Uxrvrnsma» »r JaÉN Facultad de Ciencias Exper imentales

Trabajo Fin de Grado

Producc¡ón de bacteriocinas de bacterias lácticas aisladas de encurtidos

Alumno:

Ma

Adoración Rascón Sánchez

Junio, 2016

Uxrvrnsma» »r JaÉN Facultad de Ciencias Exper imentales

Trabajo Fin de Grado

Producc¡ón de bacteriocinas de bacterias lácticas aisladas de encurtidos

Alumno:

Ma

Adoración Rascón Sánchez

Junio, 2016

ÍNDICE RESUMEN………………………………………………………………………..………….2 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………..…..…3 1.1.

Encurtidos………………………………………………………………..…..…3

1.1.1. Fermentación………………………………………………………………3 1.1.2. Encurtidos analizados……………………………………………...…....6 1.2.

Bacterias lácticas…………………………………………………………..….8

1.2.1. Clasificación de bacterias lácticas………………………………….…9 1.2.2. Sustancias producidas por bacterias lácticas…………………….…9 1.3.

Bacteriocinas……………………………………………………………….…11

1.3.1. Clasificación de bacteriocinas…………………………………………12 1.3.2. Aplicación de bacteriocinas en alimentos………………………...…13 1.4.

Probióticos………………………………………………………………...…...14

2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………….16 3. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………..…….….17 3.1. Material biológico……………………………………………………………..…17 3.2. Material de laboratorio……………………………………………………….…17 3.3. Medios de cultivo……………………………………………………………...…18 3.4. Procesado de los alimentos………………………………………………...…20 3.5. Crecimiento bacteriano………………………………………………………....21 3.6. Tinción de Gram………………………………………………….…………...….21 3.7. Producción de bacteriocinas…………………………………………….….…22 4. RESULTADOS ………………………………………………………….………….….24 4.1. Crecimiento bacteriano…………………………………………….……………24 4.2. Identificación de microorganismos por Tinción de Gram……………..….25 4.3. Detección de bacterias productoras de bacteriocinas……….………..…29 5. DISCUSIÓN………………………………………………………………….…………41 6. CONCLUSIONES………………………………………………………….…………42 7. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………….…….……43

1

RESUMEN

Las bacterias ácido lácticas (BAL) están ampliamente distribuidos en la naturaleza, estas se han aislado tanto del tracto digestivo de humanos y animales como de algunos alimentos, siendo la leche su medio más típico. Estas bacterias han sido utilizadas históricamente para preservar los alimentos ya que gracias a la fermentación de azúcares se obtienen algunas sustancias como

ácido

láctico

o

bacteriocinas

que

ayudan

a

competir

contra

microorganismos patógenos por lo tanto son muy utilizadas en la industria alimentaria y farmacéutica. En este ensayo hemos intentado aislar bacterias ácido lácticas de encurtidos y observar la producción o no de bacteriocinas ya que estos péptidos tienen actividad antimicrobiana frente a microorganismos patógenos protegiendo nuestra salud y pueden actuar como probióticos.

ABSTRACT

Lactics acid bacterias (LAB) are so extended in nature, there have been found in the human and animals digestive tract, and also in some food, being milk the most typical. These bacterias have been used historically to perserve food becasuse in the fermentation of sugars is obtained some substances as lactic acid or bacteriocins that help to figth against pathogenic microorganisms, so they are use so much in food industry and pharmaceutical industry. In these experiment we have tired to isolate lactics acid bacterias on pickled to see the production or not of bacteriocins, as these peptides have antimicrobian activity againt phatogenic microorganisms protecting our health and they can perform as probiotics.

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1. INTRODUCCIÓN

1.1.

Encurtidos Los encurtidos son alimentos vegetales hortícolas sumergidos en una

determinada concentración de sal y/o vinagre para disminuir su pH, alargando así la vida útil del alimento y por lo tanto su conservación. Esto se debe a un proceso de acidificación que hace que la aparición de microorganismos indeseados sea prácticamente nula y por lo tanto el riesgo de intoxicación alimenticia mínima, además de adquirir nuevas características organolépticas.

Según el método utilizado para elaborar el encurtido se producirá fermentación o no. Si se sumerge únicamente en vinagre no se producirá fermentación, pero por el contrario, si se introduce en salmuera habrá fermentación espontánea gracias a las bacterias fermentativas que se encuentran en el mismo, convirtiendo los azúcares del vegetal en ácido láctico.

