Fac. Cs. Qs. Dpto. De BIOQUÍMICA - ALIMENTOS LABORATORIO DE BIOQUÍMICA II Q.F.B

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

ÁREA ESPECÍFICA DE:

BIOQUÍMICA - ALIMENTOS

NOMBRE DE LA ASIGNATURA:

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I

CÓDIGO:

FAR 111L

FECHA DE ELABORACIÓN:

MARZO 2002

NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR:

FORMATIVO

TIPO DE ASIGNATURA:

CIENCIA DISCIPLINARIA

PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIÓN: M. C. Ma. Bertha Alvarado Hidalgo M. C. Rosa María Dávila Márquez M. C. Eustoquia Ramos Ramírez Q.F.B.Inés Zoraida García Cerón M. C. Leticia García Albarrán HORAS DE TEORÍA:

HORAS PRÁCTICA: 2

CRÉDITOS: 10

PRE-REQUISITOS: Sin requisitos RECOMENDACIONES: Biología, Química orgánica I, Fisicoquímica I Química general, Química analítica, Análisis Instrumental PRESENTACIÓN GENERAL DEL PROGRAMA Las moléculas presentes en los organismos forman una mezcla muy compleja que es necesario conocer de forma individual para relacionarlas con sus propiedades biológicas. En el caso particular de proteínas, su estudio permite establecer los parámetros necesarios a controlar para su aplicación extracelular y regulación; por ello, en este laboratorio se realizarán algunas determinaciones para aminoácidos, proteínas, enzimas y carbohidratos que reafirmarán y complementarán los aspectos cubiertos en clase

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OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO Al término del curso, el alumno:

¾

Desarrollará habilidades manuales para el empleo de material y equipo del laboratorio de Bioquímica

¾

Realizará separación de mezclas de aminoácidos por cromatografía en papel

¾

Determinará el pI de proteínas y aplicará éste para realizar el aislamiento de caseínas

¾

Aplicará el efecto de la temperatura y fuerza iónica para aislar proteínas del suero lácteo

¾

Aplicará temperatura para desnaturalizar una enzima e inhibidores para controlar su actividad

¾

Realizará algunas reacciones para determinar la presencia de carbohidratos

METODOLOGÍA. Todo proceso de enseñanza - aprendizaje que tenga como finalidad la construcción de conocimientos significativos involucra al docente y alumnos en actividades regidas por la participación y respeto mutuo, en donde se realizan acciones que permiten alcanzar los objetivos propuestos, por ello en el desarrollo del curso:

¾

Se considerará la asistencia y puntualidad, con la finalidad de promover en el estudiante un sentido de responsabilidad.

¾

A través de la formación de equipos se promoverá la iniciativa en la toma de decisiones, creatividad, administración del tiempo y trabajo en equipo.

¾

A través de la discusión de los resultados de las prácticas de laboratorio se promoverá el desarrollo de la capacidad de solución a diferentes problemas que se le presenten.

INSTRUMENTACIÓN DIDÁCTICA A UTILIZAR Equipamiento de laboratorio adecuado para cada práctica y pizarrón

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CRITERIOS DE EVALUACIÓN

¾ ¾

Los alumnos deberán cubrir el 100% de prácticas y reportes La calificación mínima aprobatoria es de 7.0

PRÁCTICAS DE LABORATORIO PROPUESTAS: Están sujetas a la disponibilidad de reactivos y equipo, a continuación se presentan las prácticas que como mínimo se realizan cada cuatrimestre.

¾

Cromatografía de Aminoácidos

¾

Determinación de aminoácidos azufrados en las proteínas

¾

Punto Isoeléctrico de Proteínas

¾

Aislamiento de Proteínas parte A

¾

Aislamiento de Proteínas parte B

¾

Actividad enzimática

¾

Determinación de la Presencia de Azúcares reductores y Formación de Osazonas

NOTA: Después de realizada cada práctica, en la sesión siguiente se discute el procedimiento y resultados obtenidos BIBLIOGRAFÍA Remitirse al programa teórico

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PROPIEDADES ANFOTÉRICAS DE LOS AMINOÁCIDOS INTRODUCCIÓN: La separación, identificación y valoración de aminoácidos presentes en una proteína se basan en las propiedades ácido-base de los mismos. Dos características importantes de los aminoácidos: Puntos de fusión altos y una gran solubilidad en agua, llevaron a la conclusión de que los aminoácidos se encuentran y cristalizan a partir de soluciones acuosas en forma de iones dipolares (también llamados iones híbridos o zwiteriones) en lugar de hacerlo en forma de moléculas no disociables.

-

+

NH3 - CH - COO R

Zwitterión

Cuando se disuelve en agua un ión híbrido cristalizado puede actuar como ácido (donador de protones) o como base (aceptor de protones) Como ÁCIDO:

+

NH3 - CH - COO

-

NH2 - CH - COO

-

+H R

+

R

Como BASE: + +

H

+

NH3 - CH - COO

-

+

NH3 - CH - COOH

R

R

Las sustancias que poseen esta propiedad son ANFOTEROS y se llaman ANFOLITOS. Puede comprobarse tal comportamiento realizando una titulación con álcali (se observa comportamiento como ácido) o con ácido ( se observa comportamiento como base) de tal forma que se construyan a partir de los diferentes valores de pH obtenidos, curvas de valoración.

