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BIBLIOTECA 0CM 5306065673

FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD

BIOLOGICAS

COMPLUTENSE

DE MADRID

CARACTERÍSTICAS ‘Y FUNCION DE LOS CANALES IONICOS DE MEMBRANA DEL MUSCULO DEL CANGREJO DE RIO

ALFONSO ARAQUE ALNENDROS

INSTITUTO

CAJAL

C’S.I.C-

Tesis

Doctoral

Julio,

17.23

ccc

1993

Consejo Superior de Investigaeiones Ciernihcas

Icsi~J

INSTITUTO CAJAL Avenida Docto, Arce, 37. 28032 Madrid. España

WASHINGTON BURO BObETA, Doctor en Medicina, Profesor de Investigación del Consejo Superior de investigaciones Científicas

CERTIFICA: Que O. Alfonso Araque Almendros ha realizado bajo su dirección, en el Instituto de Neurobiología “Santiago Ramón y cajal” del consejo Superior de Investigaciones Científicas, los trabajos correspondientes a su Tesis Doctoral titulada “CARACTERíSTICAS Y FUNCION DE LOS CANALES IONICOS DE MEMBRANA DEL MUSCULO DEL CANGREJO DE RIO” para alcanzar el Grado de Doctor, y queda contorne con su presentación para que sea juzgada. Y para que así conste, firma el presente en Madrid, a dos de Junio de mil novecientos noventa y tres.

ngton Buño

4/~

A mis padres, Antonio y Araceli A mis hermanos A Maica, Chiquilla de mis sueños

el espíritu humano revelaba su participación en el universo mediante teoremas exactos... ‘Memorias de Adriano”, Marguerite Yourcenar.

“Malalda 1”, Quino.

Y en tanto que él iba de aquella manera menudeando tragas, no se le acordaba de ninguna promesa que su amo le hubiese hecho, ni tenía por ningún trabajo, sino por mucho descanso, andar buscando las aventuras, por peligrosas que fuesen. “El Ingenioso Hidalgo Don Quijote de la Mancha”, Miguel de Cervantes.

A NODO DE AGRADECIMIENTOS

Muchos son quienes han contribuido, aun sin saberlo, a que haya llegado hasta aquí. De todos debo y quiero acordarme ahora. Washington Buño, mi maestro. Que me enseñó electrofisiología (lo de menos), el gusto y el entusiasmo por la Ciencia. Y más, que no todo en la vida es Ciencia. Trabajar con él siempre es un privilegio y un placer. Mi mayor admiración, respeto y afecto. Juan Lerma, quien primero me ayudó en esto. Riguroso, a veces severo, pero siempre a mano y dispuesto para cualquier ayuda. Aún recuerdo mi primer día, que me invitó a comer, y un caté que apenas pude terminar, y es que el cangrejo siempre ha mandado. Luis Barrio, el tercero que me acogió en el viejo edificio, afable y espléndido, a quien debo muchos buenos consejos. La calidad científica y humana de ellos tres ha sido y es referente de mi esfuerzo. Benjamín Fernández, que quiso enviarme al Instituto Cajal, casi sin conocerme, con una confianza en mi inestimable. José María Velasco, un torrente de aire fresco, que me conoció antes que yo a él. Omar Macadar, en un verano inolvidable. Gran maestro. Privilegio de haberle conocido, por su hablar y su escuchar. Es dificil aprender tanto, de tanto, en tan poco tiempo. Además traía cerezas, y la pasamos bien, muy bien. También los franceses. Sobre todo, Daniel Cattaert y Franqois Clarac. Y Marsella. Mis amigos del laboratorio. Antonia García, que siempre me ha escuchado, que no es poco, y a quien debo más de lo que imagina. Paco Peláez, que me enseñó a tomar sidra y, aunque no es del atleti, siempre me ayuda. Obristián Bonansco, que no sé, pero que está. Michel Borde, con quien me gusta discutir, que aprendo mucho, y que además juega al fútbol. Y los que serán. Espero. Mis amigos de fuera. Todos. Ellos se saben. Y Miguel, compañero de viaje. Y Jesús y Montse, que siempre están a un fin de semana de Venecia. Mi familia, y, sobre todo Maica, porque quiere y porque quiero. Ayuda, estimulo y comprensión. Que mucho de mí es de ellos. También la reina de Africa y el hombre tranquilo, el adagietto, los alfiles, los trenes, Atenea. Quiero agradecer a la Caja de Madrid, la beca. A los agraviados, si los hay, que los habrá: gracias por la benevolencia. He aprendido mucho y disfrutado más, pero lo mejor, sin duda, es haberlos conocido.

1.

INTRODtJCCION Y OBJETIVOS

1.1. INTRODUCCION

2

1.2.

7 7

INTRODUCCION AL PREPARADO EXPERIMENTAL 2.1. AFERENCIAS Y SINAPSIS lA. Características morfológicas IB. Características fisiológicas

2.11. FIBRA MUSCULAR ITA. Características morfológicas 118. Características fisiológicas 2.111. ANATOMíA 1.3.

II.

OBJETIVOS

7 8 •

.

.

.

•

.

.

.

•

.

.

.

11 11 11 12

•

.

.

.

14

MATERIALES Y NETODOS 11.1.

DISECCION

18

11.2.

ESTINTJLACION AFERENTE

19

11.3.

MICROELECTRODOS

20

11.4.

REGISTRO INTRACELULAR

21 23 24

4.1. FIJACION DE CORRIENTE CON DOS ELECTRODOS 4.11. FIJACION DE VOLTAJE CON DOS ELECTRODOS 4.111. CONDICIONES DE REGISTRO o CRITERIOS DE BONDAD DE REGISTRO • lIlA. Fijación temporal de Vm • urB. Fijación espacial de Vm

27 27 28

11.5.