1.1.1. Fermentación Este proceso es el responsable de las características distintivas de los productos fermentados, como pueden ser su textura, sabor y aroma, prolongación de su vida útil y de los beneficios que presentan para la salud. (Holzapfel, 2002). Dicho proceso se da en multitud de alimentos además de darse en encurtidos como son por ejemplo productos lácteos, pan, cerveza, vino, etc. La fermentación es uno de los pasos más importantes a la hora de elaborar un producto fermentado, entre ellos los encurtidos. Para ello se introducen los vegetales en salmuera y se deja que la flora microbiana perteneciente al alimento lo fermente de manera natural. De este modo evitaremos las fermentaciones de microorganismos indeseados y con ello la putrefacción del alimento. Introduciendo el vegetal en sal lograremos que se lleve a cabo únicamente la fermentación ácido-láctica de bacterias lácticas, el medio adecuado para que se produzca debe tener una concentración óptima de salmuera y un pH ácido o cercano a pH neutro, este descenso es debido a la producción de ácido láctico.

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Dentro de la fermentación podemos elegir entre dos métodos para llevarla a cabo según la concentración de sal que a su vez depende de la temperatura a la que vaya a estar el alimento.

-

Baja salinidad (8% de sal): Se da una fermentación rápida, se produce una cantidad pequeña de gas y hay que tener controlado el proceso para que no se desarrollen bacterias perjudiciales y el fruto no tenga la firmeza deseada.

-

Alta salinidad (10% de sal): La fermentación es algo más lenta, la producción de gases es mayor y más vigorosa. La firmeza del fruto suele ser mejor y además el riesgo de aparecer organismos indeseados es muy bajo.

En el proceso de fermentación se producen algunos cambios como:

-

Cambios físicos: En las primeras 48-72h el agua, azúcares, proteínas, minerales, etc. que contiene el fruto se difunde por osmosis a la salmuera añadida, perdiendo peso. Estos servirán como alimento a las bacterias ácido lácticas. Pasado el tiempo, la sal vuelve a penetrar en el fruto creando poros por los que entra el agua, dando al fruto su aspecto normal, turgente. Un encurtido con fermentación previa está más firme y crujiente.

-

Cambios químicos: El cambio más significativo es la transformación de azúcares procedentes de los frutos a ácido láctico gracias a las BAL aunque también aparecen, en pequeñas cantidades, ácido acético, alcoholes y ésteres. En ocasiones hay cantidades importantes de anhídrido carbónico e hidrógeno. El valor de pH va ligado a la producción de ácido láctico. Al principio el pH se encuentra entre 6,5-7 y tras la fermentación y por lo tanto producción de ácido láctico, desciende a valores entre 3,4 y 3,8 pero nunca superando el pH 4. La acidez final del producto dependerá del método de salinidad empleado, oscilando entre 0,6 y 0,8. 4

-

Cambios microbiológicos: Los microorganismos más importantes que intervienen en la fermentación son las bacterias ácido lácticas, bacterias productoras de gases y levaduras que se encuentran de forma natural tanto en el fruto como en la tierra que se cultiva. Para la producción de ácido láctico, el microorganismo más abundante y habitual es Lactobacillus plantarum aunque se pueden encontrar

otros

como

Lactobacillus

brevis,

Leuconostoc

mesenteroides y Pediococcus cerevisiae. En la producción de gas aparecen bacterias del género Aerobacter, que además generan anhídrido carbónico e hidrógeno. A mayor concentración de salmuera, mayor concentración de aerobacterias y por lo tanto mayor producción de gases

pero cuando la

concentración desciende hay una rápida formación de ácido láctico que impide la proliferación de dichas bacterias. Las levaduras oxidativas son responsables de malos olores y disminución de calidad en los encurtidos, por lo que hay q combatir su aparición y para ello se utiliza aceite mineral, rayos U.V. o luz solar.

En los procesos de fermentación se debe controlar: -Concentración de sal: Este evaluación se deberá hacer diariamente durante los diez primeros días y para ello se utilizará un densímetro o pesasales contrastados.

-Control de pH: Para medir este parámetro se utiliza un pH-metro o una tira de pH y se evalúa en la misma muestra en la que se determina la concentración de salmuera. Este control se hará durante los primeros 15 días, a partir de aquí se hará de forma más espaciada hasta llegar al final de la fermentación en la cual quizás haya que corregir la acidez del producto.