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pH Curva de un aminoácido monoamino, monocarboxílico.

ml de base

ml de ácido

A partir de estas curvas podemos obtener datos como las pKa que indican el valor de pH en que las soluciones de aminoácidos tienen su máxima capacidad amortiguadora y el valor del PUNTO ISOELECTRICO (pI ó pHI) que se define como el valor de pH en el cual un aminoácido presenta carga neta eléctrica igual a cero. Debemos hacer notar que no todos los aminoácidos son monoamino monocarboxílicos y por lo tanto encontraremos curvas de valoración características para cada aminoácido. OBJETIVOS 1. Realizar una titulación de diferentes aminoácidos para comprobar su comportamiento anfotérico. 2. Construir una curva de valoración y a partir de ésta calcular los valores de pKa y pI. MATERIAL • Potenciómetro. • Vaso de precipitado • Barra magnética. • Buretas

• Agitador Magnético • Soportes con pinzas • Probeta.

REACTIVOS • HCl 0.1 N • NaOH 0.1 N • Soluciones de aminoácidos 0.01 N DESARROLLO. 1. En un vaso de precipitado colocar la barra magnética y 30 ml del aminoácido a titular. 2. Llene y afore una bureta con la solución de HCl o NaOH y colóquela sobre el vaso con la ayuda de un soporte dispuesto con pinzas de tal forma que permita la libertad de movimiento de la llave de la bureta.

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3. La titulación potenciométrica se efectuará haciendo una lectura inicial antes de añadir el titulante y después de cada adición, las cantidades adicionadas de titulante se indicarán por el titular de la práctica. 4. Antes de iniciar la titulación espere las indicaciones sobre el manejo del potenciómetro y su ajuste. REPORTE: 1. Graficar en papel milimétrico el volumen en mililitros sobre el eje de la abcisas y los valores de pH en el eje de las ordenadas. 2. Sobre la gráfica marcar los valores de pKa. 3. Calcular los valores de pI para cada aminoácido. 4. Comparar los valores de pI obtenidos en la práctica con los valores reportados en la bibliografía. 5. Discutir los resultados obtenidos. 6. Conclusiones generales. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4.

Escriba la ecuación de Henderson-Hasselbach. Defina Anfolito. Defina punto isoeléctrico. Escriba la estructura de un aminoácido monoamino dicarboxílico

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CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS INTRODUCCIÓN Varios factores son importantes en la separación de sustancias por cromatografía en papel, entre ellos hay que citar la partición, una combinación de partición y adsorción y en algunos casos el intercambio iónico. El factor predominante en la separación de solutos por cromatografía en papel es la partición entre dos fases no miscibles (coeficiente de reparto); fase estacionaria (agua) y fase móvil (solventes orgánicos). El soluto se mueve en la dirección del flujo del solvente a una velocidad determinada por la atracción que ejerzan sobre las fases del sistema, a esto se le denomina Rf. Los principales factores con este método influencian los Rf de los aminoácidos son el pH, tipo de papel, temperatura y longitud de la mecha. Es conveniente analizar al mismo tiempo y con el mismo disco soluciones estándar y soluciones desconocidas. OBJETIVOS: 1. Realizar una cromatografía circular de aminoácidos. 2. Separar una mezcla de aminoácidos. MATERIAL: Que deberán traer los alumnos • Tijeras

• Compás

• Lápiz

• Reglas

• Algodón

En el laboratorio • Caja de petri • Capilares • Papel filtro • Estufa a 55ºC REACTIVOS: • • • •

Aminoácidos en solución 0.05 Solvente: n-Butanol: Ácido acético glacial: Agua (4:1:5) Revelador: Solución de Ninhidrina Hidróxido de amonio concentrado

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DESARROLLO: 1. Doble por la mitad el círculo de papel filtro con ayuda de dos escuadras. 2. Con lápiz y regla divida en cuatro cuadrantes el círculo de papel filtro. 3. Con un compás trace un circulo de un centímetro de radio en el centro del papel (origen). 4. En el extremo más alejado del centro de cada cuadrante escriba el nombre de cada aminoácido y en un cuadrante la palabra mezcla. 5. Con ayuda del compás haga un orificio en el centro del papel. 6. Con un pedazo de algodón haga una pequeña mecha e introdúzcala por el orificio, procure que la mecha no sea muy gruesa. La mecha por la parte inferior debe tener de 1.5 a 2 cm de largo y por la parte superior debe estar casi al ras del papel. 7. Coloque en la base de la caja de petri el solvente (aproximadamente 15 ml). Tápela para que se sature. 8. Aplique en el papel sobre el origen, utilizando los capilares, el aminoácido que corresponda al nombre escrito en cada cuadrante, para la mezcla, deberá colocar una gota de cada aminoácido procurando que seque entre cada aplicación. 9. Una vez secas todas las muestras pase el papel sobre el bocal de una botella de hidróxido de amonio concentrado para neutralizar los aminoácidos. 10.Coloque el papel dentro de la caja petri (sobresalen los bordes) presione ligeramente. 11.Espere que corra el solvente y saque el papel cuando el solvente esté en el borde de la caja. Quite la mecha jalándola hacia abajo, marque con el lápiz el frente del solvente para cada cuadrante . 12.Seque por aereación el papel y rocíe el revelador , espere que seque un poco e introdúzcalo a la estufa hasta aparición de color. CUESTIONARIO. 1. ¿En qué orden migran los aminoácidos de los diferentes grupos? 2. ¿Es la Ninhidrina un revelador selectivo? ¿Por qué? 3. ¿Como se calcula el Rf?

