CAPÍTULO 2.3.7.

ANAPLASMOSIS BOVINA

RESUMEN La anaplasmosis bovina es consecuencia de la infección con Anaplasma marginale. Se conoce desde hace tiempo una segunda especie, A. centrale. No está claro si representa una verdadera especie separada. Anaplasma marginale es responsable de casi todos los brotes de la enfermedad clínica. El microorganismo se clasifica en el género Anaplasma, que pertenece a la familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Genéticamente, A. marginale encaja dentro del genogrupo II de las Ehrlichiae. Los signos característicos de la anaplasmosis son anemia e ictericia, pero la enfermedad clínica solo se puede confirmar por identificación del organismo. Una vez infectado, el ganado puede permanecer toda la vida como portador, y la identificación de estos animales depende de la detección de anticuerpos específicos mediante pruebas serológicas o del ADN de las rickettsias mediante técnicas de amplificación. Identificación del agente: El examen microscópico de sangre o de frotis de órganos con tinción de Giemsa es el método más común para identificar Anaplasma en animales con infección clínica. En estos frotis, A. marginale aparece dentro de los eritrocitos como cuerpos densos y redondeados de 0.3-1.0 µm de diámetro, la mayor parte de ellos situados en la zona marginal del eritrocito o en su proximidad. Anaplasma centrale es aparentemente similar, pero la mayor parte de los microorganismos se sitúan lejos del margen del eritrocito. En algunos países existen colorantes comerciales que permiten una tinción rápida de Anaplasma. Es importante que los frotis se hagan bien y estén exentos de material extraño. Los frotis de material de ganado vivo deberían prepararse, con preferencia, de sangre obtenida de la vena yugular o de algún otro gran vaso. En el caso de diagnosis post-mortem, los frotis deben proceder de órganos internos (incluyendo hígado, riñón, corazón y pulmones) y de la sangre retenida en vasos periféricos. Esto último es particularmente deseable si el estado de descomposición, después de la muerte, es avanzado. Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas más utilizadas han sido la fijación del complemento (FC) y las pruebas de aglutinación en placa. Sin embargo, datos recientes confirman que la prueba FC presenta una sensibilidad baja (20%) que resulta inaceptable para la identificación de ganado con infección persistente. Por consiguiente la prueba FC debe considerarse como una prueba poco fiable para certificar el estado de animales individuales. Para la detección de animales portadores se ha demostrado que un enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA), disponible comercialmente, presenta una sensibilidad muy mejorada (96%). También pueden utilizarse pruebas ELISA indirectas, ELISA puntuales y de inmunofluorescencia indirecta. Se han utilizado pruebas experimentales basadas en el ácido nucleico, que son capaces de detectar la presencia de una infección de bajo nivel en ganado portador y en las garrapatas que actúan como vectores. Cuando se utilizan para el diagnóstico pruebas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa está justificada una cierta precaución, ya que se necesita una reacción combinada para identificar portadores de bajo nivel y puede tener lugar una amplificación inespecífica. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En varios países se usan vacunas vivas para proteger el ganado contra la infección por A. marginale. La vacuna que contiene A. centrale es de uso más amplio y confiere protección contra cepas virulentas de A. marginale.

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

Se dispone de vacuna contra Anaplasma centrale en forma refrigerada y congelada. El control de calidad es muy importante ya que pueden estar presentes en el ganado donador otros agentes transmisibles por la sangre que pueden contaminar las vacunas y tener una diseminación amplia. Por esta razón se recomienda la vacuna congelada que permite un control de calidad posterior a la producción, lo que limita el riesgo de contaminación con otros patógenos. Las vacunas contra Anaplasma centrale no son completamente seguras. Una recomendación práctica es limitar su uso, en la medida de lo posible, a terneros, pues la inmunidad inespecífica reducirá el riesgo de algunas reacciones vacunales que pueden requerir tratamiento con tetracicilina o imidocarb. La inmunidad parcial se desarrolla en 6-8 semanas y dura varios años después de una única vacunación.