SOLUCIONES DE PERFUSION

30

11.6.

APLICACION LOCALIZADA EXTRACELULAR

31

11.7.

INYECCION INTRACELULAR

31

11.8.

PROCESAMIENTO DE RESULTADOS

32 32 33 33

8.1. SUESTRACCION DE CORRIENTES LINEALES 8.11. AJUSTES EXPONENCIALES A CORRIENTES 8.111. ESTADíSTICA

1

III.

RESULTADOS III .1.

ACTIVIDAD ELECTRICA: POTENCIAL Y CORRIENTES TOTALES DE MEMBRANA. 1.1. RESUMEN 36 1 • II. INTRODUCCION 37

1.111. METODOS 1.1V. RESULTADOS l.V. DISCUSION

38 39 45

111.2. CARACTERIZACION DE LA CORRIENTE INSTANTANEA DE PERDIDA (Ir)

2.1. RESUMEN 2.11. INTRODUCCION 2.111. METODOS 2.1V. RESULTADOS IVA. Caracterización general IVB. Efecto de distintos iones sobre 1, 2.V. DISCUSION 111.3.

CARACTERIZACION DE LA CORRIENTE ACTIVADA POR HIPERPOLARIZACION (1,»).

3.1. RESUMEN 3.11. INTRODUCCION 3.111. METODOS 3.1V. RESULTADOS IVA. Relación I—V instantánea de lA,» IVE. Dependencia de voltaje de CA,» IVC. Dependencia de tiempo de 1,,» IVD. Naturaleza iónica de IA,»~ Efecto de iones fisiológicos tVDa. Iones Na IVDb. Iones Ca2~ y Mg’ IVDc. Iones CV IVDd. Iones K~ IVE. Efecto de iones no fisiológicos IVEa. Cationes monovalentes (Cs~’ y RW) IVEb. Cationes divalentes (Ba’~, Mn2t Cd2~ y Zn2) .

3.V. 111.4.

.

47 48 50 51 51 54 56

DISCUSION

.

.

.

.

.

•

.

.

.

76 77 77 77 80 84

.

84

. .

CARACTERIZACION DEL BLOQUEO DE 1,,» POR Cd’~ Y Zri2. 4.1. RESUMEN 4.11. INTRODUCCION 4Á111. METODOS

4.1V. RESULTADOS 4.V. DISCUSION

II

63 64 66 69 71 72 74

86 86 91 92

93 94 105

111.5

-

CARACTEPIZACION DE LA CORRIENTE DE ENTRADA ACTIVADA POR DESPOLARIZACION 0.99)

es mayor

definiendo

ventana

valores

de Vm = -28.43

Vm,

y = 0 uy las

de corriente

los

de voltaje

de 1, de

La corriente

sostenida

de un potencial

despolarizante

el

corriente

de despolarización

Figura

relativa intervalo

de 1,

La intersección

para un valor

de

inactivación (r

dependencia

se superponen, por

current").

(véase

la

ocurre

determinado

inactivación

la

aceptablemente

que definen

la

Tanto

de

respectivamente.

e inactivación

el

espacio

ajustan

como

de voltaje

(triángulos)

normal.

activación

y (5.41,

de ajuste

Así,

en solución

la

se

(5.3)

activación para

de

la dependencia

y de la inactivación

(círculos)

una

curvas

5.8 se representa

sináptica de corriente 1.1

B).

-70

-40

-10

Vm

Figura 5.8. voltaje de la han ajustado considerado correspondientes intersección

20

50

(mV)

Corriente de Ventana de I,,. La dependencia de activación (0) y de la inactivación (A) de I,, se a las ec. (5.3) y (5.4), respectivamente. No se han los puntos de la inactivacibn voltaje por a Vm < -45 mV (véase texto). El punto de de ambas curvas ocurre en Vm = -28.43 mV.

142

IVG. Los distintos

Farmacologia

CCVD, además de diferir

electrofisiológicas

(en

cuanto

que

dependencia

de voltaje,

dependencia

regulación

metabólica

y/o

notables

diferencias

tipo

bien

(o-CgTX)

y tipo

N (Nowycky

el

péptido

Por tipo

ultimo,

La adición

a la

una notable

TEA,Ba*'

(Figura

la concentración sugiere

acompañada

Esta

un efecto

En efecto, por

del

pico

en tanto nifedipina

esto

de la arana sensibilidad

tipo

1987;

L

Carbone bloqueado

y por una toxina FTX)

(Llinás

alguna

et

aperta. del

canal

toxinas. extracelular en la

dependiente en el umbral

de 1,

CCVD

Conus

los

Agelenopsis

de 1

amplitud

que se acentúa

que la forma

al aumentar

de concentración, de activación

5.9

y que por no se ve

de 1, ni en

en la relaci6n

I-V

B).

de esta

1 6 10 pM, la amplitud 143

en solución

(a 10 PM),

como se muestra (Figura

Nifedipina

PM

de 1,

de Nifedipina

tal

es,

et al.,

1992)

los

marino

(denominada

reducción,

extracelular

de inversión,

de la amplitud

alterada

reducción

de variaciones

su potencial

citadas

solución

5.9).

gasterópodo

et al.,

en el veneno

de las

produce

tanto

(Mintz

(por

o-conotoxina

P es especificamente

no se ha demostrado

T a ninguna

antagonitas sobre

umbral,

peso molecular

1989) presentes

DHP actúan

peptídica

198.5; McCleskey

o-Aga-IVA

las

o como

del

El CCVD tipo

de bajo

Asi,

La toxina

veneno

iónica, presentan

respectivamente),

CCVD de alto

et al.,

1989).

