Ingenier´ıa y Ciencia, ISSN 1794–9165 Volumen 3, n´ umero 6, diciembre de 2007, p´ aginas 41–62

Aprovechamiento del residuo agroindustrial del mango com´ un (Mangifera indica L.) en la obtenci´ on de az´ ucares fermentables Usage of the common mango agroindustrial waste (mangifera indica L.) in the destraction of fermentables sugars L. F. Mej´ıa Giraldo1 , H. A. Mart´ınez Correa2 , J. E. Betancourt Guti´errez3 y C. E. Castrill´on Casta˜ no4 Recepci´ on: 14-feb-2007 /Modificaci´ on: 16-jul-2007 /Aceptaci´ on: 25-jul-2007 Se aceptan comentarios y/o discusiones al art´ıculo

Resumen El residuo del mango com´ un (Mangifera indica L.) es un material vegetal que contiene gran cantidad de tejido lignocelul´ osico, el cual puede ser aprovechado para la obtenci´ on de metabolitos fermentables y productos de la fermentaci´ on. En este trabajo se aplicaron tratamientos de hidr´ olisis al residuo del mango com´ un con el fin de hacer la conversi´ on de sus polisac´ aridos a unidades de az´ ucares fermentables. Se aplic´ o hidr´ olisis ´ acida a tres concentraciones diferentes de ´ acido sulf´ urico diluido. Tambi´en, se aplic´ o hidr´ olisis enzim´ atica con 1

Especialista Ciencia y Tecnolog´ıa de Alimentos, [email protected], profesor, Universidad de San Buenventura, Santiago de Cali–Colombia. 2 MSc Ingenier´ıa Qu´ımica, [email protected], profesor, Universidad Nacional de Colombia, Palmira–Colombia. 3 Ingeniero agroindustrial, [email protected], egresado, Univesidad Nacional de Colombia, Palmira–Colombia. 4 Ingeniero Agroindustrial, [email protected], egresado, Univesidad Nacional de Colombia, Palmira–Colombia. Universidad EAFIT

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Aprovechamiento del residuo agroindustrial del mango com´ un (Mangifera indica L.) en la obtenci´ on de az´ ucares fermentables dos tipos de enzimas comerciales a diferentes concentraciones en las condiciones de trabajo est´ andar. De igual manera se aplic´ o hidr´ olisis t´ermica a dos temperaturas diferentes. A cada tratamiento aplicado se le efectuaron pruebas de concentraci´ on de az´ ucares totales, concentraci´ on de az´ ucares reductores, porcentaje de celulosa y hemicelulosa residual, datos con los cuales se determinaron los mejores tratamientos y se procedi´ o a efectuar combinaciones de los mejores tratamientos de hidr´ olisis. El tratamiento m´ as significativo de las pruebas individuales fue el de hidr´ olisis ´ acida a 0,50 % v/v de ´ acido sulf´ urico a 80◦ C por una hora. En los tratamientos combinados el resultado m´ as significativo fue el tratamiento en el que se combinaron la hidr´ olisis enzim´ atica (como pretratamiento) m´ as una hidr´ olisis t´ermica e hidr´ olisis ´ acida. Por razones de seguridad en el uso de reactivos, as´ı como eliminaci´ on de efectos colaterales adversos para la fermentaci´ on alcoh´ olica posterior, se seleccion´ o el procedimiento que involucra la hidr´ olisis t´ermica como pretratamiento y la hidr´ olisis enzim´ atica como tratamiento principal, como el tratamiento de mejor aplicaci´ on en la producci´ on de metabolitos fermentables a partir de residuos de mango com´ un con finalidad producci´ on de alcohol posteriormente. Estudios posteriores han permitido abordar la hidr´ olisis por v´ıa microbiana con Aspergillus niger y Trichoderma viride, as´ı como la fermentaci´ on alcoh´ olica postratamiento hidrol´ıtico usando los estudios previos. La hidr´ olisis y fermentaci´ on alcoh´ olica simult´ aneas, y m´ as recientemente y en ejecuci´ on la simultaneidad de los procesos adicionando una levadura recombinante que tiene capacidad de fermentar az´ ucares de cinco carbonos. Palabras claves: residuo de mango com´ un o mango hilacha, az´ ucares, celulosa, hemicelulosa, lignina, pectina, hidr´ olisis ´ acida, hidr´ olisis enzim´ atica, hidr´ olisis t´ermica, fermentaci´ on alcoh´ olica.

Abstract The common mango waste (Mangifera indica L.) is a vegetable material containing a high level of lignocelluloses tissue which can be used to obtain fermentable metabolites and fermentation products. In this study hydrolysis treatments were applied to the common mango in order to make the conversion of its polysaccharides to fermentable sugar units. Acid hydrolysis was applied to three different concentrations of dilute sulphuric acid. An enzymatic hydrolysis with two types of commercial enzymes to different concentrations in standard work conditions, was also applied. In addition, a thermic hydrolysis was applied at two different temperatures. At each treatment, the following tests were applied: total sugar concentration, reduced sugar concentration, and percentage of cellulose and hemicellulose residuals. Based on the data obtained from the tests, the best treatments were identified and so the best combinations of the best hydrolysis treatments were carried out. The most significant treatment for individual tests was acid hydrolysis at 0, 50% v/v sulphuric acid at 80◦ C for one hour. In the combined treatments the most

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relevant result was the treatment that combined the enzymatic hydrolysis (as pretreatment) plus a thermic hydrolysis and acid hydrolysis. For security reasons in the reagents use, as well as in the elimination of collateral adverse effects for further alcoholic fermentation, a procedure involving thermic hydrolysis as pretreatment and enzymatic hydrolysis, was chosen as the main treatment with the most appropriate application in the fermentable metabolites production from common mango waste in order to produce alcohol. Further studies have allowed approaching the hydrolysis via microbial with Aspergillus niger and Trichoderma viride, as well as the alcoholic fermentation post-treatment hydrolytic using previous studies. The simultaneous hydrolysis and alcoholic fermentation, and recently performing the simultaneity of the processes, adding a recombining yeast that has the capacity to ferment sugars from five carbons. Key words: mangos waste, sugars, cellulose, hemicellulose, acid hydrolysis, enzimatic hydrolysis, thermic hydrolysis, alcoholic fermentation.

