CAPITUI,O III

BACTERIAS H^TEROTROFAS i.

Fijadoras del nitrógeno atmosférico.

Como ya se ha índicado (prímera paríe - 2g), las bacterias heterótrofas, al carecer del poder de síntesis, han de utilizar - para la elaboración de su propio cuerpo y para obtener la energía necesaria al mantenimiento de sus funciones vitales - materia orgánica formada por otros organismos. A estos fines, tales bacterias utilizan compuestos orgánicos complejos, tales como los proteidos y los productos de su hidrólisis, polipéptídos e incluso aminoácidos, las grasas y ácidos grasos y los glúcidos, presentando algunas bacterias preferencia^ por determinados grupos, raientras que otras pueden utilizar como fuente de carbono y energfa una gran variedad de materias. El nitrógeno lo obtienen preferentemente unas bacterias de proteínas complejas, albumosas o peptonas, mientras que otras son capaces de fijar dírectamente el nitrágeno atmosférico. Atendiendo a este modo de adquirir su nitrógeno, pueden clasificarse las bacterias heterótrofas de la siguiente forma: Z. - BACTRRIAS FIJADORAS DRI, NITRbG^NO ATMOSIrk^RICO.

a) b)

- Anaerobias. Bacterias libres . ^ I• ^ II. - Aerobias. Bacterias en simbiosis.

2. - BACTERIAS A^ROBIA5 QU^ NECF.SITAN NITRÓGRNO COMBINADO. a)

Formando es fioras.

b) No f ormando es^oras. ^. - BACT^RIAS ANA^ROBIAS QUI3 NDC$SITAN NITRÓGI:NO COMBINADO.

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i. - Bacterias fijadoras del nitrógeno atmosfErico.

a) I. - BACT^ttiAS LisR>rs nxA^xosrAS. -(Véase primera parte, páginas io$-ii3.) Para el aislamiento de estas bacterias, tuvo Winogradsky la feliz idea de utilizar un medio de cultivo desprovisto totalmente de nitrógeno, en el que sólo podrían desarrollarse aquellos organismos capaces de proporcionarse el nitrógeno de la atmósfera. ^1 medio empleado por Winogradsky (iog) fué el siguiente: Fosfato bípotásíco (S^I3P0^) .... .... .. . . . . . . Sulfato magnEsíco (MgSO^ ' 7Hy0) ... . . . . . . . . Clornro sódico (NaCI) .... . .. . . .. . . . . . . . . . . . Sulfato ferroao (PeSO^ • ^H^O) .. . . . . . . . . . . . . Snlfato de manganeso (MnSO^ • 4Ii^0) .. . . .. . Glucosa ......... ......................... Carbonato cálcico (CaCos) . . . . . . . . . . . . . . . . . . Agua destilada ............................

i,o gramos. o,x r o,oi r o,oi • o,oi ^ xo,oo ^ 30,00 + iooo c.c.

Para evitar la descomposición de la glucosa, conviene esterilizar el carbonato de cal separadamente. . El medio se distribuye en matraces pequeños de i5o c. c. de cabida, llenos hasta el cuello, que se esterilizan a iio^ durante treinta minutos, añadiendo a cada uno de ellos unos 4 gramos de carbonato de cal. 5e prepara un extracto de suelo pasteurizado, para lo cual se ponen 5o gramos de1 suelo en 20o c. c. de agua, calentando Ientamente hasta los $o^, temperatura que se mantiene durante quince minutos. 5e enfña rápidamente, y mediante pipetas esterilizadas se inoculan los matraces, poniendo en cada uno de ellos io c. c. del e^racto de suelo. Se incuban a 25^ ó 30^, observándose la formación de abundantes burbujas gaseosas, índice de la fermentación butírica que se extiende por todo el Iíquido, mientras que las partículas de carbonato se recubren de un mucílago en el que se encuentran bacterias anaerobias pertenecientes al género Clostridium, y especie denominada por Winogradsky Cl. ^astorianum. El cultivo se enriquece haciendo trasplantes sucesivos en el mismo medio, utilizando como inóculo una partícula del carbonato de cal del fondo del cultivo. I,as observaciones microscópicas hay que efectuarlas en gotas de líquido tomadas del fondo de1 matraz con una pipeta esterilizada. Para obtener cultivos puros se calienta a 7g^, durante diez minutos, un cultivo enriquecido, con lo que mueren las bacterias que no forman esporas, y este cultivo sirve para inocular trozos de patata, que pre^46_

viamente han sido espolvoreados con carbonato de cal y esterilizados en placas de Petri. Las placas inoculadas se incuban a 30^, en condiciones anaerobias, en vacío parcial o en atmósfera de hidrógeno, y al cabo de unos seis días pueden observarse sobre la superficie de la patata colonias amarillentas, redondeadas, llenas de burbujas gaseosas, formadas por Clostridium pastorianum. Como medio para el aislamiento y cultivo de las bacterias productoras de ácido butírico, puede emplearse también el siguiente medio sólido (=4): Glucosa ................................. Eztracto de carne I,íebig ......... .. . . . . . . .

