Tema 3.2

Bases genéticas de la reprogramación celular José Manuel Pérez Pérez [email protected] Avances en Genética, Máster en Bioingeniería y Biotecnología 11 de marzo de 2014

T3.2. Bases genéticas de la reprogramación celular 1. Introducción: marco histórico y conceptual 2. Métodos de inducción de células madre pluripotentes 3. Inducción de células madres pluripotentes (iPSCs) mediante sobreexpresión génica 4. Técnicas para el estudio de la reprogramación celular 5. Etapas en la reprogramación celular de iPSCs 6. Función de los factores OSKM durante la reprogramación celular 7. Cambios epigenéticos durante la reprogramación celular 8. Aplicaciones de la reprogramación celular 9. El proyecto “Grandiose”

Preformación vs. epigénesis

Desarrollo embrionario del pollo (D1-D5)

1 Introducción: marco histórico y conceptual

Definición de epigenética • “la rama de la biología que estudia la relación causal entre los genes y sus productos, y que da sentido al fenotipo” (Waddington, 1942) Paisaje epigenético de Waddington

• Requiere de diferenciación celular (regulación de la expresión génica)

C.H. Waddington (1957)

La plasticidad celular durante el desarrollo • El concepto de diferenciación celular: somatoplasma vs. germoplasma (Weismann, 1893)

• La pluripotencia de las células embrionarias (Haeckel, Roux, Driesch, Morgan, 1890s)

• La reprogramación de células embrionarias (Spemann, Mangold, 1924)

• La reprogramación celular en individuos adultos: regeneración del cristalino en tritones (Colucci, Wolff, 1890s)

• El principio de equivalencia nuclear (Spemann, 1938)

Totipotencia, pluripotencia y transdiferenciación • Totipotente: puede generar todos los tipos celulares incluyendo tejidos extraembrionarios

• Pluripotente: puede generar células de las tres capas embrionarias

• Multipotente: puede generar varios tipos de células somáticas pero de un tejido particular

• Unipotente: sólo generan un tipo de célula

Totipotencia, pluripotencia y transdiferenciación Multipotente

Totipotencia, pluripotencia y transdiferenciación

Definición de células madre Existen dos tipos principales de células madre: somáticas y embrionarias (ESCs) Auto-perpetuación (self renewal) Es capaz de dividirse de forma simétrica y sin diferenciación Pluripotencia Es capaz de producir células diferenciadas de cada una de las tres capas embrionarias: endodermo, mesodermo y ectodermo

El concepto del nicho en células madre

Las células madre embrionarias son pluripotentes Cuerpos embrionarios

In vitro

ESCs (mezcla de células diferenciadas)

Teratomas Inyección en ratones inmunodeprimidos

Células de las tres capas

Inducción de la reprogramación celular

5-azacitidina

Antennapedia

eyeless

• W. Gehring (1987, 1996)

• Weintraub (1987)

Inducción de la reprogramación celular

Reprogramación nuclear de la pluripotencia 1. Transferencia de núcleos de células somáticas (SCNT)

• Ranas adultas de origen clonal a partir de células somáticas (Briggs, King, Gurdon, 1950s)

• La oveja Dolly (Wilmut, 1996) • ratones, perros, cabras, lobos, animales extintos, etc. 2 Métodos de inducción de células madre pluripotentes

Reprogramación nuclear de la pluripotencia 1. Transferencia de núcleos de células somáticas (SCNT) Tachibana M, et al. (2013) Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer. Cell 153:1228-38

 baja eficacia (1-2%)

 memoria epigenética

Reprogramación nuclear de la pluripotencia 2. Fusión celular

• Para identificar proteínas supresores de tumores (1960s) • Transactivación directa de genes de pluripotencia (Oct4, Nanog)  entre la misma o distintas especies

 reorganizaciones genómicas

Reprogramación nuclear de la pluripotencia 3. Sobreexpresión de factores de transcripción

Shinya Yamanaka Kyoto University

Cronología de la reprogramación nuclear

Cell 126: 663-676 (2006)