1

Introducci´ on

El estudio presentado es un pre´ambulo del proyecto “Aprovechamiento de los residuos agroindustriales en la producci´on de metabolitos de alto valor agregado”, el cual puede ser un gran elemento de partida para la mejor utilizaci´on de los recursos y la disminuci´on de la contaminaci´on ambiental generada por la industria colombiana, y en particular por la agroindustria de pulpas y jugos. Los resultados mencionados corresponden al estudio continuo que se inici´o en el a˜ no 2002 y que contin´ ua en desarrollo, present´andose los avances logrados hasta el 2005. La utilizaci´on de materiales lignocelul´osicos viene siendo investigada intensamente, debido a que estos representan el mayor componente de los residuos agr´ıcolas y desechos agroindustriales en el mundo, y constituyen una fuente abundante y segura de recursos renovables y energ´ıa. Sin embargo, actualmente en Colombia estos residuos est´an siendo subutilizados en la mayor´ıa de los casos causando serios problemas de contaminaci´on ambiental por la deficiencia en disposici´on final, a pesar de que son potencialmente buenos para ser utilizados como materia prima en la producci´on de az´ ucares, alimento para animales, biomasa microbiana, producci´on de ´acidos org´anicos y alcoholes, entre otros. Volumen 3, n´ umero 6

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En el departamento del Valle del Cauca se procesan aproximadamente 351,5 toneladas/semana de mango com´ un por parte de la agroindustria de pulpas y jugos, generando un problema serio de contaminaci´ on ambiental con los residuos obtenidos. Solamente en el despulpado de mango se generan cerca de 50−55 % de residuos, es decir, aproximadamente 193,32 toneladas/semana, representados en c´ ascara, semillas, restos de pulpa y fibra [1]; este rubro ha aumentado en un 30 %, valores revisados a septiembre de 2006. Este proyecto genera las condiciones adecuadas para el aprovechamiento de residuos en la producci´on de residuos fermentables con el fin de producir insumos con mayor valor agregado como es el caso del etanol. La obtenci´on de combustibles l´ıquidos a partir de biomasa agr´ıcola ha despertado gran inter´es en los u ´ltimos a˜ nos. La necesidad de encontrar carburantes para motores de explosi´on que no dependan del petr´oleo es evidente, adem´ as de ser una alternativa importante para disminuir la contaminaci´on ambiental. La utilizaci´on de diversos residuos agr´ıcolas es una propuesta lo suficientemente importante para producir biocombustibles y as´ı reducir la dependencia exclusiva en este sentido de la ca˜ na de az´ ucar, generando con ello valor agregado, permitiendo el desarrollo social de las comunidades comprometidas con el uso racional de materias primas y los residuos. Estos residuos son materiales constituidos en su mayor parte por tejidos lignocelul´osicos, los cuales se deben someter previamente a diferentes tipos de tratamientos hidrol´ıticos para poder aprovecharlos favorablemente en la producci´on de compuestos susceptibles de fermentaci´on (glucosa, fructosa, manosa, xilosa, entre otros) elementos esenciales para la producci´on de diferentes compuestos de alto valor agregado.

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Metodolog´ıa

El material utilizado en la realizaci´on del trabajo fue el residuo del mango com´ un (Mangifera indica L.) proveniente de la industria despulpadora de frutas, que comprende la c´ ascara o pericarpio y residuos de fibra y pulpa. La materia prima se someti´o a secado con el fin de remover el agua para conservaci´on del material y aplicar tratamientos de hidr´olisis sobre el material rehidratado. El secado del material se prolong´o hasta extraer aproximada-

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mente el 70 % de la humedad. El proceso de secado se realiz´o en un secador de bandejas con aire caliente a una temperatura de 45◦ C. A la materia prima seca, se le realizaron pruebas como: az´ ucares totales (M´etodo de Antrona), az´ ucares reductores (M´etodo DNS), contenido de fibra, con el fin de obtener datos iniciales (testigo) para comparar con los datos que se obtuvieron del proceso hidrol´ıtico, adem´as de un an´alisis proximal para caracterizar el residuo de mango. El material seco fue molido en molino de discos y tamizado para obtener un tama˜ no de part´ıcula a trav´es de tamiz N. 60, el cual diluye sin problemas en el agua y facilita la hidr´olisis por la ampliaci´on del ´area de contacto [2]. Para determinar la proporci´on de hidrataci´on del material seco para tratamientos de hidr´olisis, se realizaron ensayos con soluciones de 2,5; 5; 10 y 20 % p/v de materia seca, se decidi´o que la mejor condici´on de la muestra para la hidr´olisis es la soluci´on al 2,5 % p/v, con la cual se trabajaron las pruebas experimentales del proyecto.

