Artículos técnicos

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Revista Tecnicaña No. 27, Septiembre de 2011

Aislamiento e Identificación de Bacterias Ácido Acéticas en Materia Prima y Tren de Fermentación en el Ingenio Providencia S.A. Mayra Alejandra Hurtado M.1, Ingrid Marcela Ramos P.1, Darly Silvana Parrado S.2 , Héctor Egidio Guzmán A.3 Palabras clave: Acetobacter sp., Gluconobacter sp., acidez volátil, acético, oxidación, sobreooxidación

Introducción La diversidad de variables que influyen sobre el proceso de producción eficiente de alcohol carburante constituye un reto para la industria. En este proceso es particularmente importante la etapa de fermentación durante la cual se deben mantener bajos niveles de acidez láctica y acética, ya que valores superiores a 3000 ppm de la primera y 1000 ppm de la segunda pueden afectar negativamente el comportamiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae y consecuentemente, afectar negativamente la eficiencia y producción de alcohol carburante. En el proceso de producción de etanol los puntos críticos de control microbiológico se encuentran en la materia prima, la etapa de propagación de la levadura y la fermentación, ya que en ellas puede ocurrir contaminación por bacterias ácido acéticas (BAA), microorganismos que se desarrollan en ambientes ricos en azúcares y aerobios. Además, algunos géneros como Acetobater sp. prefieren etanol como fuente de carbono y generalmente predominan en las últimas etapas de las fermentaciones y en el vino, incluso en condiciones de baja tensión de oxígeno (Bartowsky y Henschke, 2008; Gullo y Giudici, 2008; Du Toit y Lambrechts, 2002). Las BAA son bacilos gram negativos ampliamente conocidos por su habilidad para oxidar rápida e incompletamente sustratos de carbono, especialmente azúcares y alcoholes, por lo que se encuentran altamente adaptados en ambientes ricos en azúcar y etanol. La presencia de estas bacterias puede generar un aumento en la acidez volátil ―expresada en términos de ácido acético― en la materia prima y en el mosto de fermentación, debido a su capacidad de oxidación de etanol a ácido acético e incluso, en algunos casos, de sobreoxidación hasta CO2 y H2O. Estos microorganismos tienen dos sistemas enzimáticos que dan lugar a la conversión de etanol en ácido acético. Inicialmente el etanol se oxida por acción de alcohol deshidrogenasa (ADH) a acetaldehído, producto intermedio que por acción de aldehído deshidrogenasa (ALDH) se oxida y transforma en ácido acético (Bartowsky y Henschke, 2008; Gullo y Giudici, 2008). Desde 2005, cuando se inició la producción de alcohol carburante en el Ingenio Providencia, se han venido presentando problemas constantes de contaminación con levaduras ‘salvajes’ 1. Estudiantes en pasantía Microbiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana-Bogotá D. C. 2. Coordinadora Laboratorio Microbiología Planta de Alcohol Carburante. 3. Asistente Laboratorio Físico-Químico Planta de Alcohol Carburante.

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y bacterias ácido lácticas; además, a partir del segundo semestre de 2008 se presentó la contaminación con bacterias ácido acéticas, lo que fue evidenciado por el aumento de la acidez volátil, principalmente en el tanque de activación de la levadura, donde las condiciones son completamente aeróbicas. Esto hizo necesario iniciar el estudio de las características y el comportamiento de este tipo de bacterias con el fin de establecer el impacto que tienen sobre la fermentación y las posibles alternativas para su control. El objetivo del presente trabajo fue seleccionar un medio de cultivo que permita la identificación y cuantificación fácil y rápida de bacterias ácido acéticas en materiales del proceso de fermentación, caracterizar a nivel de género los aislamientos obtenidos a partir de materia prima (Miel B) y tren de fermentación, y determinar la cinética de producción de ácido acético de estos aislamientos.

