APROVECHAMIENTO DE ACEITES RESIDUALES DEL PROCESO DE FRITURA COMO SUSTRATO PARA EL DESARROLLO DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE LIPASAS

FRANCISCO JAVIER PEÑA PERDOMO

UNIVERSIDAD DE LA SABANA FACULTAD DE INGENIERIA INGENIERIA DE PRODUCCION AGROINDUSTRIAL CHIA 2006

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APROVECHAMIENTO DE ACEITES RESIDUALES DEL PROCESO DE FRITURA COMO SUSTRATO PARA EL DESARROLLO DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE LIPASAS

FRANCISCO JAVIER PEÑA PERDOMO

Proyecto de grado para optar al titulo de Ingeniero de Producción Agroindustrial

Director ERLIDE PRIETO Esp. Ingeniería Ambiental

Asesor MARIA CLEMENTINA CUETO Msc. Microbiología de Alimentos

UNIVERSIDAD DE LA SABANA FACULTAD DE INGENIERIA INGENIERIA DE PRODUCCION AGROINDUSTRIAL CHIA 2006

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Nota de aceptación

____________________________________ ____________________________________ ____________________________________

____________________________________ Presidente del Jurado

____________________________________ Jurado

____________________________________ Jurado

Chía, Enero de 2006

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A DIOS POR SER MI GUIA, A MI FAMILIA, A MI UNICO AMOR, A MI DIRECTORA Y ASESORA Y A TODAS Y CADA UNA DE LAS PERSONAS QUE INTERVINIERON EN LA FELIZ CONSECUCION DE ESTE OBJETIVO.

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TABLA DE CONTENIDO Pág. RESUMEN ABSTRACT INTRODUCCION 1 Objetivos 2 1. Justificación. 3 2. Marco Teórico. 6 2.1 Aceites vegetales. 6 2.1.1 Producción de Oleaginosas en términos de grasas y aceites en Colombia. 6 2.1.2 Aceite de Palma. 9 2.1.3 Aceites residuales del Proceso de Fritura (ARPF). 11 2.1.3.1 Aspectos generales. 11 2.1.3.2 Degradación de los aceites vegetales. 12 2.1.3.3 Principales reacciones de degradación. 13 2.1.3.4 Entorno comercial. 15 2.2 Crecimiento de microorganismos. 16 2.2.1 Factores que influyen sobre el crecimiento. 16 2.2.1.1 Nutrientes. 17 2.2.1.2 Temperatura. 17 2.2.1.3 Acidez y alcalinidad (pH). 18 2.2.1.4 Disponibilidad de agua. 19 2.2.1.5 Requerimientos de Oxigeno. 19 2.2.2 Microorganismos productores de Lipasas. 20 2.2.3 Investigaciones sobre Microorganismos productores de Lipasas. 23 2.3 Enzimas Microbianas. 26 2.3.1 Lipasas. 27 2.3.2 Hidrólisis de triglicéridos. 29 2.3.3 Principales usos y aplicaciones Industriales. 30 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Materiales. 33 3.1.1 Aceites residuales del proceso de fritura. 33 3.1.2 Material Biológico. 33 3.1.3 Materiales de laboratorio. 34 3.1.4 Reactivos. 34 3.1.5 Equipos. 35 3.2 Métodos. 3.2.1 Esquema de ensayos preliminares. 36

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3.2.2 Diseño experimental. 37 3.3 Métodos fisicoquímicos y microbiológicos. 40 3.3.1 Caracterización de aceites residuales del proceso de fritura. 40 3.3.1.1 Contenido de Humedad. 40 3.3.1.2 Contenido de Nitrógeno. 41 3.3.1.3 Índice de acidez. 43 3.3.1.4 pH. 43 3.3.1.5 Índice de Peróxidos. 44 3.3.1.6 Índice de Rancidez ( Método KREIS). 45 3.3.1.7 Contenido de ácidos grasos libres. 45 3.3.2 Obtención e identificación de microorganismos. 46 3.3.2.1 Determinación de hidrólisis de grasas. 49 3.3.2.2 Aislamiento y mantenimiento de cepas. 49 3.3.3 Medios de cultivo sólidos. 49 3.3.4 Medios de cultivo líquidos. 51 3.3.5 Determinación preliminar de las condiciones más apropiadas de desarrollo de los tres microorganismos en medio de cultivo complejo. 51 3.3.6 Ensayo para determinación de crecimiento de los microorganismos en medio MCE-1 y MCE-2. 53 3.3.7 Análisis de Turbidimetría. 53 3.3.8 Ensayo de actividad enzimática y producción de biomasa en medio líquido. Ensayos preliminares. 54 3.3.9 Proceso de hidrólisis de triglicéridos por acción enzimática. 55 4. RESULTADOS Y ANALISIS 4.1 Caracterización fisicoquímica en cuanto a calidad de los aceites residuales del proceso de fritura (ARPF). 57 4.1.1 Contenido de humedad. 57 4.1.1.1 Datos de la estandarización del reactivo de Karl-Fisher. 57 4.1.1.2 Datos para la determinación de humedad del Blanco(Metanol). 58 4.1.1.3 Datos de la determinación de humedad de los tres tipos de ARPF utilizados. 59 4.1.2 Contenido de nitrógeno. 60 4.1.3 Índice de acidez. 61 4.1.4 pH. 62 4.1.5 Índice de peróxidos. 62 4.1.6 Índice de rancidez. (Método de Kreiss). 63 4.2 Pruebas preliminares microbiológicas. 64 4.2.1 Obtención de muestras de mantequilla. 64 4.2.2 Obtención de muestras de frutos maduros de palma africana. 64 4.2.3 Resultados de desarrollo de Microorganismos a las 24 Horas después de sembrados a 37ºC. 65 4.2.4 Aislamiento e identificación de colonias formadas en los medios

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de cultivo. Evaluación preliminar de los parámetros de pH, temperatura y ausencia o presencia de agitación. 4.3.1 Crecimiento a pH 5.0 y 7.0. 4.3.2 Crecimiento a Temperatura de 28ºC, 37ºC, y 45ºC. 4.3.3 Crecimiento en medio de cultivo con presencia y ausencia de agitación. 4.4 Ensayo de actividad enzimática (hidrólisis de grasas) de los microorganismos utilizados. 4.5 Ensayos preliminares de producción de biomasa y actividad enzimática en medio líquido. 4.5.1 Determinación de crecimiento. 4.5.1.1 Crecimiento de microorganismos en los dos medios de cultivo experimental MCE-1 y MCE-2. 4.5.1.2 Cuantificación de biomasa. 4.5.2 Ensayos preliminares de hidrólisis de triglicéridos. 4.6 Proceso de hidrólisis de triglicéridos por acción enzimática. 4.6.1 Resultados de producción de ácidos grasos libres para cada ARPF utilizado como medio de cultivo para los tres diferentes microorganismos empleados y su respectivo blanco. 4.6.2 Eficiencia de Hidrólisis de triglicéridos por microorganismo para cada medio de cultivo empleado. 4.6.3 Resultados de variación de pH del medio de cultivo con los diferentes ARPF utilizados, los tres microorganismos empleados y su respectivo blanco.

