Busqueda de puentes de hidrogeno • Un puente de hidrogeno (puente-H) permite que pedazos del peptido relativamente distantes en la cadena queden cerca uno de otro en el espacio. Son muy comunes en proteinas, y si se pudiese identificar donde estan (atomos dador y aceptor), obtendriamos una restriccion estructural importante. • En una proteina los puentes-H mas interesantes son aquellos entre los protones NH y carbonilos del esqueleto peptidico, como ser los que vemos en α-helices y hojas β. Tambien podemos verlos de grupos NH y CO en cadenas laterales (Asn, Asp, Gln, Glu) a grupos CO y NH del esqueleto peptidico:

• Para ubicarlos estudiamos las velocidades de interecambio de los protones NH. La idea es que protones labiles protegidos del solvente no intercambian tan rapido con protones del solvente como aquellos que esten expuestos al medio.

Velocidad de intercambio de amidas • Osea, si agregamos D2O a una solucion de nuestra proteina en H2O y tomamos espectros a distintos tiempos vemos que las señales de los NH desaparecen a distintas velocidades. • Como en la region NH de un espectro 1H 1D hay mucho solapamiento, normalmente usamos un experimento 2D rapido, como ser un COSY. Miramos las correlaciones NH-Hα a distintos tiempos. 4.0

t = 0 (Sin D2O) Agregado de D2O

4.0 (Hαs)

t = t1

4.0

t = t2

8.0

(NHs)

7.0

Intercambio de amidas (continuado) • Con estos datos podemos determinar que NH participan en puentes-H fuertes y debiles, y cuales no participan. Como tambien tenemos datos de NOE y acoples 3J podemos ver si estas amidas pertenecen a regiones de la proteina con estructura secundaria definida (helices-α, hojas β, o bucles β). • Si y SOLO si podemos hacer eso, podemos usar al puente-H como una restriccion estructural en la generacion del modelo 3D. • ¿Porque el ‘SOLO’? Solo conocemos al dador del puente-H, pero no hay, al menos hasta hace poco, forma de determinar cual es el C=O aceptor. Si le erramos a esto, el resultado es catastrofico: Como basicamente estamos ciclando el peptido no hay forma de obtener la estructura correcta. • Si decidimos que es razonable, podemos usar los puentes-H en los calculos como una restriccion de distancias:

EHB = KHB * ( ri - rHB-ideal )2

• rPH-ideal es ~2.5 Å. Como los puentes-H tambien tienen una componente angular (el angulo N-H…O tiene que estar entre 135 y -135), podemos hacer el termino EHB mas complejo para incorporar esto tambien…

Gradientes de temperatura de amidas • Las velocidades de intercambio andan bien en proteinas, ya que los tiempos son relativamente largos. En peptidos mas chicos esto no siempre es asi. • Como son mas flexibles, tienen mucho mas contacto con el solvente y todo se intercambia en tiempos mas cortos (minutos en vez de horas). En el tiempo que nos lleva poner D2O en el tubo, ir al laboratorio de RMN, ponerlo en el iman, y ajustar el campo ya no tenemos NHs, sino que NDs… • En peptidos, en vez de estudiar velocidades de intercambio analizamos el cambio en el corrimiento de los protones NH en funcion de la temperatura (gradientes de temperatura). • Cuanto mas expuesto este el proton NH al solvente, mas rapido sera su intercambio con los protones del agua, lo que mueve su corrimiento quimico a campos altos (4.7 ppm…). • Medimos los gradientes de T en partes por billon (ppb). Valores por debajo de -2 indican que estamos protegidos del solvente, entre -2 y -5 ppb que estamos parcialmente protegidos (tenemos puente-H parte del tiempo), y arriba de -6 que el proton NH esta completamente expuesto al agua. • Como en proteinas, no podemos determinar cual es el aceptor (que oxigeno). Osea, tenemos que tener cuidado si queremos usar esta informacion para imponer restricciones…

Gradientes de temperatura de amidas (…) • Para el peptido Ala-Arg-Pro-Tyr-Asn-Aic-Cpa-Leu-NH2:

• El NH de la Leu esta en un puente-H parcial.