no peptídica al.,

los

cinética,

unitaria),

agonistas

1985).

en el

inhibe

y Swandulla, por

como

et al.,

contenida

geographus

distinta

de Ca2*, selectividad

conductancia

BAY K o nifedipina,

L (Nowycky

poseen

en su farmacologfa.

específicamente, ejemplo,

en sus características

relación máxima

no se ve de 1,

es

A

OmV

-6Om”J----L Control

~/IM

Vm -60 c

-40

Nif edipina

10,uM

(mV)

-20

0

20

40

A A A A AAAA

A

AO

0; // 00 0' /

00 \

Nif edipina

0 -200 -400 -600

0 OO0

0 O 1' i i I

Figura 5.9. Efecto de Nifedipina sobre 1,. A, corrientes activadas por despolarización en solución TEA,Ba'(Control) y tras adición sin compensación de 1 y 10 PM Nifedipina. 8, relación I-V del pico de I, en solución TEA,F?a*+ (0) Y en presencia de 1 y 10 PM Nifedipina (0 y A , respectivamente).

144

-1omv -6omV-

Control

B

1j~M BAY K

Potencial -60

de

Membrana

-20

-40

0

(mV) 20

b.

40

L

0

8 /Y OO fo’

\\ 0’

0, \ . .../ \

-100

Y w. (D

-200

-300

O, oo”’

2

5 OJ 5-->

0 0

0

i -400

Figura 5.10. Efecto de BAY K sobre 1,. A, corrientes activadas (Control) y tras adición por despolarización en solución TEA,Ba" I-V del pico de 1, sin compensación de 1 I.~M BAY K. B, relación en soluci6n TEA,~Ba2' (0) y en presencia de 1 pM BAY K (0).

145

0.68

y 0.40

veces

menor,

En la Figura BAY X provoca (Control).

5.10 A se muestra

el

incremento

La relación

de manifiesto de 1,

respectivamente, cómo,

I-V

del

pico

(círculos

de activación

de 1,

ni

de su potencial

parte,

I,,

no es modificada

lfil/ml),

tipo

un reconocido

P cuya

nl/ml

constante

(no mostrado; Todo

ello

vease

permite

características los

pero

CCVD que median

Los entrada

resultados activada

es una corriente tipo

del umbral

de FTX

de los

CCVD de 10

de

de las

acuerdo

fibras

a

las

musculares,

L.

DISCUSION

indican

despolarización

transportada

que

del

por iones

de CCVD, cuya activación

voltaje

se

1993).

son de tipo

presentados por

et al.,

de 1,

5-V.

I-V,

es alrededor

que,

corriente

incremento

específico

aparente

concluir

esta

máxima

por la presencia

Araque

farmacológicas

pone

de inversión.

bloqueante

de afinidad

B),

amplitud

de la relación

I.IM

TEA,Ba"

5.10

y que este

alteración

(hasta

de la forma

(Figura

un 56% la

llenos),

1

en solución

de 1,

sin

Por otra

por el contrario,

de 1er generada

que 1 PM BAY K aumenta

en el control

realiza

que en el control.

la

corriente

músculo

abductor

Ca2+ a través

e inactivación

de (1,)

de un único

son dependientes

de

y de tiempo. Tanto

saber,

las

características

su alto

carácter

umbral

por

conductancia

de

farmacológicas, adscribir

de activación

persistente

inactivación

el

en voltaje Ba"

en

electrofisiológicas

que cuanto

CCVD responsable

el

(alrededor

tiempo,

(entre de

es

de 1, 146

su

-40

Ca'*,

que

de

y como

1,,

a

de -40 mV),

su

elevado

-15 sus

sensible a aquellos

mV)

rango y

la

de mayor

características a DHP, de tipo

permiten L.

obstante,

No

difiere

la cinética

de la de otras

L descritas

en otros

considerablemente especialmente

corrientes sistemas.

la descrita y

mecanismo

de acoplamiento

vertebrados

CCVD como sensores

orgánulo 1973:

Schwartz

1988;

Rfos

la et

de invertebrados

Ca"

desde

el

hacer

notar

en músculo invertebrados vertebrados. que el

(Hidalgo

Bers,

1991)

se

Rios

de Ca"

1979;

y Palade,

desde

(abreviadamente espacio

que la cinética cardíaco

LCIC)

1992)

Asi,

mecanismo

que

el mecanismo mecánico,

Smith

y Verdugo,

el

al.,

esqueletico 1988;

cardiaco

mecanismo

de

y se fundamenta

en

a traves

respecto

inducida de los

CCVD

es interesante

de la corriente.de

Ca"

a la de músculo

esqueletico

de

la

esquelético

de

de músculo

de LCIC es posiblemente

en cuanto 147

et

sarcoplásmico

de activación

este

y Chandler,

y en músculo

quimica

A este

y más rápida

a los

que actúan

1987;

que

que fluye

es semejante

canales

eléctrica

Vergara

reticulo

extracelular.

de

en músculo

propuesto

el

en la actuación

de Ca" desde

y Brum,

et al.,

ha

de

(Schneider

Sin embargo,

Györke

de acoplamiento

liberación

de E-C es de naturaleza

liberación

por el

1985;

de

señal

muscular

1991).