A. INTRODUCCIÓN Los brotes de anaplasmosis bovina se deben normalmente a la infección por Anaplasma marginale. Anaplasma centrale produce una anemia moderada, pero los brotes en el campo son muy raros. En algunos aislamientos de A. marginale se han descrito estructuras adicionales asociadas con los cuerpos de Anaplasma (17); aunque este parásito se ha denominado A. caudatum, no se considera como una especie separada. Anaplasma marginale se presenta en la mayor parte de los países tropicales y subtropicales, y en algunas regiones más templadas. Anaplasma centrale se describió por vez primera vez en Sudáfrica. Desde entonces el organismo ha sido importado en otros países –incluyendo Australia y algunos países de Sudamérica, Sudeste asiático y Oriente Medio- para ser utilizado como vacuna contra A. marginale. Las especies de Anaplasma se consideraron en principio como protozoos parásitos, pero la investigación posterior reveló que no poseían atributos que justificaran esta descripción. Desde 1957 se han clasificado en la familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Recientemente se ha propuesto una reorganización de la familia, que en el pasado incluía los géneros Anaplasma, Aegyptianella, Haemobartonella y Eperythrozoon (31), basándose en una combinación del análisis de secuencias del ARN ribosómico 16 S, de groesI, y del gen de la proteína superficial (6,37). En la familia Anaplasmataceae reorganizada se incluye toda la subdivisión alfa de Proteobacterias que pertenecen a los géneros Ehrlichia, Anaplasma, Cowdria, Wolbachia y Neorickettsia, reteniendo provisionalmente a Aegyptianella. Además, el género Anaplasma se ha ampliado hasta incluir Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia bovis y Ehrlichia platys, con la nueva designación de Anaplasma phagocytophila que incluye tanto Ehrlichia equi como la Ehrlichia del “agente HGE”. Los géneros Haemobartonella y Eperythrozoon se consideran en la actualidad más próximos a los micoplasmas. Las especies de Anaplasma se trasmiten mecánica o biológicamente por insectos vectores. Una revisión basada en un estudio cuidadoso de experimentos de transmisión presenta una lista de 14 garrapatas diferentes que han sido descritas como capaces de transmitir experimentalmente A. marginale (13). Éstas son: Argas persicus, Ornithodoros lahorensis, Boophilus annulatus, B. decoloratus, B. microplus, Dermacentor albipictus, D. andersoni, D. occidentalis, D. variabilis, Hyalomma excavatum, Ixodes ricinus, Rhipicephalus bursa, R. sanguineus and R. simus. Los autores concluyeron que algunos de estos resultados, como los de R. bursa, H. excavatum y O. lahorensis no son muy convincentes y que las garrapatas identificadas como A. persicus eran probablemente A. sanchezi o A. radiatus. Además, Rhipicephalus e. evertsi y Hyaloma m. rufipes se han descrito como vectores experimentales en Sudáfrica (28). La transmisión intra o interespecífica es común, incluso en las especies de Boophilus de un solo hospedador. Las garrapatas macho pueden ser particularmente importantes como vectores .La demostración experimental de la implicación de un vector no implica necesariamente que tenga un papel en la transmisión en condiciones de campo. Sin embargo, las especies de Boophilus son claramente vectores importantes de la anaplasmosis en países tales como Australia o Sudáfrica, y algunas especies de Dermacentor son vectores eficaces en los Estados Unidos de América (USA). Otros artrópodos picadores muy diversos se han considerado como vectores mecánicos, particularmente en USA. Se ha demostrado la transmisión experimental con ciertas especies de Tabanus (mosca del caballo) y con mosquitos del género Psorophora (30). La importancia de los insectos picadores en la transmisión natural de la anaplasmosis no está bien documentada y parece variar mucho de una región a otra. Anaplasma marginale puede transmitirse también con facilidad durante la vacunación contra otras enfermedades, a menos que se utilice una aguja nueva o esterilizada para inyectar a cada animal. Se ha descrito una transmisión similar por medio de instrumentos quirúrgicos no esterilizados. Los principales vectores de A. centrale parecen ser garrapatas de hospedadores múltiples, propias de África, como R. rimus. No se ha demostrado que la garrapata común de los bóvidos (B. microplus) sea un vector. Esto es importante porque A. centrale se utiliza como vacuna en regiones infestadas por B. microplus.