2.1

An´ alisis Proximal

En el an´alisis proximal se determinaron los porcentajes de prote´ına bruta, cenizas totales, grasa bruta, extracto libre de nitr´ogeno (carbohidratos) y agua. • Determinaci´ on del contenido en materia seca (AOAC 1990. 934,01) [3] • Determinaci´ on del contenido de cenizas (AOAC 1990. 942,05) [3] • Determinaci´ on del contenido en grasa (m´ etodo soxhlet, AOAC 1990. 920,39) [3] • Determinaci´ on del contenido en prote´ına bruta (m´ etodo de Kjeldahl) • Determinaci´ on del contenido de fibra (m´ etodo Ankom) Volumen 3, n´ umero 6

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• Determinaci´ on de az´ ucares totales (m´ etodo de antrona - Dubois, 1956) [4]. Fundamento: la reacci´on de antrona constituye la base de un m´etodo conveniente para la determinaci´on de hexosas, aldopentosas y ´acidos hexour´onicos, bien sea que est´en libres o formando parte de los polisac´aridos. La soluci´on azul–verdosa muestra la absorci´on m´axima a 625 nm. La lectura se realiz´o en un espectrofot´ometro de tipo UV–1603 SHIMADZU. • Determinaci´ on de az´ ucares reductores (m´ etodo DNS - Miller, 1959) [5]. Fundamento: el ´ acido 3,5 dinitrosalic´ılico en presencia de calor reduce el ´ acido 3–amino–5 nitrosalic´ılico por los az´ ucares reductores presentes, desarroll´andose un color amarillo caf´e el cual es estable hasta por 24 horas. La lectura se realiza a 575 nm. Este m´etodo permite medir las unidades reductoras presentes en los az´ ucares. La lectura se realiz´o en un espectrofot´ometro de tipo UV–1603 SHIMADZU. 2.1.1 Hidr´ olisis ´ acida. La hidr´olisis ´ acida se llev´o a cabo con ´acido sulf´ urico diluido, adicionado a la soluci´on 2,5 % p/v de materia prima a temperatura de 80◦ C y por un tiempo de una hora. En el proceso de hidr´olisis ´acida se realizaron pruebas preliminares, debido a que se ten´ıan diferentes concentraciones de ´acido (0,25; 0,50; 0,75; 1; 2; 3; 4 y 5 %), y se determinaron las tres concentraciones m´as eficientes en la hidr´olisis, en cuanto a producci´on de az´ ucares reductores se refiere. 2.1.2 Hidr´ olisis enzim´ atica. La hidr´olisis enzim´atica se efectu´o con dos tipos de enzimas comerciales: Celluclast 1,5 L y Pectinex ultra SPL (Novo Nordisk Ferment). La primera enzima es una celulasa que act´ ua sobre la celulosa y la hidroliza, y la segunda es una pectinasa–celulasa que desdobla los complejos de pectina y celulosa. Las concentraciones de las enzimas (Celluclast y Pectinex ultra SPL) se determinaron con base en las especificaciones y par´ametros de la ficha t´ecnica de cada enzima comercial las cuales contienen informaci´on acerca de la actividad, rangos de temperatura y pH, concentraci´on y tiempo, en la cual la enzima presenta condiciones ´optimas de actividad en un sustrato determinado. En el caso de Pectinex Ultra SPL, la enzima no ten´ıa un rango de concentraci´on para la utilizaci´on definido, raz´on por la cual se decidi´o hacer pruebas con concentraciones tales como: 200, 400 y 600

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ppm; con base en experiencias previas de hidr´olisis en maceraci´on de jugos de frutas pulposas [6]. Para la enzima comercial Celluclast 1,5 L, se ten´ıa un rango espec´ıfico de 400 a 1000 ppm de concentraci´on, seg´ un la ficha t´ecnica. Por tal raz´on, se realizaron pruebas a concentraciones diferentes de enzima: 400, 600 y 800 ppm en la soluci´on de mango com´ un.

2.1.3 Hidr´ olisis t´ ermica. Se efectuaron con autoclavado (mezcla l´ıquido– vapor) y a temperatura de ebullici´on a presi´on atmosf´erica durante una hora. Este procedimiento se efectu´o teniendo en cuenta dos temperaturas de prueba (T1 = 98◦ C, presi´on atmosf´erica y T2 = 125◦ C, 1,4 bar). Despu´es de cada tratamiento se efectuaron pruebas de concentraci´on de az´ ucares reductores, concentraci´on de az´ ucares totales y determinaci´on de fibra (celulosa y hemicelulosa) en porcentaje. Cada experimento se realiz´o por triplicado, los datos obtenidos en el dise˜ no experimental se les aplic´o un an´alisis de varianza (GLM–ANOVA) a trav´es del programa SAS, adicionalmente se realiz´o una prueba de significancia posterior al an´alisis de varianza denominada Prueba de DUNCAN con el fin de verificar las diferencias de los tratamientos aplicados al material. En el an´alisis de varianza, para deducir la incidencia de un tratamiento en las variables de respuesta el factor P r > F debe ser menor de 0,05, este valor indica la significancia de los datos. En la prueba de significancia para medias de DUNCAN la categorizaci´on de los tratamientos deben poseer letras distintas para demostrar las diferencias significativas entre tratamientos, o letras iguales para indicar la similitud de los datos de un tratamiento a otro.

3

Resultados

Caracterizaci´ on del residuo de mango com´ un (Mangifera indica L.) El an´alisis proximal se presenta en la tabla 1. Se puede apreciar que el contenido de carbohidratos es alto, lo cual lo hace un material de excelentes condiciones para la obtenci´on de metabolitos fermentables, en la medida que estos est´an constituidos principalmente por celulosa.