1989;

Lea y Ashley,

la

al.,

esquelético

sarcoplásmico,

la

contracci6n

y Pizarro,

acoplamiento

retlculo

de Ca2+ permitendo

para

(véase

del

diferente

y no como verdaderos la

es

de Ca",

al

músculo

basado

mecanicamente

de ryanodina

como canales

y está

de voltaje,

transduciendo

receptores

En el

de I,,

de vertebrados

quizá

que el mecanismo

mecánica

por CCVD tipo

corrientes

acuerdo

de E-C.

de Ica

la activaci6n

esqueletico

de

1989),

E-C es de naturaleza

mediadas

que la de otras

se ha propuesto

de Ca'+,

de Ca"

en músculo

Swandulla,

e inactivación

En efecto,

más rápida

(Carbone

los

de activación

que depende

del

más lento tiempo

de

difusión

intracelular

reticulo

sarcoplásmico,

influjo

de Ca"

de los

y,

al sitio

una mayor

una mayor

dado

funcional

receptor

del

velocidad

velocidad

en el

de activaciõn

de

naturaleza

estado

es generado

por

presente

que de

solución

Ba'*,

inactiva

por

voltajes

inferiores

los

a

a la

provocada

por

la

no

al umbral

una sucesiva

las

es por

de

de

posibles

acumulación aplicación 148

mismo 1,

en

CCVD) se

ocurra

para

en favor la idea de

de la

de

de una

CCVD para

de una conspicua

explicaciones del

y no 1,

(ausente

hablaria

apertura

de activación

postpulso

facilitar

por el

por pico

es dependiente

I,,,,

la

cuando

de que 1,

que

de 1,

a

del

el

podria

permea

obscura

de 1, tanto

no puede desecharse nula,

de

magnitud)

que ésta

potenciación

activación

aunque

lo

o bien

i6n

Que la

dos son

saber,

este

idéntico.

amplitud

El hecho

CCVD)

resultado

potenciación

cuando

intracelular

pero

parte,

que

el

referentes

(y en igual

Ca"

voltaje.

inferiores

de 1,

a 500 ms.

fenbmenos,

la

bien

aun cuando

probabilidad,

dos

sugiere el

de 1,,

menor

amplitud).

propios

hipótesis,

fenómeno,

y la

de Ca'+

es superior

encontrados,

prepulso

quizá

apertura

la segunda

son

de la

corrientes

puede ser

a saber,

de igual

de tiempo

las

sistemas

reseñados

potenciación

ms,

de corrientes

amplitud

el

25

persistente

estacionario

ambos

otra

carácter

voltaje,

de baja

del

a

consistentemente por

prepulsos

voltajes

el

ser

y

inactivación

(y

que la constante

L en otros

de ambos tipos

Dignos

(siendo

en tanto

por CCVD tipo

No obstante,

Por

por tanto,

de 1,. es inferior

mediadas

baja

y requeriria

parte,

inactivación

Caz'

su unión

CCVD.

Por otra

como

de Ca2' para

al

1,.

segundo

grado

de inactivación

de pulsos

despolarizantes

de amplitud

creciente

y/o

una acumulación

(que no es sensible

a los

de Ca2' citosólico)

que provocaría

electromotriz amplitud favor

de de 1,.

de esta

1, podria

última

por

para

un determinado

sido

demostrada

de

acción

corresponde

con el

corriente

et al.,

la existencia

abierto

a un estado

curva

de inactivación)

estado

abierto

canales

desde

las

de activación

con

de Vm comprendida la

corriente

sinaptica de

larga

el

generación

valor para

rango

en de

de

Vm

el

cual

1977;

del

ha

de ventana

(en

alcanzado

et al.,

1984:

sugerida según

las

(de acuerdo

a la

a pasar

a un

de activación),

1992).

la

de un estado

volverian

estados

se

se define

canal,

el

del

En el

e inactivación entre

cardíacas,

ha sido

cerrado

et al.,

generandose canal

(Shorofsky

músculo

abductor,

se superponen

en una

-45 y -20 mV, que se corresponde

sostenida con trenes duración,

Brown

y luego cual

corrientes

de potenciales

de voltaje

a la curva

despolarización

estimulaciõn,

la

de distintos

Hirano

la

se superponen

probabillsticamente

inactivado

1992:

de

hablaria

de las

en el estado

pasarlan

repetitivo

fuerza

la potenciación

En fibras

y Scholz,

En este

y January,

región

bien

sistemas

de.voltaje

(Reuter

(de acuerdo

asi un ciclo

curvas

donde

de transiciones

los

fenómeno

de una corriente durante

rango

1992).

cuales

si

de voltaje.

existencia

de ventana

Hirano

tal

de la

disminuciõn

e inactivación

rango

meseta,

homeostãticos

fenómeno.

current")

en

una

CCVD en distintos

la

"window

tanto,

no manifieste

este

intracelular

una disminuciõn

por

de activacibn

mediadas

fisiológicos

interpretación,

enmascarar

inglés,

y,

Que 1,

Las curvas de Ca"