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B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Los síntomas clínicos más marcados de la anaplasmosis son anemia e ictericia, la última con aparición tardía en la enfermedad. No se presenta hemoglobinemia ni hemoglobinuria, lo que puede ayudar al diagnóstico diferencial entre anaplasmosis y babesiosis, que a menudo es endémica en las mismas regiones. No obstante, la enfermedad solo se puede confirmar por identificación del microorganismo causante.

1.

Identificación del agente

Las muestras obtenidas a partir de ganado vivo deben incluir frotis finos de sangre y sangre recogida con anticoagulante. Los frotis finos de sangre, secados con aire, se mantienen de modo satisfactorio a temperatura ambiente por lo menos 1 semana. Las muestras de sangre con coagulante deberían mantenerse a 4ºC a menos que se lleve al laboratorio en unas pocas horas. Esta muestra es útil para preparar frotis frescos si los anteriores no fueran satisfactorios. Además un cierto volumen pequeño de células y/o un recuento de eritrocitos puede ayudar a poner de manifiesto la implicación de Anaplasma cuando en los frotis se detecta solo un número pequeño de parásitos, como puede ocurrir en la fase de recuperación de la enfermedad. En contraste con Babesia bovis, Anaplasma no se acumula en los capilares, de modo que es apropiada la sangre de la yugular u otro gran vaso. Debido a la morfología poco diferencial de Anaplasma, es esencial que los frotis estén bien preparados y libres de substancias extrañas, pues las partículas de restos pueden confundir la el diagnóstico. Las extensiones gruesas de sangre, que se utilizan en el diagnóstico de la babesiosis, no son apropiadas para el diagnóstico de la anaplasmosis, porque Anaplasma es difícil de identificar una vez que se separa de los eritrocitos. Las muestras obtenidas de animales muertos deben ser frotis finos, secados al aire, del hígado, riñón, corazón y pulmones y de un vaso sanguíneo periférico. Éste último se recomienda, en particular, si hay un retraso notable antes del examen post-mortem porque, en tales circunstancias, la contaminación bacteriana en los frotis de los órganos puede conducir a una identificación equívoca de Anaplasma. Los frotis de cerebro, que son útiles en el diagnostico de algunas formas de babesiosis, no tienen valor directo en el diagnóstico de la anaplasmosis (14), aunque deberían incluirse para el diagnóstico diferencial cuando sea pertinente. Para la preparación de frotis se requiere la sangre de órganos, mejor que los tejidos de los órganos per se, porque el objetivo es ser capaz de examinar microscópicamente eritrocitos intactos para la presencia de Anaplasma. Los frotis derivados de sangre de órganos se mantienen satisfactoriamente durante varios días a temperatura ambiente (14). Los frotis de sangre y de los órganos se fijan 1 minuto con metanol absoluto y se tiñen con 10% de colorante de Giemsa durante 30 minutos. Después de la tinción, los frotis se lavan tres o cuatro veces con agua de grifo para eliminar el colorante adherido y luego se secan al aire. Los frotis se examinan con aceite de inmersión a un aumento de 700-1.000 x. En los frotis teñidos con Giemsa, A. marginale aparece como cuerpos densos, redondeados y muy coloreados dentro de los eritrocitos, de aproximadamente 0,3-1,0 µm de diámetro. La mayor parte de estos cuerpos se localizan en el margen del eritrocito o en su proximidad. Esta característica diferencia A. marginale de A. centrale, presentando en este último caso los microorganismos una localización más centrada en el eritrocito. En algunos países1, se dispone de colorantes comerciales para tinción rápida de Anaplasma. El porcentaje de eritrocitos infectados varía según la fase y la gravedad de la enfermedad. Con A. marginale pueden presentarse parasitemias máximas que superan el 50%. Durante los períodos de alta parasitemia, son comunes las infecciones múltiples de eritrocitos individuales. La infección se hace microscópicamente visible en 2-6 semanas después de la transmisión. Durante la enfermedad clínica, la parasitemia se duplica aproximadamente cada día hasta los 10 días, y luego decrece a una velocidad similar. Puede persistir durante algunas semanas una anemia muy fuerte después de que los parásitos lleguen a ser virtualmente indetectables en los frotis. Después de la recuperación de la infección inicial, la mayor parte del ganado permanece con infección latente durante el resto de su vida. Para detectar Anaplasma en frotis realizados post-mortem se puede utilizar la tinción con anticuerpos fluorescentes como una técnica alternativa. Johnston et al. (14) han descrito un procedimiento de inmunofluorescencia directa para el diagnóstico post-mortem de anaplasmosis. Aunque parece ser más sensible que la tinción con Giemsa, la fluorescencia inespecífica es un problema importante.