67

4.3

69 69 70 70 72 73 73 74 76 77 78 80 85 86

CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFIA

89 91 92

ANEXOS

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INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Producción anual de desechos Industriales. Tabla 2. Disponibilidad de ARPF en Bogotá D.C. Tabla 3. Principales microorganismos productores de lipasas. Tabla 4. Composición de medio base para hidrólisis de grasas. Tabla 5. Datos para la estandarización del reactivo de Karl-Fisher. Tabla 6. Datos del contenido de humedad de ARPF. Tabla 7. Contenido de Nitrógeno de ARPF. Tabla 8. Índice de acidez de ARPF. Tabla 9. Valores de pH de ARPF. Tabla 10.Valores de me de ARPF. Tabla 11.Resultado de la prueba de Kreiss para ARPF. Tabla 12.Densidad óptica a 600 nm para medio a pH 5.0 y 7.0. Tabla 13.Densidad óptica a 600 nm para medio de cultivo a diferentes temperaturas. Tabla 14.Densidad óptica a 600 nm para medio de cultivo con presencia y ausencia de agitación. Tabla 15.Resultados de hidrólisis de triglicéridos. Tabla 16.Prueba F para hidrólisis de triglicéridos. Tabla 17.Análisis de varianza para valores de pH.

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INDICE DE GRAFICAS

Gráfica 1. Gráfica 2. Gráfica 3. Gráfica 4.

Producción total de la cadena de Oleaginosas. Producción de Oleaginosas, por producto. Consumo aparente de aceite en Colombia. Distribución del aceite de palma por aplicaciones en el mundo para el año 2001. Gráfica 5. Distribución de la producción de ARPF por sectores en Bogotá. Gráfica 6. Condiciones más apropiadas de crecimiento para los tipos de microorganismos empleados. Gráfica 7. Variación de porcentaje de ácidos grasos libres en el MCE-2 con ARPF de empanadas colombianas. Gráfica 8. Variación de porcentaje de ácidos grasos libres en el MCE-2 con ARPF de Frisby. Gráfica 9. Variación de porcentaje de ácidos grasos libres en el MCE-2 con ARPF de KFC. Gráfica 10. Variación de pH en el MCE-2 con ARPF de empanadas Colombianas. Gráfica 11.Variación de pH en el MCE-2 con ARPF de Frisby Gráfica 12.Variación de pH en el MCE-2 con ARPF de KFC.

Pág. 7 8 9 10 15 71 80 81 82 85 87 87

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INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6.

Titulador Titrino 702 SM. Digestor y equipo para manejo de gases. Destilador. Potenciómetro. Frutos maduros de palma africana. Siembra y aislamiento microbiano de muestra de mantequilla en medio de cultivo con mantequilla. Figura 7. Siembra y aislamiento microbiano de muestra de mantequilla en medio de cultivo con Lecitina. Figura 8. Siembra y aislamiento microbiano de muestra de fruto de palma en medio de cultivo con mantequilla. Figura 9. Siembra y aislamiento microbiano de muestra de fruto de palma en medio de cultivo con Lecitina. Figura 10. Resultados de la Tinción de Gram. Figura 11. Resultados de la Tinción de Gram. Figura 12. Actividad lipolítica de microorganismos aislados de mantequilla. Figura 13. Actividad lipolítica microorganismos aislados de palma. Figura 14. Actividad lipolítica Pseudomona aeruginosa. Figura 15. Crecimiento del microorganismo aislado de mantequilla. Figura 16. Crecimiento del microorganismo aislado de palma. Figura 17. Crecimiento de Pseudomona aeruginosa. Figura 18. Muestras de MCE-2 con ARPF de Empandas colombianas. Figura 19. Papel filtro con aceite-biomasa.

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INDICE DE DIAGRAMAS

Pág. Diagrama 1. Reacción general catalizada por las lipasas en medio natural.

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Diagrama 2. Proceso de prensado de fruto de palma para obtención y aislamiento de microorganismos.

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INDICE DE ANEXOS A. Composición de aceites residuales del proceso de fritura. B. Datos experimentales de variación de pH en función del tiempo por microorganismo y sustrato. C. Datos experimentales de variación de porcentaje de ácidos grasos libres en función del tiempo, por microorganismo y sustrato. D. Siembras de muestras de aceite residual de fritura en medio base. E. Análisis de varianza para los valores de porcentaje de ácidos grasos libres y pH para medio de cultivo con ARPF de empanadas colombianas. F. Resultados de la prueba de Tukey y prueba de Dunnett para porcentaje de ácidos grasos libres y pH en el medio de cultivo con ARPF de empanadas colombianas. G. Resultados de la prueba de Tukey para los datos de porcentaje de ácidos grasos libres y pH en medio de cultivo con ARPF de empanadas colombianas en función del tiempo. H. Análisis de varianza para los valores de porcentaje de ácidos grasos libres y pH para medio de cultivo con ARPF de Frisby. I. Resultados de la prueba de Tukey y prueba de Dunnett para porcentaje de ácidos grasos libres y pH en el medio de cultivo con ARPF de Frisby. J. Resultados de la prueba de Tukey para los datos de porcentaje de ácidos grasos libres y pH en medio de cultivo con ARPF de Frisby en función del tiempo. K. Análisis de varianza para los valores de porcentaje de ácidos grasos libres y pH para medio de cultivo con ARPF de KFC. L. Resultados de la prueba de Tukey y prueba de Dunnett para porcentaje de ácidos grasos libres y pH en el medio de cultivo con ARPF de KFC. M. Resultados de la prueba de Tukey para los datos de porcentaje de ácidos grasos libres y pH en medio de cultivo con ARPF de KFC en función del tiempo.

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ABSTRACT Three residual oils of fritter (ARPF) were used as substrate for the growth of microorganisms that produce lipases and its physicochemical properties were analyzed. The microorganisms were isolated from homemade butter and the fruit of palm oil and initially identify by Gram stain as Gram negative bacilli, also a strain of Pseudomona aeruginosa was used in the study. The lipolitic activity was evaluated on lecithin agar and the conditions for the growth of the microorganisms were evaluated at different conditions of pH (5.0 and 7.0) and temperature (28, 37 and 45ºC), with and without agitation on TSB broth. The experimental cultivation was carryout in two types of substrates, one composed of ARPF only and the second one mainly of ARPF and a tampon to regulate the pH. The experiment was hold during 96 hours at conditions adequate for the growth of the microorganisms and the production of free fatty acids was measured as percentage of oleic acid through the time. It was made totally at random by means of a factorial experimental design with parcels subdivided in the time. The three microorganisms show lipolitic activity by the appearance of halos around the colonies growth on lecithin agar. The conditions for adequate growth were of 37ºC, pH 7.0 with continuous agitation. None of the microorganisms survived in the means of cultivation only composed by ARPF. The three microorganisms showed production of free fatty acids during the first 24th and 48th hours of treatment in the different cultivation means composed by ARPF and tampon of phosphate of sodium; however the appearance of free fatty acid can not be attributed only to the microorganisms, because the control samples also showed an increase in its acidity. Because characteristics of the means of cultivation it was not possible to collect data of produced biomass.