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Tabla 1: caracterizaci´ on del residuo de mango com´ un (Mangifera indica L.) Composici´ on Materia Seca Humedad Prote´ına Extracto Et´ereo Cenizas Carbohidratos Celulosa Hemicelulosa pH

3.1

Porcentaje ( %) 31,45 68,55 7,03 5,5 3,48 15,44 14,21 4,88 4,2

Pruebas preliminares

mg AR/mg material seco

3.1.1 Pruebas preliminares para hidr´ olisis ´ acida. En la figura 1 se puede observar que las tres concentraciones en las cuales se obtiene mayor cantidad de az´ ucares reductores son a 0,25; 0,50 y 0,75 %, raz´on por la cual se eligieron para practicar el tratamiento de hidr´olisis ´acida y compararlos con los resultados de los dem´as tratamientos. 0,5000 0,4500 0,4000 0,3500 0,3000 0,2500 0,2000 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 H

25 0, A_

H

50 0, A_

H

75 0, _ A

H

1 A_

H

2 A_

H

3 A_

H

4 A_

H

5 A_

Concentracion de acido (%)

Figura 1: concentraci´ on de az´ ucares reductores vs. concentraci´ on de ´acido sulf´ urico

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mg AR/mg material seco

3.1.2 Pruebas preliminares para hidr´ olisis enzim´ atica. La concentraci´on de enzima de mayor rendimiento en producci´on de az´ ucares reductores (figura 2) es 600 ppm, pero con respecto a la concentraci´on de 200 ppm y 400 ppm, no se presenta una alta diferencia. Esta cercan´ıa en el valor de los datos de az´ ucares reductores, y el alto costo de las enzimas son razones suficientes para decidirse por la concentraci´on de 200 ppm, ya que la producci´on de az´ ucares reductores es muy similar en los tres tratamientos. El mayor contenido de az´ ucares reductores se obtiene con 800 ppm de la enzima, pero las otras dos concentraciones de enzima tienen producci´on similar de az´ ucares reductores, por lo cual no existen diferencias marcadas entre los tres tratamientos. Por esta raz´on y debido al alto costo del tratamiento con enzimas, se decidi´o utilizar la menor concentraci´on de enzima, es decir, 400 ppm para la comparaci´on con otros tratamientos (figura 3). 0,3720 0,3700 0,3680 0,3660 0,3640 0,3620 0,3600 0,3580 200

400

600

Concentracion de enzima (ppm)

Figura 2: concentraci´ on de az´ ucares reductores versus Concentraci´ on de enzima Pectinex Ultra SPL

3.1.3 Pruebas preliminares para hidr´ olisis t´ ermica. No se practicaron pruebas preliminares al m´etodo de hidr´olisis t´ermica y se realizaron las pruebas definitivas con las variables propuestas inicialmente (T1 = 98◦ C y T2 = 125◦ C). Volumen 3, n´ umero 6

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mg AR/mg material seco

obtenci´ on de az´ ucares fermentables

0,2920 0,2900 0,2880 0,2860 0,2840 0,2820 0,2800 400

600

800

Concentracion de enzima (ppm)

Figura 3: concentraci´ on de az´ ucares reductores versus Concentraci´ on de enzima Celluclast 1,5 L

3.2

An´ alisis estad´ıstico

Respecto a los datos obtenidos experimentalmente para las variables de respuesta (az´ ucares reductores, az´ ucares totales, % celulosa y % hemicelulosa), tabla 2, se presenta un nivel de confiabilidad por encima del 99 %, es decir, son altamente significativos con respecto a cada tratamiento practicado. Se escogieron los mejores tratamientos preliminares en cada caso para su an´alisis. Los datos de valor medio (media estad´ıstica) con la misma letra no presentan diferencias significativas. Tabla 2: an´ alisis Duncan para hidr´ olisis ´acida, enzim´ atica y t´ermica Tratamiento

Valor medio Valor medio Valor medio Valor medio (mg Az. Re- (mg Az. % de % de Hemiductores/mg totales/mg Celulosa celulosa materia seca) materia seca)

Sin tratamiento H2 SO4 0, 25 % H2 SO4 0, 50 % H2 SO4 0, 75 % Pectinex 200 ppm Celluclast 400 ppm 98◦ C 125◦ C

0,23347 0,34850 0,46053 0,29890 0,37743 0,28853 0,31120 0,31913

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E B, C A D B D D C, D

0,67367 0,44577 0,51127 0,49590 0,41653 0,42367 0,51807 0,48260

A C, D B B, C D D B B, C

14,2167 6,3833 3,1733 1,9833 11,1500 10,1767 12,3467 11,1900

A D E E B, C C B B, C

4,8867 4,5300 1,9700 1,8367 3,6533 2,3533 2,0800 2,0233

A A, B C C B C C C

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Entre las variables de respuesta, las de mayor relevancia son los az´ ucares reductores y la celulosa, ya que son los mejores indicadores de la degradaci´on y conversi´on de tejido lignocelul´osico en az´ ucares fermentables y cantidad de celulosa residual, figuras 4 y 5.

mg AR, AT/mg ms

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

S

in

o nt ie m ta tra

A H

0,

25

A H

0,

5 A H

0,

75

ex tin c Pe

2

00

pp

m t4

as cl

00

pp

m

o

T H

98

C

o

T H

5 12

C

u el C Concentraciones mg AR mg AT

Figura 4: concentraci´ on de az´ ucares en los tratamientos

3.2.1 Hidr´ olisis ´ acida. En la hidr´olisis ´acida, espec´ıficamente a concentraci´on de 0,50 %, se presenta la mayor producci´on de az´ ucares reductores, lo cual la hace la de mayor eficiencia en cuanto a producci´on de metabolitos fermentables se refiere. Los az´ ucares reductores tienden a reducir su concentraci´on por encima de la concentraci´on de ´ acido sulf´ urico al 0,50 %, debido a que el ´acido en mayor concentraci´on degrada los az´ ucares fermentables. Los az´ ucares totales tienden a reducirse cuando aumenta la concentraci´on de ´acido, formando compuestos diferentes derivados de la degradaci´on de azucares del material. Estos compuestos (´acidos org´anicos, compuestos arom´aticos, entre otros) pueden tener una alta incidencia sobre procesos fermentativos que se lleven a cabo en el material hidrolizado, provocando inhiVolumen 3, n´ umero 6