Uso de VIAs y GTAs • Un problema de tener datos de puentes-H es saber que los tenemos pero no poder usarlos con certeza. • Si queremos hacerlo con cuidado, hacemos todos los calculos de las estructuras 3D con NOEs y 3Js, y despues descartamos las estructuras en las que NHs que sabemos que estan involucrados en puentes-H no aparezcan en puentes-H (lease, lo usamos como una confirmacion). • Tambien los podemos usar directamente si tenemos datos de NOE y 3Js complementatios, como ser en casos que tengamos helices-α y hojas β bien definidos. El problema son los bucles β, donde vemos puentes-H pero no NOEs/3Js. • O podemos hacer algo mas complicado, que es probar todos los aceptores razonables posibles en simulaciones independientes y ver cuales son los que nos dan menor energia:

O

O

O H

O H

O

E1

O

O O

O H

O E3

O H

O E2

Marcado isotopico • En principio, los unicos nucleos que podemos ver por RMN en una proteina son los 1Hs. En proteinas chicas (~ 10 KDa, ~ 80 aminoacidos) esto no es problema. Podemos identificar todos los residuos, determinar todos los NOEs, y medir la mayoria de los acoples 3J con TOCSYs, COSYs, y NOESYs. • En moleculas mas grandes (> 10 KDa), el solapamiento se torna problematico. Muchos residuos quedan sin identificar, y no podemos asignar partes del esqueleto peptidico. • Lo que necesitamos son mas nucleos con actividad de RMN. De esa forma podriamos editar los espectros en base a ellos, o agregar una tercera (y talvez cuarta) dimension. • Para poder hacer esto necesitamos varias cosas: - Hay que conocer el gen responsible de la sintesis de la proteina que nos interesa. - Neceitamos a un biologo molecular que prepare un plasmido con el gen, si es posible usando E. coli como vector, que crezca en medio minimo, de manera que cualquier estudiante en el laboratorio pueda sobreexpresarlo. - La proteina sobreexpresada tiene que ser funcional. El 85% de las veces la proteina se sobreexpresa pero precipita… - Un protocolo bueno/bonito/barato de purificacion.

Marcado isotopico (continuado) • 10 a 1 que uno de estos requerimientos falla en la vida real. Problemas de sobreexpresion, purificacion, y precipitacion tienen arreglo. Conseguir el gen es mas complicado… • Habiendo resuelto todos estos problemas, hacemos crecer al vector con el plasmido en medio enriquecido isotopicamente. Generalmente, medio M9 (minimo), que solo tiene NH4Ac y glucosa como fuentes de N y C. No podemos usar extractos de levadura, etc., etc. • Si queremos proteina marcada con 15N, usamos 15NH4Ac (es barato). La glucosa-U-13C es mas cara, pero necesaria en algunos casos cuando 15N solo no alcanza. • Asi obtenemos proteina marcada parcial o totalmente, en que parte (15N) o todos (13C=O, 13Cα, and 15Ns) los nucleos del esqueleto peptidico tienen actividad de RMN.

H 15

N

O 13 13

C AA1

C

AA2 13 15

N H

C

H 15

13

C

O

N

O 13 13

C

C AA3

• Ademas ahora tenemos constantes de acople 3J ‘nuevos’ que nos dan informacion sobre otros diedros, H-C-C-15N y H-N-C-13C, cada una con sus propios paramteros de Karplus.

Marcado isotopico (…) • Uno de los experimentos mas comunes en proteinas marcadas con 15N es una correlacion heteronuclear 1H-15N. En vez de hacer un HETCOR, que detectaria 15N (baja sensibilidad), hacemos un HSQC o HMQC, que nos da la misma informacion pero detecta 1H. • El experimento es barbaro, porque nos sirve para desparramar señales de la proteina en base al corrimiento quimico del 15N (que es grande):

7.0

1H

8.0

“0”

185.0

15N

δ

165.0

• Ideal para varias cosas. Una es medir velocidades de intercambio de amidas. • Tambien es util en la identificacion de sistemas de espines: Si no tenemos buena resolucion en el COSY/TOCSY y hay señales solapadas, podemos usar una correlacion 1H-15N para expandir el 2D a una tercera dimension…

δ

Espectroscopia RMN 3D • …lo que nos trae a la espectroscopia 3D. Nada de que asustarse. Los principios de la espectroscopia 3D son los mismos que los de la 2D. • Lo podemos pensar de esta manera: De la misma forma que el tiempo de evolucion t1 nos da la segunda dimension f1, podemos agregar otro tiempo de evolucion y obtener un tercer eje de frecuencia luego de una TF (3D): • Para un 2D teniamos:

Preparacion

Evolucion Adquisicion Mezcla (t1) (t2) f1

f2

• En un 3D tenemos:

Preparacion

Evolucion Mezcla Evolucion Mezcla Adquisicion (t1) (1) (t2) (2) (t3)

f1

f2

f3

• Como en los 2D, dependiendo del tipo de mezclado que usemos en cada pedazo, el tipo de datos que obtenemos…