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RESUMEN Tres aceites residuales de fritura (ARPF) fueron utilizados como sustrato para el desarrollo de microorganismos productores de lipasas. A estos se les analizaron sus propiedades fisicoquímicas. Se aislaron microorganismos de mantequilla casera y del fruto de palma de aceite, los cuales fueron inicialmente identificados mediante Tinción de Gram; además se utilizó una cepa de Pseudomona aeruginosa. Se evaluó la actividad lipídica de los microorganismos y luego se determinaron las condiciones adecuadas de crecimiento cultivándolos en medio TSB a pH 5.0 y 7.0, temperatura de 28, 37 y 45 ºC en presencia y ausencia de agitación. Una vez establecidas estas condiciones, se inocularon en los medios de cultivo experimentales, uno compuesto solo por ARPF y otro compuesto principalmente por ARPF y un tampón para neutralizar el pH. Se sometieron a un tratamiento por 96 horas a las condiciones adecuadas de crecimiento y se midió el porcentaje de ácidos grasos libres producidos por cada microorganismo en cada tipo de sustrato a través del tiempo. Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con parcelas divididas en el tiempo. Los tres microorganismos presentaron actividad lipásica al formar halos alrededor de las colonias sembradas en medio base, y las condiciones favorables de crecimiento fueron de 37ºC, pH 7.0 y agitación continua. Ninguno de los microorganismos sobrevivió en el medio de cultivo compuesto únicamente por ARPF. Los tres microorganismos presentaron producción de ácidos grasos libres durante las primeras 24 y 48 horas de tratamiento en los diferentes medios de cultivo compuestos por ARPF y tampón de fosfato de sodio; pero por el comportamiento que toma el blanco dentro del experimento no se puede atribuir sólo a los microorganismos la producción de ácidos grasos libres. Por las condiciones propias del medio de cultivo no se pudieron obtener datos de biomasa producida por microorganismo en cada sustrato.

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INTRODUCCION Este proyecto busca determinar la posibilidad de aprovechar los aceites residuales del proceso de fritura de diferentes fuentes (KFC, Frisby, y Empanadas Colombianas) como sustrato para el desarrollo de microorganismos lipolíticos que fueron previamente aislados de mantequilla casera y fruto de palma de aceite. En la primera parte del trabajo se muestra la importancia del sector de oleaginosas en Colombia en términos de aceites y grasas. Los inconvenientes ambientales que originan los aceites residuales del proceso de fritura, así como la producción estimada para la ciudad de Bogotá y el manejo actual que se le está dando a este tipo de residuos. Se hace referencia a la importancia que tiene este tipo de microorganismos en el área de la biotecnología, por su amplio uso y aplicación en la producción de Lipasas. La segunda parte explica la metodología experimental utilizada basada en un modelo factorial, las técnicas de identificación y aislamiento de microorganismos, y la hidrólisis de ácidos grasos por acción enzimática. Los resultados y análisis se dividen en tres partes, los ensayos preliminares de obtención, aislamiento e identificación de microorganismos lipolíticos, así como las condiciones más apropiadas de pH, temperatura y agitación para su crecimiento. Se ensayaron dos sustratos experimentales con un alto porcentaje de aceite residual de fritura (ARPF) para evaluar crecimiento y actividad lipídica de los microorganismos aislados y posteriormente se procedió a valuar la hidrólisis de ácidos grasos por acción enzimática en el sustrato rico en ARPF.

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OBJETIVOS

Objetivo General Aprovechar los aceites residuales del proceso de fritura de diferentes empresas (KFC, Frisby, Empanadas Colombianas) como sustrato para el desarrollo de microorganismos productores de Lipasas.

Objetivos Específicos •

Caracterizar fisicoquímicamente, tres tipos de aceites residuales del proceso de fritura utilizados en la industria alimentaría (KFC, Frisby, y Empanadas Colombianas).

•

Obtener y aislar cepas silvestres capaces de desarrollarse en medios con contenido graso (lipídicos), a partir de un fruto maduro de palma africana y mantequilla casera.

•

Seleccionar

las

condiciones

más

apropiadas

de

crecimiento

(pH,

temperatura y ausencia o presencia de agitación) de los microorganismos aislados. •

Evaluar los microorganismos aislados para determinar su capacidad de desarrollo en cada sustrato y determinar su eficiencia en la producción de ácidos grasos libres.

•

Identificar las condiciones de operación más favorables para el desarrollo y conservación de los microorganismos productores de lipasas de acuerdo a los resultados obtenidos.

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1. JUSTIFICACION Durante las últimas décadas una de las principales preocupaciones de los líderes mundiales ha estado centrada en el tema medioambiental, propiamente en lo referente al impacto negativo de las emisiones de gases producto de la combustión en automotores y en el manejo y aprovechamiento de residuos. Es claro que el mundo en el que vivimos ha sido víctima del desarrollo y evolución del hombre. La tecnología y el creciente desarrollo industrial traen consigo la generación de volúmenes considerables de desechos, los cuales aun no estamos en disposición de manejar de la manera más adecuada y eficiente. Las estimaciones de producción anual de desechos industriales en países encuestados en 1993, nos muestran que es necesario disminuir y/o aprovechar de manera integral las materias primas que se requieren para la producción de cualquier producto industrial y los subproductos generados dentro de cada proceso. (Tabla 1.) Tabla 1. Producción anual de desechos Industriales en América latina y el Caribe. Toneladas 0,075 X 10^6 0,82 X 10^6 4 X 10^6 40,16 X 10^6 0,3 X 10^6 1,31 X 10^6