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CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS (2) INTRODUCCIÓN Varios factores son importantes en la separación de sustancias por cromatografía en papel; entre ellos hay que citar la partición, una combinación de partición y adsorción y en algunos casos el intercambio iónico. El factor predominante en la separación de solutos por cromatografía en papel es la partición entre dos fases no miscibles (Coeficiente de reparto); fase estacionaria (Agua) y fase móvil (Solventes orgánicos). El soluto se mueve en la dirección del flujo del solvente a una velocidad determinada por la atracción que ejerzan sobre él las fases del sistema, a esto se le denomina Rf. Los principales factores que afectan al Rf de los aminoácidos son el pH, tipo de papel y temperatura. Es conveniente analizar al mismo tiempo y en el mismo papel soluciones estándar y desconocidas. OBJETIVOS: 1. Realizar una cromatografía ascendente de aminoácidos. 2. Separar una mezcla de aminoácidos. MATERIAL: • • • •

Cámara cromatográfica Papel para cromatografía (16 cm largo X 18 cm ancho) Estufa 90 0 C Capilares

LOS ALUMNOS DEBERÁN TRAER: • Lápiz • Reglas REACTIVOS: • Aminoácidos en solución 0.05 M • Solvente: n - Butanol: Ácido acético glacial: Agua 4 : 1 : 5 • Revelador: Solución de Ninhidrina • Hidróxido de amonio concentrado

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DESARROLLO 1. Cuidando de tocar SOLO en la esquina superior, marque una línea horizontal a 2 cm del borde inferior a todo lo ancho de la hoja de cromatografía (Origen) 2. Sobre el origen marque respecto de la orilla las siguientes medidas: 3.5 , 7.5 , 11.5 y 15.5 cm respectivamente. 3. En estos puntos escriba el nombre del aminoácido que corresponda y la palabra 4. 5.

6. 7. 8. 9.

mezcla. Coloque en la cámara el solvente (aproximadamente 20 ml) tápela para que se sature. Aplique con los capilares sobre el punto que marcó en el origen el aminoácido que corresponda, para la mezcla deberá colocar una gota de cada aminoácido procurando que seque entre cada aplicación. Una vez secas todas las muestras pase el papel sobre el bocal de una botella de hidróxido de amonio concentrado para neutralizar los aminoácidos. Tomando las esquinas del borde superior únalas (Formando un rollo) e introdúzcalo a la cámara, cierre. Espere que corra el solvente y saque el papel cuando el solvente esté aproximadamente a un cm. del borde de la cámara. Seque por aereación el papel y rocíe el revelador, espere que seque un poco e introdúzcalo a la estufa hasta aparición de color.

CUESTIONARIO 1. ¿En qué orden migran los aminoácidos de los diferentes grupos? 2. ¿Es la ninhidrina un revelador selectivo? ¿Por qué? 3. ¿Cómo se calcula el Rf?

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PUNTO ISOELÉCTRICO DE PROTEÍNAS INTRODUCCIÓN: La conducta de una proteína ante una titulación, depende del número y la carga de cada uno de los grupos ionizables de los aminoácidos que las formen (grupo guanidílico, fenólico, imidazólico, amino y carboxilo). El pH al que una proteína muestran un mínimo de solubilidad es su punto isoeléctrico o pH isoeléctrico, definido como el valor de pH al que una molécula posee carga neta de cero y es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico. En estas condiciones no existe repulsión electrostática ente moléculas de proteínas vecinas y tienden a coalecer y flocular o precipitar según sea el caso. OBJETIVOS: 1. Determinar el pI de diferentes proteínas. 2. Observar el efecto del alcohol como agente precipitante. MATERIAL: • 9 tubos de ensaye • 1 gradilla. REACTIVOS: • Caseinato de sodio 0.1 N • Gelatina al 1.0 % • Ovoalbúmina en KCl 1:16 • Ácido acético: 0.01 N, 0.1 N, 1.0 N.

• • • •

NaOH 1.0 N Acetato de sodio 0.1 N Alcohol etílico Agua destilada

DESARROLLO: DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEINA. Preparar 9 tubos como lo indica la tabla siguiente NÚMERO DE TUBO REACTIVOS.(ml.) Agua destilada Ac acético 0.01 N Ac acético 0.1 N Ac acético 1.0 N

1 8.38 0.62 -----

2 7.75 1.25 -----

3 8.75 --0.25 ---

4 8.5 --0.5 ---

5 8 --1 ---

6 7 --2 ---

7 5 --4 ---

8 1 --8 ---

9 7.4 ----1.6

Agitar los tubos y agregar 1 ml de solución de caseína (Caseinato de sodio 0.1 N). Agitar los tubos inmediatamente. Observar los enturbiamientos que se producen después de agitar, esperar 15 minutos y anotar los resultados marcando con "0" la falta de turbidez, marcar con una "+"· los grados de turbidez y con una "X" la precipitación. El pH de cada tubo se determina usando la ecuación de Henderson Hasselbach.