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16 14 12

%

10 8 6 4 2 0 Sln tratamiento

HA 0,25

HA 0,50

HA 0,75

T ra t a m ie nt os

Celulosa %

Pectinex 200 ppm

Celuclast 400 ppm

o

HT 98 C

o

HT 125 C

Hemicelulosa %

Figura 5: porcentaje de celulosa y hemicelulosa en los tratamientos

bici´on e inactividad de los microorganismos [7]. Seg´ un el an´alisis estad´ıstico (GLM–ANOVA), se presentan diferencias significativas entre los tres tratamientos de hidr´olisis ´ acida, con mayor significancia para la hidr´olisis a 0,50 % de concentraci´on de ´ acido sulf´ urico, tabla 2. El contenido de hemicelulosa en el material desciende a medida que se eleva la concentraci´on de ´ acido sulf´ urico, ya que a mayor concentraci´on de ´acido el tratamiento tiende a ser m´as agresivo degradando mayor cantidad de hemicelulosa. De igual manera se representa la din´amica de reducci´on de contenido de celulosa, la cual alcanza su mayor degradaci´on a una concentraci´on de 0,75 % de ´acido sulf´ urico, pero los az´ ucares reductores a esta concentraci´on son menores. Esta variaci´on muestra que el a´cido sulf´ urico a mayor concentraci´on degrada mayor cantidad de celulosa y no necesariamente convirti´endolos a az´ ucares, sino que los transforma en otro tipo de compuestos tales como ´acido ac´etico, furfural e hidroximetilfurfural y compuestos arom´aticos derivados de la lignina que pueden inhibir un eventual proceso de fermentaci´on posterior [8]. Seg´ un el an´alisis estad´ıstico (GLM–ANOVA), se presentaron diferencias

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significativas en la reducci´on de celulosa y hemicelulosa en los tratamientos con hidr´olisis ´acida a 0,25 y 0,50 %, y no se present´o diferencia significativa entre los tratamientos de 0,50 y 0,75 % en cuanto a reducci´on de celulosa y hemicelulosa, tabla 2. 3.2.2 Hidr´ olisis enzim´ atica. Desde el punto de vista de la hidr´olisis enzim´atica, la mayor producci´on de az´ ucares reductores la tuvo la enzima Pectinex Ultra SPL a 200 ppm, debido a la hidr´olisis de la pectina presente en el residuo del mango com´ un, como en todas las dem´as frutas. En el proceso de hidr´olisis enzim´atica, las dos enzimas tuvieron una concentraci´on similar de az´ ucares totales. La conversi´on de pectina a ´acido galactur´onicos se reporta como az´ ucares totales seg´ un la t´ecnica de detecci´on utilizada, lo cual no es del todo cierto considerarlos como az´ ucares fermentables [6]. Seg´ un el an´alisis estad´ıstico (GLM–ANOVA) se presentaron diferencias significativas entre los dos tratamientos enzim´aticos, en cuanto a az´ ucares reductores, obteniendo mayor significanc´ıa el tratamiento con Pectinex Ultra SPL, tabla 2. El porcentaje de degradaci´on de celulosa fue menor en el tratamiento con Pectinex, ya que la enzima ataca prioritariamente la pectina y en menor medida la celulosa. La enzima Celluclast 1,5 L, actu´o selectivamente sobre la celulosa obteniendo rendimientos superiores a la enzima Pectinex en la hidr´olisis de esta mol´ecula. La celulosa que se degrad´o, en su mayor´ıa, se convirti´o en az´ ucares reductores, ya que la celulosa es una enzima de alta selectividad que garantiza la conversi´on o despolimerizaci´on de la celulosa y la hemicelulosa, en su mayor´ıa, a unidades fermentables de glucosa [9]. La enzima Celluclast, tuvo mayor selectividad en el momento de actuar sobre la hemicelulosa, ya que esta enzima es espec´ıfica para la degradaci´on de celulosa y complejos de celulosa y hemicelulosa [10]. Seg´ un el an´alisis estad´ıstico (GLM–ANOVA), no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos enzim´aticos, en cuanto a celulosa se refiere, pero en cuanto a hemicelulosa, si hubo mayor significancia en el tratamiento con Celluclast 1,5 L, tabla 2. 3.2.3 Hidr´ olisis t´ ermica. El tratamiento t´ermico present´o una producci´on de az´ ucares reductores a´ un mayor que el tratamiento con la enzima Celluclast. El tratamiento con alta temperatura (125◦ C) y presi´on (1,4 bar) tuvo el mayor rendimiento en cuanto a az´ ucares reductores con respecto al trataVolumen 3, n´ umero 6

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miento a 98◦ C y presi´on atmosf´erica. Se aprecia que la reducci´on de az´ ucares totales es menor, lo cual indica que el tratamiento no es tan severo en cuanto a degradaci´on de az´ ucares se refiere, es decir, no se produce alta cantidad de compuestos diferentes a los az´ ucares, sobre todo en la hidr´olisis a 98◦ C. Seg´ un el an´alisis estad´ıstico (GLM–ANOVA) no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos de hidr´olisis, en cuanto a az´ ucares reductores, raz´on por la cual se sugiere trabajar el tratamiento a 98◦ C por razones de ahorro energ´etico, tabla 2. Este tratamiento t´ermico, generalmente, es utilizado como pretratamiento para aplicar posteriormente la hidr´olisis enzim´atica, debido a que separa el complejo celulosa–hemicelulosa facilitando la acci´on de las enzimas sobre cada mol´ecula [10]. El tratamiento t´ermico no es tan severo, sobre todo, en la hidr´olisis a 98◦ C. Por esta raz´on se nota que en los tratamientos t´ermicos la celulosa no resulta tan afectada por la temperatura, lo contrario sucede con la hemicelulosa que si resulta degradada o hidrolizada por el tratamiento t´ermico, es decir, el tratamiento de hidr´olisis t´ermica tiene efectos m´as notables sobre la hemicelulosa y en menor medida sobre la celulosa, tablas 2 y 3. Tabla 3: resultados estad´ısticos entre los mejores tratamientos de hidr´ olisis mg AR/ mg ms H.A 0,50 % 0,46053 A H.E Pectinex 200 ppm 0,37743 B H.T 98◦ C 0,31320 C Tratamiento

mg AT/ % Celulosa mg ms 0,51127 B 3,1733 A 0,41653 C 11,1500 B 0,51807 B 12,3467 B

% Hemicelulosa 1,9700 A 3,6533 B 2,0800 A

Con base en los datos obtenidos se seleccionaron los tres mejores tratamientos, en los cuales se nota una mayor producci´on de metabolitos fermentables (az´ ucares reductores) y mayor hidr´olisis de celulosa y hemicelulosa; en el tratamiento de hidr´olisis ´ acida corresponde a la concentraci´on de 0,50 % de ´acido sulf´ urico, en el tratamiento enzim´atico a la enzima Pectinex Ultra SPL que obtuvo altos niveles de producci´on de az´ ucares reductores y en el trata◦ miento t´ermico una temperatura de 98 C tuvo una buena respuesta, raz´on por la cual puede ser utilizado como pretratamiento para hidr´olisis posteriores. En la hidr´olisis t´ermica la diferencia entre los dos tratamientos no tuvo

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una alta significancia, por lo cual se seleccion´o como mejor tratamiento aquel que demande menor consumo de energ´ıa y equipamiento especial. Con los tratamientos seleccionados se realizaron una serie de combinaciones para determinar cual presentaba mejores resultados en producci´on de metabolitos fermentables. 3.2.4 Tratamientos Combinados. La combinaci´on de los tratamientos fue la siguiente: Tratamiento 1. Hidr´ olisis enzim´atica + (Hidr´olisis ´acida + Hidr´olisis t´ermica) 1. Pectinex Ultra SPL 200 ppm, pH 4,5 y T = 40◦ C, t = 20 minutos. 2. H2 SO4 0,50 % v/v + T = 98◦ C, t = 1 hora. Tratamiento 2. Hidr´ olisis ´ acida + Hidr´ olisis t´ermica 1. H2 SO4 0,50 % v/v + T = 98◦ C, 1 hora. Tratamiento 3. Hidr´ olisis t´ermica + Hidr´olisis enzim´atica 1. T = 98◦ C, t = 1 hora 2. Pectinex Ultra SPL 200 ppm, pH 4,5, T = 40◦ C, t = 20 minutos. La aplicaci´on de tratamientos combinados es una alternativa viable para lograr mayor producci´on de az´ ucares reductores, ya que se mejoran las condiciones de hidr´olisis por la acci´ on de pretratamiento, mejorando los efectos de la hidr´olisis principal, tabla 4. Tabla 4: datos experimentales para tratamientos combinados Tratamiento T1 T2 T3 Volumen 3, n´ umero 6

mg AR/ mg ms 0, 5464 A 0, 4697 C 0, 5338 B

mg AT/ % Celulosa % Hemicelulosa mg ms 0, 5704 C 2, 85 C 2, 09 B 0, 4977 D 3, 14 C 2, 06 B 0, 5876 B 9, 8 B 1, 99 B

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En el caso del tratamiento que combina enzima y ´acido (tratamiento 1), el efecto sin´ergico se refleja en la alta concentraci´on de az´ ucares reductores al final del procedimiento. La enzima act´ ua sobre la pectina y el complejo celulosa–hemicelulosa facilitando la acci´ on hidrol´ıtica del ´acido directamente sobre la mol´ecula de celulosa, figuras 6 y 7. Este procedimiento conlleva a que el ´acido adicionado degrade alguna parte de los az´ ucares reductores formados en la hidr´olisis enzim´atica, lo cual reduce las expectativas potenciales de esta combinaci´on. De manera similar que en el procedimiento individual de hidr´olisis ´acida al 0,50 %, gran parte de los az´ ucares totales son degradados, por la acci´on del ´acido, a compuestos diferentes que pueden resultar inhibidores de la fermentaci´on.

mg AT, AR/mg ms

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Sin tratamiento

2

1

3

T ra t a m ie nt os

mg AR

mg AT

Figura 6: concentraci´ on de az´ ucares totales y reductores para los tratamientos combinados

Para el tratamiento que combina adici´on de ´acido y temperatura de 98◦ C (tratamiento 2) no se encontraron diferencias significativas con respecto al tratamiento con ´ acido al 0,50 % y temperatura de 80◦ C, ya que las diferencias en la temperatura no variaron en gran medida los resultados. Para lograr una diferencia, se debe hacer un tratamiento con temperaturas demasiado elevadas (> 150◦ C) y menores tiempos de exposici´on, lo cual trae consigo altos rendimientos en cuanto a az´ ucares reductores se refiere [10].