Materiales y métodos Obtención de muestras Durante el periodo septiembre de 2009 y enero de 2010 se analizaron muestras provenientes del mosto del tanque de activación de levadura (R-305), los fermentadores (R-311, R-312, R-313), el tanque sedimentador de levadura (R-331), el tanque acidulador de levadura (CV-304), la Miel B, y del contenido de sólidos sedimentables (T-121) de la planta de alcohol de Ingenio Providencia S.A,. Medios de cultivo, obtención de aislamientos y caracterización bioquímica Las cepas se aislaron y se les inoculó 0.1 ml de cada dilución seriada en

medio GYP (Kadere et al., 2008): glucosa, 2%; acetato de sodio trihidratado, 0.5%; triptona, 0.5%; extracto de levadura, 0.5%; fosfato de potasio, 0.1%; Tween 80, 0.5%; y agar, 1.7%. En medio Manitol (Kadere et al., 2008): manitol, 2.5%; extracto de levadura, 1%; y agar, 1.5%. En medio WL diferencial: extracto de levadura, 0.4%; triptona, 0.5%; dextrosa, 5%; fosfato de potasio, 0.055%; sulfato de magnesio, 0.015; cloruro de calcio, 0.0125%; cloruro de potasio, 0.0425%; cloruro de hierro (III), 0.00025%; sulfato de manganeso, 0.00025%; verde de bromocresol, 0.0022; y agar, 1.7%. Y en medio Williamson (Suárez e Íñigo, 2004): medio base = mosto, 50%; extracto de levadura, 0.5%; agar, 2%; y etanol grado reactivo, 4%. Buffer citrato: ácido cítrico, 4.7% y fosfato disódico, 4.38%. El pH del medio GYP se ajustó a 6.8, mientras que

Las BAA son bacilos gram negativos ampliamente conocidos por su habilidad para oxidar rápida e incompletamente sustratos de carbono, especialmente azúcares y alcoholes, por lo que se encuentran altamente adaptados en ambientes ricos en azúcar y etanol. La presencia de estas bacterias puede generar un aumento en la acidez volátil ―expresada en términos de ácido acético― en la materia prima y en el mosto de fermentación, debido a su capacidad de oxidación de etanol a ácido acético e incluso, en algunos casos, de sobreoxidación hasta CO2 y H2O.

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los medios Manitol y Williamson se ajustaron a pH 7.0. El crecimiento de levaduras se inhibió por la adición de cicloheximida 100 ppm. Las cajas se incubaron a 30°C durante 72 horas en condiciones aerobias. La morfología microscópica de cada colonia se confirmó mediante coloración de gram. Los aislamientos correspondientes a bacilos o cocobacilos gram negativos se caracterizaron bioquímicamente a nivel de género mediante pruebas de oxidasa, catalasa y oxidación de etanol. Para esta última se preparó el medio propuesto por Juárez y Parés (1997) y se inoculó cada aislamiento en la superficie inclinada del medio utilizando una estría e incubando durante 72 h a 30 °C en condiciones aerobias. Las lecturas de la prueba se hicieron a 24 horas, 48 horas y 72 horas. Un cambio de color de verde a amarillo en el medio producto de viraje del pH de neutro a ácido fue calificado como resultado positivo, lo que indica el consumo de etanol por oxidación. Esta prueba permitió diferenciar presuntivamente dos géneros de BAA: Gluconobacter sp., que oxida etanol hasta ácido acético (viraje del medio a amarillo) y Acetobacter sp., que lo oxida hasta CO2 y H2O (viraje del medio inicialmente a amarillo y luego a verde). Curvas de producción de ácido acético Las curvas de producción de ácido acético fueron realizadas con dos aislamientos del tanque de activación, previamente seleccionados a partir de medio WL diferencial y denominados como WL1 y WL3, correspondientes a Gluconobacter sp. y Acetobacter sp., respectivamente, y un aislamiento obtenido a partir de Miel B denominado BAA-02, correspondiente a

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Gluconobacter sp. Las cepas se reactivaron en caldo GYP a 30˚C y 120 r.p.m. durante 24 horas. Los inóculos fueron preparados en 500 ml en caldo miel estéril con extracto de levadura (0.1%), ‘Feed’ (mezcla de miel B, agua de proceso y nutrientes) (11%) y urea (0.04%) y se completó el volumen con agua de proceso.

e Íñigo, 2004; Du Toit y Lambrechts, 2002; Sokollek et al, 1998). En el presente trabajo se evidenció que estos medios efectivamente permiten el crecimiento de colonias a partir de muestras de mosto para producción de alcohol carburante, las cuales morfológicamente pertenecen al grupo de BAA.