-Control de observación de frutos y depósitos de fermentación: Para ello se va observando periódicamente tanto los frutos como los 5

depósitos en los que estos se encuentran anotándose las observaciones, indicándonos la finalización de los cambios físicos del fruto.

1.1.2. Encurtidos analizados Para llevar a cabo este ensayo hemos estudiado dos grupos de encurtidos divididos en encurtidos ecológicos y no ecológicos. Un producto ecológico es aquel que se obtiene sin utilizar ningún tipo de producto químico, por lo tanto no se modifica su capacidad nutritiva con dichos productos ya sean abonos, pesticidas, herbicidas, etc. tanto para mejorar la fertilidad del suelo como para eliminar algún tipo de hierba o insecto indeseado del producto. Para el cultivo de productos ecológicos vegetales se pueden utilizar compost como forma de abono o rotación de cultivos para renovar los nutrientes del suelo entre otras prácticas, manteniendo así la fertilidad del suelo en el que estos son cultivados, pues esta práctica se basa en la producción de vegetales respetando el medio que le rodea, es decir, el ecosistema.

Por el contrario para la producción de productos no ecológicos sí se usan productos químicos ya sea para su elaboración como para su conservación, pues a la hora de cultivar vegetales se utilizan abonos, pesticidas, herbicidas, etc. tanto para mantener o mejorar la fertilidad del suelo como para eliminar algún insecto, microorganismo o planta indeseada en el cultivo. A la hora de la conservación y preservación del alimento pueden añadirse conservantes, aditivos, aromas, etc. artificiales. Los alimentos utilizados en el ensayo han sido:

Aceitunas La aceituna es el fruto de la oliva que pertenece a la familia Oleaceae. Este fruto proporciona algunos beneficios como favorecer la digestión, previene enfermedades cardiovasculares, facilita el vaciamiento de la vesícula biliar y además son antioxidantes. Su pulpa contiene alrededor del 80% de ácido oleico, un ácido graso que ejerce un beneficio para los vasos sanguíneos, de ahí su ayuda a prevenir enfermedades cardiovasculares, pues ayuda a eliminar el colesterol malo de la sangre. 6

Las aceitunas pueden consumirse en forma de aceite o en fresco tras un proceso de fermentación. Al inicio de la fermentación de estos alimentos predominan géneros Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc, que compiten con la microbiota Gram positiva, que a medida que continúa el proceso van desapareciendo y predominando otras, por lo que al final encontramos generalmente Lactobacillus. (Fernández et al., 1993; Harris, 1998).

Pepinillos El pepinillo es un pepino inmaduro comercializado como encurtido tras una fermentación ácido-láctica. El pepino pertenece a la familia de las cucurbitáceas y se consume en forma de encurtido por su resistencia a temperaturas elevadas y concentración salina elevada. El microorganismo que lleva a cabo este proceso es Lactobacillus plantarum. El pepinillo, al estar fermentado no aporta los mismos nutrientes que el pepino fresco, pues el aporte nutricional que aporta es algo más bajo, aunque podemos destacar su contenido en sodio, vitamina B6 y ácido ascórbico que tiene poder antioxidante. También puede servir para la prevención de tumores gracias a su poder antioxidante.

Guindillas La guindilla pertenece a una variedad autóctona de pepino. Es un alimento rico en vitaminas, destacando vitamina C que le da actividad antioxidante lo que hace que sea beneficioso para nuestra vista, oído, piel, aparato respiratorio y circulatorio. La vitamina A que favorece el metabolismo y la utilización de aminoácidos por las proteínas; vitamina E, con importantes funciones antioxidantes y la vitamina K, que presenta acción antihemorrágica, coagulante y acelera la cicatrización de los tejidos (Franco, 1995). Su sabor picante se debe al alcaloide capsaicina quien actúa también como antioxidante.

Berenjenas Es una planta herbácea anual, contiene un alto porcentaje de agua y bajo en azúcares, proteínas y grasas por lo que no tiene mucho aporte calórico. Su mineral más abundante es el potasio aunque también contiene calcio, magnesio y fósforo. Podemos encontrar algunas vitaminas como provitamina A 7

o vitamina C. Pero tiene una sustancia llamada solanina que es tóxica y puede provocar migrañas y alteraciones gastrointestinales por lo que no la podemos consumir cruda.

1.2.