Lodos NP Lodos P Liquidos NP Liquidos P Solidos NP Solidos P

Fuente OPS, 1994, Serie ambiental No 14

NP : No Peligrosos P : Peligrosos

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Los aceites residuales del proceso de fritura (ARPF) provenientes de la Industria alimentaria, que por sus condiciones fisicoquímicas, no son aptos para seguir siendo usados en el procesamiento de comestibles, se originan principalmente en los procesos que involucran fritura profunda de alimentos, la cual utiliza temperaturas mayores a 180ºC. La exposición del aceite a altas temperaturas, así como su reutilización generan cambios graduales tanto en su composición química y física como en sus propiedades organolépticas, afectando la calidad de los alimentos y del aceite. Actualmente se conocen prácticas inadecuadas con respecto al uso de los ARPF, algunas de estas son: i) uso reiterado y sin reemplazo del aceite aún cuando se ha deteriorado totalmente, ii) fritura indiscriminada de una amplia variedad de alimentos por intervalos de tiempos prolongados, lo que acelera los procesos de degradación, iii) recolección y recuperación artesanal de los aceites gastados de diversas fuentes, los que posteriormente son reingresados al mercado informal de comidas rápidas a un costo menor. iv) uso de los ARPF como base para la fabricación de comida para animales (Quiñones, 2003). El 20 % de todas las transformaciones reportadas a nivel biotecnológico son realizadas con lipasas. Estas son producidas por diversas especies de microorganismos, los cuales tienen gran versatilidad de operación. La importancia de los microorganismos radica principalmente en su capacidad de excretar al medio extracelular este tipo de enzimas que tienen aplicaciones en detergentes, aceites y grasas, industrias lácteas y farmacéuticas. (Xiu-Gong Gao, 2000). Los procesos industriales que involucran reacciones químicas para la obtención de un producto determinado necesitan un catalizador para acelerar la velocidad de reacción; desde hace muchas décadas los más comúnmente utilizados son los ácidos sulfúrico, fosfórico, clorhídrico, y las bases como el NaOH y el KOH. Sin embargo

su

uso

puede

tener

algunas

desventajas

en

procesos

de

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transesterificación o esterificación de aceites y grasas debido a problemas de separación entre catalizadores alcalinos solubles en alcohol, lo que hace difícil su reutilización o el aprovechamiento de subproductos, además de lo que implica su tratamiento y disposición final. (Quiñones, 2003). Este trabajo plantea el aprovechamiento de los aceites residuales del proceso de fritura como sustrato para el desarrollo de microorganismos productores de lipasas, las cuales al ser catalizadores biológicos representarían una ventaja medioambiental y económica en el momento de poder producirlas a bajos costos, además de requerir menores temperaturas de reacción respecto a los catalizadores químicos, lo que favorece los costos totales de producción.

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2. MARCO TEORICO

2.1 ACEITES VEGETALES Los aceites y grasas vegetales son sustancias orgánicas, formadas por los ésteres de ácidos grasos y glicerina a los que se denominan glicéridos; la glicerina puede estar mono, di o triesterificada por los ácidos grasos, en cuyo caso se forman los mono, di o triglicéridos. Además de los ésteres de la glicerina, el aceite contiene pequeñas cantidades de vitaminas, fosfátidos (lecitinas), esteroles, colorantes (carotenos, clorofila y xantofilas), agua e hidrocarburos que constituyen el material insaponificable (Mirasolain, 1998). Los triglicéridos son los acilglicéridos más abundantes en la naturaleza

y los

principales componentes de todas las grasas y aceites ya que representan más del 95 % de su composición. Las características físicas y químicas de los triacilglicéridos dependen fundamentalmente del tipo, la concentración y la forma de distribución de los ácidos grasos en las tres posiciones (Badui, 1996).

2.1.1 PRODUCCION DE OLEAGINOSAS EN TERMINOS DE GRASAS Y ACEITES EN COLOMBIA. El sector de aceites y grasas es importante dentro del conjunto de la industria colombiana de alimentos, debido a los vínculos que los productos de este sector tienen tanto en la propia industria de alimentos como con otras actividades productivas (Ministerio de Agricultura, 2004). La producción total de oleaginosas en términos de aceites y grasas se ha venido incrementando en los últimos años, tal como lo muestra las gráficas 1 y 2. Para el país esta es una de las industrias con mayor importancia debido a su aporte

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dentro de la balanza comercial. En Colombia el eslabón primario de la cadena productiva depende básicamente del cultivo de palma. Gráfica 1. Producción total de la cadena de Oleaginosas.

Fuente: Cadena Oleaginosas, Aceites y grasas 2004. Ministerio de Agricultura. Entre 1993 y 2003, la cadena representó en promedio el 3,2% de la producción industrial, con una generación de 7.053 empleos directos en 2003, esto es, el 1,3% del total de empleo industrial (Ministerio de Agricultura, 2004). De acuerdo con la información de producción del DANE el 81,3% de la producción de la cadena se distribuye en cinco eslabones: mantecas compuestas para mesa y cocina (28%), aceite crudo de palma africana (17,4%), margarina (12,9%), aceites mezclados

para

mesa

y

cocina

(12,1%)

y

aceite

refinado

de

soya

(10,6%)(Ministerio de Agricultura, 2004).

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Gráfica2. Producción de Oleaginosas, por producto.

Fuente: Ministerio de Agricultura.2004. La gráfica 3 muestra la estimación del consumo aparente de los principales aceites producidos (ajonjolí, algodón, coco, aceite crudo de palma, aceite refinado de palma, aceite crudo de palmiste, refinado de palmiste, crudo y refinado de soya, crudo y refinado de girasol, crudo y refinado de maíz, ricino, crudo y refinado de oliva, margarina), exportados e importados en Colombia. Dicha estimación se realiza como la suma del volumen producido e importado, menos la cantidad exportada en el mismo año. Así mismo se presenta el consumo per cápita en Kg por habitante (Ministerio de Agricultura, 2004).

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Gráfica 3. Consumo aparente de aceite en Colombia.

Fuente: Ministerio de Agricultura.2004.

2.1.2 ACEITE DE PALMA Aspectos generales La palma de aceite es el cultivo oleaginoso de mayor producción de aceite por unidad de superficie; con un contenido del 50% en el fruto, puede rendir de 3.000 a 5.000 Kg. de aceite de pulpa por hectárea, más 600 a 1.000 Kg de aceite de palmiste. El aceite extraído de palma por su característica y composición, es una materia prima con diversidad de aplicaciones. El aceite de pulpa y el de palmiste (almendra), se emplean para producir margarina, manteca, aceite de mesa y de cocina y jabones. Además, el aceite de pulpa se usa en la laminación de acero

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inoxidable, concentrados minerales, aditivos para lubricantes, crema para zapatos, tinta de imprenta, velas, etc.; se usa también en la industria textil y del cuero, en la trefilación de metales y en la producción de ácidos grasos y vitamina A (Pérez, D. y Pinilla C, 2003). El gráfico 4 resume las aplicaciones de aceite de palma en el mundo (Fedepalma, 2001).

Gráfico 4. Distribución del aceite de palma por aplicaciones en el mundo para el año 2001. Entorno comercial La industria del aceite de palma en Colombia se ha limitado a tres aspectos: i) La extracción del aceite crudo y su posterior refinación, ii) aplicaciones en la industria de alimentos como frituras, margarinas, mantecas, cremas, helados, iii) exportaciones, en donde más del 25 % se corresponde a aceite crudo de palma (Ministerio de Agricultura, 2004).

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2.1.3 ACEITES RESIDUALES DEL PROCESO DE FRITURA (ARPF) 2.1.3.1 Aspectos generales Los aceites residuales del proceso de fritura (ARPF) son aceites provenientes de la industria de alimentos, que por sus condiciones fisicoquímicas y uso intensivo, no son aptos para seguir siendo usados en el procesamiento de comestibles. Se originan principalmente en los procesos que involucran fritura profunda de los alimentos, los cuales utilizan elevadas cantidades de aceite, ya que requieren la inmersión completa del alimento a temperaturas elevadas (mayores a 180 °C). Los riesgos sanitarios que implica el uso de ARPF como base en los alimentos para animales, han sido demostrados por diversos estudios (Cuesta, 1991), pues concentraciones indeseables de materias contaminantes provenientes de la degradación química del aceite pueden ser cancerígenas. Las materias contaminantes también sufren un efecto de bioacumulación, que aumenta su concentración a lo largo de la cadena alimentaria. Los ARPF constituyen uno de los residuos de mayor impacto ambiental en el sector de alimentos, ya que si se descargan a los sistemas de alcantarillado elevan la carga orgánica, por encima de los niveles normales que se manejan en aguas domésticas afectando los tratamientos posteriores (Quiñones, 2003). Actualmente, en otros países como Chile, existe como alternativa de disposición la entrega del residuo en instalaciones que lo mezclan con otros aceites y solventes para ser utilizado como combustible alternativo en cementeras (empresas como Hidronor, Bravo Energy, Ingraser).

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2.1.3.2 Degradación de los aceites vegetales La práctica de recolectar y reutilizar los ARPF genera un alto riesgo para la salud de los consumidores ya que de acuerdo con el tipo de alimento sometido a fritura, éste absorbe entre un 5 y un 20% del aceite utilizado, por lo que puede aumentar en forma importante la cantidad de compuestos peligrosos como los que aporta un aceite degradado al alimento (Franco, 2001). Entre los compuestos que se generan por la degradación del aceite se encuentran: Volátiles: Las reacciones oxidativas que implican la formación y descomposición de hidroperoxidos conducen a compuestos tales como aldehídos saturados e insaturados, cetonas, hidrocarburos, lactonas, alcoholes, ácidos y esteres. Tras el calentamiento del aceite durante 30 minutos a 180 ºC, en presencia de aire, pueden detectarse por cromatografía en fase gaseosa productos de oxidación volátiles primarios. La cantidad de productos volátiles varía ampliamente, dependiendo del tipo de aceite, el alimento y el tratamiento térmico, pero generalmente alcanza un valor meseta, debido probablemente a que se alcanza un equilibrio entre la formación de volátiles y su pérdida por evaporación o descomposición.

Compuestos polares no poliméricos de volatilidad moderada (Hidroxi y epoxi ácidos): Estos compuestos se producen a lo largo de varias rutas oxidativas, en las que participan los radicales alcoxi. Dímeros y polímeros de ácidos y glicéridos: Estos compuestos se generan por combinaciones térmicas y oxidativas de radicales libres. La polimerización produce un aumento sustancial de la viscosidad del aceite de fritura. Ácidos grasos libres: Estos compuestos se producen por hidrólisis de los triacilgliceroles, por el calentamiento en presencia de agua (Fennema, 2000).

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Las reacciones descritas son responsables de diversos cambios físicos y químicos observables en el aceite a lo largo de la fritura. Entre estos cambios, cabe citar el incremento de la viscosidad y del contenido en ácidos grasos libres, el desarrollo de un color oscuro, el descenso del índice de yodo y la tensión superficial, la modificación del índice de refracción y un aumento en la tendencia a la formación de espuma. El deterioro de los aceites vegetales es inevitable cuando se emplean a altas temperaturas; sin embargo, no todos los aceites se degradan de la misma manera ya que depende del tipo y cantidad de ácidos grasos que contengan. Los aceites con bajo contenido de ácidos grasos insaturados (aceite de palma), son mucho más estables que los aceites con alto contenido de ácidos grasos insaturados (aceite de oliva, colza o soya). Con el fin de mejorar la estabilidad térmica de los aceites insaturados, es común el uso de mezclas con aceites saturados, por ejemplo soya-oleína de palma (en proporciones que no superan el 30 % de oleína) (Du Plessis, 1981). 2.1.3.3 Principales reacciones de degradación. Hidrólisis En contacto con la humedad del alimento, los triglicéridos liberan cadenas de ácidos grasos, incrementándose la acidez del aceite con aparición de metilcetonas y lactonas que pueden producir olores desagradables. Durante la fritura, a temperaturas de 180 – 190 ºC el proceso de hidrólisis tiene poca importancia puesto que la humedad tiende a eliminarse en forma de vapor, aunque algunos autores describen contenidos de agua del 0.5 al 1.5 % (Du Plessis, 1981). Oxidación térmica o Autooxidación La autooxidación es un proceso oxidativo no enzimático muy frecuente en los procesos de fritura; se caracteriza por la oxidación de los ácidos

grasos en

13

presencia del oxigeno del aire, que da lugar a compuestos intermedios inestables denominados hidroperóxidos y peróxidos (formadores de radicales libres). La descomposición térmica de los hidroperóxidos produce gran cantidad de productos de escisión y material de alto peso molecular, especialmente dímeros, que en presencia de oxígeno forman grandes cantidades de grupos hidroxilo y carbonilo. Los ácidos grasos insaturados son los más sensibles a la autooxidación. Las grasas que han sufrido un proceso de oxidación tienden a oscurecerse, aumentar la viscosidad, incrementar la formación de espuma y sabores y olores desagradables. El cambio en el color, se produce por la transformación de las sustancias presentes en los alimentos como azúcares, almidones y proteínas que sufren reacciones de Maillard (Cuesta, 1991). Polimerización Los polímeros formados provienen en su gran mayoría de los ácidos grasos poliinsaturados y radicales libres que tienden a combinarse entre ellos formando compuestos lineales más o menos largos y ramificados o compuestos cíclicos. La polimerización se debe a la descomposición de los peróxidos, que forman radicales alquílicos y agua, que a su vez atacan a otros hidroperóxidos produciendo más radicales que finalmente se dimerizan. Los polímeros, al aumentar de tamaño y peso molecular, incrementan la viscosidad del aceite favoreciendo la formación de espuma y por tanto la oxidación; por otro lado, producen un arrastre mayor de aceite por parte del producto frito debido a que gotea con más dificultad. Estos forman en la superficie del aceite y los freidores una capa de consistencia plástica, muy adherente y difícil de eliminar.

14

2.1.3.4 Entorno comercial Los ARPF ofrecen una alternativa de bajo costo y aceptable disponibilidad como materia prima para la producción de biodiesel. Estudios realizados en 7 países de la unión Europea muestran que se recolectan cerca de 400.000 ton de ARPF por año, y se espera que esta cifra pueda incrementarse a 700.000 ton. En Bogotá, un estudio realizado por CORPODIB en el año 2002, con relación a la producción anual de ARPF de diversas fuentes, establece la distribución de las principales fuentes productoras de estos en la ciudad. Los resultados se muestran en el gráfico 5. Gráfico 5. Distribución de la producción de ARPF por sectores en Bogotá

Fuente: CORPODIB 2002 El estudio revela también la producción de ARPF gastados por sectores, donde se destacan las empresas dedicadas al servicio de alimentos para empresas, grandes industrias de comidas rápidas (McDonalds, Presto, Wimpy, El Corral, etc.), cadenas de asaderos de pollo (La Brasa Roja, Frisby, KFC, etc.), hoteles (La Fontana, Tequendama, Hotel Dann, Radisson, etc.). Las cifras consolidadas sobre los anteriores productores y que no incluyen restaurantes independientes y otras fuentes informales en la tabla 2.

15

Tabla 2. Disponibilidad de ARPF en Bogotá D.C. Origen

Disponibilidad anual (ton)

Asaderos de pollo

130.11

Alimentos para empresas

128.4

Comidas rápidas

104.16

Hoteles

26.9

TOTAL

389.6

Fuente: CORPODIB 2002 La producción reportada corresponde al 25 % estimación total anual de producción de ARPF en Bogotá que es de 1500 toneladas.

2.2 CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS El crecimiento se define como un incremento en el número de células microbianas en una población, lo cual también puede ser medido como un incremento en la masa microbiana.

2.2.1 Factores que influyen sobre el crecimiento. La velocidad de crecimiento varía con el tipo de célula microbiana y también en función de las condiciones medioambientales físicas y químicas. En general, el tiempo para que se duplique la biomasa aumenta con la complejidad del organismo, de forma que los tiempos de duplicación medios para las células animales y vegetales son substancialmente mayores que los de los mohos y las levaduras, que a su vez son mayores que los de las bacterias. Las actividades microbianas se ven muy afectadas por las condiciones fisicoquímicas del ambiente. Los organismos pueden tolerar algunas condiciones adversas, que propasadas, no les permiten crecer y por lo tanto debemos

16

distinguir entre las condiciones ambientales y sus efectos sobre la viabilidad y su reproducción. Los factores más importantes son: disponibilidad de nutrientes, temperatura, pH, disponibilidad de agua y oxígeno (Madigan, 1998).

2.2.1.1

Nutrientes

Los microorganismos requieren de nutrientes para su energía y crecimiento. El mayor requisito para cualquier célula es tener una fuente de carbono y de nitrógeno. De igual manera requiere en menores cantidades de otros nutrientes menos importantes como azufre, fósforo, potasio y magnesio. Muchos estudios de biotecnología han utilizado aceites vegetales como fuente de carbono para el crecimiento de microorganismos productores de lipasas y así mismo la posterior caracterización y purificación de la enzima (Kamikura, 1999).

2.2.1.2 Temperatura. Puede afectar a los microorganismos vivos de dos formas muy diferentes. A medida que la temperatura sube, las reacciones enzimáticas son más rápidas y el crecimiento se acelera. Sin embargo por encima de una cierta temperatura, las proteínas, ácidos nucleicos y otros compuestos celulares pueden dañarse irreversiblemente. Para cada microorganismo existe una temperatura mínima por debajo de la cual no existe crecimiento, una temperatura óptima a la cual el crecimiento es el más rápido posible y una temperatura máxima, propasada la cual no existe crecimiento.

17

2.2.1.3 Acidez y alcalinidad (pH) Cada organismo tiene un rango de pH dentro del cual es posible el crecimiento y normalmente posee un pH óptimo muy bien definido. La mayoría de los ambientes naturales tienen valores de pH de 5.9, y los organismos con pH óptimo equivalente son los habituales. Sólo unas pocas especies pueden crecer a pH inferior a 2 o mayor a 10. Los hongos como grupo, tienden a ser más tolerantes al ácido que las bacterias. Según el pH los microorganismos se pueden clasificar en acidófilos pH bajos, neutrófilos con pH neutros, alcalófilos con pH óptimo de 10-11. Independientemente

de

las

condiciones

extremas

en

que

vivan

los

microorganismos (pH del medio extracelular), el pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad, con el objeto de impedir la destrucción de las macromoléculas hábiles en condiciones ácidas o alcalinas. Tampones En un cultivo con medio no renovado, el pH puede cambiar durante el crecimiento como consecuencia de las reacciones metabólicas. Por ello frecuentemente se emplean tampones para mantener constante el pH del medio de cultivo. Estas soluciones amortiguadoras funcionan solamente en rangos estrechos de pH por lo que para valores de pH diferentes hay que utilizar soluciones distintas.

18

2.2.1.4 Disponibilidad de agua. Todos los microorganismos requieren agua y la disponibilidad de ella es un factor importante para el crecimiento microbiano en la naturaleza. La mayoría de los microorganismos son incapaces de prosperar en ambientes con muy baja actividad de agua, de modo que o bien simplemente mueren, o se deshidratan y pasan a condiciones estáticas. Cuando un organismo crece en un medio con baja actividad de agua, solo puede obtener agua del ambiente para llevar acabo sus reacciones metabólicas aumentando la concentración interna de solutos. Esto puede llevarse a efecto, bien bombeando iones hacia el interior celular o sintetizando o concentrando un soluto orgánico.

2.2.1.5 Requerimientos de Oxigeno Los microorganismos pueden ser clasificados de acuerdo a sus requerimientos de oxigeno en: •

Aeróbicos: requieren necesariamente de oxigeno para crecer.

•

Microaerófilos: Son aerobios que pueden utilizar este gas solo cuando su tensión es más baja que la del aire.

•

Anaeróbicos: Carecen de sistemas respiratorios y no pueden utilizar el oxigeno como aceptor terminal de electrones.

•

Anaerobios facultativos: Pueden crecer en ausencia o presencia de oxigeno.