Espectroscopia RMN 3D (continuado) • No vamos a ir pulso por pulso detallando como funcionan, pero si voy a describir (y escribir) algunas de las secuencias y como las analizamos. • Las tenemos que separar en dos categorias dependiendo del tipo de mezclado: • Espectros 3D de separacion: Tomamos el sistema de espines y separamos distintos parametros (corrimientos quimicos, acoples) en distintas dimensiones. Un ejemplo seria una version 3D del HOMO2DJ. Eso no es tan comun en proteinas/ADN. • Espectros 3D de transferencia: En estos tenemos un proceso de transferencia, como ser acoples-J o NOE, para pasar informacion entre las distintas dimensiones. Son una extension de los experimentos 2D que hemos visto, y los que se usan mas comunmente. • La manera en que los armamos es basicamente poniendo dos experimentos 2D uno atras del otro (al menos es facil de entender de esta manera). • Dependiendo de esto, vamos a tener cosas como TOCSYHSQC, NOESY-HSQC, COSY-COSY, COSY-NOESY, TOCSY-NOESY, etc., etc. • Vamos a ver cual es la idea con un ejemplo simple, y despues como funcionan algunos de los mas comunes.

Espectroscopia RMN 3D (…) • Digamos que podemos exitar selectivamente solo a ciertos protones NH de la muestra (hoy vamos a ver un poco mas sobre pulso selectivos). Solo los protones acoplados con estos protones nos darian cross-peaks: 90

90s t1

90

tm

• Osea, hacemos esta exitacion selectiva seguida por un experimento TOCSY 2D. Nuestro 2D solo va a tener una franja que corresponde a la amida que elejimos. Para una Leu:

NH

Hα

Hβ

Hγ

Hδ

• Si cambiamos gradualmente la frecuencia del puso selectivo a la de otro NH veriamos el TOCSY de otros aminoacido…

Espectroscopia RMN 3D (…) • Ahora podriamos poner todos los espectros 2D apilados y cada plano tendria uncamente las conectividades de un sistema de espines aislado:

Frecuencias de NHs resueltas

Frecuencias de 1H alifaticas • Esto seria un ‘seudo’ experimento 3D. El problema es como hicimos la seleccion de los NH. En general, aislamos los NHs (o lo que queramos) con un experimento 2D que los resuelva. • Por lo que hemos visto, una correlacion 1H-15N es ideal para esto, porque la mayoria de los cross-peaks estan bien resueltos en la dimension de 15N. • Es mas, la forma en que adquirimos un 3D no involucra tomar un monton de 2Ds y ‘apilarlos’ para obtener el 3D, sino que obtener datos en t1, t2, t3 y hacer una TF 3D…

Espectroscopia RMN 3D (…) • Es mas, cross-peaks que aparecen en el cubo son debidos a transferencia de polarizacion entre los nucleos que tenemos en las 3 dimensiones. • Un 3D que combine a una correlacion 15N-1H y a un TOCSY tendria esta apariencia (hacer el dibujito me costo un triunfo):

1H

1H

15N

δ

δ

δ

• Con suerte, tenemos cada una de las lineas de cross-peaks separadas unas de otras, empezando cada una en la correlacion 15N-1H. Los δs de 1H estan separados por los δs de 15N. • Mirar este cubo es dificil con 200 amidas. En general solo miramos planos a distintas frecuencias de 15N.

Espectroscopia RMN 3D (…) • Dependiendo de la franja (plano) que consideremos, vamos a tener espectros TOCSY correspondientes a distintos NHs:

Secuencia de pulsos TOCSY-HSQC • El experimento que usamos en este ejemplo es uno de los mas usados cuando hacemos espectroscopia 3D. La secuencia de pulsos es esta: 90

13C 15N

Δ

{X}

90 t2

Δ

{X}

: 90

90 t1

1H:

90

180

DIPSI t3

• En breve, el primer pedazo es un TOCSY en 1H, donde tenemos que saturar 13C o 15N (porque lo hacemos en proteina marcada). Aca tenemos t1 (f1), osea que tenemos un TOCSY 1H-1H en esta dimension. • La segunda parte es un HETCOR detectado inversamente (un HSQC), donde vamos a tener frecuencias de 1H en un eje (f1) y de 13C or 15N en el otro (f2). • Al final, como la deteccion en el periodo t3 es en 1H, tenemos corrimientos quimicos y acoples espin-espin de 1H en f3.