Shinya Yamanaka Kyoto University

Cell 131: 861-872 (2007)

• Hipótesis: las células somáticas diferenciadas pueden reprogramarse en células madres pluripotentes (iPSCs)

• 24 genes candidato (expresados en ESCs)

3 Inducción de células madres pluripotentes mediante sobreexpresión génica

¿Cuántos factores se necesitan para la reprogramación? Diseño experimental FBX15: se expresa de manera específica en ESCs βgeo: el gen de resistencia al antibiótico G418

Para la transformación se utilizó un retrovirus que permite la integración del transgen en el genoma

¿Cuántos factores se necesitan para la reprogramación?

10 candidatos 24 candidatos que se expresaban en ESCs

Factores OSKM

Oct4 (14) Sox2 (15) Klf4 (20) Myc (22) 4 candidatos

Las iPSCs son pluripotentes Marcadores de pluripotencia Desarrollo embrionario (in vivo)

Formación de teratomas Formación de cuerpos embrionarios (in vitro)

Se han generado iPSCs en: Ratón (Yamanaka et al., 2006) Humano (Yamanaka et al., 2007) Macaco (Liu et al., 2008) Ratas (Liao et al., 2009; Li et al., 2009) Perros (Shimada, H. et al, 2010) Cerdos ( Esteban, M. A. et al., 2009) Titís (Wu, Y. et al., 2010) Conejos (Honda, A. et al., 2010) Caballos (Kristina Nagy et al., 2011 ) Pollos (Lu et al., 2011)

Premio Nobel en Fisiología o Medicina, 2012

Shinya Yamanaka John B. Gurdon

“for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent”

Técnicas para el estudio de la reprogramación celular 1. Estudio del perfil transcripcional a genoma completo (RNA-seq) • Serie temporal • Al nivel de células individuales

4 Técnicas para el estudio de la reprogramación celular

Clasificación de células activadas por fluorescencia

Técnicas para el estudio de la reprogramación celular 2. Inmunoprecipitación de la cromatina y secuenciación (ChIP-seq) 3. Proteómica

Etapas en la reprogramación celular de iPSCs 1. Fase de iniciación 2. Fase intermedia 3. Fase tardía (maduración y estabilización) Fase de iniciación

5 Etapas en la reprogramación celular de iPSCs

Fase tardía

Etapas en la reprogramación celular de iPSCs 1. Fase de iniciación 2. Fase intermedia 3. Fase tardía (maduración y estabilización)

Etapas en la reprogramación celular de iPSCs D0-D3

• Se produce la desdiferenciación, aumenta la proliferación y se altera la expresión génica

• Se altera el metabolismo energético

Etapas en la reprogramación celular de iPSCs D9-D12

• Maduración: se activan los genes de pluripotencia (core pluripotency gene network)

Sall4, Oct4, Nanog, Sox2, Esrrb

• Estabilización: una proporción baja de células se convierte en iPSCs

Dppa2, Utf1

Modelos de reprogramación celular • Sólo una pequeña fracción de células (95%)

• Mbd3 interacciona con OSKM y actúa como represor de los genes de pluripotencia

• OSK también interaccionan con WDR5 o UTX (que actúan como reguladores positivos de pluripotencia)

Aplicaciones de las iPSCs en Medicina

8. Aplicaciones de la reprogramación celular

Diferenciación de iPSCs in vitro

Diferenciación de iPSCs in vitro

El proyecto “Grandiose” • Objetivo: caracterización molecular de la ruta de reprogramación celular a iPSCs mediada por OSKM

• >50 investigadores en 9 grupos de investigación (Canadá, Australia, Corea del Sur, Holanda)

• 5 artículos publicados:

9. El proyecto “Grandiose”

[email protected] practicas avances

• Fgf4, Cdh1, Chd7, Sall4, Oct4, Nanog, Sox2, Esrrb, Dppa2, Utf1, Lin28, Tet2, UTX, Dnmt1, Lsd1, …