•

Anaerobios estrictos: mueren en presencia de oxigeno

19

2.2.2 MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE LIPASAS La importancia de estos microorganismos radica en la capacidad que tienen para producir una gran variedad de enzimas y excretarlas al medio extracelular, siempre y cuando se hallen bajo las condiciones adecuadas de desarrollo. Comercialmente se producen enzimas, de un gran número de microorganismos capaces de producir lipasas, entre los principales productores se encuentran bacterias, levaduras, y hongos. El proceso de producción es usualmente aeróbico, y los medios de cultivo similares a los empleados en las fermentaciones para producir antibióticos (Madigan, 1998). Entre los microorganismos productores de Lipasas tenemos: Tabla 3. Principales microorganismos productores de lipasas. Origen Fúngico

Origen Bacteriano

Rhizomucor meihei

Chromobacterium viscosum

Pencillium cambertii

Pseudomonas cepacia

Humicola lanuginosa

Pseudomonas aeruginosa

Rhizopus oryzae

Pseudomonas fluorescens

Candida rugosa

Pseudomonas fragi

Candida antarctica Lipase A

Bacillus thermocate nulatus

Candida antarctica Lipase B

Staphylococcus hyicus

Aspergillus niger

Staphylococcus aereus

Geotrichium candidum

Staphylococcus epidermidis

Fuente: Anna University Chennai. 2005 www.au-kbc.org De los microorganismos productores de lipasas más importantes, esta el perteneciente al grupo de las Pseudomonas. Todos los géneros de este grupo son bacilos rectos o curvos con flagelos polares, pero no vibroides; tamaño 0.5-1.0

20

µm, sin esporas. Las Pseudomonas son un grupo importante de bacilos Gramnegativos; flagelo polar único o múltiples, sin vainas, apéndices o yemas, metabolismo respiratorio nunca fermentativo, aunque puede producir pequeñas cantidades de ácido a partir de glucosa

aeróbicamente. Utilizan compuestos

orgánicos, no polímeros, algunos son litotróficos, usando H2 o CO como único donador de electrones; algunos pueden utilizar arginina como fuente de energía en forma anaeróbica. Las características de identificación clave son la ausencia de formación de gas a partir de glucosa y la prueba oxidasa positiva, ambas ayudan a distinguir las Pseudomonas de las bacterias entéricas. Los representantes de este género tienen en la mayor parte de los casos, requerimientos de nutrición muy sencillos y se desarrollan organotróficamente a valores neutros de pH y a temperaturas entre los límites de las mesófilas. Una de las propiedades más sorprendentes de las Pseudomonas es la capacidad para utilizar una amplia variedad de compuestos orgánicos como fuentes de carbono y donadores de electrones para la generación de energía (Meehan, 2002). Numerosas investigaciones se han centrado en la purificación y caracterización de lipasas a partir de Pseudomonas spp (Domínguez, 2002). El desarrollo de Pseudomonas se detiene a aw de (0.97-0.98), son fácilmente destruidas por el calor, crecen mal si disponen de poco oxígeno, son poco resistentes a la deshidratación y su crecimiento es pobre o nulo por encima de 43 ºC. La Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, que en medios de cultivo produce colonias de color azul-verdoso debido a la producción de pigmentos. Se encuentra ampliamente difundida en la naturaleza en íntima asociación con medios húmedos.

21

Es un microorganismo que crece bien en la mayor parte de los medio habituales de laboratorio, entre ellos MacConkey y Levine. No fermenta ningún carbohidrato y es capaz de crecer a temperaturas de 42ºC. En Agar Sangre da lugar a colonias de morfología variable, en ocasiones α-hemolíticas y con un olor característico a fruta. Elabora pigmentos hidrosolubles que colorean el agar como la “piocianina” de color azul, “pioverdina” de color verde y “piorrubina” de color rojo. Es la única especie que produce piocianina, característica que se puede utilizar para su identificación. La producción de pigmentos se puede potenciar recurriendo a medios especiales como, por ejemplo, el King A y el King B. Además existen medios selectivos para el aislamiento de P.aeruginosa a partir de muestras contaminadas como heces y esputo como son el Agar Cetrimida y el Agar Irgarsen. (Meehan, 2002). Identificación de la Pseudomona aeruginosa Las características que ayudan a la identificación de P.aeruginosa son: •

Crecimiento en la mayor parte de los medios de cultivo.

•

En Agar Sangre da colonias azul-verdosas con olor afrutado Catalasa y Oxidasa+.

•

Reducción de Nitratos.

•

Crecimiento a 42ºC.

•

En Agar de Kligler produce un crecimiento en superficie sin viraje del medio.

•

Oxidación de Glucosa en un medio de Oxidación-Fermentación.

•

Hidrólisis de Arginina.

•

No decarboxilan ni Lisina ni Ornitina.

•

Tolerancia a la Cetrimida.

22

2.2.3 Investigaciones sobre Microorganismos productores de Lipasas. R.E Andersson, 1980. La producción de lipasas no es función del número total de la bacteria Pseudomona fluorescens. La temperatura óptima de crecimiento bacteriano y producción de lipasa fue de 20ºC y 8ºC respectivamente. La actividad lipolítica fue estudiada en emulsión de aceite de oliva a temperaturas de 8 y -30ºC. Las óptimas condiciones de producción de enzimas generalmente difieren de las del crecimiento bacteriano. La temperatura óptima de producción de lipasas es a menudo más baja que la del crecimiento microbiano y esta no es función del crecimiento total de células. Una única bacteria lipolítica fue aislada de un sistema de crecimiento selectivo que consistió en 99% triglicéridos (aceite de soya) y 1% fase acuosa, en condiciones de 37ºC y agitación de 500 rpm. La bacteria fue identificada como Pseudomona aeruginosa YS-7, la cual fue capaz de crecer en un ambiente de bajo contenido de agua con un tiempo de generación de 3 horas y pudo sobrevivir al estrés de agua en un medio rico en triglicéridos. Esta bacteria es altamente tolerante a altas concentraciones de sales ácidas grasas derivadas de la hidrólisis bacteriana del aceite. El crecimiento fue acompañado de hidrólisis de triglicéridos, el cual continuó ocurriendo incluso después del crecimiento de saturación hasta que el agua fue totalmente gastada. Las lipasas de este tipo de microorganismos son generalmente inducidas con esteres de ácidos grasos y en algunos casos ácidos grasos libres, sirven como inductores. En muchos casos los microorganismos funcionan en una emulsión diluida de aceite-agua donde un área interfacial alta y larga es disponible para la degradación y utilización de triglicéridos como sustrato. Con condiciones de limitación extrema de agua es necesario hidrolizar los triglicéridos para utilizar los ácidos grasos para el crecimiento (Shabtai, 1991). Una lipasa extracelular de Pseudomona aeruginosa YS-7, fue producida, purificada y caracterizada en solución acuosa y solventes orgánicos. Se utilizó un

23

medio con 5%(wt/vol) de aceite de soya. Más del 95% de la actividad fue encontrada en el sobrenadante. La lipasa hidrolizó varios ésteres de ácidos grasos en un pH óptimo de 7.0 y un rango de temperatura de 20 a 55ºC (Shabtai y Noemí,1992). Pseudomona alcaligenes M-1 secreta lipasas alcalinas las cuales tienen excelentes características para la remoción de manchas grasas bajo condiciones de lavado modernas. Se encontró que la bacteria no es capaz de crecer en presencia de glucosa y requirió de sustratos alternos para su desarrollo. Las condiciones de fermentación fueron por medio de inducción con aceite de soya para el desarrollo de biomasa a pH 7 y 35ºC (Gerritse, 1998). Lipasas de Pseudomona aeruginosa LP 602 fue aislada de aguas domesticas. La enzima exhibió una máxima actividad a pH 8, a 55ºC la enzima no fue estable. Las condiciones de operación fueron 30ºC con agitación de 200 rpm por 48 horas. Se utilizó aceite de soya como inductor. (Dharmsthiti, 1998). El pH y la temperatura óptima fueron de 7.0-9.0 y 45-60ºC, respectivamente. Con una agitación de 150 rpm a 30ºC por 72 horas respectivamente para la lipasa extracelular de Pseudomonas sp.

