Bacterias como herramientas potenciales en el mejoramiento de humedales artificiales para el tratamiento de aguas Bacteria as potential tools in the improvement of constructed wetlands for wastewater treatment Irina Salgado Bernal1, Mario Cruz Arias1, María del Carmen Durán Domínguez2, Ramona Oviedo3, María Elena Carballo Valdés1, Armando Martínez Sardiñas1 1

Facultad de Biología, Universidad de La Habana. Calle 25 # 455 entre J e I, Vedado, La Habana (Cuba).

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Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México. Paseo de la Investigación Científica, Edificio E-3, Ciudad Universitaria, Coyoacán, D.F (México).

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Instituto de Ecología y Sistemática (IES) (Cuba).

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Bacterias como herramientas potenciales en el mejoramiento de humedales artificiales para el tratamiento de aguas

RESUMEN El trabajo trata una de las problemáticas actuales de mayor importancia: el tratamiento de aguas residuales, tomando como referencia los sistemas de humedales artificiales o construidos, los cuales representan una alternativa sostenible para la remoción de contaminantes. No obstante, el papel de los microorganismos en estos sistemas no ha sido totalmente estudiado. Teniendo estos elementos en cuenta, el objetivo del trabajo fue obtener cepas bacterianas nativas con potencialidades para ser empleadas en el bioaumento de humedales construidos. Se aislaron bacterias rizosféricas de plantas hidrófitas de humedales naturales y se les realizó una batería de pruebas fisiológicas como fijación de nitrógeno y solubilización de fosfato (para el mejoramiento de las plantas presentes en los sistemas de humedales) y acumulación de fosfato, reducción de nitrato, oxidación de amonio, nitrito y amonificación (para la disminución o eliminación de fósforo y nitrógeno). Se obtuvieron 58 aislados, con los cuales se alcanzaron los siguientes porcentajes de respuestas positivas, para cada prueba: 79 % en fijación de nitrógeno, 17 % en solubilización de fosfato, 60 % en acumulación de fosfato, 47 % en reducción de nitrato, 0 % en oxidación de amonio y nitrito y 67 % en amonificación. Como conclusión se cuenta con aislados bacterianos nativos que podrían ser incorporados en humedales construidos para mejorar el comportamiento de las hidrófitas en estos sistemas e influir directamente en la remoción de nitrógeno y fósforo. Palabras clave: tratamiento de aguas residuales, bacterias rizosféricas, humedales artificiales, bioaumento ABSTRACT The present work approaches one of the most important current problems: the treatment of wastewaters, taking as starting point the artificial or constructed wetlands systems, which represent a sustainable alternative for removal of pollutants. Nevertheless, the rol of microorganisms in these systems has not been completely studied. Taking these elements into account, the objective of the work was to obtain native bacterial strains with potentialities to be employees in constructed wetlands bioaugmentation. For that, rhizospheric bacteria were isolated from hydrophyte plants present in natural wetlands and it were carried out a battery of physiologic tests as nitrogen fixation and phosphate solubilization (for the improvement of existent plants in wetland systems) and phosphate accumulation, nitrate reduction, ammonium oxidation, nitrite oxidation and ammonification (for phosphorus and nitrogen decrease or elimination). 58 bacterial isolates were obtained, with which the following percentages of positive answers were reached, for each test: 79 % in nitrogen fixation, 17 % in phosphate solubilization, 60 % in phosphate acumulation, 47 % in nitrate reduction, 0 % in ammonium oxidation and nitrite oxidation and 67 % in ammonification. These results are considered positive, because although in 2 tests it was not positive answer, as conclusion of the work it were obtained native bacterial isolates that could be incorporated in constructed wetlands, to improve the behavior of hydrophytes in these systems and to influence in the nitrogen and phosphorus removal. For that reason the results constitute an alternative proposal for the treatment of liquid residuals. Key words: wastewater treatment; rhizospheric bacteria; constructed wetlands; bioaugmentation