1

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Los colorantes rápidos incluyen Camco-Quick y Diff-Quick, Baxter Scientific Products, McGaw Park, Illinois, USA y Hema 3 y Hema-Quick, Curtin-Matheson, Houston, Texas, USA.

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Un procedimiento costoso, pero en ocasiones justificable para confirmar la infección, particularmente en ganado con infección latente, consiste en inocular sangre del animal sospechoso en un ternero esplenectomizado (sin bazo). Se inocula intravenosamente una cantidad (hasta 500 ml) de la sangre del donador con anticoagulante en el ternero esplenectomizado, y luego se examinan frotis de sangre al menos cada 2-3 días. Si el donador está infectado, se observará Anaplasma en los frotis del ternero esplenectomizado, por lo general, en 4 semanas, aunque este período puede prolongarse a 8 semanas. Las pruebas basadas en los ácidos nucléicos para detectar A. marginale en ganado portador son de desarrollo reciente (8, 9, 11, 12, 33). Se ha descrito una sonda radiactiva de ARN que detectó parasitemias tan bajas como 0,000025% (8). Las garrapatas infectadas también se han identificado utilizando una sonda para ADN clonado (13). La sensibilidad analítica de métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha estimado en 0,0001% de eritrocitos infectados, pero a este nivel solo se detectaría una parte del ganado portador (9, 11). Recientemente se ha utilizado una técnica PCR combinada que es sensible y potencialmente específica para identificar ganado portador de A. marginale (33). Esta técnica es capaz de identificar niveles de menos de 30 eritrocitos infectados por ml de sangre, lo que equivale a una parasitemia de aproximadamente 0,000001%, que está bien por debajo de los niveles más bajos en los portadores (33). No obstante, la PCR combinada plantea serios problemas de control de calidad para un uso rutinario (33). Los laboratorios que emplean esta prueba deberían reconocer los problemas de especificidad debidos a amplificación inespecífica. Un paso adicional, como el análisis con enzimas de restricción, la hibridación tipo Southern, o la secuenciación, puede confirmar la especificidad de lo que resulte amplificado. Por lo general, excepto con animales que han sido tratados o se encuentran en una fase muy inicial de la infección ( 30%. •

Interpretación de los resultados

El porcentaje de inhibición se calcula del siguiente modo: 100 – OD de la muestra x 100/ OD media del control negativo = Porcentaje de inhibición. Las muestras con 30% de inhibición son positivas.

b)

Prueba de aglutinación en placa La ventaja de la CAT es que es una técnica sensible, que puede realizarse en el laboratorio o en el campo, y que proporciona el resultado en unos pocos minutos. Las reacciones inespecíficas pueden ser un problema. El antígeno para CAT es una suspensión de partículas de A. marginale. Se infectan terneros esplenectomizados por inoculación intravenosa con sangre que contenga eritrocitos infectados por Anaplasma. Cuando la parasitemia excede 50%, el animal se sangra, los eritrocitos infectados se lavan, se lisan, y las membranas de los eritrocitos y las partículas de Anaplasma se centrifugan. Los sedimentos se sonican, se lavan, y luego se resuspenden en una solución de colorante para producir la solución de antígeno.

2

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VMRD, Inc., 4641 Pullman_Albion Rd., P.O. Box 502, Pullman, Washington 99163, USA. Tel.: (1.509) 334.58.15; Fax: (1.509) 332.53.56; http://www.vmrd.com

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Un procedimiento con ligeras modificaciones del descrito originalmente (1,2) es el siguiente: i)

Comprobar antes de su uso que todos los componentes de la prueba están a una temperatura de 2526ºC (esta temperatura constante es un factor crítico en la prueba).

ii)

En cada círculo de la placa de ensayo (un plástico claro tipo perspex o una placa de cristal con círculos marcados de 18 mm de diámetro), colocar juntos, pero sin tocarse, 10 µl de factor de suero bovino (BSF), 10 µl del suero de ensayo, y 5 µl del antígeno CAT3. En cada placa se deben probar sueros negativos y débilmente positivos.

iii)

BSF es suero de un animal seleccionado con un alto nivel de conglutinina. Si se desconoce el nivel de conglutininas, se puede utilizar suero fresco de un animal que esté libre de Anaplasma. La raza Jersey es adecuada, habitualmente. El BSF se debe guardar a –70ºC en pequeñas alícuotas, y cada vez que se realizan las pruebas se utiliza una alícuota fresca. La inclusión de BSF mejora la sensibilidad de la prueba. Mezclar bien con una varilla de vidrio. Después de mezclar cada prueba, limpiar la varilla de vidrio con un papel limpio para evitar la contaminación cruzada.

c)

iv)

Colocar la placa de prueba en una cámara húmeda y agitar a 100-110 rpm durante 7 minutos.

v)

Leer inmediatamente contra una luz. Una aglutinación característica del antígeno (valorada de +1 a +3) se considera un resultado positivo. Se considera que la prueba da un resultado negativo cuando no existe esa aglutinación característica.

Prueba de fijación de complemento Se han publicado manuales detallados para realizar tanto la versión estándar (34) como la versión en microtítulo (35) de la prueba FC para anaplasmosis. Aunque la prueba de FC se ha empleado ampliamente durante muchos años usando ambas técnicas, datos recientes confirman que carece de sensibilidad y falla en la detección de una proporción importante de ganado portador (3). Por consiguiente, la prueba FC no puede ser recomendada como ensayo fiable para detectar animales infectados.

d)

Enzimoinmunoensayo indirecto Se ha encontrado un método I-ELISA, basado en el uso de un antígeno normal de eritrocitos (antígeno negativo) y de un antígeno de eritrocitos infectados por A. marginale (antígeno positivo), que es fiable para la detección de sueros positivos frente a A. marginale (7). Aunque más lento que las pruebas que utilizan un solo antígeno, esta prueba elimina los sueros con niveles de actividad inespecífica debidos a los isoanticuerpos para los componentes de los eritrocitos normales. La prueba identificó correctamente los 100 sueros positivos conocidos tomados de ganado bovino hasta después de 3 años de la infección, mientras que el 3% de sueros negativos, el 2% de sueros de Babesia bovis y el 4% de sueros de B. bigemina dieron falsos resultados positivos. La prueba con los dos antígenos se realiza como se indica. •