Utilizando aceite de soya como fuente de

carbono (Dong y Shujuan, 1999). Un rendimiento de 87.5 U/ml se obtuvo a partir de la lipasa de una especie de Pseudomona. Esta tuvo una máxima actividad a pH 9.0 y 45ºC. La actividad de agua óptima fue de 0.5 y 0.6. La lipasa fue utilizada con éxito para la glicerólisis de aceite de palma en la producción de monogliceridos. Las condiciones de operación fueron 30ºC a 200 rpm por 3 a 5 días. Se utilizó aceite de oliva como medio enriquecido dando por hecho que si un microorganismo es capaz de crecer en aceite de oliva, es capaz de producir lipasas. Los efectos de varios inductores en la producción de lipasas mostraron que ácidos grasos de cadena corta (número

24

de carbonos 90 min.

Color Lovibond 5 ¼

Amarillo Rojo

30

1 – 1.5

Antioxidante

120 ppm

Fuente: Team. Tecnología empresarial de alimentos S.A

Aceite de Frisby:

Aceite puro 100 % vegetal Aceite refinado de soya y oleica de palma. Antioxidante BHTTBHQ Acido cítrico Fuente: Ficha técnica del aceite.

Aceite de KFC: No fue posible adquirir su información.

96

ANEXO B Datos experimentales de variación de pH en función del tiempo, por microorganismo y sustrato.

Tiempo Microorganismo Sustrato Muestra 1 E.C 2 3 1 Aislado de KFC 2 mantequilla 3 1 Frisby 2 3 1 E.C 2 3 1 Aislado de KFC 2 Palma 3 1 Frisby 2 3 1 E.C 2 3 1 Pseudomona KFC 2 aeruginosa 3 1 Frisby 2 3 1 E.C 2 1 Blanco KFC 2 1 Frisby 2

0 7,13 7,13 7,13 7,23 7,23 7,23 7,22 7,22 7,22 7,13 7,13 7,13 7,23 7,23 7,23 7,22 7,22 7,22 7,13 7,13 7,13 7,23 7,23 7,23 7,22 7,22 7,22 7,13 7,13 7,23 7,23 7,22 7,22

24 7,04 6,91 6,89 7,13 6,81 6,97 7,07 7,34 7,21 6,98 6,94 7,07 7,11 7,00 7,06 7,05 7,28 7,17 7,04 6,86 6,70 6,98 7,11 7,05 7,20 7,08 7,14 6,95 6,99 7,00 7,00 7,12 7,12

48 6,41 6,83 6,62 6,63 6,98 6,28 6,68 6,65 6,71 7,10 7,11 7,11 6,55 6,55 6,55 6,65 6,60 6,70 6,53 6,92 6,73 6,61 6,60 6,61 6,35 6,30 6,40 6,90 6,94 6,56 6,58 6,60 6,66

72 6,55 6,50 6,53 6,90 6,85 6,95 6,84 6,80 6,88 6,48 6,44 6,46 6,94 6,98 6,90 6,71 6,70 6,72 6,52 6,90 6,71 6,80 6,75 6,85 6,69 6,62 6,76 7,05 7,11 6,90 6,94 6,86 6,86

96 6,73 6,70 6,72 6,94 6,90 6,98 6,78 6,91 6,85 7,01 7,00 7,01 7,17 6,99 7,08 6,44 6,74 6,59 7,01 6,90 6,96 6,82 7,20 7,01 6,53 6,50 6,56 6,98 7,00 7,18 7,18 6,86 6,80

97

ANEXO C Datos experimentales de variación de porcentaje de ácidos grasos en función del tiempo, por microorganismo y sustrato.

Tiempo Microorganismo Sustrato Muestra 1 E.C 2 3 1 Aislado de KFC 2 mantequilla 3 1 Frisby 2 3 1 E.C 2 3 1 Aislado de KFC 2 Palma 3 1 Frisby 2 3 1 E.C 2 3 1 Pseudomona KFC 2 aeruginosa 3 1 Frisby 2 3 1 E.C 2 1 Blanco KFC 2 1 Frisby 2

0 0,026 0,026 0,026 0,033 0,033 0,033 0,012 0,012 0,012 0,026 0,026 0,026 0,033 0,033 0,033 0,012 0,012 0,012 0,026 0,026 0,026 0,033 0,033 0,033 0,012 0,012 0,012 0,026 0,026 0,033 0,033 0,012 0,012

24 0,50 0,40 0,47 0,40 0,50 0,51 0,30 0,30 0,36 0,30 0,40 0,30 0,50 0,50 0,41 0,30 0,29 0,26 0,31 0,31 0,36 0,50 0,50 0,50 0,31 0,34 0,36 0,30 0,30 0,72 0,68 0,20 0,20

48 0,20 0,30 0,30 0,50 0,48 0,44 0,40 0,46 0,46 0,20 0,30 0,28 0,50 0,48 0,44 0,40 0,44 0,44 0,30 0,40 0,23 0,50 0,52 0,56 0,40 0,46 0,46 0,28 0,32 0,50 0,50 0,28 0,32

72 0,30 0,20 0,28 0,45 0,48 0,43 0,33 0,36 0,30 0,30 0,20 0,23 0,46 0,48 0,44 0,31 0,33 0,30 0,20 0,20 0,26 0,48 0,49 0,49 0,36 0,38 0,34 0,49 0,51 0,60 0,60 0,25 0,21

96 0,20 0,20 0,15 0,40 0,40 0,46 0,20 0,30 0,22 0,20 0,20 0,12 0,40 0,50 0,40 0,20 0,20 0,22 0,30 0,20 0,13 0,40 0,45 0,50 0,30 0,29 0,28 0,51 0,49 0,41 0,39 0,20 0,20

98

ANEXO D Siembras de muestras de aceite residual de fritura en medio base.

99

ANEXO E Análisis de varianza para los valores de porcentaje de ácidos grasos libres (%FFA) Y pH para medio de cultivo con ARPF de empanadas colombianas: %FFA Dependent Variable: ffa Source

DF

Sum of Squares

Mean Square F Value Pr > F

Model

26

1.03085135

0.03964813

0.06880000

0.00245714

Error

28

Corrected 54 Total

Source

1.09965135

R-Square

Coeff Var

Root MSE

ffa Mean

0.937435 DF

20.62899

0.049570 Type I SS

0.240291 Mean Square F Value Pr > F

Micro 3 Muestra(Micro)7 tiempo 4 Micro*tiempo 12 Source

16.14