Las curvas de producción de ácido acético para los tres aislamientos se construyeron para simular a escala de laboratorio las condiciones del tanque de activación (R-305), en medio estéril que contenía Feed (9.25%), urea (0.03%) y agua de proceso (71.58%); se ajustó a pH 4.0 y se suplementó con etanol grado reactivo (2.5%) e inóculo (16.6%) (Ingenio Providencia S. A, 2010). Cada aislamiento se evaluó por duplicado durante 10 h a 30 °C y 120 r.p.m. tomando muestras al comienzo y a las horas 2, 4, 5, 6, 8 y 10 para analizar población por recuento en placa en medio WL diferencial y acidez volátil (ppm). La concentración de etanol (v/v, %) se cuantificó al comienzo y a las horas 5 y 10. Adicionalmente, se midieron el oBrix y se analizaron azúcares fermentables y residuales por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).

En general, las poblaciones obtenidas en los cuatro medios de cultivo evaluados para una misma muestra no presentaron diferencias mayores a una unidad logarítmica (resultado no mostrado). En los medios GYP y Manitol se observaron los menores recuentos de unidades formadoras de colonia (UFC/ml), mientras que los medios Williamson y WL diferencial mostraron mayor recuperación, lo que puede estar asociado con su composición, ya que el crecimiento de BAA es influenciado de forma crítica por la disponibilidad de fuentes de nitrógeno, carbono y factores de crecimiento disponibles en el medio (Gullo y Giudici, 2008). Adicionalmente, el medio GYP presentó baja selectividad ya que permitió también la recuperación de bacterias gram positivas.

El medio WL diferencial presentó mayores ventajas en comparación con los demás medios evaluados, tales como alta recuperación y selectividad, facilidad en el recuento de UFC/ml, debido a que es un medio translúcido que propicia la diferenciación de las colonias de BAA (Foto 1 A), además, es el único medio evaluado químicamente definido, por lo que su preparación es sencilla y rápida. Por estas características se seleccionó como medio de cultivo para la determinación rutinaria de la población de BAA presente en el tren de fermentación y materia prima. Aislamiento de bacterias ácido acéticas e identificación presuntiva de género Se obtuvieron en total doce aislamientos a partir de las muestras del tren de fermentación en los cuatro medios de cultivo evaluados, que corresponden a doce colonias morfológicamente diferentes. De estos, sólo un aislamiento correspondió a bacilos gram positivos, proveniente del medio GYP, que no fue incluido en la caracterización bioquímica y los medios Williamson, WL diferencial y Manitol mostraron una alta selec-

Resultados y discusión Selección de medio de cultivo Los medios de cultivo evaluados resultaron adecuados para el crecimiento y aislamiento de BAA a partir de muestras de procesos de fermentación, lo que confirma los hallazgos en vino y vinagre (Kadere et al, 2008; Bartowsky y Henschke, 2008; Gullo y Giudici, 2008; Gullo et al, 2006; Baena et al, 2006; Suárez

Foto 1. Morfología de aislamientos de BAA. A.: Colonias de BAA en medio WL Diferencial, B.: Morfología microscópica (Cocobacilos gram negativos).

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tividad hacia bacilos y cocobacilos gram negativos (Foto 1 B), morfología reportada para BAA (Gullo y Giudici, 2008; Kedere et al, 2008; Sokollek et al, 1998; Juárez y Parés, 1997). Adicionalmente, se obtuvieron cuatro aislamientos en el medio WL diferencial a partir de Miel B. Se encontró que trece de los dieciséis aislamientos obtenidos fueron catalasa positiva y oxidasa negativa. De acuerdo con Bergey et al. (1994) y Kadere et al. (2008) estas cepas pertenecen a los géneros Acetobacter o Gluconobacter. La colonia denominada WL4 fue catalasa negativa y la BAA-02 fue oxidasa positiva (Cuadro 1); por tanto, no fueron incluidas en los ensayos posteriores. Las cepas de Acetobacter fueron confirmadas y diferenciadas de Gluconobacter utilizando el método descrito por Juárez y Parés (1997). Basado en este método, las cepas de Acetobacter sobreoxidan etanol a acético y finalmente a CO2 y H2O a través del ciclo de los tricarboxílicos.