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INTRODUCCIÓN El agua, más que una parte esencial de nuestro planeta, es un elemento indispensable para mantener la vida, el crecimiento y el desarrollo de los organismos vivos, por lo que la protección y el saneamiento de este recurso natural constituyen prioridades para la humanidad y en las que está comprometida la comunidad científica. La alarmante situación de la contaminación de los recursos hídricos, representa un grave problema ambiental en el contexto global como consecuencia de la industrialización, globalización, crecimiento poblacional y urbanización,1 a lo que tributa el vertimiento directo de residuales domésticos e industriales, sin tratar o con tratamientos deficientes, a los ecosistemas acuáticos. La carga contaminante de las aguas residuales municipales, dada por la presencia de materia orgánica, nutrientes (nitrógeno y fósforo), así como por cantidades traza de compuestos recalcitrantes y metales2, representa un riesgo ambiental por el potencial impacto que tiene sobre la calidad de las aguas receptoras,3 y por su acción directa en la eutroficación (crecimiento de algas como resultado del exceso de nutrientes en los cuerpos de agua).4 Se han empleado numerosas tecnologías para el tratamiento de las aguas contaminadas, que incluyen fundamentalmente tratamientos físico – químicos, los cuales permiten la remoción parcial de la carga orgánica, el nitrógeno y el fósforo, aunque el costo de los reactivos que se utilizan es alto y la remoción de la demanda química de oxígeno es pobre, por tanto, es deseable el empleo de otros procesos como los biológicos.5 Además, en los momentos actuales es necesario que se implementen tecnologías óptimas desde el punto de vista medio - ambiental y económico, sobre todo en países en vías de desarrollo.6 Actualmente se ha puesto gran énfasis en la biotecnología ambiental y el desarrollo sostenible, en particular las técnicas biológicas pueden ser eficazmente aplicadas en la remediación de aguas contaminadas.7 La estrategia de las tecnologías de biorremediación es el uso de diferentes vías metabólicas y el incremento de los procesos de degradación autóctonos para eliminar, o al menos, reducir las sustancias contaminantes indeseables. Debido a que casi todos los productos naturales y un gran número de compuestos sintéticos son degradados por las bacterias, independientemente de su peso molecular o complejidad estructural, estos microorganismos se han convertido en un factor clave en la biorremediación2,8,9,10 y desempeñan un papel importante en los sistemas ingenierizados como las plantas de tratamiento de aguas.11 Existen bacterias con habilidad para solubilizar fosfato y también para acumular fuentes de fósforo inorgánico a partir de soluciones acuosas y bacterias que participan en diferentes transformaciones de fuentes de nitrógeno. Existen numerosos métodos de tratamiento para eliminar el fósforo. En todos los casos es removido por conversión de los iones de fósforo en el agua en una fracción sólida. Esta fracción puede ser un precipitado de sal insoluble, una masa microbiana en un lodo activado o una biomasa de planta en humedales construidos.4 Algunas bacterias tienen la habilidad de tomar el exceso de ortofosfato y acumularlo como polifosfatos, entonces el fósforo es removido con la biomasa en la planta de tratamiento de residuales. Existen numerosos géneros reportados como organismos acumuladores de polifosfato (PAOs por sus siglas en inglés), por ejemplo: Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, grupo Comamonas-Pseudomonas, grupo Flavobacterium-Cytophaga, Moraxella, Xanthomonas, Paraecoccua, Bacillus, Corynebacterium y otras muchas bacterias G+ (han sido reportadas que acumulan polifosfato en lodo activado).12 El nitrógeno total está comprendido por nitrógeno orgánico, amonio, nitrito y nitrato. Los dos mecanismos para la remoción de nitrógeno son asimilación y nitrificación – desnitrificación. Debido a que el nitrógeno es un nutriente, los microorganismos presentes en los procesos