Ba2'

mecanismos

de Ba"

o la

sugiriendo 149

ocurre

que

inyección la

durante

la

de pulsos

de

existencia

de una

corriente

de ventana

carácter tanto

de

persistente tiempo

de I,.,

como

comportamiento

Ca2+ que al

dure

lento

La existencia

la

influjo

y tónico de un pico

rapido

sea

de naturaleza

mecanica

viscoelãstica

de las

sistema movimiento, transitoria parte,

la superación

muscular

podria

del

inicial

más

que la retículo

los

la

sarcoplásmico

niveles

prácticamente

nulo

LCIC,

y una

citosólico,

del

de tiempo L, cuya

lo

músculo

por

hasta

el

al

mecánica

al

muscular por

mediada

Ca>‘ sostenida

de Ca" que

desde

supuesto

su

nivel

desencadenar nivel

seria

Ca"

de LCIC,

influjo

para

otra

por

un mecanismo

idóneo

este

alcanzar

abductor

concluir

de

Ca2'

un mecanismo

una

por un único

de

rápida

cinética

de corriente

de Ca" mientras

total dura

tipo

de dentro

y y que

una hace

de

de CCVD de tipo de voltaje

y de

activación, de los

rapida posible

la despolarización. 150

corriente

de Ca" dependiente

es dependiente

despolarización,

que no es

que la

es una corriente

mediada

el máximo de

podemos

e inactivación

presentando

inactivación,

de

está

citosólico

conseguido

expuesto

activación

milisegundos

sostenido

ves

y de voltaje

tiempo, permite

en reposo

confiere

estacionaria:

de un gran

Ca"

la

de el.

De todo entrada

de

la corriente

mantenimiento

la

como sistema,

contracción

muscular

la existencia

el

En efecto,

resistencia

una

que

del

musculares

de

contracción

inercia

quimica.

fibras

fuerte

asi

músculo.

y/o

de

el

de Ca*' durante

de 1,. puede explicarse

grado

necesitarla

ser necesaria

elevara

alto

con

explicando

de una posible

cve

puesto

liberado

un

sostenido

de este

para

naturaleza

junto

estimulacibn,

necesaria ésta

contribuirla,

que

7 primeros

cinética el

influjo

de

111.6.

CARACTWIZACION

RETRASADA

DE LA CORRIENTE

ACTIVADA

POR DESPOLARIZACION

6.1. En el activada

presente

por

primeros menos

que 100

los

aproximadamente

conductancia

sigmoidea en torno

a -30

cinética

siempre

cuya inferior

1,

es

de tiempo dentro

por

de los

tiempo,

al

en el

con

[K'],

potencial

de

de Nernst. a

la

1,

(G,)

ecuación

es

una

comienza

de 70 mV. El

en torno y

función

de Boltzman,

alrededor

activación

constante

varia

(Etc)

esperada

ecuación

por

1,

potencial

a 10 mV.

desactivación

la

cuarta

potencia

de

tiempo

es

puede de una

dependiente

ser

función de

Vm y

a 5 ms. bloqueada

concentraciones Ba"

la

descrita

exponencial,

de

de G. se sitúa de

aceptablemente

estacionario inactivación

inversión

siguiendo

media

retrasada

500 ms.

mV y es máxima

de activación La

presenta

subyacente

de Vm que,

corriente

es dependiente

a la variación

de K' según

La

no

de

amplitud

un estado

primeros

igual

la

(1,).

alcanza

potencial

equilibrio

se estudia

cuya

ms y que

durante El

capitulo

corriente

y de voltaje,

(1,)

FU3SONEN

despolarización

1, es una

DE SALIDA

TEA

por

de TEA extracelular

intracelular,

por

(superiores

altas

a 25 mM) y por

extracelular. De todo

ello,

concluimos

de tiempo

y de voltaje,

rectificación

retardada

fijación

de corriente

que 1, es una corriente

transportada de y cuyas

salida

por observada

caracteristicas 151

R,

dependiente

responsable en

condiciones

electrofisiológicas

de

la de

y

farmacológicas

la

rectificadoras

asemejan

retardadas

notablemente

presentes 6.11.

Hodgkin corriente

y Huxley

en

el

median

esta

axón

(1952a,d)

por

observado

tras

voltaje

gigante

demostraron

de

el

responsables

un pequeño

despolarizante

período (Hodgkin

et

fue

inmensa

de células

excitables,

aunque

rectificador canal

no

de

K'

sino

hace a

electrofisiológicas

y

coexistir

incluso,

como

y Huxley

media

(1952a,b,d),

500

ms

de tiempo

por

de esta de una

corriente

los

ser del

4-aminopiridina, 152

pueden,

1992).

el

descrito

de

durante de

por es

tiempo,

que

cuya inferior

y la

de

cuarta

constante a 10 ms.

retardados Ba"

no

primeros

activación por

un

y que K'

los

descrita

y siempre

rectificadores a

que

salida

de

propiedades

despolarización

menos

puede

de voltaje

con

tipo

retardado

cinética

exponencial

es dependiente

sensibles

al

La

funcibn

FarmacolOgicamente, generalmente

tiempo,

término

único

(Hille,

de

la

propiedades

similares

por

de en

el

rectificador

corriente

despolarización.

desactivación potencia

una

inactivación de

el

mostrõ

de ellos

de

presencia

a un

celular

que se activa

selectivamente

presenta

tipo

que

un pulso

La

canales

muy

K'

descrita

no

representativo

canal voltaje-dependiente

durante

actualmente

de

funcionales

de

de

de conductancia

donde

referencia clase

potencial

"rectificadores

1949).

Asi,

en un mismo

Considerando Hodgkin

una

de

incremento

al.,

de una

canales

posteriormente

idénticas.

retardado

Los

de retraso

retardados

similares

existencia del

nombre

del

rectificadores mayoría

la

calamar.

recibieron

ser

sistemas.

en la repolarización

corriente

retardados"

en diferentes

corrientes

INTRODUCCION

de K' involucrada

acción

a otras

son extra

e

intracelular

y

Cs'

dependiendo

del

Igualmente,

todos

tipo

1967),

de

estos

1969;

en

receptores

por

el

estudiados, los

distintos

los

rectificadores

tipos

vertebrados

son

Stanfield,

menos

de dos

aunque,

presente

los

capítulo

de salida

utilizado apdo.

dos III.

de membrana tipos

METODOS

los

concentraciones 1967: de

de

extracelular

TEA para

pueden

de

la

que

axones

de

de

TEA

invertebrados

ser

(al

bloqueados,

no ser

Wong y Binstock, la

en

Stanfield,

axones

se estudia

ni

siquiera 1980).

corriente

retrasada

rectificación

retardada

MEXODOS impuesto

de protocolos del

sistemas

de

los

el

abductor. 6.111.