Combinacion NOESY-HSQC • De manera similar se puede combinar un NOESY con el HSQC. La secuencia es esta: 90

13C 15N

Δ

{X}

90 t2

Δ

{X}

: 90

90 t1

1H:

90

180

tm t3

• Ahora, en vez de un TOCSY en la primera parte tenemos un NOESY. La segunda parte es identica al anterior. • En el 3D vamos a tener una correlacion 1H-15N (o 13C) en el plano f1-f2, y espectros NOESY en los planos f1-f3. Cada uno de estos espectros NOESY tendran unos pocos protons. Si la resolution es buena, cada NH tendra su prop plano f1-f3. • De forma similar podemos combinar cualquier tipo de espectro 2D para obtener un experimento 3D. Estos dos son los mas usados en proteinas, que son las macromoleculas para las cuales se hace mas RMN 3D…

Espectroscopia RMN 3D (…) • Con datos reales:

3D

Proyeccion

• Este NOESY-HSQC es de un mutante dimerico de GpA (tomado de http://bioc.rice.edu/~mev/spectra3.html)

Pulsos selectivos • Muchas de estas secuencias 3D se usan para determinar sistemas de espin al principio del proceso de asignacion. La mayoria hacen uso de algun tipo de exitacion selectiva que actua solo en parte de los espines del peptido: • Por ejemplo, puede ser que solo queramos ver que esta enlazado a Hαs pero no a NHs. Es mas, luego de marcar la proteina con 15N y 13C tenemos que poder controlar la transferencia de polarizacion dentro del esqueleto peptidico. • Para hacer todo esto necesitamos pulsos selectivos, los cuales hemos mencionado antes pero nunca descrito en detalle. • Un puslo no selectivo es corto y rectangular, lo que le da un ancho de banda amplio centrado en la portadora (esto ya lo vimos en detalle…). Para mejorar la selectividad podemos hacer el tiempo de pulso mucho mas largo, lo que nos da un rango de frecuencias mas estrecho: Tiempo:

Frecuencia:

ωo

ωo

Pulsos selectivos (…) • El problema de usar pulsos selectivos rectangulares son las bandas laterales (hay que acordarse de la TF del pulso rectangular). Por lo tanto, tendriamos exitacion de frecuencias no deseadas. • Lo que neceitamos es un pulso en el dominio de los tiempos que afecte exclusivamente ciertas frecuencias. Osea, el pulso no puede tener un perfil de intensidad contra tiempo rectangular, y debe tener forma (i.e., intensidad modulada). • Un metodo aproximado para determinar cual seria la forma de un pulso es ver como queremos que sea la exitacion en el dominio de frecuencias y hacer una TF inversa (TF-1) para obtener la forma necesaria en el dominio del tiempo : Δω TF-1 Δt

ω

t

• Para hacerlo bien se debe hacer un analisis completo de las ecuaciones de Bloch. Las formas de pulso mas comunes son la gausiana y la gausiana al cuadrado. Cambiando ya sea la forma, la potencia, o largo del pulso podemos seleccionar, por ejemplo, a los Hα, NH, 13Cα, o 13C=O de la muestra…

Experimentos 3D con pulsos selectivos • …lo que nos trae de vuelta al uso de pulsos selectivos en espestroscopia 3D. Ahora podemos ajustar aun mas lo que queremos ver con nuestro 3D. En vez de, por ejemplo, exitar todos los nucleos 13C en la molecula, podemos exitar solo los 13Cα del esqueleto peptidico. De esta forma solo tenemos transferencia de polarizacion que involucre a estos carbonos. • Esto es muy util porque nos permite seguir atomos a lo largo del esqueleto peptidico de manera selectiva. Estos experimentos se nombran de acuerdo a como se transfiere la polarizacion de un nucleo a otro. Por ejemplo, el ‘HNCA’:

Experimentos 3D con pulsos selectivos (…) • Aca estamos transfiriendo polarizacion de 1H a 15N (estamos mejorando la señal de 15N y a su vez obteniendo una correlacion entre los dos nucleos), despues pasandola solo a los nucleos 13Cα (usamos pulsos π / 2 y π selectivos). • Osea, terminamos teniendo transferencia de polarizacion de los 1Hs a los 13Cα a travez de 15N, y por lo tanto los 13Cα quedan marcados con informacion de δs de 1H y 15N. • Al final obtenemos un correlacion (cross-peak) a la frecuencia de 15N-1H-13Cα (una pelota en el espacio a estas coordenadas. Usando otros pulsos selectivos podemos ver otras correlaciones. Por ejemplo, el HCA(CO)N ‘salta’ los 13C=O: