel presentaron el pico a 533 nm (característico de betacianinas). El extracto de betabel presentó además un pico a 474 nm, que corresponde a betaxantinas. En el extracto de M. candida no se detectaron los picos correspondientes a betaxantinas o betacianinas, sino un pico a 420-450 nm (Figura 2).

1.8

1.2

M. candida Betabel Betanina comercial

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 300 340 380 420 460 500 540 580 620 660 700 Longitud de onda (nm)

Figura 2. Espectro de absorbancia del pigmento de M. candida. Figure 2. Absorbance spectrum of M. candida pigment.

PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS POR CALLOS DE Mammillaria candida SCHEIDWEILER (CACTACEAE)

Abundancia

La muscaflavina, forma isomérica del ácido betalámico, absorbe a 420 nm. El ácido betalámico se encuentra en una gran variedad de pigmentos; en particular, las betaxantinas están formadas por ácido Sbetalámico en combinación con aminoácidos. Por ejemplo, la indicaxantina presente en Opuntia ficus indica está formada por ácido S-betalámico y prolina, y la vulgaxantina por ácido S-betalámico y glutamina (Gibson y Nobel, 1986). Esto sugiere que el pico a 420-450 nm en el extracto de M. candida podría corresponder a un derivado del ácido betálamico. Para tratar de dilucidar la estructura química del pigmento se analizó el extracto por cromatografía de gases-masas (Figura 3). Los picos principales presentaron tiempos de retención de 7.58 y 10.15. La comparación con las bibliotecas Wiley y NIST indicó que el pico 10.15 corresponde a 2, 6-dimetoxi-4-(2- propenil) fenol (MPF), con un ajuste a biblioteca de 95% (Cuadro 4). Los compuestos fenólicos en plantas son precursores de una gran cantidad de metabolitos, entre ellos los pigmentos (Piatelli, 1976), por lo que es probable que el MPF sea precursor del ácido betalámico. Además, la correlación obtenida para el pico 7.58 fue 33% y el mejor ajuste correspondió al razoxano (Cuadro 4). Los dos anillos de piperazindiona de este compuesto son precursores de alcaloides y tienen actividad antitumoral (Scott y Williams, 2002). Dado que los estudios se realizaron con extractos totales de M. candida, se requerirán estudios posteriores, con fracciones purificadas, para determinar la naturaleza exacta del pigmento.

10.15

TIC: MC4MX.D (+,−) 2500 2000

7.58 23.03

1500 1000

2.33 .01

500

Tiempo

6.43 3.69

2

4

8.70 9.05 9.39 10.77 7.87 9.81

6

8

12.25 12.42 13.94

10 12

14

16.55

16

18

19.82

20 22 24

Figura 3. Cromatograma del extracto etanólico a partir de callos de M. candida. Figure 3. Chromatogram of the ethanol extract from M. candida callus.

Pigment analysis The analysis of the extract showed the presence of a peak at 300 nm, which was also present in the betanine standard and in red beet extract (Figure 2). Betacyanins and betaxanthins contain at least one aromatic acyl residue (cinnamic acid), whose peak of absorbance is between 280 and 300 nm (Reznig, 1980); our data research indicate that the three samples contain acyl betalains. Betanin and red beet extract presented a peak at 533 nm (characteristic of betacyanins). The red beet extract also showed a peak at 474 nm, which corresponds to betaxanthins. In the M. candida extract, the peaks corresponding to betaxanthins or betacyanins were not detected, but instead there was one at 420-450 nm (Figure 2). Muscaflavine, an isomeric form of the betalamic acid, absorbs at 420 nm. Betalamic acid is present in a great variety of pigments; particularly, betaxanthins are formed by S-betalamic acid in combination with amino acids. For example, indicaxanthin, present in Opuntia ficus indica, is composed of S-betalamic acid and proline, and vulgaxanthin, of S-betalamic acid and glutamine (Gibson

CONCLUSIONES Se obtuvieron callos de M. candida cuatro veces más pigmentados que el testigo modificando las condiciones de cultivo. Por tanto, el cultivo in vitro de cactáceas puede ser una alternativa biotecnológica para obtener productos de alto valor agregado (colorante natural en alimentos) sin deterioro del medio ambiente. Puesto que se ha descrito que las betalaínas tienen actividad antiviral, éste podría ser otro uso del pigmento, con mucho potencial.

Cuadro 4. Estructuras químicas predichas por comparación con las bibliotecas Wiley y Nist. Table 4. Chemical structures predicted by comparison with Wiley and NIST libraries. Tiempo de retención (mm)

Ajuste a biblioteca (%)

Fórmula

Nombre

Relacionado a

raxozano

alcaloides

O O

7.58

33

HN

N

O

O

OH O

10.15

95

NH

N

O

2,6-dimetoxi betaxantina 4-(2-propenil) fenol

SANTOS-DÍAZ et al.

625

AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2005

AGRADECIMIENTOS Al SHIGO-CONACYT (Alim 47) y al FAI-UASLP (C-97).