El potencial

los

mayoría

superiores)

responsable

músculo

todos

(Hille,

1957;

mientras

en tanto

concentraciones

y Hagiwara,

distintos

así,

bajas

de

de estos

los

que

Vogel,

1992):

milimolar)

de magnitud

presente

en el

la

y

variable

concentraciones

tales

(Tasaki

y sostenida

rango

mayores

incluso,

En el

el

e intracelular

embargo

(Hille, de

de sendos

entre

es sin

por

1983),

6rdenes

efectivas

celulares

y Saito,

La afinidad

en

extracelular

bloqueados

(en

necesitan

1992).

similar

retardados

extracelular 1970;

receptor

Hagiwara

actualmente

es

cuaternarias,

(Koppenhöfer

considerablemente

intracelular

1992).

extracelular

Hille,

considerándose

Hille,

la existencia

sistemas

1972,

TEA, difiere

celulares,

receptor

cara

grado

aminas

,,1957;

demostrado

numerosos

y Hille,

a

y Hagiwara

en la

diferente

1983;

sensible

habiéndose

canales

Armstrong

tipos

son

diferenciados

en

(Stanfield,

TEA (Tasaki

Hille,

receptores

aunque

celular ellos

fundamentalmente 1959;

intracelular,

ha sido

análogos

capitulo

111.3, 153

de -60

a los con

la

mV y se han

descritos salvedad

en el de que,

en el protocolo Idénticas

P2,

V no es hiperpolarizante

convenciones

seguidas

en el

y medidas

presente

Figura

corrientes

6.1

A,

por

en

una

denominamos

I,,

y que

una

inicial

en el

rápida

capitulo

ha

estudiada

Tras

bloqueo

son

suprimidas,

B muestra

pulso

que

salida

neta

parte,

observada

la relación

de

1,

de un umbral

de

electrice

de la membrana

el

de rectificación

nombre

a -30

se activa

una

por

mV, y cuya rectificación

frente

se estudia

1,. a los

que

111.1).

154

La Figura

de

despolarizante 1,.

no lineal,

1,

otra

comportamiento

es

una

despolarizacibn activación

Por

presentando

mV. Este

o retardada

tanto

la corriente

a

en

6.1

(circulos)

corriente a partir

es responsable el

comportamiento

a la despolarización,

de salida

(que

18 ms del

normal

pulso

que

III.5),

A y B),

aislada

exclusiva

a Vm indica

a -30

próximo

existencia

forma

en torno

que

5.1

indicando del

(que

de salida

de 1, medida

final

normal

0 mM Ca'+ (Figura

asi

de 1, es claramente

frente

voltaje-dependiente

y que

en soluci6n

de

de generación

lineal

la

al

I-V

IX0.99)

n, = ñ_ [l deducida

de

máximo

la

de n,

ecuación

Los

resultados

se activa a

la

con

de

su crecimiento

f

y que

está

una

primeros

15 ms y no presenta

curva

su

desinactivación

variable

que sigue (n

Huxley,

según

1952d). durante la

capaz

expresibn

de primer función

Así,

la

pulso

f 0.90

S de 12.24 de 70 mV.

despolarización

máximo por

tiempo

de (al

los

menos

de Vm, 1, se

exponencial, pocos

de

dentro

repolarización

alcanzando

milisegundos

de explicar

(n)

son

un

los

de un

de

la

A).

adimensional

que

un

la

de

de IX

tal

que G, es proporcional

una reacción

Y n-ll,

máximo

6.4

más simple

en suponer

a 10.82

por

temporal a

(Figura

activada

inactivación

un curso

probabilidad a partir

activación

Tras

G,

de acuerdo

alrededor

alcanza

y

que

resto)

de tiempo

500 ms).

siguiendo

sigmoidea

una pendiente

activada

sigmoidea,

primeros

B indican

la

valor

n.. = $&

6.3

que

según

el

curva.

forma

medio

es

de la

Figura

del

esta

de la

desinactiva

de una

pendiente

Dependencia

1, sigue

se basarfa

cual

de

máximamente

temporal

El modelo

el

en la

mV, que

curso

repolarización

Vo es Vm para

(indicando

El

máxima

ii,

se realiza

ND.

los

en

es independiente

a -30

mV, que

durante

que

la

Boltzman

(6.3) la

despolarización

en torno

0.71,

l), define

de un canal

umbral

Boltzman,

mostrados

la

ecuación

apertura

de

que

ecuación

+ exp(Vo-V/S)]-1,

(generalmente

S es un parámetro

a la

que orden

de

a la cuarta

potencia

varía

entre

y uno,

entre

dos estados

Vm y

no

de

de

G, desde

de

es

función

(I-exp(-tJ)'

(esto 160

es,

cero

tiempo

activación voltaje

comportamiento

cero

y

posibles (Hodgkin

y

hasta

su

del

tiempo

según

una

(t) curva

A

30mV -60,V~

0

0

l

-30

-10

Vm

10

30

(mV)

Dependencia de tiempo de 1,. A, corrientes activadas Figura 6.4. por despolarización en solución 0 mM Ca" (lineas punteadas) ajustadas a la ec. (6.9) (lineas continuas). Las corrientes capacitiva y de p&dida han sido substraídas. B, relación T-V de la constante de tiempo de activación de 1, (T,). 161

sigmoidea)

y su desactivación

según

función

una

cumplirian

las

es función

exponencial

de exp(-4t)

simple).