Bacterias lácticas

Se conoce como bacterias lácticas a aquellos microorganismos que tras la fermentación de carbohidratos, obtienen como producto final ácido láctico. Este grupo de bacterias tal vez sea el más abundante, ya que están ampliamente distribuidas, pudiendo encontrarlas tanto en la naturaleza como en el tracto digestivo y urinario de humanos y animales formando parte de su microflora. Además, este grupo tiene un importante papel en la industria alimentaria interviniendo en la producción de alimentos fermentados como leche, productos lácteos, cárnicos, vegetales, vinos y cervezas. Las bacterias lácticas (BAL), aportan nuevas características organolépticas a los alimentos mejorando su sabor, olor, textura y valor nutricional. Además, ayudan a aumentar la vida útil del alimento gracias a la acidificación del medio (tras la producción de ácido láctico) y a su capacidad de crecer y desarrollarse en ambientes con un pH ácido y concentración salina relativamente alta, lo que hace que se inhiba el crecimiento y desarrollo de microorganismos patógenos y por tanto de sus sustancias tóxicas. Debido a la concentración salina del medio, se lleva a cabo una buena deshidratación del alimento, haciendo que este se deteriore por factores físicos o químicos y no por agentes bacterianos.

La amplia distribución de BAL es debido a su capacidad de crecer y desarrollarse

en

ambientes

de

elevadas

temperaturas,

de

altas

concentraciones de cloruro sódico, en sustratos de origen animal de un pH neutro, así como en elevada acidez en sustratos de origen vegetal (Carr, 1973). Esta amplia heterogeneidad de ambientes se debe a su amplia diversidad morfológica y fisiológica. En general, las BAL son cocos o bacilos Grampositivos,

no

esporulados,

anaeróbicos

aerotolerantes,

inmóviles,

microaerofílicos o aerotolerantes; oxidasa, catalasa y bencidina negativas, carecen de porfirinas y citocromos, no reductores de los nitratos y producen ácido láctico como el único o principal producto de la fermentación de 8

carbohidratos (Carr et al., 2002; Vázquez et al., 2009). Aunque algunos ensayos han demostrado que hay algunas excepciones y no todas las bacterias lácticas tienen dichas características. Al ser microorganismos anaerobios pueden impedir el crecimiento de aerobios Gram negativos.

1.2.1. Clasificación de bacterias lácticas Las bacterias ácido lácticas pertenecen al filo Firmicutes que contiene alrededor

de

Leuconostoc,

20

géneros:

Pediococcus,

Lactococcus, Aerococcus,

Lactobacillus,

Streptococcus,

Carnobacterium,

Enterococcus,

Oenococcus, Tetragenooccus, Vagococcus y Weisellason los principales miembros de las BAL, siendo Lactobacillus el más grande de estos géneros. (Bouzar et al., 1997; Devlieghere et al., 2004; Gálvez et al., 2007; Jagnow y Wolfang, 1991).

Estas bacterias se pueden clasificar según su producto final en la fermentación: homofermentativas (Producen como producto final en la fermentación sólo ácido láctico) o heterofermentativas (Como producto final de la fermentación produce otras sustancias a demás de ácido láctico) o según a la temperatura óptima a la que crecen: mesófilas (tienen una temperatura de incubación entre 20-25ºC durante 18-20h) o termófilas (tienen una temperatura de incubación entre 40-45ºC durante 2-4h).

1.2.2. Sustancias producidas por bacterias lácticas

Ácido láctico: Este ácido es el que producen en mayor cantidad las bacterias lácticas. El ácido provoca un ambiente desfavorable para agentes patógenos o para la putrefacción del alimento ya que el pH del medio influye mucho en el crecimiento y desarrollo de los microorganismos responsables del deterioro del alimento. El efecto que causa el ácido en el alimento depende de la especie de microorganismo, tipo de ácido, concentración y tiempo. Así, por ejemplo, las bacterias lácticas son ácido tolerantes, es decir, pueden crecer algunas a valores de pH tan bajos como 3.2 y otras a valores tan altos como 9.6 (la mayoría crecen a pH entre 4 y 4.5) (Carr et al., 2002). 9

Ácido propiónico: Este al igual que otros ácidos hace que haya un ambiente desfavorable para bacterias gram positivas, gram negativas, mohos y levaduras lo que hace preservar por más tiempo el alimento en el que se encuentre.