LITERATURA CITADA Becker, H., and M. Sauerwein. 1990. Manipulating the biosynthetic capacity of plant cell cultures. In: Secondary Products from Plant Tissue Culture. Charlwood, V., and M. and C. Rhodes. (eds). Clarendon Press, Oxford, England. pp: 43-55. Charlwood, V. B., K. A. Charlwood, and J. Molina-Torres. 1990. Accumulation of secondary compounds by organized plant cultures. In: Secondary Products from Plant Tissue Culture. Charlwood, V., and M. J. C. Rhodes (eds). Clarendon Press, Oxford, England. pp: 167-200. Clouse, S. D., M. Langfford, and T. C. McMorris. 1996. A brassinosteroid-insensitive mutant in Arabidopsis thaliana exhibits multiple defect in growth and development. Plant Physiol. 111: 671-678. Colomas, J., P. Barthe, C. Bulard. 1978. Separation et identification des betalaines synthetisees par les tissues de tige de Myrtillocactus geometrizans cultivés in vitro. Z. Planzenphysiology 87: 341-346. Elías-Rocha, M. A., M. S. Santos-Díaz, and A. Arredondo-Gómez. 1999. Propagation of Mammillaria candida (Cactacea) by tissue culture techniques. Haseltonia Yearbook of the Cactus and Succulent Society of America 6: 96-101. Elliot, D. C. 1979. Ionic regulation for citokinin-dependent betacyanin synthesis in Amaranthus seedlings. Plant Physiol. 63: 264-268. Gibson, A. C., and P. S. Nobel. 1986. Special chemicals. In: The Cactus Primer. Harvard University Press, London. pp: 188-207. Girod, P. A., and J. P. Zryd. 1991. Secondary metabolism in cultured red beet (Beta vulgaris) cells: Differential regulation of betaxanthin and betacyanin biosynthesis. Plant Cell Tissue and Organ Culture 25: 1-12. Hernández, H., y H. Godínez. 1994. Contribución al conocimiento de las cactáceas mexicanas amenazadas. Acta Botánica Mex. 26: 3352. Luczkiewcz, M., and W. Cisowski. 2001. Optimization of the second phase of a two phase growth system for anthocyanin accumulation in callus culture of Rudbeckia hirta. Plant Cell Tissue and Organ Culture 65: 57-68. Merillon, M., M. Rideau, and J. C. Chenieux. 1984. Influence of sucrose on levels of ajmalicine, serpentine and triptamine in Catharantus roseus cells in vitro. Planta Medica 50: 496-501. Murashige, T., and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-479. Ouelhazi, L., S. Hamdi, J. C. Chenieux, and M. Rideu. 1994. Cytokinin and auxin-induced regulation of protein synthesis and poly A+ RNA accumulation in Catharantus roseus cell cultures. Plant Physiol. 144: 167-174. Piatelli, M. 1976. Betalains. In: Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments. Goodwin, T. W.(ed). Academic Press. New York. pp: 560-596. Quintero-Higuera, F., M. S. Santos-Díaz, and R. García de la Cruz. 1997. Cell wall proteins of in vitro cultures of chilli pepper with different tolerance to water stress. Plant Sci. 128: 217-223. Reznig, H. 1980. Betalains. In: Pigments in Plants. Czygan, F. C. (ed). Gustav Fisher, Sttutgart. pp: 370-392. Scott, J. D., and R. M. Williams. 2002. Chemistry and biology of the tetrahydroisoquinoline antitumor antibiotics. Chem. Rev. 102: 1669-1730.

626

VOLUMEN 39, NÚMERO 6

and Nobel, 1986). This suggests that the peak at 420450 nm in M. candida extract might correspond to a derivative of betalamic acid. In order to try to dilucidate the chemical structure of the pigment, the extract was analyzed by gass chromatography-mass spectroscopy (Figure 3). The main peaks presented retention times of 7.58 and 10.15. The comparison with Wiley and NIST libraries indicated that the 10.15 peak corresponds to 2, 6dimethoxy -4- (2-propenyl) phenol (MPF) fitting to library by 95% (Table 4). The phenol compounds in plants are precursors of numerous metabolites, pigments among them (Piatelli, 1976), thus MPF may probably be a precursor of betalamic acid. Furthermore, the correlation obtained for the 7.58 peak was 33%, and the best fit corresponded to razoxane (Table 4). The two piperazinedione rings of this compound are precursors of alkaloids and show antitumor activity (Scott and Williams, 2002). Since the studies were carried out with total extracts of M. candida, subsequent studies with purified fractions will be required to determine the exact nature of the pigment.

CONCLUSIONS M. candida calluses, four times more pigmented than the control, were obtained by modifying culture conditions. Therefore, in vitro culture of cactaceae may be a biotechnological alternative for achieving products of high aggregate value (natural food coloring), without deteriorating environment. Since it has been recognized that betalains have antiviral activity, this might be another use of the pigment with great potential. —End of the English version—




 Spears, K. 1988. Developments in food colourings: the natural alternative. Trends Biotech. 6: 1973-1980. Su, W., and A. E. Humphrey. 1990. Production of rosmarinic acid in high density perfusion cultures of Anchusa officinalis using a high sugar medium. Biotech. Letters 12: 793-798. Yakamoto, K., K. Ilida, K. Sakamura, K. Hajiro, Y. Asada, T. Yoshikawa, and T. Furuya. 1994. Anthocyanin production in cultured cells of Aralia cordata Thunb. Plant Cell Tissue and Organ Culture 36: 21-26. Ye, Z. H., and J. E. Varner. 1994. Expression of an auxin and cytokininregulated gene in cambial region of Zinnia. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 6539-6543. Zhong, J. J., and T. Yoshida. 1995. High-density cultivation of Perilla frutescens cell suspension for anthocyanin production: Effects of sucrose concentration and inoculum size. Enzyme Microbial Tech. 17: 1073-1079.