I,o gramos. I,2 • 0,8 •

Goruro sódíco (NaG) .... . . . . . . . . . . . . . . . .

o,z

Agar ...................................

I,6

Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Ioo c, c.

Peptona Witte ...........................

• •

Reacdbn ligeramente alcaliaa.

I,as bacterias del género Clostridium son bastoncillos anaerobios o microaerófilos, que, al esporular, se ensanchan en forma de huso (Clostridium de Fischer) o de palillo de tambor (Pkctridium de Fischer). Bredeman (i4) incluyó en una sola especie, Bacillus amylobacter, todas las bacterias que tienen la propiedad de fijar nitrógeno atmosférico y llevar a cabo la fermentación de diversos gltícidos con formación de ácido butírico y alcohol butílico. Aun cuando autores como Omeliansky (76) se mostraron disconformes con esta agrupación en una sola especie, de bacterias tales como Clostridium, Granulobacter, Plectridium, etc., esta misma norma ha sido seguida por Bergey en su Manual, que, como se ve a continuación, incluye en la especie Clostridium butyricum Prazmowsky una serie de bacterias descubiertas por diversos investigadores en diferentes medios y procesos, entre ellas el Clostridium ^astorianum, encontrado por Winogradsky. Clostridium butyricum Prazmowsky. (Botan. Zeitung, 37^ 409: 1879•) Slxoxlnaes. - Vibrion butyrique Pasteur (Compt. Rend., 5z^ 334: 1861). Bacillus amylobacter van Tieghem (Bul1. Soc. Bot. France, z4: Iz8; 1877). Bacillus butyricus Botkin (Zeit. f. Hyg., II: 42I; 18gz). Granulobacter saccharobutyricum Beijeriack yGranulobacter lactobutyricum Beijerinck (Verhandl. d. K. Akad. v. Wetenschappen, Tweede Sectie, Deel I, Amsterdam, 18g3). Granulobacter butylicum Beijerlnck (Arch. Neerland., zg, 1896). Clostridium pastorianum Winogradsky (Centbl. Bakt., II, 9^ 43: 19oz). Plectridium plectinovorum Storner (Centbl. Bakt., II, Ig: 171; Igo4). Bacillus amylobacter Bredemann (Centbl. Bakt., II, z3^ 385: 1909)•

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Bastoncillos, de o,7g a i µ X 3 a zo µ, presentándose aislados, en parejas y en cadenas largas. Pueden producir formas delgadas, de o,s µ de ancho. En los cultivos jóvenes se mueven activamente con flagelos perítricos. Fsporas ovales centrales de i X 2 a 5 µ. Acumula glicógeno en sus células y es Gram positiva. Picadura profunda en gelatina: No muestra licuación. Colonias en agar-suero (anaerobias): Pequeñas, aplastadas, irregulares, grisá.ceas, semitransparentes. Colonias en agar simple y glucosado, en bisel (anaerobias): Grisáosas, aplastadas, húmedas, eatendidas, con bordes irregulares, laciniados. Colonias profundas, en cultivos de agar en masa, compactas, de 2 a 3 mm. de diámetro, con porción central densa y periferia lanosa poco definida. I,a picadura profunda en agar muestra un desarrollo filiforme granuloso. ^nturbia el caldo glucosado. Coagulación ácida de 1a leche tornasolada, con formación abundante de gas y reducción precoz del tornasol. Sobre patata (con carbonato de cal), formación de una película delgada, estensa, difícilmente perceptible, en la que posteriormente aparecen puntos elevados amarillentos. El medio se hace blando y friable, con formación de burbujas gaseosas. No forma indol. No licúa el suero sanguíneo. Reduce los nitratos a nitritos y amonfaco. Fermenta la glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa y el almidón, con formación de ácidos, gases y alcoholes, en cantidades dependientes de la temperatura, de la cantidad de hidrato de carbono fermentable y de las substancias nitrogenadas de que disponga. Forma principalmente ácido butírico, con cantidades menores de ácidos propiónico, acético y fórmico. I,os gases formados son CO, y H=. I,os alcoholes formados son los butílico, propílico, etílico y trazas de amílico, dependiendo de la composición de las substancias fermentadas. De ordinario se forman dos partes de alcohol por una de acetona. Fija el nitrógeno atmosférico. Anaerobia, aun cuando soporte pequeñas cantidades de oxígeno; con 3o mmgs. de oxígeno por litro las esporas llegan a germinar. Temperatura óptima: 30o a 400, Reacción mínima: pH = 5. fdem bptima: pH = 6,g a ^,3. -4$-

