A r c h . Biol. Med. E x p e r . 1:56-60,

1964

EFECTO DE LA ADRENALINA SOBRE LA SÍNTESIS Y DEGRADACIÓN DE GLICÓGENO EXTRAIBLE Y RESIDUAL EN CORTES DE HÍGADO * Epinephrin effect on synthesis and breakdown of extractable and residual glycogen by liver slices. ENRIQUE FIGUEROA y ARIANA PFEIFER Instituto

de Química

Fisiológica

y Patológica,

Escuela Santiago,

Recibido

para

su

publicación

RESUMEN

de Medicina,

Universidad

de

Chile,

Borgoño

1470,

Chile. el

20

de

Julio

de

1 963.

Pfeifer han encontrado una mayor incorporación de glucosa-C en el glicógeno extraíble que en el residual de cortes de hígado de conejo o rata incubados con glucosa-C ( 6 ) . Se ha encontrado que las variaciones cuantitativas en el glicógeno total de órganos de animales sometidos a cambios endocrinológicos se realizan principalmente a expensas del glicógeno extraíble (7-9). Nos ha parecido por lo tanto de interés establecer si estas modificaciones del glicógeno extraíble correspondían a un mayor efecto de la hormona sobre la glicogénesis o sobre la glicogenólisis del glicógeno extraíble que el glicógeno residual de cortes de tejido. Damos cuenta en este trabajo del efecto de la adrenalina sobre la síntesis y la degradación de las dos fracciones de glicógeno de hígado que se pueden distinguir por medio del TCA. 14

S e e s t u d i ó el efecto de la a d r e n a l i n a , a g r e gada in v i t r o , sobre la g l i c o g é n e s i s y g l i c o g e n ó l i s i s del g l i c ó g e n o e x t r a í b l e y r e s i d u a l e n cortes de h í g a d o de conejo. La a d r e n a l i n a i n h i b i ó la síntesis y e s t i m u l ó la d e g r a d a c i ó n del g l i c ó g e n o e x t r a í b l e . N o h u b o efecto de la a d r e n a l i n a sobre la síntesis del g l i c ó g e n o residual; en c a m b i o , la g l i c o g e n ó l i s i s del g l i c ó g e n o r e s i d u a l fue est i m u l a d a por la h o r m o n a . INTRODUCCIÓN

La extracción completa del glicógeno de los tejidos animales no puede realizarse con soluciones de ácido tricloroacétieo (TCA) en frío. Pueden así distinguirse dos fracciones de glicógeno (1, 2). Una fracción que es extraída con una solución de TCA en frío y que ha sido llamada glicógeno extraíble y otra que no es extraída con una solución de TCA en frío y llamada glicógeno residual. Esta última requiere digestión con KOH para su aislamiento. Se ha encontrado una clara diferencia metabólica entre ambos tipos de glicógeno. Cuando se inyecta glucosa-C por vía intraperitoneal o por otra vía a animales enteros, ésta se incorpora en ambas fracciones del glicógeno de diversos órganos pero a diferentes velocidades (3-5). En experimentos in vitro Figueroa y 14

14

MATERIAL Y MÉTODOS S e u t i l i z a r o n c o n e j o s m a c h o s de a l r e d e d o r de 2000 g de peso. L o s a n i m a l e s f u e r o n m u e r tos por g o l p e e n la cabeza, se e x t r a j o el h í g a d o r á p i d a m e n t e y se c o l o c ó en KC1 0,154 M. L o s cortes se h i c i e r o n a m a n o alzada y f u e r o n c o l o c a d o s i n m e d i a t a m e n t e en s o l u c i ó n de H a s t i n g s fría y o x i g e n a d a ( m e d i o I) ( 1 0 ) . A l r e d e d o r de 100 m g de cortes f u e r o n i n c u b a d o s e n frascos de 25 m l q u e c o n t e n í a n 2 m i de s o l u c i ó n de H a s t i n g s e n r i q u e c i d a con g l u c o s a - C 0,03 M ( 1 0 0 . 0 0 0 c p m ) . A dos de los frascos se l e s h a b í a a g r e g a d o 200 ug de a d r e n a l i n a . C o m o fase gaseosa se usó una m e z c l a q u e c o n t e n í a 9 5 % de 0 y 5% de C 0 . 1 4

* Este trabajo fue financiado por el Grant N9 59-135 de la "Comisión de Ayuda a la Investigación Científica" de la Universidad de Chile y por la "Fundación Rockefeller" en un programa conjunto.