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de tratamiento pueden asimilar el nitrógeno amoniacal e incorporarlo en su masa celular. Una porción de este nitrógeno amoniacal retornará al agua residual por la muerte y lisis de las células. En la nitrificación – desnitrificación, al final se obtiene como producto gaseoso dinitrógeno.3 Para la selección de microorganismos que puedan potencialmente influir sobre la disminución de los compuestos de nitrógeno y fósforo inorgánico es importante estudiar la capacidad para la acumulación de fósforo y la acción de los microorganismos en presencia de distintas fuentes de nitrógeno inorgánico.13,14 Además para obtener cepas para el bioaumento de sistemas de tratamiento como los humedales artificiales sería útil contar con bacterias que influyan sobre la salud de las plantas, lo cual se puede lograr mediante el estudio de las potencialidades de las bacterias para fijar nitrógeno y para la solubilización del fosfato. Los microorganismos rizosféricos, en particular, tienen una importante contribución en la degradación y remoción de contaminantes;15 han sido reportadas numerosas bacterias aisladas de la rizosfera de plantas por sus capacidades degradativas.16 Esto sugiere que la introducción de este grupo de microorganismos, con características fisiológicas para la eliminación de varios contaminantes, podrían incrementar la remediación en un sistema de tratamiento determinado.17 Entre una de estas tecnologías se encuentran los humedales artificiales o construidos, utilizados para tratar aguas de origen doméstico e industrial, fundamentalmente. Estos sistemas imitan los principios de los sistemas naturales conocidos como humedales naturales.18 Los humedales construidos representan una opción viable para el tratamiento de las aguas residuales, a través de la intervención de diferentes procesos físicos, químicos y biológicos que se llevan a cabo en él, siendo además sistemas de fácil mantenimiento y operación. El trabajo con estos sistemas y el papel de las biomasas bacterianas en ellos constituye una de las temáticas priorizadas, debido a las ventajas que presenta la tecnología para el tratamiento de residuales líquidos y específicamente el tratamiento de carbono orgánico, nitrógeno, fósforo y su compatibilidad con el medio ambiente. La obtención y caracterización de bacterias con potencial biorremediante es imprescindible para la posterior inoculación de biomasas en sistemas de humedales construidos. Teniendo en cuenta estos antecedentes el objetivo del presente trabajo fue: determinar las potencialidades de 58 cepas bacterianas rizosféricas para la fijación de nitrógeno, solubilización de fosfato, acumulación de fosfato y acción sobre diferentes fuentes de nitrógeno, con el fin de ser propuestas como herramientas en el bioaumento de humedales artificiales para el tratamiento de residuales líquidos.

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas empleadas Se emplearon 58 cepas bacterianas provenientes de la rizofera de plantas hidrófitas de la especie (Typha dominguensis). Estas plantas se seleccionaron de humedales naturales de Ciudad de La Habana, Cuba. Aislamiento de bacterias rizosféricas Las bacterias se aislaron de 3 humedales aledaños al río Almendares, ubicación por GPS: Humedal 1- Lat.23º 02.323’ Long. 82º 24.002’, Humedal 2- Lat. 23º 02.863’Long.082º 23.443’, Humedal 3- Lat. 23º 03.318’Long. 082º 24.014’. Se siguió el protocolo propuesto por Muratova et al., (2003).19 Se removió el suelo no rizosférico de las raíces; la raíz con suelo rizosférico adherido se lavó en 100 mL de agua destilada y se agitó por 30 minutos. Se dejaron sedimentar las partículas de suelo y con la