I,a presencia del Clostridium en casi todos los suelos del Globo ha sido comprobada por diversos investigadores, principalmente por Winogradsky (iog), Omeliansky (^6), Preudenreich (qI) Haselhoff y Bredeman (48). a) II. - BACT^RIAS I.IBR^s ArROBIAS. - En el anterioi método para el aislamiento de bacterias anaerobias, fijadoras de nitrógeno, la pasteurización o calentamiento del suelo hasta 80^ practicada por Winogradsky tenía por finalidad simplificar la flora bacteriana del suelo eliminando los microorganismos que no eran susceptibles de esporular. Beijerinck (6), empleando una tierra de jardín sin pasteurizar, inoculada en un medio sin nitrógeno que contenía manita como fuente de carbono, e incubando a 25^ ó 30^, encontró una bacteria en forma de bastoncillos bastante anchos y a veces semejantes a levaduras, inmóviles o móviles con ayuda de un solo flagelo polar, aerobia obligada, que de ordinario se desarrollaba formando sobre la superficie del medio de cultivo una película grisácea que más tarde torna color pardo. Beijerinck denominó a esta bacteria Azotobacter chroococcum, comprobando su presencia en casi todos los suelos ensayados y en el estiércol. Una porción de la película formada puede trasplantarse a otro matraz con el mismo medio de cultivo: Manita ....................................

20,o gramos.

Irosfato bipotásico (g^HPO^) ........ . . . . . . . . .

o,z

Agua corríettte ..............................

iooo c.c.

•

Y después de varios trasplantes, se tiene un cultivo suficientemente enriquecido que permite el aislamiento del Azotobacter. Para ello, de un cultivo reciente en que la pelicula formada sea todavía muy delgada, se toma con e1 asa de platino una gota, que se diluye en agua esterilizada, agitando para separar las células bacterianas; a partir de ésta, se hace una segttnda dilución, y luego, una tercera, que se utilizan para inocular, en estrías, placas del rnedio de cultivo, solidificado por la adición de un 2 por ioo de agar. Se incuban las placas a 25^, y a los pocos días aparecen las colonias de Axotobacter, redondeadas, elevadas, convexas, lisa.s, pálidas, semiopacas, húmedas y viscosas, a menudo de 4 a 8 mm. de diámetro, que se seleccionan cuidadosamente con ayuda del microscopio para diferenciarlas de las colonias transparentes y elevadas del Bacterium radioóacter, que, con frecuencia, acompaña al Axotobacter, y al que a veces cuesta trabajo eliminar en la obtención de cultivos puros. - 49 _.

Fn lugar del medio de Beijerinck, puede emplearse cualquiera de los siguientes: Solución de Li^man (60): Manita ...................................

i5

gramos.

S•HPO^ .................................. MgSO^ • ^H=O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

0,2

•

0.2

•

CaCI^ .................................... Agna deatilada ......... ... . . . . ... . . . . .. .. ..

0,02 iooo

• c, c.

FeCI,: Una gota de soludón al ra por ioo.

Una vez disueltas las substancias, se añade la cantidad de solución de NaOH, al io por ioo, necesaria para que la fenolftaleína tome coloración ligeramente rosa. Solución de Ashby (i): Manita .................................... SH•PO^ ................................... MgSOj• ^H^O .............................

io gramos. 0,2 • 0,2 •

NaCI ..................................... CaSO^• 2H^0 .............................

0,2

•

o,i

CaCO• ....................................

g,o

r •

Agua destilada .............................

iooo

c. c.

Neutralizar con NaOH como la anterlor.

I,os cultivos puros de Azotobacter se obtienen fácilmente utilizando el gel silíceo de Winogradsky, que se prepara partiendo de una solución a125 por xoo, hecha con partes iguales, de silicatos sódico y potásico, cuyo peso específico se lleva a i,o6. En una placa de Petri se colocan g c. c. de esta solución, agregando una cota de fenolftaleína. Se prepara una solución de ácido clorhídrico a15 por ioo, y se va agregando al silicato con una pipeta graduada, hasta que desaparezca el color rojo, y se ajusta la solución de HCl de tal modo que 5 c. c. neutralicen 5 c. c. de 1a de silicatos. Para preparar 1as placas de ge1 silfceo se mezclan en un frasco volfimenes iguales de soluciones de silicatos y de HCI, agitando vigorosamente y vertiendo con rapidez en placas de Petri, que se colocan horizontalmente hasta que coagule el gel, lo que tarda de cinco a diez minutos. I,uego se llevan a recipientes de poco fondo, donde se dializan en agua corriente hasta la desaparición de los cloruros, lo que requiere unas veinticuatro horas, trasladándolas después a un vaso estéril que contenga agua destilada hervida, que se renueva varias veces. Después de bien lavadas, se escurren, y se tratan con la solución nutritiva que convenga emplear. -5^-