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16 14 12

%

10 8 6 4 2 0 Sin tratamiento

1

2

3

Tratamiento % Celulosa

% Hemicelulosa

Figura 7: porcentaje de celulosa y hemicelulosa para los tratamientos combinados

El pretratamiento t´ermico aplicado para efectuar hidr´olisis enzim´atica (tratamiento 3), result´o una excelente estrategia para aumentar la proporci´on de az´ ucares reductores formado aplicando enzima. El pretratamiento modific´o o hidroliz´o la estructura de celulosa–hemicelulosa, liberando unidades de hemicelulosa, las cuales son m´as susceptibles a la hidr´olisis t´ermica. Este pretratamiento permiti´o que la enzima adicionada (Pectinex Ultra SPL) actuara con mayor facilidad sobre la celulosa elevando la concentraci´on de az´ ucares reductores, con respecto a la hidr´olisis enzim´atica sin pretratamiento t´ermico. La selectividad de la enzima no permite altas degradaciones de az´ ucares reductores ya obtenidos en el tratamiento t´ermico y su posible conversi´on a otro tipo de compuestos diferentes a az´ ucares. Entre los tratamientos T1 y T3, seg´ un el an´alisis estad´ıstico (ANOVA), no se presentaron diferencias significativas, en cuanto a producci´on de hemicelulosa, y se presentaron diferencias significativas importantes en cuanto a la degradaci´on de celulosa, esto debido a la utilizaci´on de ´acido sulf´ urico en el primer tratamiento. Los tratamientos T1 y T3 presentan similitud en la producci´on de az´ ucares fermentables. Desde el punto de vista econ´omico, el Volumen 3, n´ umero 6

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tratamiento m´as favorable es T3 que involucra la utilizaci´on de pretratamiento t´ermico e hidr´olisis enzim´atica, a diferencia de T1 que involucra los mismos tratamientos que el anterior y la adici´on de ´acido sulf´ urico. En cuanto a tiempo de hidr´olisis los dos tratamientos son equivalentes, ya que ambos necesitan de 80 minutos de reacci´on (60 minutos para hidr´olisis ´acida o t´ermica, y 20 minutos para hidr´olisis enzim´atica).

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Conclusiones

Para establecer con claridad las conclusiones del presente estudio, es necesario diferenciar los resultados por cada tratamiento practicado y evaluar el objetivo principal de obtener metabolitos fermentables. El residuo del despulpado del mango com´ un (Mangifera indica L.) es un sustrato potencial para la extracci´on de metabolitos fermentables y posterior fermentaci´on para obtener alcohol (etanol) u otro tipo de productos por v´ıa fermentativa, ya que posee un alto contenido de carbohidratos (15,44 % en base seca), los cuales est´an representados en celulosa, hemicelulosa, pectina y az´ ucares reductores y no reductores. Adem´as, su contenido de prote´ına (7,03 % en base seca) lo hace un material que posee caracter´ısticas favorables para ser utilizado en fermentaciones microbianas. En el proceso de hidr´olisis ´ acida se obtuvieron altas concentraciones de az´ ucares reductores (az´ ucares fermentables) en el tratamiento con ´acido sulf´ urico (H2 SO4 ) al 0,50 %, obteni´endose rendimientos con respecto al material sin tratar del 52,75 %. La hidr´olisis de celulosa y hemicelulosa fue alta en el tratamiento con ´acido, pero se present´ o conversi´on de estos polisac´aridos a otro tipo de compuestos indeseables en la soluci´on hidrolizada. Este efecto se refleja en la disminuci´on de az´ ucares totales y en la alta degradaci´on de celulosa y hemicelulosa con el tratamiento ´ acido. La principal ventaja del tratamiento con ´acido sulf´ urico diluido es la baja cantidad de ´acido requerido en el proceso, pero la temperatura necesaria para efectuar la hidr´olisis generalmente es alta, al igual que el tiempo, provocando corrosi´on de los equipos utilizados y la degradaci´on de az´ ucares en otro tipo de compuestos que pueden resultar inhibidores de la fermentaci´ on alcoh´olica. Si en el proceso de hidr´olisis ´acida se desea obtener mayor producci´on de az´ ucares reductores se debe elevar la temperatura, y al operar a altas temperaturas (> 150◦ C), para que el sistema