Ácido cítrico y algunos ácidos volátiles: Estos también son producidos por BAL y de igual modo que el resto de los ácidos, son antagonistas del desarrollo y proliferación de diferentes microorganismos. Los ácidos que producen estas bacterias (láctico, acético y propiónico) ejercen su acción antimicrobiana interfiriendo con el potencial de membrana, inhiben su transporte activo, reducen el pH intracelular, dando lugar a la liberación de iones hidrógeno y del anión correspondiente, haciendo que ambos iones inhiban una gran variedad de funciones metabólicas y el crecimiento celular. (Doores, 1993; Vazquez et al., 2009).

Diacetilo: El diacetilo (2,3 - butanodiona) que procede del piruvato es otro de los productos finales del metabolismo de las bacteriaslácticas (Kandler, 1983).Este compuesto orgánico da aroma a algunos productos como mantequilla o cerveza además de impedir el crecimiento de algunos microorganismos, aunque su utilización en la industria alimentaria es algo dificultosa porque las BAL no producen una cantidad adecuada del mismo.

Peróxido de hidrógeno: Este compuesto se acumula en cultivos con bacterias ácido lácticas catalasa negativo, es decir, carecen de dicho enzima. Este, puede reaccionar con otros compuestos formando sustancias inhibidoras.

Bacteriocinas: De las sustancias antimicrobianas producidas por las bacterias lácticas, las bacteriocinas son las más interesantes tecnológicamente, ya que debido a su naturaleza proteica (Tagg et al., 1976), las inactivan los enzimas proteolíticos del tracto gastrointestinal y no son tóxicas ni inmunógenas en animales de experimentación (Bhunia et al., 1990), siendo un candidato perfecto para la conservación de alimentos.

10

1.3.

Bacteriocinas

Las bacteriocinas son péptidos con actividad antimicrobiana, segregadas por un gran número de bacterias para inhibir el crecimiento de otros microorganismos competidores (Monroy et al., 2009). Aunque estas sustancias pueden producirlas diversidad de especies bacterianas, tanto gram negativas como positivas, quizás las mejor conocidas sean las producidas por las BAL por su prometedor uso como bioconservantes de alimentos (Stiles y Hasting, 1991; Ray y Daeschel, 1992; Hernández et al., 1993; Jack et al., 1995; Cleveland et al., 2001). Estas sustancias se detectaron por primera vez en Escherichia coli (Hardy, 1975) y más tarde en algunas bacterias Gram-positivas (Tagg et al., 1976).

Las bacteriocinas producidas por bacterias lácticas son un grupo muy heterogéneo, pues por normal general, estas están formadas únicamente por proteínas aunque se han podido observar que algunas, además de su parte proteica, tienen componentes glucocídicos o lipídicos. Por este motivo, no todas reaccionan igual ante un determinado pH, temperatura o degradación enzimática. Por norma general, estas son estables a pH ácidos o próximos a pH neutros y termorresistentes, lo que les permite mantener su actividad antimicrobiana a temperaturas similares a las de pasterización y esterilización de la leche (Piard et al., 1992). No obstante, si la temperatura es demasiado elevada para la cepa, puede suprimir la producción de bacteriocinas.

La biosíntesis de bacteriocinas ocurre o en la fase logarítmica del desarrollo bacteriano o al final de la misma y, en la mayoría de los casos guarda relación con la biomasa producida (Piard y Desmazeaud, 1992), para que estas se produzcan debe haber algunos nutrientes, como extracto de levadura, aminoácidos, manganeso y manitol para aumentar, disminuir o suprimir la producción de diversas bacteriocinas (Rogers, 1972; Clarke et al., 1975; Hale y Hinsdill, 1973 y Tagg et al., 1975). Estos péptidos, las bacteriocinas, son inactivados por un enzima proteolítico, ya sea pancreático o gástrico, por lo que no resulta tóxico para el consumo humano y animal y es muy utilizado en la industria

alimentaria

para

la

biopreservación,

pues

actúa

frente

microorganismos no deseados o patógenos de los alimentos controlando la 11

fermentación de la microflora y acción microbiana, de tal modo que alarga la vida útil del alimento.

1.3.1. Clasificación de bacteriocinas Según la clasificación propuesta por Kemperman, y Monroy et al., 2009 basada en características genéticas y bioquímicas del péptido, las bacteriocinas se clasifican en: Clase I – Lantibioticos: Se trata de pequeños péptidos (