l^n el caso del Azotobacter, se echa sobre la superficie del gel solución de manita, y se llevan las placas, descubiertas, a una estufa de 60^, para que se evapore el egceso de líquido, cuidando de que el medio no se deseque demasiado (*). Las placas se inoculan con pequeñas porciones de suelo y se incuban a 28^, formándose las colonias de Azotobacter alrededor de las partículas de suelo, de donde pueden llevarse al medio líquido de cultivo. Las bacterias del género Azotobacter tienen, como hemos indicado, forma de bastoncillos anchos, y a veces redondeada, obteniendo la energía que necesitan para su desarrollo mediante la ozidación de glúcidos. Son móviles o inmóviles; en el primer caso pueden poseer un solo flagelo polar o un manojo de flagelos también polares. Varios autores, Beijerinck entre ellos, niegan la formación de esporas en este género, mientras que Ashby, Fischer y Krzemieniewski creen en ella, toda vez que puede resistir la desecación durante prolongados períodos. Prazmowski (78) demostró que la formación de esporas tiene lugar en condiciones normales, con suficiente aireación, en presencia de humatos. I,as principales especies del género Azotobacter son las siguientes (9):

Azotobacter chroococcum Beijerinck. (Centbl. Bakt., II, 9: 3-43: i9o2•)

Bastoncillo, de 2 a 3 µ X 3 a 6 K, presentándose en parejas y paquetes y rara vez en cadenas. I,as células presentan tres o cuatro gránulos refringentes y están rodeadas de una membrana mucilaginosa de espesor variable, que toma color pardusco en los cultivos viejos. I,a materia colorante es soluble en agua, alcohol, éter y cloroformo. Móvil por medio de un flagelo polar. Colonias en gelatina: Pequeñas, circulares, amarillas, granulosas. Con el tiempo toman color pardo amarillento. Picadura profunda en gelatina: Crecimiento débil. No lícúa Ia gelatina. Picadura profunda en agar-manita: Gris tendiendo a pardusco. (^) 7,os medios silfceos no necesitan esterilizatse, toda vez que los lavados con agua esterilizada, seguidos del empleo de medios muy selectivos, son suficientes para asegurar la esterilidad en lo que se refiere a contaminaciones de la atmósfera. - 51 -

Caldo: No se desarrolla. Leche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días. Patata: Brillante, escasamente perceptible, viscosa y rugosa, pardo achocolatado. Pste organismo fija nitrógeno atmosférico y desprende CO=, utilizando las siguientes substancias como fuente de energía: glucosa, levulosa, maltosa, manita, inulina, dextrina, galactosa, arabinosa, lactosa, almidón, glicerol, alcohol etílico, acetatos, butiratos, citratos, lactatos, malatos, propionatos y succinatos. Aerobia. Temperatura óptima: 250. Habitat: Se ha comprobado su presencia en casi todos los suelos con pH supenior a 6,0.

Axotobacier agilis Beijerinck. (Cex^bl. Bakt., II, ^: g61-g8z; 190I.^

Bastoncillos, de 4 a 6 µ de longitud, casi esféricos. Muy movible con ayuda de una manojo polar de cuatro a diez flagelos. Se desarrolla en medios carentes de compuestos orgánicos de nitrógeno. Colonias sobre agar-manita: Circulares, blancoagrisadas, translúcidas, con centro blanquecino. Colonias sobre agar lavado: Muestran ligera fluorescencia verde azulada. Cultivo sobre agar-manita en bisel: Grisáceo, translúcido, fluorescente. Cultivo sobre agar lavado, en bisel: Blanco amarillento, liso, bri» llante, translúcido, con centro opaco. Caldo: Se enturbia, con formación de anillo. I,eche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días. Cultivo sobre patata: Blanco amarillento, mucilaginoso, tomando más tarde color pardo amarillento. ^n presencia de ácidos orgánicos, se forma un pigmento verdoso o rojizo. Aerobia. Temperatura óptima: 280. Habitat: 1^ncontrada en las aguas de los canales de Delft. -$Z^

Aaotobacter vinelandii 7,ipman. (New Jersey Agr. Exp. Sta. Rapt., z4: ziy-z8g; igo3.)

Bastoncillos, de 2 a 3 µ X 3 a 6 µ. Se presentan aislados, en parejas y en cadenas cortas. Móvíles por medio de un flagelo polar. Colonias sobre agar-manita: Grandes, circulares, blancas, ligeramente transparentes, con fluorescencia verdosa. Caldo glucosado: Enturbiamiento eon ligero sedimento algodonoso. I,eche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días. Cultivo sobre patata: Aplastado, amarillento, pasando a pardo claro. Aerobia. Temperatura óptima: 2go. Habitat: ^ncontrada en suelos de Nueva Jersey. Azotobacter Beijerinckii I,ipman. (New Jersey Agr. Ezp. Sta. Rep., z4^ ^i7-z$5. 1903: 25^ 237-289. 19o4 ^

Células, de 3 a 4 µ X 5 a 6 µ, que se presentan aisladas, en pares o, más raramente, en cadenas. Móviles por medio de un flagelo polar. Colonias sobre agar-manita: Circulares, blancas o amarillo de azufxe. Sobre agar-manita, en bisel: Blanco, pasando a amarillo de azufre. Caldo glucosado: No se enturbia. Sobre la superficie flotan pequeñas masas circulares blancas. I,eche tornasolada: Se aclara de diez a catorce días. Sobre patata: Aplastado, amarillento, brillante, pasando a amarillo pardusco. Aerobia. Temperatura óptima: 250. Habitat: 5uelo. Axotobacter vitreus I,óhnis y Westerman. (Centbl. Bakt., II, ^z: z34-z54• 1908.)

