ALTERACIONES CROMOSÓMICAS NUMÉRICAS

ANÁLISIS CITOGENÉTICO

Dra. Graciela González Laboratorio de Citogenética y Evolución Depto. de Ecología, Genética y Evolución Fac. de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

ALTERACIONES CROMOSÓMICAS NUMÉRICAS Cambios en el número cromosómico de una especie

Nulisómicos (2n - 2) Aneuploides

Monosómicos (2n - 1) Trisómicos (2n + 1) Tetrasómicos (2n + 2)

Haploides (n) Euploides Poliploides (3n, 4n, 5n…)

Aneuploides

El número de cromosomas difiere del tipo silvestre debido a uno o más cromosomas extras o ausentes,

Causas de la Aneuploidía - Por retraso de cromosomas en meiosis o mitosis que conlleva a su pérdida en Anafase. Estos cromosomas se pierden (micronúcleos). Zea

Allium cepa

- Por No disyunción de cromosomas homólogos (meiosis) o de cromátidas hermanas (mitosis o meiosis II) que migran juntos hacia un polo. Segregación anormal.

- Por Translocación Robertsoniana

- Por Pérdida de centrómero

Aneuploidías 

La Aneuploidía se puede observar frecuentemente en células cancerosas.

- Las nulisomías (2n-2) en general en animales son letales. - Las monosomías (2n-1) son generalmente letales. En humanos: Síndrome de Turner, la monosomía para el X es viable (mujeres talla baja, cuello corto, gónadas rudimentarias, ausencia de menstruación y son estériles). - Las trisomías (2n+1) son, en general, más viables. Trisomías autosómicas. En humanos, la del cromosoma 21

Síndrome de Down

Aneuploidías Trisomías autosómicas: micas La del cromosoma 18 (síndrome de Edwards) Edwards y la del cromosoma 13 (síndrome de Patau), Patau quienes las poseen presentan múltiples malformaciones congénitas y, en general, no sobreviven más allá del año de edad. Las trisomías de los cromosomas sexuales (más toleradas) El síndrome triple X: X en 1/1.000 mujeres vivas que son fenotípicamente normales. El síndrome de Klinefelter – XXY: XXY en 1/1.000 varones vivos Fenotipo: talla alta, extremidades muy largas, valores de testosterona bajos, vello escaso, caderas anchas y son estériles. El síndrome XYY: en 1/1.000 varones, son fértiles. Pueden existir combinación de varios tipos de aneuploidías como doble monosómico, mono-trisómico, etc.

Euploidía Variación en el número del complemento completo de cromosomas . Haploidía (n) . Poliploidía (3n, 4n, 5n, 6n, etc.) X=4 Número básico (x): Es el número menor de cromosomas con la información necesaria para que el organismo sea viable .

Euploidía: Haploides (n) Un individuo haploide sólo tiene un complemento cromosómico completo y su contenido en ADN es igual al valor C de su especie. En la meiosis todos los cromosomas estarán en forma de univalentes y sus gametas serán inviables. Los haploides pueden aparecer de forma natural (partenogénesis o eliminación cromosómica de un juego entero en híbridos) o generarlos artificialmente (cultivo de antera y de microsporas). Meiosis de Maíz Haplóide

Diacinesis

Metafase I

Metafase II

Tetrada

En la naturaleza la haploidía es un estado normal en los hongos, en la fase gametofítica de las plantas inferiores y en animales en los machos de las especies con determinismo sexual por haplodiploidía (abejas, hormigas, peces).

En mejora genética: Obtención de Doble-haploides Al duplicar un haploide tenemos un individuo totalmente homocigota para todos los genes. Es de importancia en la mejora ya que obtener líneas isogénicas u homocigotas a partir de un híbrido lleva muchas generaciones. En maíz se obtienen plantas haploides por inducción de la división mitótica de la ovocélula (fertilizándola con una línea masculina inductora de haploidía). La colchicina (Colchicum autummnale L.) inhibe la formación del huso acromático y las cromátidas hermanas no migran hacia los polos. No se forma la membrana plasmática (entre las dos células hijas), dando lugar a la duplicación del complemento cromosómico completo. Las regiones meristemáticas de estas plantas haploides se tratan con colchicina para duplicar su número cromosómico.