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suspensión se prepararon diluciones seriadas de 10-1 a 10-7. Se plaqueron 3 réplicas de cada dilución en agar nutriente y se incubó a 30 ºC (temperatura del lugar de muestreo) por 48 horas. Se seleccionaron las colonias con características visibles diferentes de cada muestra y se conservaron en agar nutriente, plano inclinado, a 4 °C. Determinación de la capacidad de fijación de nitrógeno Se empleó el medio Feodorov´s Medium,20 el cual no presenta fuente de nitrógeno. Se sembraron los aislados por estría y se incubó por 72 horas a 30 °C. La lectura de los resultados se realizó por observación de la presencia o ausencia de crecimiento en el medio empleado. Determinación de la capacidad de solubilización de fosfato Se empleó el Medio NBRIP-BPB,21 conteniendo fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2) y el indicador bromofenol azul. Se sembraron los aislados en el medio y se incubó por 72 horas. Se realizó la lectura mediante la observación de zonas de aclaramiento alrededor del crecimiento bacteriano. Determinación de la acumulación de fosfato Se empleó un medio base líquido con 300 mg de fosfato de potasio.20 Se inocularon los diferentes aislados, de manera individual y se dejaron en interacción con el medio 72 horas, a temperatura de 30 ºC y 100 r.min-1. Se analizaron las soluciones antes y después de la interacción con las bacterias, a través del método analítico del molibdato de amonio y el cloruro estañoso.3, 22 Se realizó la lectura de las muestras en espectrofotómetro a 450 nm. Determinación de la utilización de diferentes fuentes de nitrógeno Reducción nitrato Se utilizó el medio Agua de peptona nitrato.23 La prueba se reveló empleando los reactivos I y II de Griess Ilosvay, zinc en polvo y observación de la campana de Durham contenida en cada tubo de prueba. Oxidación de amonio Se empleó un Medio para Bacterias Oxidadoras de Amonio.20 Oxidación de nitrito Se empleó un Medio para Bacterias Oxidadoras Nitrito.20 Amonificación Se empleó un medio líquido con peptona y cloruro de sodio. Se incubó por 3 semanas y se realizó la lectura de las soluciones en espectrofotómetro a 600 nm.20

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fijación de nitrógeno La Figura 1 muestra que el 79 % de los aislados bacterianos presentaron la habilidad para fijar nitrógeno atmosférico, resultado muy satisfactorio, pues esta es una acción que no realizan todas las bacterias, solamente géneros y especies muy específicas y en este caso se obtuvo que la mayoría de los aislados resultaron positivos para esta prueba. Los aislados positivos, según la nomenclatura usada para identificarlos, fueron: TAN112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 1110, 1111, 1113, 1114, 1115, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 211, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 2110, 2111, 221, 223, 224, 227, 228, 229, 2211, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 3110, 322, 323, 325. En la Figura 2 se observa cómo se detectó el comportamiento en el medio estudiado, a través del crecimiento o no crecimiento en el mismo.

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Figura 1. Porcentaje de cepas bacterianas aisladas de la rizofera de Typha dominguensis con capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico. Aislados con respuesta positiva (gris oscuro) y negativa (gris claro).

Figura 2. Fotos con resultados de crecimiento y no crecimiento, respectivamente, en medio para fijación de nitrógeno. La característica de fijación de nitrógeno es muy importante en microorganismos que se pretendan emplear en el bioaumento de sistemas de tratamiento de aguas como los humedales artificiales, pues las plantas no pueden realizar la fijación del nitrógeno atmosférico, los únicos organismos en la naturaleza capaces de realizar esta función son los microorganismos procariontes, ya sean aerobios o anaerobios.24 La fijación del nitrógeno consiste en la reducción del nitrógeno gaseoso atmosférico a amonio, proceso catalizado por la enzima nitrogenasa. De esta manera las bacterias nitrofijadoras benefician a las plantas. Los aislados bacterianos obtenidos no han sido identificados, pero probablemente dentro del 79 % que fijan el nitrógeno se encuentren algunas cepas bacterianas pertenecientes a los géneros: Azotobacter, Azospirillum, Klebsiella, Clostridium, Methanococcus, bacterias de vida libre fijadoras de nitrógeno,24 pues los aislados estudiados fueron obtenidos de la rizosfera de plantas hidrófitas pertenecientes a humedales naturales.