En el caso de Gluconobacter, debido a su ciclo de ácidos tricarboxílicos incompleto (α-cetoglutarato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa no funcionales) no tiene la capacidad de oxidar ácidos orgánicos como acético, cítrico, láctico, málico, pirúvico y succínico (Bartowsky y Henschke, 2008; Gullo y Giudici, 2008; Kedere et al, 2008). Después de la incubación, las cepas G1, G2, G3, WL3, M1 y M2 acidificaron el medio (Cuadro 1), lo que indica el consumo de etanol por oxidación y producción de ácido acético. No obstante, luego de prolongada la incubación éste revirtió a pH neutro, lo cual significa que el ácido acético fue convertido en CO2 y H2O, por lo que fueron clasificadas presuntivamente como Acetobacter sp. (Kadere et al, 2008). Por su parte, los aislamientos W1, W2, WL1, WL2, BAA-01, BAA-02 y BAA-04L se clasificaron como Gluconobacter sp. porque sólo oxidaron etanol hasta acético (Cuadro 1). Los aislamientos

fueron conservados en caldo GYP con glicerol (50%) en congelación a -20˚C. No obstante, es necesario aclarar que la identificación presuntiva se basó en el trabajo realizado por Juárez y Parés (1997), quienes definieron una metodología para la diferenciación entre los géneros mencionados anteriormente, motivo por el cual no se tiene en cuenta el género Gluconacetobacter, que también tiene capacidad de sobreoxidación de etanol hasta CO2 y H2O (Bartowsky y Henschke, 2008). Esto significa que los aislamientos identificados como Acetobacter sp. pueden pertenecer a Gluconacetobacter; por tanto, se requieren pruebas bioquímicas confirmatorias y valuaciones más detalladas que permitan definir la especie. Tomando como referencia las identificaciones presuntivas hasta nivel de género de los aislamientos, se podría afirmar que la composición del medio WL diferencial abarcó más

Cuadro 1. Caracterización bioquímica de los aislamientos de bacterias ácido acéticas (BAA). Medio de cultivo Williamson

GYP

Manitol

Código de colonia

7

Catalasa

Oxidasa

Oxidación de etanol (pH)

Género

W1

+

-

24 h ácido

48 h ácido

72 h ácido

Gluconobacter sp.

W2

+

-

ácido

ácido

ácido

Gluconobacter sp.

BAA-01

+

-

neutro

neutro

ácido

Gluconobacter sp.

BAA-02

+

-

ácido

ácido

ácido

Gluconobacter sp.

BAA-03L

+

+

ácido

ácido

ácido

No determinado

BAA-04L

+

-

ácido

ácido

ácido

Gluconobacter sp.

G1

+

-

ácido

neutro

neutro

Acetobacter sp.

G2

+

-

ácido

neutro

neutro

Aacetobacter sp.

G3

+

-

ácido

neutro

neutro

Acetobacter sp.

WL1

+

-

neutro

ácido

ácido

Gluconobacter sp.

WL2

+

-

ácido

ácido

ácido

Gluconobacter sp.

WL3

+

-

ácido

ácido

neutro

Acetobacter sp.

WL4

-

-

neutro

―

―

No deteminado

M1

+

-

ácido

ácido

neutro

Aacetobacter sp.

M2

+

-

ácido

neutro

neutro

Acetobacter sp.

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3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0

A

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Aislamiento WL 3 6000

2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 00

4000 2000 0 0

5

Tiempo (h)

10

Grado Alcohólico (%v/v)

Acidez volátil (ppm)

4000

Acidez colátil (ppm)

2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

4500

Grado alcohólico (%v /v )

Aislamiento WL 1 5000

10

Tiempo (h)

Figura 1. Aumento de la acidez volátil y disminución del grado alcohólico en cepas WL1 y WL3.

3 2,8 2,6 2,4 2,2 21,8 1,6 1,4 1,2 10,8 0,6 0,4 0,2 0

8000

Acidez volátil (ppm)

7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0

2

4

Tiempo (h)

6

8

Grado alcohólico (%v /v )

Aislamiento BAA-02

10

Figura 2. Producción de acético y disminución del grado alcohólico para la cepa BAA-02.