Antígeno negativo

La sangre de un ternero esplenectomizado se recoge en etilén diamino tetra-acético sódico (EDTA). Las células se lavan tres veces son solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugan 10 minutos a 5.000 g a 5ºC. Después de la centrifugación, se extraen los glóbulos blancos diluyendo las células diez veces en PBS y pasándolas a través de una columna de celulosa Whatman CFI1. Después de otra centrifugación, se diluye un volumen de las células en dos volúmenes de PBS y se guardan en alícuotas de 2.5 ml en la fase de vapor de nitrógeno líquido. Cuando se necesita, se descongela una alícuota a temperatura ambiente y se sonica 30 segundos a 100 W con una pequeña sonda a 0ºC. El producto sonicado se diluye luego, según se necesite, para utilizar en la prueba ELISA. •

Antígeno positivo

Un ternero que se ha utilizado previamente para producir antígeno negativo se infecta con A. marginale por inoculación sanguínea. Cuando la parasitemia alcanza el 80-85%, se toman 500-1.000 ml de sangre, se procesan y se almacenan como se ha descrito antes. Cuando se necesitan, se sonican alícuotas, como antes, y se diluyen convenientemente.

3

En EE.UU. y México la prueba se realiza con volúmenes mayores de reactivos: antígeno (15 µl), suero (30 µl), y factor de suero bovino (30 µl) en un tiempo de reacción de 4 minutos (ver paso iv).

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•

Procedimiento de la prueba

Se utilizan placas de micro-ELISA, con 96 pocillos, de fondo plano. Con cada lote nuevo de antígeno se realizan las titulaciones estándar del antígeno, tanto positivo como negativo, por el sistema del tablero de ajedrez, para determinar el rango de trabajo, que normalmente es 1/400 (150-200 µg de proteína/ml). A cada pocillo de la placa se añade el antígeno diluido (200 µl) , una mitad de la placa con antígeno positivo, y la otra mitad con antígeno negativo. Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban toda la noche a 4ºC. Después de la incubación, se extrae la solución de antígeno y las placas se lavan tres veces con PBS que contenga 0.1% de Tween 20 (PBST), y luego se bloquean con una solución de suero normal de caballo al 1% en PBS durante 60 minutos a 37ºC. Después dell bloqueo, las placas se lavan cinco veces con PBST antes de añadir 200 µl de los sueros de prueba. (Los sueros de prueba se diluyen de 1/400 a 1/800 con PBST que contenga 1% de suero de caballo). Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37ºC. Luego se lavan los pocillos cinco veces con PBST y se añaden 200 µl del segundo anticuerpo conjugado (IgG anti-bovina obtenida de cabra conjugada con peroxidasa de rábano), a una dilución 1/400 en PBS con 1% de suero de caballo. Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37ºC. Después de la incubación, se extrae el conjugado y los pocillos se lavan cinco veces con PBS antes de la adición de 200 µl de substrato, de preparación reciente. El substrato se prepara así; se disuelve ácido 5-amino salicílico recristalizado a concentración de 1 mg/ml en tampón fosfato, pH 6.8, a 32ºC; por cada ml de solución se añaden luego 2 µl de peróxido de hidrógeno al 30%. Después de la adición del substrato se cierran las placas y se agitan suavemente 30 minutos a 22ºC. A continuación, inmediatamente, se leen las placas a 492 nm con un lector de placas. La columna uno de cada placa se usa siempre como blanco. Para cada muestra las lecturas netas se calculan restando el resultado del antígeno negativo del resultado del antígeno positivo. En cada lote de ensayos, se prueba rutinariamente un grupo de 20 sueros negativos y un suero estándar positivo para A. marginale. Se calcula un “umbral” como la lectura de la absorbancia neta media (más dos desviaciones estándar) de los 20 sueros negativos estándar. La relación de todas las otras absorbancias netas se determina usando como unidad el “umbral”. El suero positivo se utiliza para determinar que cada lote de prueba se realiza con normalidad.

e)

Enzimoinmunoensayo de punto Comparado con I-ELISA, la prueba ELISA de punto tiene las ventajas potenciales de ser rápida, barata, y sencilla de realizar. Se ha descrito que el método de ELISA de punto descrito a continuación presenta una sensibilidad del 93% y una especificidad del 96% (21). •

Preparación del antígeno

i)