Los dobles haploides tienen dos juegos de cromosomas idénticos a los del haploide y pueden formar ovocélulas y núcleos espermáticos viables. Ej.: en cebada. centeno, sorgo, arroz, maíz, algodón, alfalfa, tabaco, girasol, etc.

Poliploides (organismos con más de dos juegos cromosómicos completos) Clase

Origen

Constitución Genómica

Autopoliploide

Dentro de una misma población

AA AA

Alopoliploides

Individuos de especies distintas (relacionadas)

AA BB

Los Autopoliploides se originan: -Por fallas en la meiosis que llevan a la formación de gametas no reducidas.

-Por la fecundación de un óvulo por dos gametas masculinas.

- Por la formación de quimeras o mosaicos poliploides por problemas en la mitosis que, afectando a la línea germinal, originan gametas poliploides.

Autopoliploidía Especiación autopoliploide

Autotetraploides

Un autotriploide Gameta haploide X Gameta no reducida (n)

2n=6

(2n) Cigoto (3n) No disyunción Gametas 2n=6

Un diploide

X

un tetraploide Autopolinización

(gametas n)

(gametas 2n) Cigoto (3n) Tetraploide 2n=4x=12 Fértil

Los autotriploides son estériles y algunos se propagan vegetativamente. Ejemplos de autotriplodes: la banana, la sandía sin semilla.

Ejemplos de autotetraploides: alfalfa, papa, algodón, café, maní.

En las plantas la poliploidía se encuentra muy extendida dentro de las angiospermas (aprox. un 70% de las especies vegetales son poliploides) Planta

Nº cromosómico básico

Número cromosómico

Nivel de ploidía.

avena

7

42

6x

maní

10

40

4x

caña de azúcar

10

80

8x

banana

11

22,33

2x,3x

papa

12

48

4x

tabaco

12

48

4x

algodón

13

52

4x

manzana

17

34,51

2x,3x

Especiación híbrida poliploide. Poliploides conviven con antecesores. Especies morfológicamente similares, con distintos nivel de ploidía, están

COMPLEJOS POLIPLOIDES

Nivel de Ploidía

ALOPOLIPLOIDÍA: Hibridación entre 2 especies distintas y posterior duplicación cromosómica

aisladas reproductivamente.

Rango de variación en caracteres morfológicos

PALEOPOLIPLOIDE

ZEA

2n=20

X=5 2n=10 Extintos Con genomas similares

CITOGENETICA CITOTAXONOMÍA

La citotaxonomía supone que a medida que más caracteres cariotípicos son compartidos por dos grupos, más estrechamente relacionados que deberían ser. El cariotipo es la expresión fenotípica más inmediata del genoma, independiente de efectos que puedan distorsionar la expresión de un carácter (medio ambiente, etapas del desarrollo, efectos epigenéticos, etc.). Por lo tanto, los caracteres citogenéticos deberían ser más fiables que otro tipo de carácter fenotípico. Aunque, el análisis del cariotipo esta sujeto a errores técnicos y de interpretación. El análisis citotaxonómico, empleando métodos clásicos y citomoleculares, demostró que el cariotipo puede proporcionar información esencial para la comprensión de la evolución y filogenia de ciertos grupos de plantas y animales.

Cariotipo Apariencia fenotípica de los cromosomas en metafase mitótica -Número básico (x), número gamético (n) y número somático (2n) -Tamaño absoluto y relativo de los cromosomas -Posición de los centrómeros (IC) -La simetría del cariotipo -Número y posición de las regiones organizadoras del nucleolo (NOR) -Cantidad y distribución de heterocromatina (bandeos cromosómicos) -Tamaño del genoma (contenido de ADN) - Localización física de secuencias (FISH) Si bien cariotipo es constante en las especies suelen ocurrir variaciones estructurales que cambian el tamaño y la posición centromérica de los cromosomas y así también la simetría del cariotipo Estas variaciones son dinámicas y no están relacionadas con complejidad genética u organísmica.