Solubilización de fosfato Los microorganismos solubilizadores de fosfato son abundantes en el suelo y pueden ser aislados de la rizosfera de las plantas. Los resultados mostrados en la Figura 3 muestran que la mayoría de los aislados no mostraron solubilización de fosfato, no obstante se

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encontró un 17 % de los aislados que si mostraron esta habilidad. Como se muestra se encontraron 2 categorías en la solubilización de fosfato: bacterias que acidificaron el pH del medio y las que produjeron fosfatasas. Los aislados positivos en esta prueba fueron: TAN112, 115, 1114, 227, 228, 229, 2211, 315, 317, 323.

Figura 3. Solubilización de fosfato por cepas bacterianas aisladas de la rizofera de Typha dominguensis. Muestra el porcentaje de aislados que solubilizaron el fosfato, aislados que solubilizaron fosfato con excreción de ácido y aislados con respuesta negativa a la prueba.

A

B

C

Figura 4. Fotos con resultados de solubilización de fosfato: solubilización de fosfato sin excreción de ácido (A), solubilización con excreción de ácido (B) y control negativo (C). En la mayoría de los ensayos realizados con bacterias solubilizadoras de fosfato la eficiencia relativa de estas bacterias está basada en la disminución del pH, debido a la producción de ácidos orgánicos en el medio circundante.21,25 En este caso el 10 % mostró solubilización sin acidificar el medio y el 7 % solubilización y excreción de ácido. El medio empleado para el ensayo contenía fosfato insoluble, específicamente fosfato tricálcico y la indicación de zonas claras alrededor del crecimiento microbiano fue una clara indicación cualitativa de la presencia de actividad solubilizadora de fosfato. Es importante contar con este tipo de bacterias para mejorar la eficiencia de sistemas como los humedales artificiales, donde las plantas tienen un importante papel en la remoción de contaminantes. En el suelo existe una gran cantidad de fosfatos inorgánicos, los cuales son inmovilizados y no se encuentran disponibles para las plantas, por tanto, la liberación de formas de fósforo insolubles y fijadas al suelo constituye un aspecto importante para

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incrementar la disponibilidad de fósforo en el suelo.21,25 La inoculación del suelo con bacterias solubilizadoras de fosfato es conocido que mejora la solubilización del fósforo fijado al suelo, lo que resulta en un mayor rendimiento de las plantas, acción que tiene lugar en la rizosfera. Este principio ha sido muy utilizado en la agricultura, pero también podría constituir un aspecto importante en los humedales artificiales, pues las bacterias solubilizadoras podrían influir en un mejor desarrollo de las plantas presentes en estos sistemas, lo que a su vez tributaría a una mayor eficiencia en los procesos de remoción de contaminantes de las aguas residuales. En la Figura 4 se muestran 3 fotos que muestra los diferentes resultados obtenidos y la diferencia observada a simple vista entre las bacterias solubilizadoras de fosfato sin excreción de ácido y las que excretan ácido, pues el medio azul, alrededor del crecimiento, se torna amarillo debido a la disminución del pH. Los microrganismos solubilizadores obtenidos tienen una acción marcada sobre el medio NBRIP-BPB, pues como se observa en las fotos las zonas de aclaramiento observadas fueron amplias y notables si se comparan con el color inicial del medio. Disponer de cepas microbianas que integren más de una característica fisiológica y/o bioquímica, resulta beneficiosa para su futura aplicación en la biotecnología ambiental. El análisis integrado, en la presente investigación, permitió identificar 10 bacterias rizosféricas (TAN112, 115, 1114, 227, 228, 229, 2211, 315, 317, 323) que comparten en común la capacidad de solubilizar fosfato y de fijar nitrógeno. Estas bacterias constituyen los mejores candidatos por sus potencialidades para un desarrollo favorable de las plantas en los humedales artificiales.

Interacción con fuentes de fósforo y nitrógeno por las 58 cepas rizosféricas Los resultados en cuanto a la acumulación de fosfato por los 58 aislados bacterianos (Figura 5) muestran que el 60 % de estos fue positivo. Este resultado es un indicador de la capacidad que pudiera tener la mayoría de las bacterias rizosféricas analizadas para la eliminación de fosfato de las aguas residuales, como una alternativa viable en la recuperación de este recurso natural. Como se muestra en la Figura 5, el 47 % de los microorganismos mostró reducción del nitrato, ya sea reducción parcial hasta nitrito o reducción total hasta dinitrógeno y además un 67 % utilizó nitrógeno orgánico. Estos resultados sugieren la posibilidad que pudieran tener estas bacterias para eliminar estos compuestos, que constituyen contaminantes importantes en los residuales. La respuesta negativa de las bacterias con respecto a la oxidación de amonio y a la oxidación de nitrito, indica la no presencia de bacterias quimiolitotróficas entre los aislados y además, evidencia la menor incidencia de este grupo microbiano en el ecosistema analizado, lo que se puede corresponder con la poca probabilidad que tienen de ser encontrados en la naturaleza.

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Figura 5. Acción de las cepas bacterianas aisladas de la rizosfera de Typha dominguensis sobre fosfato, nitrato, amonio, nitrito y nitrógeno orgánico. Se representa el porcentaje de cepas con respuesta positiva. El análisis en conjunto de las cinco pruebas realizadas mostró que hay aislados que presentaron diferentes actividades frente a los compuestos ensayados, los cuales constituyen candidatos más completos para ser utilizados en la biorremediación de nitrógeno y fósforo, contaminantes que contribuyen a la eutrofización de las aguas; entre ellos destacan los clasificados como TAN229, TAN119 y TAN315, pues mostraron resultados positivos en 3 de las pruebas. Estos aislados, a diferencia de los seleccionados en los ensayos de fijación de nitrógeno y solubilización de fosfato, podrían contribuir directamente a la disminución o eliminación de fuentes contaminantes de fósforo y nitrógeno en aguas residuales, pues la acción mostrada por estos 3 aislados se basó en la utilización de un compuesto específico. Estas bacterias se podrían inocular en humedales artificiales para potenciar la biorremediación mediante su acción directa sobre los contaminantes. En el caso de los aislados con habilidad para la fijación de nitrógeno y solubilización de fosfato podrían constituir herramientas para la potenciación indirecta de la biorremediación, a través de sus contribuciones a las plantas presentes en los sistemas de tratamiento.

CONCLUSIONES •

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El 79 % de los aislados bacterianos obtenidos mostró habilidad para la fijación de nitrógeno atmosférico y el 17 % mostró solubilización de fosfato, constituyendo estos aislados candidatos para el mejoramiento de las plantas presentes en sistemas de humedales artificiales, destacándose entre ellos los aislados TAN112, 115, 1114, 227, 228, 229, 2211, 315, 317 y 323, por su doble habilidad para realizar las dos acciones. Gran parte de los aislados mostraron respuesta positiva en la acumulación de fosfato, reducción de nitrato y amonificación, los cuales podrían ser potencialmente empleados en el bioaumento de humedales artificiales para la eliminación de nitrógeno y fósforo, destacándose TAN229, TAN119 y TAN315, pues mostraron resultados positivos en las tres pruebas. Los aislados TAN 229 y TAN 315 constituyen herramientas potenciales para su futuro empleo en la biorremediación de aguas residuales a través del bioaumento de humedales artificiales, pues mostraron respuestas positivas en todas las pruebas

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realizadas, ya sea en función de mejorar el desarrollo de las plantas o en la eliminación de nitrógeno y fósforo.

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