ampliamente los requerimientos nutricionales de las bacterias ácido acéticas presentes en el mosto del tanque de activación R-305, y posiblemente en el tren de fermentación. Producción de ácido acético de Gluconobacter sp. y Acetobacter sp. En la Figura 1 aparece el comportamiento de la producción de ácido acético de las cepas aisladas del tanque de activación. En el ensayo con el aislamiento WL1 se alcanzó un nivel de acidez volátil de 4155 ppm al final de la fermentación, equivalente a un aumento de 2520 ppm en relación con la inicial, aunque se presentó la máxima producción en

la hora 8 con 4645 ppm (Figura 2 A). Por su parte, el aislamiento WL3 aumentó la acidez volátil en 1865 ppm respecto a la inicial y llegó a 3540 ppm al final de la fermentación y a su máxima producción (3812 ppm) a la hora 8 (Figura 1 B). Por otra parte, el aislamiento proveniente de materia prima BAA02 mostró el mayor aumento de acidez volátil en el medio frente a las cepas WL1 y WL3, pues logró hasta la hora 10 una acidez volátil de 7625 ppm, equivalente a un aumento de 5905 ppm respecto al inicio de la fermentación, con tendencia a seguir aumentando (Figura 2). La marcada diferencia de producción de ácido

acético entre los aislamientos provenientes del tanque de activación y la cepa de materia prima posiblemente se debe a que en el momento de obtener los aislamientos WL1 y WL3 en 2009, coincidencialmente se estaba aplicando en el tanque de activación un biocida a base de amonio cuaternario en una concentración de 200 ppm. Es posible que el efecto de este producto se reflejó en la baja producción de acético por ambas cepas, debido a que se enlaza a sitios cargados negativamente en la pared bacteriana de la célula. Estos enlaces electrostáticos causan en las bacterias tensiones en la pared celular y disminuyen la permeabilidad de la pared, evitando con ello el flujo normal de compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos (Lentechh, 2010); por el contrario, el aislamiento BAA-02 no fue sometido a estrés fisiológico o químico, ya que en el tanque de almacenamiento de miel B no se aplicó biocida. En los ensayos de fermentación con los aislamientos seleccionados se pretendía simular las condiciones de operación en planta del tanque de activación (R-305), en el cual se espera que el grado alcohólico se

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mantenga en un nivel menor que 2% v/v. Los resultados para las tres cepas mostraron una reducción leve de éste, lo que demuestra que la producción de ácido acético tuvo lugar no solo a partir de los azúcares disponibles en el medio sino también del alcohol. Sin embargo, en el tanque de activación esta disminución no fue tan relevante, ya que en él se pretende únicamente la propagación de Saccharomyces cerevisiae, mientras que en los fermentadores, a pesar de que se busca condiciones anaerobias, por su capacidad de 1000 m3 y operación al 80%, se pueden generar áreas microaerofílicas en las que estas bacterias pueden sobrevivir (Bartowsky y Henschke, 2008; Du Toit y Lambrechts, 2002; Joyeux et al., 1984) y su acción puede generar pérdida en la producción diaria de etanol. La producción de ácido acético, expresada como acidez volátil, por parte de los tres aislamientos evaluados durante 10 horas de seguimiento alcanzó valores mayores que 3000 ppm, una concentración que puede causar disminución de la viabilidad y el rendimiento de la levadura S. cerevisiae durante su etapa de reproducción y fermentación, como lo demostraron Giannattasio et al. (2005), quienes encontraron que concentraciones de 2400 ppm y 3600 ppm de ácido acético adicionado a un medio YPD que contenía Saccharomyces cerevisiae en fase exponencial tuvieron un efecto inhibidor y no tóxico, mientras que con una concentración de 4600 ppm se evidenció toxicidad en la levadura y disminuyeron los porcentajes de viabilidad a 30% en 90 min y 0% a 200 min. Aunque en el presente trabajo no se evaluó el efecto de las tres cepas de BAA sobre la levadura, se

sabe, por experiencia en planta, que valores de acidez volátil mayores que 1000 ppm en el tanque de activación se consideran alarmantes e implican la liquidación del tanque. También se realizaron análisis para evaluar la relación entre el consumo de azúcares fermentables entendidos en términos de glucosa, fructosa y sacarosa y la producción de ácido acético, ya que en planta es muy importante mantener un porcentaje de azúcares fermentables (AF) para garantizar el buen desarrollo de la levadura en etapa de propagación. El aislamiento WL1, que presentó la menor producción de acético, también presentó el menor consumo de AF (4.93%), mientras que la cepa WL3 presentó un consumo de AF igual a 11.77%. A su vez, el aislamiento BAA-02 registró un mayor consumo de azúcares fermentables (18.7%), que se relaciona con la alta producción de acético durante el tiempo de evaluación (Figura 3). Los análisis realizados por HPLC mostraron que los aislamientos WL3 y BAA-02 tenían mayores consumos de sacarosa (11.63% y 12.09%, respectivamente) comparados con el aislamiento WL1. Sin embargo, el aislamiento BAA-02 presentó 36% de mayor afinidad por glucosa

% Fruc HPLC

El Brix al final de la fermentación para BAA-02 fue de 8.33o, que comparado con el Brix de WL1 (7.93o) y WL3 (8,31o) evidencia que durante las 10 horas de fermentación no solo tuvo lugar la producción de acido acético sino que también, debido al metabolismo que poseen estas bacterias, ocurrió la producción de intermediarios metabólicos como carboxílicos, los cuales se acumulan y aumentan el Brix en la mezcla al final de la fermentación (Stainer, 2003).

Conclusiones · El medio WL diferencial fue seleccionado para la determinación rutinaria de la población de bacterias ácido acéticas presente en el tren de fermentación y materia prima

% Gluc HPLC

% Sac HPLC

12,09 12,48 12,18 11,67

WL3 WL1

(Figura 3), lo que demuestra que para este tipo de microorganismos es metabólicamente más fácil usar la glucosa presente en la miel B. El alto consumo de glucosa por parte de esta cepa puede ser explicado por la capacidad de las bacterias ácido acéticas para oxidar la glucosa a través de una segunda ruta no fosforilada, que puede dar lugar a un cúmulo de productos parcialmente oxidados como gluconato y cetoácidos derivados (Stainer, 2003).

11,48

BAA-02

4,7 5,6

9

7,5

Figura 3. Porcentajes de consumo de azúcares fermentables por el método HPLC.

36,07

10

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por su alta selectividad y capacidad de recuperación, facilidad en la preparación y en la realización de la técnica de recuento en placa. Este medio permitió la obtención de aislamientos pertenecientes a los géneros Acetobacter y Gluconobacter, mientras que en los medios Williamson, GYP y Manitol se aisló sólo uno de los dos géneros.

Referencias Baena, S.; Jiménez, C.; Santos, I.; Cantero, D.; Barja, F. y García, I. 2006. Rapid method for total, viable and non-viable acetic acid bacteria determination during acetification process. Process Biochemistry. 41: 1160-1164. Bartowsky, E y Henschke, P. 2008. “Acetic acid bacteria spoilage of bottled red winwA review”. Journal of Food Microbiology. 125: 60-70.

· Se obtuvieron trece aislamientos identificados presuntivamente como bacterias ácido acéticas pertenecientes a los géneros Acetobacter y Gluconobacter, a partir de dieciséis colonias morfológicamente distintas obtenidas en los medios evaluados. Se destaca que siete de ellos correspondieron preliminarmente al género Gluconobacter y seis a Acetobacter.

Bergey, D.; Krieg, N y Holt, J. 1994. Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Wlliams & Wilkins. Pág. 71.

· La evaluación de producción de ácido acético de tres de estas cepas mostró que las bacterias provenientes de miel B tienen mayor capacidad de producción de ácido acético al alcanzar valores de 7000 ppm en 10 horas de fermentación, en relación con las aisladas del tanque de activación, lo cual, a su vez, se relacionó con un mayor consumo de azúcares fermentables, particularmente glucosa.

Fuentes, L.; Tapia, A.; Jimenez, T.; Mascarua, M.; Santoyo, Y.; Caso, L.; Romero, H.; Cajica, M.; León, D.; Rosales, M.; Füguemann, P. y Castillo, M. 2003. Bacterias acéticas: diversidad e interacción con plantas. Elementos. 41:57.

Agradecimientos El desarrollo y la culminación de este trabajo fueron posibles gracias a la ayuda conjunta del Laboratorio de Microbiología y Físico-Químico y al personal de la Destilería del Ingenio Providencia S.A.

Du Tooit, W. y Lambrechts, M. 2002. “The enumeration and identification of acetic acid bacteria from South African red wine fermentations”. International Joournal of Food Microbiology. 74: 57-64.

Giannattasio, S.; Guaragnella, N.; Corte-Real, M.; Passarella, S. y Marra, E. 2005. Acid stress adaptation protects Saccharomyces cerevisiae from acetic acid-induced programmed cell death. Gene. 354: 93-98. Gullo, M y Giudici, P. 2008. “Acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar: Phenotypic traits relevant for starter cul-

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