Células esféricas, de unos 2 µ de diámetro, inmóviles, que se presentan aisladas o en grupos. Colonias en agar-manita: Pequeñas, circulares, blancas,ligeramente translúcidas, brillantes. Caldo glucosado: Sedimento mucilaginoso. -53-

I,eche tornasolada: Se adara de diez a catorce días. Patata: Desanollo ligero, escasamente vísible. Aerobia. Temperatura óptima: 2g^. Habitat: Suelo. * * s

Además de 1as bacterias de los géneros Clostrádium y Axotobacter, se ha observado en cultivos de otras bacterias existentes en el suelo la propiedad de fijar el nitrógeno atmosférico. »ntre otras, mencionaremos el Bacillus asteros^orus (Meyer) Migula, que puede fijar de i a 3 mgs. de nitrógeno por gramo de glucosa consumido (14); el Bacterium radioóacter (63}, y una forma afín al Proteus vulgaris, capaz de fijar de r,& a 4,^ mgs. de nitrógeno por gramo de azúcar consumido (94) • Sin embargo, para Winogradsky, las bacterias fijadoras de nitrógeno, cuya presencia se ha señalado en el suelo, deben agruparse en dos categorlas: I.s Agentes fijadores neutrales, que comprenden a Ios dos grupos clásicos del Clostrádium ^iastorianum y Axotoóacter, cuya función normal consiste en la fijación del nitrógeno; y 2.s Agentes fijadores artificiales, que comprenden aquellos organismos que pueden fijar pequeñas cantidades de nitrógeno en las condiciones artificiales del laboratorio, y que no parece tomen parte en el proceso de fijación de nítrógeno del suelo. b) BACTERIAS ^x sl^slosls. -(Véase primera parte, páginas I14-I16.) - Poco tiempo después de los trabajos de Hellriegel y Wilfarth sobre el origen de las nudosidades de las raíces de las leguminosas y su intervención en la fijación del nitrógeno atmosférico, consiguió Beíjerinck (4) aislar en cultivo puro al microorganismo causante del proceso, que denominó Bacillus radicicola, y que, según él, se encontraba en el suelo en forma de pequeños bastoncillos, capaces cie penetrar en los pelos absorbentes de las raíces de las leguminosas, pasando luego al interior de la raíz, evolucíonando en bacilos móviles, y posteriormente en bacterioides inmóviles, ahorquillados o ramificados, que funcionan como organísmos simbiótícos.

A raíz de este descubrimiento se llevaron a cabo numerosas investigaciones, especialmente las de Bewley y Hutchinson (io), y posterior-54-

mente las de Thorton y Gangulee {q2), que confirmaron la opinión de Winogradsky sobre el ciclo evolutivo que e$perimentaban las células del Bac. radicicola, tanto en el labotario, en medios de cultivo artificiales, como en su medio habitual de vida, parecíendo exístir una relación entre la alimentación y este ciclo. A partir de un cultivo joven de Bac. radicicola, se observan las siguientes fases: Micrococos inmóviles, que al cabo de un cierto tiempo crecen hasta duplicar su diámetro primitivo; células elipsoidales, provistas de un flagelo, que poseen una movilidad extraordinaria, constituyendo lo que algunos denominaron afase de enjambres, ^; bacilos móvfles provistos de flagelos peritricos, que van perdienda paulatinamente hasta quedar inmóviles, y, finalmente, bacterioides, muchos de ellos ramificados en T o en Y, vacuolados, y presentando el contenido protoplásmico concentrado en fajas o bandas transversales. I,a multiplicación celular se verifica en dos fases: por bipartición de los bacilos móviles o por divisíón múltiple de Ios bacterioides, en la que cada banda protoplasmática da lugar a un nuevo individuo. I,a formación de bacterioides en los medios de cultivo es estimulada por la adición de azúcares o pequeñas cantidades de ácidos orgánicos de los contenidos en la savia de la planta hospitalaria (8g). I,a formacián de micrococos, que se transforman rápídamente en uenjambres», se estimula fuertemente por la adición de fosfatos o de leche. ^n el suelo, el Bac. radicicola experimenta las mismas transformaciones que en los medios de cultivo, y también aquf viene estimulada la movilidad por la adición de fosfatos. En condiciones favorables de humedad, temperatura y compacidad del suelo, la forma móvil puede desplazarse con una velocidad de un mílímetro por hora. 1;1 modo de penetración del organismo en las rafces ha sido estudiado por diversos investigadores, y recientemente por Thornton, quien ha podido comprobar que los nódulos no suelen aparecer en la planta recién germinada hasta que se empiezan a formar las hojas verdaderas (qi), época en que la planta segrega por sus raíces una substancia que estimula la multiplicación de las bacterias a su alrededor. Cerca de la egtremidad de los pelos absorbentes se desarrollan pequeñas colonias de bacterias que segregan una substancia termoestable susceptible de separarse de las bacterias por filtración (93), que provoca un cxecimiento asimétrico del pelo, a consecuencia del cual éste se riza o encorva, penetrando 1as bacterias por la región encorvada mediante un proceso que se ignoxa. Una vez dentro de Ia rafz las - ss -

bacterias, se multiplican, formando un filamento o cordón mucilaginoso que se extiende por el parénquima cortical de la ratz, y al llegar junto a las células de la endodermis excita 1a multiplicación de las células próximas, iniciándose de este modo la formación de la nudosidad, que progresa de modo distinto según la especie de la planta hospitalaria. )^n los Lupinus y Phaseolus, la infección produce una rápida multiplicación de las células infestadas, dando lugar a la formacián de la nudosidad, que en estas plantas suele tener su origen en la zona del cambium. En otras muchas plantas, las células infestadas dejan de dividirse, y la nudosidad se origina a expensas de células más externas que no han sido alcanzadas por las bacterias (bg). A medida que la nudosidad crece, se forman en ella elementos vasculares, unidos a los de la rafz, por los cuales reciben hidratos de carbono Ias bacterias. $n todos los tipos de nudosidad, las bacterias se multiplican dentro del citoplasma de la células hospitalarias, llenándolas por completo y tomando, en su mayor parte, forma de bacterioides, lo que hace suponer que sean éstos los agentes que llevan a cabo la fijación del nitrógeno. El Sac. rqdicicola puede aislarse de1 suelo o mejor aún de Ias nuda sidades, que se esterilizan ezteriormente con sublimado corrosivo al 2 por I.ooo durante dos o tres minutos, lavándolas luego varias veces con agua destilada esterilizada, y, finalmente, mediante una varilla de vidrio esterilizada se machacan en un tubo que contenga un poco de agua esterilizada, utilizando esta agua, que lleva en suspensi8n las bacterias, para hacer las siembras en medio de cultivo, que puede ser el de Ashby (pág, go) o alguno de los siguientes: i) Madio a óase da glucosa (3g): Glucosa ..................................... F'osfato monopotásirn {KFI^P04) . . . . . . . . . . . .. . Sulfato magttésíco (MgSO^ • qHrO) ........ ... .. Cloruro sódico (NaCI) .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sulfato ferroso (PeSO^) ........ . . . . . . . . . . . . . . . Sultato mangattoso (MnSO4) .. .. . . . .. . . . . . .... Cloruro cálcico (CaCI,) .......... .. ...... .. .. .. Agua deatilada .. .. .. . ..... .. . ... .... . .. .....

20,0o gramos. i,oo r o,io r Indicfos. fdem. fdem. fdem. iooo c. c.

2) M edio a b ase de ma^nita (iis): Manita ..................................... Goruro sódico (NaG) .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fosfato bipotásico (K^HPO^) ........ . . . . . . . . . . -56-

io,o gramos. 0,2 • o,g ,r

Sulfato magaEsico (MSSO^ ' 7Hr0) . ...... . . . . . . Sulfato cáldoo (CaSO^ • aH^O) ...... . ........ . Carbonato cálcIco (CaCO^) ..... . . ... . . . . . . . . . . Agus dtlevadura ............................ Agua destilada .............................. Agarlavado .................................

o,s o,c i,o ioo goo i5,o

gramos. ^ • c. c. c. c. gramos.

Para preparar el agua de levadura se diluye levadura, libre de almidón, en diez veces su peso de agua corriente; se calienta en baño de vapor durante dos o tres horas, agitando de vez en cuando; se esteriliza durante veinte minutos a iio^, y después de dejarla en reposo durante cuarenta y ocho horas, se decanta el líquído con ayuda de un sifón. 3)

M^dias a óase de txtractos de legurwixosas.

Para su preparación se maceran dos o tres horas ioo gramos de semillas en tooo c. c. de agua; luego se hierven durante dos horas y se filtran, añadiendo agua hasta completar los iooo c. c. y un i por ioo de sacarosa, 0,5 por ioo de carbonato de caI y i5 gramos de agar. 1~n lugar del extracto de semillas puede emplearse el de partes verdes y raíces de leguminosas hervidas en agua. I,as bacterias productoras de nudosidades en las leguminosas han recibido diversos nombres, según el criterio de clasificación seguido. Beijerinek Ie dió la denominación de Bacillus radicicola, que Prazmowski cambió por la de Bacterium radicicola, teniendo en euenta que no esporulaba, y por tanto, moría a temperaturas entre 60^ y 70^. Algunos investigadores las incluyeron en el género Pseudomonas, por el hecho de que varias razas poseen un solo flagelo polar. Finalmente, Smith (88) y Bergey, así como el Comité de la Sociedad de Bacteríólogos Americanos, han concedido prioridad al nombre de Rhizobium leguminosarum que le dió h'rank (38), y que en la actualidad es el más usado. I,as bacterias de las nudosidades presentan particularidades interesantes. I,a primera es que, a diferencia de lo que ocurre con la mayoría de las bacterias del suelo, su presencia en éste es discontínua, encontrándoselas solamente allí donde es, o ha sido, cultivada la planta hospitalaria; de aquí 1a necesidad o conveniencia de las inoculaciones bacterianas en el caso de cultivar por primera vez en un terreno especies leguminosas o en el de cambiar la especie que se venía cultivando; ya que la segunda particularidad es que no se trata - 57 --

de una sola especie bacteriana que pueda producir nudosidades en cualquíer especíe de planta Ieguminosa, sino que esisten razas o variedades (especies para algunos) cada una de las cuales sólo produce nudosidades en determinados géneros y especies de leguminosas. Ya en i888 reconoció Beijerinck que no todas las estirpes de bacterias de nudosidades eran idénticas, y llegó a distinguir siete variedades. Hiltner y StSrmer (49), basándose en estudios culturales y morfolbgícos, distinguieron dos grupos de baeierias: Bac. radicicola que se desarrollaba bien en medios gelatinados y producía nudosidades en los géneros Pisum, Vic•áa, Lathyrus, Phaseolus, Tri f©lium., etcétera, y Bac. Beijerinckii, que se desarrollaba mal en medios gelatinados y formaba nudosidades en los géneros Lu^inus, Ornithopus y Glycine; grupos que tuvieron que subdividir posteriormente. Utílizando la reacción de aglutinación Zipfel (iIó), llegó a la conclusión de que 1as bacterias productoras de nudosidades en distintos grupos de plantas leguminosas no eran razas ni variedades de una sola especie bacteriana, sino especies diferentes; hipótesis que parece confirmada por divexsos investigadores que han utilizado los métodos serológicos para el estudio de Ias bacterias simbióticas. Waksman (io2) establece Ios siguientes doce grupos de plantas leguminosas, cada uno de los cuales posee su raza propia de bacterias incapaz de formar nudosidades en las plantas de los restanies grupos: GRUro

I. - TríJolium pratense, Trif. hybrídum, Trif. alexandrtinum, Trij. incarna-

tum, Trif. repens, Trif. medium GRLTPO

II. - Melilotus alba, Mel. officina/is, Medicago sativa, Med. hispida, Medtica-

go lupulina, Trigonella fa*num-gr^cum. GxuPO III. - Vigna sinensis, Cassia chamracrista, Arachtis htipogea, Lespedeza striata, Mucuna utilis, Bapttisia tinctoria, Desmodium canescens, Acacia armata, Genista tinctoria, Phaseolus lunatus. GRVPO IV. - Pisum satiuum arvense, Vicia villosa, Vic. sativa, Vic, faba, Lens sculenta, I_athyrus lati/olíus. GRUro

V. -Glycine hispida (Soja máxima).

GRUro

VI. - Pñaseolus vulgaris y Pbas. multi/lorus. GRUro VII. - Lupinus perennis y Ornithopus sativa. GRUPO VIII. - Amphicarpa monoica.

GRUPO IX. - Amorpha canescens. GRVro

^

X. - Strophostyles helvola.

GRUro XI. - Robinia pseudoacacia. GRUPO XII. - Dalea alopecuroides.

* * * -58-

Bergey, en su Manual, que venimos siguiendo para la descripción de las especies bacterianas del suelo, incluye las bacterias de las nudosidades en el género Rhizobium Frank, con seis especies.

Género Rhixobium ^rank, i88g. Pequeños bastoncillos, móviles cuando jóvenes, que presentan abundantes formas ramificadas características cuando se desarrollan en condiciones adecuadas. Sou bacterias aerobias estrictas, capaces de fijar e1 nitrógeno atmosférico cuando se desarrollan en medios con hidratos de carbono y carentes de compuestos nitrogenados orgánicos. Ocasionan la formación de nudosidades en las raíces de las plantas leguminosas. La especie tipo es Rhizobium leguminosarum prank.

i. - Rhixobium leguminosarum lirank. (Laxdw. Jal^rb., ig: 5z3: 1890•)

Bastoncillos aislados, de i,2 a 3 µ de longitud, y ejemplares en forma de Y. Dentro de los bastoncillos se desarrollan formas secundarias, bacterioides, que se tiñen de amarillo con el yodo. ^n las nudosídades sobre las rafces de las Ieguminosas se observan filamentos, de los que proceden 1os bacterioides. Móvil con flagelos peritricos. Sobre caldo de guisantes gelatinado que contenga asparagina se desarrolla en forma de colonias blanquecinas de superficie brillante y mucilaginosa. I,a substancia mucilaginosa se tiñe de amarillo con el yodo y no presenta las reacciones de la celulosa. I,a gelatína se lícúa a veces. 1^1 desarrollo sobre agar-manita es rápido, con tendencia a extenderse. I,os cultivos en estría se presentan elevados, brillantes, semitranslúcidos, blancos, mucilaginosos y a veces viscosos, forrnándose abundante goma. En caldo: Sedimento mucilaginoso. I,igera producción de ácidos en medios con glucosa, galactosa, manosa, lactosa y maltosa. Aerobia. Temperatura óptima: 250. ' Habitat: En las nudosidades de Lathyrus, Pisurn, Vicia y Lens. -59-

2. - Rhixobium trifoiii Dangeard. (Ls Botanists, Ser. 16: I-z70; Iqs6.)

Bastoncillos móviles con flagelos perítricos. I,os bacterioides de los nódulos son en forma de pera, hinchados y vacuolados. El desanollo sobre agar-manita es rápido. I,as colonias son blancas, enturbiándose con la edad. Mucilaginosas. Produce grandes cantídades de goma. I,igera producción ácida en medios eon glucosa, galactosa, manosa, lactosa y maltosa. Aerobia. Temperatura óptima: 250. Habitat: ^n las nudosidades de las rafces de plantas del género Tri f olium. 3. - Rhizoóium ^haseoli Dangeard. (Le Botaniste, Ser. 16: I-z7o; 19z6.) SlNOrrlaass. - Rkiaobium Frankii var. rnajor Schneider; Rkisobíum Frankii variedad mixor Schnelder (Bull. Torr. Bot. Club, 19: zo3; 18gs).

Bastoncillos móviles con flagelos perftricos. I,os bacterioides tienen ordinariamente forma de bastoncillos, a menudo vacuolados. El crecimiento sobre agar-manita es rápido, con tendencia a extenderse. I,os cultivos en estría se presentan elevados, brillantes, semitranslúcidos, blancos, mucilaginosos. Formación ácida muy ligera en medios con glucosa, galactosa, manosa, sacarosa y lactosa. Aerobia. Temperatura óptima: 250. Habitat: En las nudosidades de las raíces de Phaseolus vulgaris, Phaseolus angusti f olia y Phaseolus multi f lorus.

4. - Rhixobium melilote Dangeard. (Le Botaniste, Ser. 16: I-2^o; Igz6.) SINOxIaue. - Rhiaobium mutabile Schneider (Bull. Torr. Bot. Club, 19: zo3; 189z).

Bastoncillos móviles con flagelos perítricos. Bacterioides mazudos y ramificados. lwl crecimiento sobre agar-manita es claramente rápido. Cultivós -60-

en estrías, elevados, brillantes, opacos, blanco perlino, mantecosos. Forma mucha goma. Formación ácida en medios con glucosa, galactosa, manosa y sacarosa. Aerobia. Temperatura óptima: 25°.

Habitat: ^n las nudosidades de las raíces de plantas de los géneros Melilotus, Medicago y Trigonella.

^. - Rhizobium radicicola (Beijerinck} Bergey y col. fBacillus radicicola Beijerinck, Bot. Zeit., q6: 7z6; i888). SrNOrnMtAS. - Bacterium radicicola Prazmowski (Laxdw. Vers-stat., 37; i8qo). Phytomixa leguminosarum J. Schr$ter (Krytogamen Flora, v. Schlesien de Cohn, 3; r889). Pseudomoxas radicicola G. T. Moore ($ull., ^i, U. S. Dept. Agric. Bur. Plant Industry, i9o5).

Bastoncillos aislados o en parejas, frecuentemente hinchados en un estremo o en la parte central, que se tiñen desigualmente. Muy movíbles con ayuda de un solo flagelo polar. Segregan una substancia mucilaginosa. Sobre agar-glucosa, cenizas: Colonias circulares elevadas, húmedas, blancas, brillantes y enteras. Sobre agar-maltosa, cenizas: Colonias húmedas, brillantes, transparentes, pasando con el tiempo a translúcidas, blancas, mucílaginosas, con tendencia a extenderse. l^n agua con maltosa y cenizas produce enturbiamiento con sedimento mucilaginoso. Aerobia. Temperatura óptima: 250. Habitat: Forma nudosidades en las raíces de especie de Lu^us, Soya y Ornitho^us.

6. - Rhixobium japonicum (Kirchner) Baldwin y Bred. (Kírchner, Beitrage sur Biol. d. P/lanzen de Cohn, y: zr3^ i895• Baldwin y Fréed., Jour. Bact., i7: iqi; i929.)

Bastoncillos móviles con flagelos monótricos. ^1 desarrollo sobre agar-manita es lento y escaso. ^1 cultivo en -6i -

estrfa es ligeramente elevado, brillante, opaco, blanco, mantecoso, con ligera formación de goma. l^l crecimiento es mayor sobre pentosas que sobre heaosas. Hay lenta producción ácida en medios con xilosa y arabinosa. Aerobia. Temperatura óptima: 250. Habitat: Produce nudosidades en las raíces de Soja maxima.