Tamaño del genoma El valor C es la cantidad de ADN por genoma haploide no replicado (en fase G1). Valor C:

AA AAAA

A AA

Valor Cx: contenido de ADN del genoma básico

AAAA

A

 El valor C, en un contexto filogenético, permite analizar los mecanismos involucrados en la evolución cromosómica.

Se mide por microdensitometría (Feulgen) o citometría de flujo 1 pg= 10-12gr 1Mb=10 6 pares de nucleótidos 1pg= 965 Mb

La paradoja del valor C No existe relación entre el contenido en ADN (valor C) y la posición que una especie tiene en la escala evolutiva. Existen especies con una complejidad evolutiva semejante que presentan una enorme variación en la cantidad de ADN.

EL TAMAÑO DEL GENOMA NO AUMENTA CON LA COMPLEJIDAD EVOLUTIVA

Arabidopsis Human Moss Rice Tomato Soy

Una pequeña porción del genoma posee genes funcionales Menor Complejidad

DNA repetido

Canola Mayor Complejidad

Potato Grass Corn

Genes funcionales

Wheat

 En las plantas, el tamaño del genoma está relacionado con diversas características fenotípicas y fenológicas (volumen cromosómico, tamaño nuclear, diámetro del grano de polen, etc.), y en varios grupos se lo ha relacionado con: la longitud del período vegetativo, biomasa, posibilidades de crecer en condiciones ambientales adversas, etc.

TASA METABOLICA

TAMAÑO CORPORAL

COMPLEJIDAD ORGANISMICA

TASA DE DESARROLLO

DIVISIÓN CELULAR

TAMAÑO CELULAR

TAMAÑO DEL GENOMA DUPLICACIONES

MUTACIONES CROMOSOMICAS INSERCIONES DELECIONES

ELEMENTOS TRANSPONIBLES

OTROS MECANISMOS MOLECULARES

En Angiospermas se ha encontrado un amplio rango de variación independientemente del nivel de ploidía (0,1-128 pg)

Diversidad intergenérica, interespecífica e intraespecífica. Esta variación no está relacionada con la complejidad organísmica, ni es explicable por diferencias en el número de genes funcionales

“PARADOJA” O “ENIGMA” DEL VALOR C 2x (0,7 pg) Bulnesia sarmientoi 8x (2,9 pg) Bulnesia bonariensis

Arabidopsis thaliana 125 Mb 0.5 pg

128 pg

Fritillaria assyriaca 120000 Mb

2x (4,5 pg) Bulnesia retama

 Incremento en Valor C (Obesidad Genómica)

 Disminución del Valor C

Cromosomas B Aumento en el numero de copias de secuencias Repetidas (TE) Poliploidia Recombinacion homologa desigual Recombinacion ilegitima

La eucromatina y la heterocromatina En los núcleos interfásicos, la eucromatina se tiñe menos que la heterocromatina debido a su menor grado de enrollamiento.

Diferencias en la actividad genéticas: En la eucromatina están la mayoría de los genes activos. La heterocromatina, que casi no contiene genes activos, se localiza en regiones pericéntromericas, teloméricas, incluso hay cromosomas completos heterocromáticos (cromosoma Y de D. melanogater, cromosomas B de maíz). Diferencias citológicas: En los núcleos interfásicos, existe un mayor grado de enrollamiento en la heterocromatina que en la eucromatina. Alociclia: la heterocromatina sigue un ciclo de condensación y descondensación distinto a la eucromatina. La heterocromatina se replica más tarde que la eucromatina.

El análisis de la variación cariotípica Tinción convencional (hematoxilina acética, carmín acético, orceína, etc.)

Cariogramas

-Conteos cromosómicos -Morfología de los cromosomas - Determinación de las asimetrías del cariotipo

Confección de idiogramas - Valores medios de brazos e índices centroméricos (IC) de cada par de cromosomas homólogos (al menos 5 metafases) - Morfología de los cromosomas: M, SM, ST, T (Levan et al.,1964)

Identificación cromosómica Técnicas de Bandeo Cromosómico: tratamientos y tinciones de los cromosomas para obtener un bandeo transversal característico sobre los cromosomas. Además, permiten distinguir anomalías cromosómicas (translocaiones, deleciones, etc).

Bandeos Clásicos: C , G, R, Q o fluorescentes (DAPI-CMA) Zea

Localizan secuencias de ADN altamente repetidas (heterocromatina constitutiva y de regiones NOR) Scilia sp.

Técnicas de citogenética molecular FISH – Hibridación In Situ Fluorescente Revela la constitución de secuencias de una determinada porción cromosómica.

Bandeo C- cariograma Zea mays ssp. mexicana

Bandeo DAPI- idiograma

Citogenética Molecular (ISH: In situ hybridization) Combinación de la citogenética clásica y la genética molecular Permite conocer la composición de secuencias de una región cromosómica, mapear una secuencia determinada sobre los cromosomas, y revelar las homologías entre las especies a nivel de ADN repetido (heterocromatina constitutiva) Hibridar secuencias de ADN marcado sobre cromosomas o interfases, según su homología.

Útil en estudios:  Sistemático-taxonómicos  Filogenéticos  Evolutivos  Mejoramiento Genético  Biotecnológicos

En qué se basa? Entonces….

GISH (Hibridación in situ Genómica) Pintado de cromosomas o de parte de ellos, según su homología, con una sonda de ADN genómico total marcado.

FISH (Hibridación in situ Fluorescente) Localización de sondas marcadas (de secuencias conocida o no) sobre cromosomas o interfases.

GISH: para estudiar las homologías genómicas entre especies - Muestra similitudes entre los genomas a nivel de ADN repetitivo - La distribución física de las secuencias repetidas que comparten Afinidades genómicas del maíz con los teosintes (GISH) Z.m.mexicana

Z.m.huehuetenanguensis

Z.m.parviglumis

Z. diploperennis

Z. luxurians

Metafases mitóticas de Maíz

Z. perennis

Aplicaciones del GISH En híbridos y poliploides naturales o artificiales:  Conocer del origen de un híbrido interespecífico  Reconocer los cromosomas de cada especie parental

 Establecer las relaciones genómicas entre las especies parentales.  Estudiar los dominios cromosómicos de los genoma parentales.  Detectar cromosomas introgresados y translocaciones. Solanaceas

Hordeum x Secale

Elymus scabrifolius

Croccus

DAPI Milium vernale

Nicotiana

Gibasis

GISH

Aplicaciones del FISH Localización física de secuencias particulares: Mapeos cromosómicos Multi-FISH Localización de las secuencias repetidas de los knobs heterocromáticos de maíz y teosintes

Azul: Tinción DAPI Rojo: Secuencia knob 180-bp Verde; Secuencia knob TR-1

Aplicaciones del ISH: Mejoramiento genético - Localización física y genómica de loci transgénicos (FISH + GISH) Transgenes en tabaco

- Detección de introgresiones cromosómicas y translocaciones

Introgresión de Leymus en Triticum

Translocacion intergenómica

Aplicaciones del FISH: Clínica: Detección de Aneuploidías

Célula en interfase de líquido amniótico. Trisomía para el crom. 21 (rojo) y par 13 (verde).

Detección de Deleciones

Metafase hibridada con una sonda para la Deficiencia de esteroide-sulfatasa, causada por una microdeleción en el X y una sonda de centrómero (control).

Multi-GISH

Se combinan las marcas de las sondas, los fluorocromos empleados para la detección y los filtros para la observación.

DNA FIBER FISH EXTENDIDOS DE HEBRAS DE ADN • Se extienden las fibras de ADN sobre portaobjetos. • Se hibridan con clones de parte de genes o secuencias específicas muy cortas.

Fibras de ADN de trigo hibridadas con los fragmentos EcoRI: HMW-1Dx5 (8.7 Kb) y HMW-1Ax1 (7.0 Kb)

Graciela González [email protected]