Según

(es

todo

decir,

ello,

se

ecuaciones 1, = n'I.,,,

(6.4)

Y dn/dt donde

I,,,

B, son

es el

las

constantes

dependiente

de 1, para cinéticas

las

cada

de la

condiciones

t = 0 (donde

(6.5)

de la

de Vm. La solución

que satisface n, para

máximo

= a,(l-n)-B,, valor reacción ecuación

de contorno

n, es el valor

de Vm y donde de primer

orden

diferencial

según

de n en el

las

(6.5) cuales

reposo)

n, el

valor

máximo

para

n =

es

n = n,-(n,-n,)exp(-t/r,), siendo

a. y

(‘5.6)

cada Vm de n, y donde

n, = a./(a.+A,),

(6.7)

Y 7" = (0.99)

de 1,.

que

el

curso

La constante

inferior

de campana

a -10 mV (Figura

ecuación temporal

de tiempo

de Vm, como cabía siempre

la

esperar

(6.9) de

ecuación

a 5 ms y mostrando

asim&rica 6.4 B). 162

activacih

de activación de la

invertida

describe y de 1, (6.8),

una relación

con un máximo

en

A

1 OmV -6OmVm

Control

2000

TEA

T

@Control 0

A TEA 2 c

1500

l 0

a,

-3

1000

0

r

0

.d t: 0

500

0

7

-60

-30 Vm

0

30

(mV)

Figura 6.5. Efecto de TEA extracelular sobre 1,. A, corrientes activadas por despolarización en solución 0 mM Ca” (Control) y en solución 0 mM Ca2*, 100 mM TEA (TEA). B, relacibn I-V de 1, medida al final del pulso despolarizante en ausencia (0) y presencia de TEA (A). Las corrientes capacitiva y de pkdida han sido substraidas. 163

La

Figura

pulso

100

mM TEA.

1,.

La

receptores

provocar

de corrientes

menores

del de TEA la

concentraciones de

1,

(no

concentraciones

apreciables

receptores

músculo

0

de

bloqueo

bloqueos

de 1. del

final

dependiente

embargo,

de los

al

bloqueante

menor

sin

afinidad

canales

pues

un

necesarias,

una menor

de TEA de los

apdo.

producen

1. medida

es

por

y en solución

efecto

bloqueante

a 25 mM para

sugiere

de

notable

de TEA,

activadas

(Control)

I-V

el

efecto

Son

superiores

corrientes

relación

extracelular

mostrado).

de TEA

0 mM Ca"

extracelular

TEA

cual

muestra

ilustra

Este

concentración de

A

en solución

despolarizante

sobre

Efecto

6.5

despolarización mM Caz+,

IVE.

de 1,,

lo

extracelulares

abductor

respecto

a otros

semejantes

en distintos

sistemas

inyección

intracelular

de

(vease

6.11). Por

otra

produce

parte,

un acusado

casos

la bloqueo

prãcticamente

total

la concentración desconocida, a la

mayor

alcanzado,

TEA

los

de

las

inmensa

Figuras

sugiere

5.2

los

en

de los

y 5.7).

Si bien

ejercer y el

receptores

presentan

1,

mayoría

inyección

TEA extracelular que

de

tras

observada

con

canales

en la

alcanzada

rapidez

perfusión

bloqueo

1,,

(véanse

intracelular la

respecto

de

TEA tambien

de TEA es el

alto

bloqueo grado

de

intracelulares

mayor

afinidad

de que

los

extracelulares. lVF. Los

iones

corrientes 1980; muestra

Ba"

Efecto

de Ba"

son reconocidos

de K' semejantes

Armstrong el

efecto

et

al.,

1982;

de la

adición

extracelular bloqueantes

a 1, en Hille,

numerosos 1992).

de 13.5 164

extracelulares sistemas En la

mM Ba"

sobre

de (Arhem,

Figura

6.6

1, obtenida

se

A

50mV -6OmV-

Control

Ba’+ 1

t3 1800 2

1500

E aJ %

1200

0

OControl ABa2+

:

0.8 0.6

900

.rl k

800

u

300

G8 0.4 0.2 0 -60

-20

20

Vm

(mV)

60

-70

-30

Vm

10

50

90

(mV)

Figura 6.6. Efecto de Ba2* extracelular sobre 1.. A, corrientes activadas por despolarización en solución 5 mM Cd" (Control) y tras adición de 13.5 mM Ba'*. Las corrientes capacitiva y de pérdida han sido substrafdas. i?, relación I-V de I, medida a los 40 ms del pulso despolarizante en ausencia (0) y presencia de Ba" (A). C, curvas de activación de G. en ausencia (0) Y presencia de Ba2' (A), donde los valores de xcalculados a partir de la ec. (6.2) han sido ajustados a la ec. (6.3) (lineas continuas). Los pardmetros de ajuste son: en Control, ñ. = 0.98 + 0.01, Vo = 11.25 f 0.62 mV, S = 13.18 k 0.53; en 13.5 mM Ba'*, ñ, = 0.99 -+ 0.01, Vo = 5.14 _+ 0.48 mV, S = ll.35 f 0.41. 165

en

solución

5

bloqueadas, en

el

mM Cd"

(Control),

observandose

control.