2

2

ADRENALINA

L o s frascos f u e r o n a g i t a d o s d u r a n t e dos h o r a s a 37°C. Cada c o n d i c i ó n e x p e r i m e n t a l fue h e cha s i e m p r e en d u p l i c a d o . El m e d i o I de H a s t i n g s ( 1 0 ) es u n t a m p o n b i c a r b o n a t o rico en Ca+ + , M g + + y K + y q u e p r o d u c e en los cortes síntesis neta de g l i c ó g e n o d u r a n t e el p e r í o d o de i n c u b a c i ó n c u a n d o se a g r e g a g l u c o s a c o m o sustrato. La síntesis es m á s c o n s t a n t e c u a n d o la c o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l de g l i c ó g e n o de l o s cortes es baja ( 1 3 , 6 ) . En este m e d i o se p r o d u c e s i e m pre una i n c o r p o r a c i ó n s i g n i f i c a t i v a de g l u c o s a - C en a m b a s f r a c c i o n e s de g l i c ó g e n o , s i e n do la a c t i v i d a d específica del g l i c ó g e n o e x traíble 2 a 3 v e c e s m a y o r q u e la del g l i c ó geno residual ( 6 ) . 1 4

D e s p u é s de la i n c u b a c i ó n los cortes de dos frascos con a d r e n a l i n a y dos frascos s i n a d r e nalina f u e r o n s o m e t i d o s a los p r o c e d i m i e n t o s para la d e t e r m i n a c i ó n de g l i c ó g e n o e x t r a í b l e y r e s i d u a l y para la d e t e r m i n a c i ó n de su r a d i o a c t i v i d a d . El resto de los cortes i n c u bados f u e r o n sacados de l o s frascos y s o m e tidos a una s e g u n d a i n c u b a c i ó n e n m e d i o de K r e b s sin sustrato por una hora a 37°C ( c o n y sin a d r e n a l i n a ) . D e s p u é s de esta s e g u n d a i n c u b a c i ó n se d e t e r m i n a r o n los dos tipos de g l i c ó g e n o y su r a d i o a c t i v i d a d . El m e d i o de K r e b s , a m o r t i g u a d o r de fosfato que t i e n e una c o n c e n t r a c i ó n baja de Ca + + , M g - - y K+ pero rica en N a + , p r o d u c e una i n t e n s a g l i c o g e n ó l i s i s de los cortes de h í g a d o ( 1 3 ) y no incorpora g l u c o s a - C en el g l i c ó g e n o c u a n d o esta se a g r e g a al m e d i o de i n cubación ( 1 4 ) . 1 4

D e a c u e r d o con el d i f e r e n t e c o m p o r t a m i e n to del g l i c ó g e n o en los dos m e d i o s de i n c u b a c i ó n p o s t u l a m o s q u e e n l a s c o n d i c i o n e s del m e d i o de H a s t i n g s los p r o c e s o s de s í n t e s i s pred o m i n a n sobre los p r o c e s o s de d e s t r u c c i ó n del g l i c ó g e n o y en las c o n d i c i o n e s del m e d i o de K r e b s p r e d o m i n a n l o s p r o c e s o s de d e s t r u c c i ó n sobre los de síntesis. El m e d i o de H a s t i n g s lo h e m o s u t i l i z a d o para e s t u d i a r el efecto de la a d r e n a l i n a sobre la s í n t e s i s de g l i c ó g e n o y el m e d i o de K r e b s para el e f e c t o sobre la d e g r a d a c i ó n . La d e t e r m i n a c i ó n del g l i c ó g e n o se r e a l i z ó de la s i g u i e n t e m a n e r a . L o s cortes f u e r o n l l e vados a un pequeño homogenizador PotterE l v e h j e m para h a c e r u n h o m o g e n i z a d o con 1 m i de T C A frío al 5 % . El p r e c i p i t a d o de p r o t e í n a fue l a v a d o 3 v e c e s con 0,5 m i de T C A al 5 % . L o s l í q u i d o s de l a v a d o s f u e r o n c o m b i n a d o s ( a l r e d e d o r de 2,5 m i ) y tratados

57

Y GLICÓGENO

con 0,1 m i de K O H al 3 0 % , 0,1 m i de N a S 0 al 2 % y 3 v o l ú m e n e s de etanol. S e dejó por lo m e n o s 2 horas e n la pieza fría y l u e g o se centrifugó. El g l i c ó g e n o p r e c i p i t a d o , q u e c o r r e s p o n d e al g l i c ó g e n o e x t r a í b l e , fue d i s u e l to e n 1 m i de a g u a y r e p r e c i p i t a d o con etanol. Este p r o c e s o f u e r e p e t i d o dos v e c e s . P o r últ i m o el g l i c ó g e n o se d i s o l v i ó e n 1 m i de agua y se t o m a r o n a l í c u o t a s para m e d i r g l i c ó g e n o por el m é t o d o de M o n t g o m e r y ( 1 2 ) . L a rad i o a c t i v i d a d se m i d i ó en u n c o n t a d o r de flujo, sin v e n t a n a , S-16, Tracerlab. 2

4

La proteína precipitada por el T C A se digirió con K O H al 3 0 % d u r a n t e 45 m i n u t o s . S e a g r e g ó 0,1 m i de N a S 0 al 2 % y se p r e cipitó el g l i c ó g e n o r e s i d u a l con etanol. F u e l a v a d o , d e t e r m i n a d o y contada su r a d i o a c t i v i dad en la m i s m a forma q u e el g l i c ó g e n o e x traíble. U n e x p e r i m e n t o de control en que el g l i c ó g e n o e x t r a í b l e fue t r a t a d o c o n K O H al 3 0 % m o s t r ó q u e no se p r o d u c í a n c a m b i o s en la cantidad de g l i c ó g e n o , ni e n las c p m i n c o r poradas. La g l u c o s a y la g l u c o s a r a d i o a c t i v a se o b t u v i e r o n de los l a b o r a t o r i o s S c h w a r z . La a d r e n a l i n a de los l a b o r a t o r i o s Merck. 2

4

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este trabajo se ha investigado el efecto de la adrenalina sobre el metabolismo del glicógeno en cortes de hígado de conejo agregándolo al medio de incubación de los cortes. En las Tablas I y II se muestran los experimentos sobre el efecto de la adrenalina en el metabolismo del glicógeno. Hay un efecto notable de la adrenalina sobre el glicógeno extraíble en los dos medios de incubación, evidenciable al medir la concentración de glicógeno extraíble del corte (Tabla I) y al medir la incorporación de glucosa-C (Tabla II). La adrenalina disminuye en un 50% la incorporación de glucosa-C en el glicógeno extraíble en el medio de Hastings y en una proporción semejante la síntesis neta de glicógeno. En el medio de Krebs en presencia de adrenalina hay un estímulo de la glicogenólisis del glicógeno extraíble evidenciable también por los dos métodos de análisis utilizados. 14

14

58

E. FIGtTEROA Y A. PFEIFER TABLA

Efecto

de

la adrenalina

sobre la residual

glicogénesis de cortes

I

y la glicogenólisis del de hígado de conejo

Glicógeno extraíble * Experimento N