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DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA GELATINA La gelatina y otras proteínas se disuelven por completo en el agua aún en su punto isoeléctrico, por lo tanto deben añadirse agentes precipitantes como el alcohol etílico para hacerlo de manifiesto. Preparar 9 tubos como lo indica la tabla siguiente: NÚMERO DE TUBO REACTIVOS (ml) Acetato de sodio 0.1 N Ac. Acético 0.1 N Ac. Acético 1.0 N Agua destilada Gelatina al 1 %

1 2

2 2

3 2

4 2

5 2

6 2

7 2

8 2

9 2

0.12 --3.88 2

0.25 --3.75 2

0.5 --3.5 2

1 --3 2

2 --2 2

4 ----2

--0.8 3.2 2

--1.6 2.4 2

--3.2 0.8 2

Mezclar bien el contenido de los tubos y DESECHAR LA MITAD de cada uno, al tubo No 5 añadir de 5 a 8 ml de alcohol etílico hasta producir una tenue nebulosidad, adicionar a los demás tubos la misma cantidad de alcohol que la añadida al tubo No. 5. Anote los resultados de la misma forma que para la caseína. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA OVOALBÚMINA Preparar 7 tubos como lo indica la tabla siguiente: NÚMERO DE TUBO REACTIVO (ml) Acetato de sodio 0.1 N Ac. Acético 0.01 N Ac. Acético 0.1 N Ac. Acético 1.0 N NaOH 1.0 N Agua destilada Ovoalbúmina pH aproximado

1 1 ------6.95 1.5 8

2 1 0.05 ----0.05 6.95 1.5 7

3 1 --0.25 ----6.75 1.5 5

4 1 --1 ----6 1.5 4

5 1 --4 ----3 1.5 4

6 1 ----1.6 --5.4 1.5 3.4

7 ----6.4 --0.6 1.5 2.8

Agite y anote los resultados igual que en los casos anteriores. CUESTIONARIO: 1. Defina pI de una proteína 2. Escriba la ecuación de Henderson Hasselbach 3. ¿Por qué el alcohol actúa como agente precipitante para la gelatina?

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AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS INTRODUCCIÓN: Las caseínas de la leche y las proteínas del suero son los dos grandes grupos de proteínas de la leche. Se encuentran en forma de suspensión coloidal y existen grandes diferencias entre sus estructuras y propiedades químicas. Existen dos sistemas de estabilidad de las proteínas de la leche: En uno de estos sistemas las proteínas se encuentran en forma coloidal debido a una combinación de los mecanismos de carga eléctrica e hidratación. Estas proteínas tienden a precipitar en presencia de iones divalentes como el calcio y son insolubles en su punto isoeléctrico, ejemplo: Caseína. En el segundo sistema, las proteínas están en suspensión coloidal estabilizadas por un mecanismo de hidratación. Estas proteínas son más lábiles a la desnaturalización por calor y no son tan sensibles a los iones divalentes, se encuentran solubilizadas en su punto isoeléctrico, ejemplo: Las proteínas del suero. El método clásico para el fraccionamiento de las proteínas de la leche consiste en una precipitación de las caseínas en su punto isoeléctrico (pH 4.6) quedando como sobrenadante las proteínas del suero que pueden separarse por medio de una precipitación selectiva con sales de sulfato de amonio (precipitación por salado). OBJETIVOS: 1. Aislar la proteína caseína comprobando su presencia mediante la prueba de Biuret. 2. Comprobar el efecto de las sales neutras en las proteínas (precipitación por salado) 3. Comprobar el efecto de la temperatura sobre las proteínas. MATERIAL: • 1 Matraz Erlen Meyer • 1 agitador • Papel filtro • 3 Tubos de ensaye • 1Baño María a ebullición

• • • • •

1 Pipeta 1 Embudo 2 vasos de precipitado 1 Baño María a 38 ºC 1 Matraz aforado de 100 ml

REACTIVOS: • • • • •

Ácido acético 2 N Eter etílico Alcohol etílico Hidróxido de sodio al 10% Solución saturada de sulfato de amonio

• • • • •

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NaCl al 1% Agua destilada Reactivo de Biuret NaOH al 50% Solución estándar (8mg/ml)

de

caseína

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EL ALUMNO DEBERÁ TRAER: 125ml de leche descremada (el día anterior a la práctica coloque la leche cruda en el refrigerador y descreme antes de asistir al laboratorio). DESARROLLO: 1. Calentar en un matraz 125ml de leche a 38ºC, sin retirar del baño. 2. Agregar gota a gota y con agitación ácido acético 2 N hasta obtener un máximo de precipitado coposo (aproximadamente 25 ml) 3. Dejar reposar 15 minutos y filtrar (se obtendrá el precipitado y un sobrenadante, GUARDE el sobrenadante para pasos posteriores y trabaje con el precipitado). 4. Transfiera a un vaso de precipitado, agregue 20 ml de alcohol etílico, agite y deje reposar diez minutos. 5. Decante, deseche el sobrenadante. 6. Agregue 10 ml de éter, agite y deje reposar 5 minutos. 7. Filtre y exprima el precipitado en el papel filtro ( presione ligeramente contra las paredes del embudo con ayuda del agitador) 8. REPITA LOS PASOS 6 Y 7 DOS VECES. 9. Después del tercer lavado abra el papel filtro y deje evaporar el éter entre 15 y 20 minutos. 10. Pese aproximadamente 400 mg de la caseína obtenida, transfiera al matraz aforado con ayuda de 50-75ml de NaCl al 1%, calentar en el baño María a 38ºC y añadir la mínima cantidad posible de NaOH al 50% hasta la disolución total, afore con agua destilada. (SOLUCIÓN PROBLEMA). 11. Del sobrenadante obtenido en el paso 3 haga una dilución 1:4 con agua destilada. Empleando el método Biuret determine proteínas según el siguiente cuadro: NÚMERO DE TUBO SOLUCIÓN (ML) 2 Sol. Estándar de 0.75 Caseína --Sol. Problema --Sol. Problema 1:2 --Sobrenadante 1:4 Sobrenadante sin --diluir 5.25 NaCl al 1 % 4 Reactivo de Biuret

1 1

3 0.5

4 0.25

5 ---

6 ---

7 ---

8 ---

9 ---

---------

---------

---------

1 -------

--1 ------

----1 ---

------1

---------

5 4

5.5 4

5.75 4

5 4

5 4

5 4

5 4

6 4

1. Mezclar y dejar reposar 30 minutos (puede ser menos tiempo). 2. Leer a 540 nm. Ajustando a 100% la transmitancia con el tubo No. 9.

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3. Del sobrenadante obtenido en el paso 3 coloque un ml en el tubo de ensaye y agregue un ml de solución saturada de sulfato de amonio, observe. 4. En un tubo de ensaye coloque un ml de sobrenadante obtenido en el paso 3 y caliente en el baño María a ebullición, observe. REPORTE: Construya la curva estándar de caseína: Tubos 1 a 4 D.O. (Absorbancia)

mg Interpole la lectura del problema y del sobrenadante en la curva obtenida para determinar la concentración en cada caso. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4.

¿Cómo es la solubilidad de las proteínas en su pI? ¿Cuál es el fundamento de la prueba de Biuret? ¿Cuál es la explicación física de la precipitación por salado? ¿Cómo afecta la temperatura a las proteínas?

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EFECTOS DEL CIANURO SOBRE LA CATALASA INTRODUCCIÓN: Nombre común: Catalasa. Nombre sistemático: Oxidorreductasa de peróxido de hidrógeno Número de la comisión internacional de enzimas: 1.11.1.6 Peso molecular: 250,000 pH óptimo: 7.0-7.6 La Catalasa es una enzima que ser encuentra en todas las células vivas (a excepción por ejemplo de los microorganismos anaerobios). Es especialmente abundante en sangre y en hígado. La Catalasa es una hemoproteína, aparentemente tiene función protectora ya que elimina el peróxido de hidrógeno que de otro modo sería tóxico para el organismo. Cataliza la siguiente reacción: 2 H2O2

2 H2O

+

O2

La catalasa al igual que los citocromos y peróxidasas son inhibidos importantemente por el cianuro, ya que este se combina sobre enzimas que contienen hierro en la forma ferrosa. OBJETIVOS: 1. Medir la actividad de la catalasa en presencia y ausencia de cianuro. 2. Determinar cuantitativamente la actividad de la catalasa desnaturalizada. MATERIAL: Deberán de traer los alumnos por equipo • Lanceta estéril • Hielo. • Molde para baño de hielo En el laboratorio • Matraz Erlenmeyer de 50 ml. • Capilar • 5 tubos de ensaye. • 2 pipetas de 10 ml. • 2 pipetas de 5 ml. • 3 pipetas de 1 ml • Bureta con soporte REACTIVOS: • Agua destilada fría. • Amortiguador de fosfato 0.02 M pH 7. • Catalasa (Dilución de sangre fresca 1:1000). • Peróxido de hidrógeno 0.05 M en amortiguador de fosfatos.

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• KMnO4 0.005 M. • H2SO4 6 N. • KCN 5 X 10-5 M.

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DESARROLLO: 1. Poner 10 ml. de agua destilada fría en un matraz de 50 ml. rodeado de hielo picado. 2. Recoger una muestra de sangre fresca capilar del dedo, del orden de 10 lambda (10 microlitros) mediante punción con una lanceta estéril. 3. Dejar caer la sangre en el agua fría. Aspirando la pipeta varias veces para asegurarse que toda la sangre pase al agua. 4. Agitar el matraz durante un minuto para tener una mezcla homogénea. La sangre diluida se mantiene a temperatura baja durante todo el experimento. 5. Se preparan los tubos de acuerdo al siguiente cuadro. Mezclando el contenido de los tubos por rotación. NOTA: Todos los reactivos deben encontrarse a temperatura de hielo fúndente y la reacción se lleva a cabo a 0 ºC.

REACTIVOS (ml) Amortiguador de fosfatos 0.02 M de pH 7. H2O20.05 M (en amortiguador de fosfatos pH 7.0) Agua KCN 5 X 10-5 M H2SO4 6N Catalasa Catalasa calentada

1 10.0

2 10.0

TUBO No. 3 10.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

1.0 -----2.0 0.5 -----

1.0 ----------0.5 -----

1.0 ---------------0.5

0.5 0.5 ----0.5 ------

-----1.0 ----0.5 ------

4 10.0

5 10.0

El tubo número 1 es un blanco de reactivo y representa la cantidad de peróxido añadido a cada tubo. En los tubos 2 a 5 la reacción se detiene 5 minutos exactamente después de empezar, por adición de 2ml. de H2SO4 6 N. Se traspasa el contenido de cada tubo en matraces previamente rotulados y se titula cada uno con la solución de KMnO4 0.005 M. La primera gota de permanganato en exceso respecto a la cantidad necesaria para la oxidación del peróxido vuelve rosa la solución. Este es el punto final.

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CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD: 1. La actividad de la catalasa puede expresarse como moles de peróxido descompuesto por efecto de enzima en 5 minutos a 0 ºC 2. Antes de iniciar los cálculos, hacer una tabla del siguiente modo para ir anotando los resultados obtenidos. TUBO Ml de KMnO4 utilizados mmoles de KMnO4 utilizados mmoles de H2O2 que no reaccionaron mmoles de H2O2 descompuesto Actividad específica

1

2

3

4

5

3. Para calcular los mmoles de peróxido que no reaccionaron debe multiplicase por 2.5 los mmoles de KMnO4 que se añadieron. Este factor de 2.5 es resultado de la estequiometría de la descomposición del peróxido por el permanganato, que indica que por cada 2 moles de permanganato que se añaden se descomponen 5 moles de peróxido y por lo tanto 5/2= 2.5. 4. El testigo de tiempo cero es el número de mmoles de peróxido encontrados en el tubo número 1. 5. Para conocer los mmoles de peróxido descompuesto se debe restar la cantidad de mmoles de peróxido que no reaccionaron de la cantidad de peróxido existente al principio (Testigo de tiempo cero). 6. Como se trabajó con una dilución de sangre 1:1000 y el ensayo se realizó con una muestra de 0.5 ml; se debe multiplicar por 2000 los mmoles de peróxido descompuesto para obtener la actividad específica de catalasa correspondiente a la definición en el punto 1. 7. Determinar el porcentaje de inhibición de los tubos 3, 4 y 5; tomando como 100% de actividad la obtenida en el tubo número 2. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué son los peroxisomas? 2. ¿Como podemos inactivar a una enzima? 3. ¿Qué ventajas tiene estudiar las formas de inactivación de una enzima? 4. ¿A que se debe la formación de H2O2 en los glóbulos rojos? 5. Escriba la reacción de descomposición del H2O2 por el KMnO4.

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ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. INTRODUCCIÓN: Las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de reacciones biológicas específicas. La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteínas, mientras que otras necesitan además, uno o más componentes no proteicos llamados COFACTORES. El cofactor puede ser un ion metálico o bien una molécula llamada COENZIMA, algunas enzimas necesitan de ambos. Los cofactores son generalmente estables frente al calor, mientras que muchas enzimas pierden la actividad por calefacción. El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de HOLOENZIMA, la proteína por sí misma es inactiva y recibe el nombre de APOENZIMA. Algunas enzimas precisan de iones metálicos como cofactores y se les llama +3 METALOENZIMAS, por ejemplo la catalasa que requiere de Fe . La mayoría de las enzimas posee actividad a un pH característico al cual su actividad es máxima; por enzima o por debajo de ese pH la actividad disminuye. La velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa en general por la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y permanece totalmente activa. La mayoría de las enzimas se desactivan a temperaturas comprendidas entre 55-60ºC. Esto depende del hecho de que son proteínas; moléculas que se desnaturalizan con el calor, con la pérdida simultánea de sus propiedades. Si a un sistema enzimático se añaden sustancias que impiden la realización de la actividad propia de la enzima se dice que el sistema ha sido inhibido y la sustancia que se usa con estos fines se llama INHIBIDOR. La reacción en que interviene la enzima Catalasa es: 2 H2O2

2 H2O

+

O2

Esta enzima pierde actividad a altas temperaturas o en presencia de inhibidores como el grupo CN- que forma quelatos con su cofactor o el Pb- que actúa sobre grupos -SH de la enzima indispensable para su actividad. OBJETIVOS: 1. El alumno observará la actividad de la enzima Catalasa utilizando diferentes fuentes biológicas. 2. El alumno comparará el efecto de la temperatura de algunos inhibidores como el Pb y el CN- sobre la actividad enzimática de la Catalasa

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MATERIAL: El alumno deberá traer: • • • •

• H2O2

• Papa * • Hígado de pollo* • Manzana

*

2 goteros Pinzas pequeñas. Papel absorbente Cuchillo

* todo crudo En el laboratorio

• • •

12 tubos de ensaye 1 gradilla Baño María 100ºC

REACTIVOS: • Cianuro de sodio al 5% • Nitrato de plomo al 5% DESARROLLO: 1. Corte en trozos delgados (procure que sean todos del mismo tamaño)cada tejido disponible y póngalo sobre el papel absorbente anotando el nombre correspondiente. No debe tocarse con los dedos, sino manipularse con las pinzas. 2. De cada tejido separe una porción y póngala en un tubo y cúbrala con agua destilada, introdúzcala en el agua hirviente durante 5 minutos, coloque estas porciones sobre el papel absorbente indicando que están hervidas y anote su nombre. 3. Prepare una serie de tubos para cada tejido como lo indica la tabla siguiente: Contenido Tejido NaCN 5% Pb(NO3)2 5% H2O2

Tubo 1 Sin hervir --------2 ml

Tubo 2 Hervido --------2 ml

Tubo 3 Sin hervir 5 gotas ----2 ml

Tubo 4 Sin hervir ----5 gotas 2ml

Mezcle bien, marque con cruces de 1 a 5 según aprecie la intensidad de burbujeo en cada serie de tubos. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.? 2. ¿Qué es el factor Q-10? 3. escribir el complejo que se forma con el Fe y el CN-.

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DETECCIÓN DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES INTRODUCCIÓN: Los carbohidratos cuya molécula contiene un grupo carbonilo libre se denominan azúcares reductores. Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos presentan un carbonilo libre, estos azúvares son oxidados con facilidad a adiversos productos en un medio alcalino con iones metálicos reducibles tales como Cu+2 o la Ag+1. Los carbohidratos como la sacarosa cuyos carbonos anoméricos forman parte del enlace glucosídico, se denominan azúcares no reductores, los cuales no son oxidados con facilidad y por lo tanto no reducen iones metálicos. OBJETIVO: 1. Detectar la presencia de azúcares reductores en una muestra problema por medio de la reacción de Trommer. MATERIAL: • 8 tubos de ensaye • 1 gradilla • Baño María 100ºC

• 2 pipetas de 5 ml • Pinza para tubo de ensaye

REACTIVOS: • Glucosa al 1% • NaOH al 10

• Sulfato cúprico al 1% • Soluciones problema 1, 2, 3 al 1%

DESARROLLO: Prepare una serie de tubos tal y como se indica en la siguiente tabla Contenido Glucosa Problema 1 Problema 2 Problema 3 NaOH Sulfato cúprico

Tubo 1 2 ml

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

2 ml 2 ml

2 ml 2 ml

2ml 2 ml 2 ml

El sulfato cúprico debe añadirse con cuidado y gota agota, agitando los tubos. En presencia de glucosa el precipitado de hidróxido cúprico (+2) formado, se disuelve coloreando el líquido de color azul claro. La capa superior del líquido se calienta hasta ebullición, la aparición de un precipitado amarillo de hidróxido cuproso (+1) y luego de rojo de óxido cuproso indica que la reacción de Trommer es positiva.

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CUESTIONARIO: 1. Escriba la reacción que ocurre al adicionar sulfato cúprico e hidróxido de sodio a la glucosa 2. Defina azúcar reductor y azúcar no reductor 3. Mencione 3 ejemplos de azúcares reductores

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DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE AZÚCARES Y FORMACIÓN DE OSAZONAS INTRODUCCIÓN: Los carbohidratos son moléculas que desde el punto de vista químico se definen como polihidroxialdehidos o polihidroxiacetonas (derivados aldehídicos o cetónicos de polialcoholes), es necesario saber identificar a estas moléculas del conjunto de biomoléculas presentes en una muestra, existen pruebas generales como la de Molish o más específicas como la de Seliwanoff, Bial Biuret, Formación de osazonas, etc., que nos permiten conocer diferentes aspectos de las moléculas en cuestión, En esta práctica realizaremos una prueba general de detección que es la de Molish y una reacción de identificación por formación de osazonas. OBJETIVOS: 1. Detectar la presencia de carbohidratos en una solución problema mediante la prueba de Molish. 2. Identificar el azúcar presente en la solución problema por formación de osazonas. MATERIAL: • 5 tubos de ensaye • 2 portaobjetos. • 3 pipetas REACTIVOS : • Solución de glucosa al 10% • H2SO4 concentrado. • Soluciones problema A y B • Clorhidrato de fenilhidracina

• • • •

Balanza granataria. 1 agitador. Baño María. Microscopio

• Soluciones problema 0.01 M • H2O destilada. • Reactivo de Molish (a naftol 5% en etanol) • CH3COONa

DESARROLLO: (Antes de iniciar espere las indicaciones del profesor) PRUEBA DE MOLISH 1. En cuatro tubos de ensaye rotulados: blanco, testigo, problema A y problema B, coloque 2.5 ml de cada solución indicada al 10%. 2. Añada dos gotas de reactivo de Molish y mezcle bien. 3. Vierta con cuidado y deslizando por las paredes del tubo 2 ml de H2SO4 concentrado ¡no agite! 4. La aparición de un color violeta rojizo en la interfase es una prueba positiva de la presencia de carbohidratos (compare con el testigo).

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FORMACIÓN DE OSAZONAS. En la balanza granataria: 1. Pese 2gr de clorhidrato de fenilhidracina y 3gr de acetato de sodio, mezcle cuidadosamente bien (reactivo de fenilhidracina-acetato). 2. Pese 0.7gr de reactivo fenilhidracina-acetato por cada muestra positiva que obtuvo en la prueba de Molish (Excepto para el testigo). 3. En un tubo de ensaye coloque 1ml de la solución positiva a Molish pero ahora con una concentración de 0.01 M 4. Agregue el reactivo de fenilhidracina-acetato. 5. Adicione 2ml de agua destilada y mezcle bien. 6. Tape el (o los) tubos con algodón y colóquelos en el baño María a ebullición, observe a los 15 minutos y deje hervir 10 minutos más. 7. Rotule cada portaobjetos. 8. Retire el (o los) tubos del baño y deje enfriar, coloque cuidadosamente los cristales en un portaobjetos con ayuda del agitador. 9. Observe los cristales al microscopio a seco débil. REPORTE: 1. 2. 3. 4.