acompañada

que

Esta

es de alrededor

de voltaje,

tal

en el

grado

voltaje

de

efecto,

la

no

Figura

6.6

y han sido

(6.3),

no son de

en

sobre

otros

de voltaje

de G,,

un verdadero

han

1,

es

de salida

presente (1,)

rectificación fijación 1, voltaje

es

una

activada

por

retardada

de (véase

y de tiempo.

al

constancia de En

de activación

de

de Baz+, donde

>0.99) lo

a los

extracelular.

según

(r

pulsos

dependencia

cual

la

ecuación

a la

ecuación

indica

que

desplazamiento

de activación,

concluir

capitulo

corriente

obtenidos

el

hacia

como

incremento

no modifica

de los

de corriente

Ba2'

de

ha sido

extracelular

de

III.4).

extracelular podemos

la

(circulos)

el

capítulo

Esta

ser

umbral

distintos

curvas

debido

para

en el

B).

diferentes,

canales

6-V. En el

sido

de su curva

bloqueo

las

sin

de 1, medida

que

ajustados

no

(véase

que Ba"

6.6

y ausencia

sistemas

divalentes Puesto

que

aceptablemente

despolarizados

descrito iones

C muestra

substancialmente

Ba"

I-V

sido

en Ba2' que

ocurre

ni

por

han

menor

los

relación

modificada

experimentales

(6.2)

valores

ve

I,(,,

que

de 1. sugiere

(triángulos)

valores

efecto

se

e

mostrado)

(Figura

de disminución

1, en presencia los

la

despolarizante

1,

1,,

de un 40% para

como muestra

pulso

de

en E, (no

activación,

1,

1. ea sensiblemente

disminución

de variaciones

17 ms del

donde

que

E, ni

Ba"

que

la dependencia

extracelular

median

ejerce

1,.

DISCUSION se estudia

la

despolarización salida capitulo transportada

La dependencia 166

corriente

retrasada

y responsable

observada

de la

en

condiciones

de

K'

dependiente

de

III.1). por de voltaje

de su activación

muestra

que esta

ocurre

a partir

Vm de forma

sigmoidea

indica

que

probabilidad

independiente

del

mV. En cuanto

a la dependencia

crece

con

cual

ser

puede

Debe hacerse

y lenta

de Vm tras

imposibilidad (véase Aun

cuando

presentar

debe

voltaje

1, ha

reduccibn

cuarta

redistribución

que,

duraci6n

definida

1966;

et

al.,

1970)

o si

la pronta as1 en

de acción

"todo

desconocido

estudios

persistente

progresiva

es debido 1981;

o

no

primeros pulsos

y muy

de lenta

de una parcial (Frankenhaeuser

y

inactivación

de

1966;

a la Dubois,

y su elucidación

que escapan

por

los

durante

y Kusano,

de 1, (Dubois,

noses

y profundos

como

y participa

de una muy lenta Nakajima

nuevos

que permite

de la membrana

1962:

1986)

inferior

de activación

es consecuencia

al.,

y Dubois,

rapidez

como

una

et

componentes

en un tiempo

en ocasiones,

fenómeno

si es resultado

distintos

funcidn

a 5 ms y que

al menos durante

1, (Nakajima Adrian

temporal

una

es inferior

de potenciales

ocurre

de K' a través 1956),

de

la despolarización

es a 70

se ha dado en calificarla

por tiempo,

de 1.. Si este

Hodgkin,

potencia

a 1, e Ir,-,,

sido

indicarse

de mayor

canal

III-B).

inactivación

ms,

(lo

en torno

de 1,, su curso

de generación capitulo

de un

su saturación

la extremada

en relación

de Boltzman

apertura

persistente

notar

a -30 mV,

de tiempo

de 1,, aun cuando

repolarizaciõn

nada"

de

de tiempo

estacionario

y desactivación

500

constante

un estado

retrasada

la

próximos

la ecuación

según

y encuentra

por

cuya

a 15 ms.

la

resto)

descrito

exponencial, alcanza

la

de valores

a los

Nakajima,

existencia 1983;

de Benoit

requeriría objetivos

aquf

perseguidos. Las características

electrofisiolõgicas 167

y farmacolõgicas

de

1,

presentan

acusadas

retardados sólo

presentes

axón

del

gigante

presentar

una

curva

rectificador

practicamenteidénticas. a partir

de ambos

de

consiste

acción,

músculo de la

sin

corriente

repolarización rectificación relativas músculo

umbral

función del

gigante

de

las

a la generación son

la

puestas

III.8.

168

de

funcionales

función

de ambas

un potencial de

1,

despolarizado

del

que

el

de calamar.

acción

implicaciones

de potenciales

encuentran

activación

de 1, como corriente

potencial

retardada,

abductor

axón

mas

caracteristicas

de Vm tras de

por

valores

y analogías

de 20 mV mãs

de Na‘ del

1952a,b,d) hacia

casos

1.

descrito

y analogias

en ambos

el

ejemplo,

clásico

demas

diferencias

es alrededor

de la

sus

repolarizaciOn

embargo,

abductor

Ademas

el

en la

por

y Huxley,

diferencias

En efecto,

Asf,

desplazada

todas

de las

sistemas.

corrientes

(Hodgkin

Estas

rectificadores

retardado

de activación siendo

otros

sistemas.

de calamar

despolarizados,

significado

con

en distintos

se diferencia

en el

similitudes

responsable de

Ca"

de la y

de

funcionales de acción

manifiesto

de

graduados en

el

capítulo

la 1, por

III.?. CARACTERIZACION DE LA CORRIENTE DE SALIDA INICIAL