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continu´e como l´ıquido es necesario aumentar la presi´on y ello incrementa la inversi´on en cuanto a tecnolog´ıa y equipos se refiere. En el proceso de hidr´olisis enzim´atica se obtuvieron los mejores resultados en el tratamiento que utiliz´o la enzima comercial Pectinex Ultra SPL (Novo Nordisk Ferment), ya que se obtuvo un rendimiento en az´ ucares reductores con respecto al material sin tratar del 38,15 %, el cual es un rendimiento significativo que demuestra que el tratamiento enzim´atico es aplicable al material en particular. El tratamiento enzim´atico actu´o con mayor incidencia sobre la pectina y la hemicelulosa del mango com´ un, y en menor medida sobre la celulosa. La hidr´olisis enzim´atica presenta ventajas en cuanto a la acci´on selectiva sobre los componentes del material y su baja proporci´on de az´ ucares convertidos a otros compuestos (´ acidos org´anicos, furfural, HMF, entre otros), seg´ un el tratamiento experimental efectuado y el material utilizado. El proceso de sacarificaci´on por hidr´olisis enzim´atica presenta ventajas tecnol´ogicas y de operaci´on en cuanto a que la temperatura (40◦ C) y el pH (4,5) de la actividad de la enzima no implican dificultades t´ecnicas y costos muy elevados, pero el valor de la enzima comercial representa un gran porcentaje del costo del tratamiento. En el proceso de hidr´olisis t´ermica se obtuvieron rendimientos bajos con respecto a los tratamientos anteriores. El rendimiento m´aximo de az´ ucares reductores obtenido en la hidr´olisis t´ermica se obtuvo a 125◦ C y fue de 26,85 %, y en el tratamiento a 98◦ C se obtuvo un rendimiento de 25,47 %, con respecto al material sin tratamiento. Se determin´o que las diferencias entre un tratamiento y otro no tuvieron una significancia relevante y por tal raz´on se opt´o por el tratamiento que implique la menor inversi´on energ´etica. Esta hidr´olisis t´ermica es eficiente como pretratamiento, debido a que facilita la separaci´on del complejo celulosa–hemicelulosa e hidrolizando parte de la hemicelulosa, facilitando la acci´ on de un tratamiento hidrol´ıtico posterior. La celulosa y hemicelulosa contenida en el mango com´ un, fue degradada, en su mayor parte, por los tratamientos con ´acido sulf´ urico debido a la agresividad de este ´acido al entrar en contacto con material lignocelul´osico. Sin embargo, el hecho de que haya habido mayor degradaci´on celul´osica y hemicelul´osica con ´acido, no implica que todo el material hidrolizado haya sido convertido en az´ ucares reductores (az´ ucares fermentables), gran cantidad del material lignocelul´osico hidrolizado se convirti´o en otro tipo de compuestos

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no deseados en la soluci´on hidrolizada tales como: ´acidos org´anicos (ac´etico, f´ormico y levul´ınico), compuestos arom´aticos, furfural e hidroximetilfurfural, entre otros, que son potenciales inhibidores de microorganismos en el caso de una fermentaci´ on alcoh´olica. El tratamiento enzim´atico, present´o mayor degradaci´on sobre la pectina presente en el material, la hemicelulosa asociada a la celulosa y de f´acil degradaci´on, y sobre la celulosa, en menor proporci´on. A pesar de su selectividad en la acci´ on sobre los componentes del material, las enzimas utilizadas, Pectinex Ultra SPL y Celluclast 1,5 L (Novo Nordisk Ferment), present´ o degradaci´on de compuestos lignocelul´osicos a otro tipo de compuestos diferentes de az´ ucares (´ acidos galactur´onicos, entre otros), aunque en muy baja proporci´on. Esta reacci´on se pudo apreciar en la reducci´on de az´ ucares totales posterior al tratamiento enzim´atico, sin embargo, es preciso afirmar que esta reducci´on en la concentraci´on de az´ ucares totales, pudo ser provocada por errores de lectura en el procedimiento de determinaci´on de az´ ucares totales (m´etodo de Antrona), ya que es un m´etodo colorim´etrico que puede presentar errores o desviaciones atribuidas a calibraci´on de equipos de lectura (espectrofot´ometro) o a los reactivos utilizados en el procedimiento. La hidr´olisis t´ermica no afect´o de manera considerable la celulosa contenida en el material ya que el tratamiento t´ermico no es tan fuerte o selectivo como el tratamiento ´acido o enzim´atico, respectivamente. La hidr´olisis t´ermica tuvo mayor consecuencia sobre la hemicelulosa contenida en el mango com´ un, es decir, se present´o mayor degradaci´on en la hemicelulosa que sobre la celulosa. Esta reacci´on se debe a que la hemicelulosa asociada con celulosa se desprende y el calor aplicado al sistema hidroliza la hemicelulosa que es una mol´ecula de f´acil degradaci´on, produciendo az´ ucares fermentables. Este procedimiento es recomendado, seg´ un datos bibliogr´aficos, como pretratamiento para la aplicaci´on posterior de otros m´etodos de hidr´olisis. Los tratamientos en los cuales se obtuvieron mejores resultados fueron: • Hidr´olisis ´acida: ´ acido sulf´ urico 0,50 %, 80◦ C, 1 hora. • Hidr´olisis enzim´atica: Pectinex Ultra SPL 200 ppm, pH 4,5, 20 minutos, 40◦ C. • Hidr´olisis t´ermica: 98◦ C, 1 hora, presi´on atmosf´erica. En los tratamientos combinados, el tratamiento que present´o los mejores

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resultados en cuanto a producci´on de metabolitos fermentables fue la combinaci´on de enzima, temperatura y ´ acido sulf´ urico, con la enzima como pretratamiento. Con este tratamiento combinado se obtuvo un rendimiento en az´ ucares reductores de 57,28 % con respecto al material sin tratamiento, es decir, se present´o un rendimiento mayor que en el mejor tratamiento individual (´acido sulf´ urico 0,50 %, 80◦ C). Sin embargo, el procedimiento implica elevada inversi´on en cuanto a enzima, ´ acido y temperatura utilizada. En cuanto a la conversi´on de celulosa y hemicelulosa, la combinaci´on de tratamientos aumenta la degradaci´on de material lignocelul´osico, sobre todo en el proceso con ´acido. De manera similar que en el proceso individual con ´acido, la concentraci´on de compuestos diferentes formados por degradaci´ on de carbohidratos puede resultar un factor de inhibici´on para microorganismos fermentativos. Por las razones antes expuestas, se selecciona el tratamiento 3: hidr´olisis t´ermica (98◦ C, 1 hora, presi´on atmosf´erica) + hidr´olisis enzim´atica (Pectinex Ultra SPL a 200 ppm, pH 4,5, 40◦ C, 20 minutos), como el que mejor combina la producci´on de az´ ucares fermentables y condiciones de tratamiento suaves.

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