Escriba los problemas con que trabajó e indique cuál fue positivo a la prueba de Molish Dibuje la forma de los cristales de los azúcares conocidos. Dibuje la forma de sus cristales problema. Escriba el nombre y estructura del problema identificado.

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de Molish? Escriba la reacción utilizando glucosa y ribosa como ejemplos. 2. ¿Cuál es el fundamento de la formación de osazonas? Escriba la reacción utilizando galactosa como ejemplo. 3. Explique a qué se debe que algunos azúcares sean agentes reductores.

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DETECCIÓN DE CARBOHIDRATOS INTRODUCCIÓN: Los carbohidratos son moléculas que desde el punto de vista químico se definen como polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas, cuyas funciones son formar estructuras como la pared celular de las células vegetales o servir como fuente de energía y almacén. Es necesario detectar la presencia de estas biomoléculas en una muestra determinada y para ello existen pruebas específicas como la de Seliwanoff, Bial; Biuret o generales como la de Molish, cuyo resultado es la formación de compuestos como el furfural. OBJETIVO: Detectar la presencia de carbohidratos en una muestra problema mediante la prueba de Molish. MATERIAL: • 5 tubos de ensaye • 1 gradilla • •

REACTIVOS: • Reactivo de Molish (α-naftol al 5% en etanol). • H2SO4. • Soluciones Problema 1, 2 y 3 • Agua destilada.

DESARROLLO: 1. Prepare una serie de 5 tubos como lo indica la tabla siguiente: TUBOS REACTIVOS (ml) 1 2 3 4 5 Agua destilada 5 --------Glucosa --5 ------Problema 1 ----5 ----Problema 2 ------5 --Problema 3 --------5 Reactivo de Molish 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2 gotas 2. Vierta con cuidado y deslizando por las paredes sin agitación 2 ml de H2SO4 concentrado. 3. La aparición de color violeta rojizo en la interfase indica la presencia de carbohidratos. CUESTIONARIO: 1. Escriba las fórmulas de los siguientes azúcares usando la proyección de Haworth : Glucosa y Ribosa. 2. Escriba la reacción que ocurre al agregar H2SO4 a hexosas o pentosas. 3. A qué se debe la formación de color en la prueba de Molish.

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CROMATOGRAFÍA DE AZÚCARES INTRODUCCIÓN: La Cromatografía en papel constituye uno de los métodos más útiles para separar y caracterizar cantidades muy pequeñas de muestras. Comparando con la migración de la sustancia problema y la de los patrones en un solvente determinado puede identificarse provisionalmente la sustancia problema. Para la detección e identificación de determinados compuestos es necesario usar reacciones coloreadas específicas. Los azúcares reductores por ejemplo, dan productos coloreados con el reactivo de anilina-oxalato, con nitrato de plata amoniacal o con Peryodatobencidina. OBJETIVO: Realizar una cromatografía circular de algunos carbohidratos. MATERIAL: • Caja de Petri • Capilares

• Papel filtro • Estufa a 105oC

El alumno deberá traer: • Algodón • Compás • Reglas

• Tijeras • Lápiz

REACTIVOS: • Soluciones de: Fructosa, Ribosa y Glucosa al 2% • Solvente: Isopropanol: Ácido acético glacial: Agua 3 : 1 : 1 • Revelador: Peryodato de sodio 0.5 % ; Bencidina 0.5% DESARROLLO 1. 2. 3. 4.

Doble por la mitad el círculo de papel filtro con la ayuda de dos escuadras. Con lápiz y regla divida en cuatro cuadrantes el papel filtro. Con un compás trace un círculo de 1 cm de radio en el centro del papel. (Origen) En el extremo más alejado del centro en cada cuadrante escriba el nombre del azúcar que vaya a aplicar. 5. Con ayuda del compás haga un orificio en el centro del papel.

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6. Con un pedazo de algodón haga una pequeña mecha e introdúzcala por el orificio, procure que la mecha no sea muy gruesa. La mecha por la parte inferior debe tener de 1.5 a 2.0 cm de largo y por la parte superior debe estar casi al ras del papel. 7. Coloque en la base de la caja de Petri el solvente (aproximadamente 15 ml), tápela para que se sature. 8. Con la ayuda de los capilares coloque sobre el origen la muestra que corresponda 9. Una vez secas las muestras coloque el papel dentro de la caja (sobresalen los bordes) presione ligeramente. 10.Espere que corra el solvente y saque el papel cuando el solvente esté en el borde de la caja . Quite la mecha dejándola hacia abajo, marque con el lápiz el frente del solvente para cada azúcar. 11.Rocíe ligeramente con NaIO4 0.5% y deje reaccionar 5 minutos a temperatura ambiente, rocíe con Bencidina. Aparecerán manchas blancas sobre un fondo azul. (un exceso de azúcar y/o cantidades pequeñas de peryodato originan manchas pardas en lugar de blancas). 12. Bordee con lápiz la mancha y determine el centro de la misma, calcule el Rf de cada azúcar y discuta su migración con base a su polaridad. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4.

Escriba el fundamento de la cromatografía ¿Cómo se calcula el Rf? ¿Cuál es la diferencia entre Rf y coeficiente de reparto? ¿Cuál es el fundamento del revelado de la cromatografía?

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