Recoger sangre con parasitemia elevada en EDTA.

ii)

Eliminar el plasma y lavar los eritrocitos con tampón glicina 0,1 M, pH 3,0.

iii)

Lavar los eritrocitos con PBS, pH 7,4, en presencia de inhibidores de proteasas (tetrationato sódico 3,5 mM) y 0,01% de timerosal.

iv)

Eliminar la capa de leucocitos después de cada lavado.

v)

Resuspender los eritrocitos en PBS a dilución 1/5, sonicar, someter a tres ciclos de congelación y descongelación, y volver a sonicar el lisado.

vi)

Mezclar el material con un volumen igual de Nonidet P-40 en PBS, e incubar 3 minutos a 25ºC.

vii)

Recoger los cuerpos de Anaplasma por centrifugación diferencial.

viii) Lavar el precipitado tres veces con tampón frío (cloruro de colina 155 mM, HEPES [N-2hidroxietilpiperazina, ácido N-2-etanesulfónico] 5 mM, pH 7,4). ix)

Resuspender el precipitado en PBS y medir la concentración de proteína. Depositar el antígeno (1,0 µl/disco; 25 µg de proteína/ml) sobre discos (de 6 mm de diámetro) de nitrocelulosa cortados con una taladradora de papel. Secar al aire los discos recubiertos con el antígeno. En estos discos el antígeno permanece estable durante más de 2 años si se mantienen a 20ºC o a 4ºC, y por al menos 3 meses cuando se conservan a 25ºC.

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

•

Procedimiento de la prueba

i)

Colocar los discos con el antígeno en pocillos con el fondo plano de placas de microtitulación.

ii)

Todos los procedimientos se realizan a 25ºC y utilizando reacciones de 200 µl de volumen.

iii)

Incluir sueros positivos y negativos conocidos y controles de antígeno.

iv)

Para el bloqueo, añadir PBS que contenga 0,5% de Tween 20 a cada pocillo, incubando luego 15 minutos.

v)

Probar los sueros a una concentración inicial de 1/200 en PBS que contenga 0,05% de Tween 20, e incubar 1 hora.

vi)

Lavar tres veces, 10 minutos cada vez, con PBS que contenga 0,1% de Tween 20.

vii)

Añadir el conjugado de fosfatasa alcalina/ proteína A, diluido 1/500 en PBS que contenga 0,5% de Tween 80, e incubar los pocillos 30 minutos, lavando después como antes, excepto que el último lavado se hace con PBS solo.

viii) Añadir nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-indoxil fosfato en tampón Tris 0,1 M, pH 9,5, y permitir que el color aparezca por 10-20 minutos. ix)

f)

La aparición de un punto de color púrpura, de intensidad variable, indica una reacción positiva; no se ve color en los discos con reacciones negativas.

Prueba de inmunofluoresencia indirecta con anticuerpo Debido al número limitado de pruebas de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (IFI) que puede realizar diariamente un operador, se suelen preferir otras pruebas serológicas. La prueba IFI se realiza como se describe para la babesiosis bovina en el Capítulo 2.3.8., excepto que para la preparación de frotis de antígeno se utiliza sangre infectada por A. marginale. Un problema serio de esta prueba es la fluorescencia inespecífica. Es muy probable que el antígeno obtenido de sangre recogida tan pronto como aparezca una parasitemia adecuada (5-10%) resulte idóneo. La fluorescencia inespecífica debida a anticuerpos que se adhieren a eritrocitos infectados puede reducirse lavando los eritrocitos en un tampón glicina ácido antes de que se preparen los frotis de antígeno (22). Los eritrocitos infectados se lavan dos veces en tampón glicina 0.1 M (pH 3,0, centrifugado a 1.000 g por 15 minutos a 4ºC) y luego una vez en PBS, pH 7,4.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Se han utilizado varios procedimientos de inmunización para proteger al ganado bovino contra la anaplasmosis en países donde la enfermedad es endémica, pero ninguno es ideal (19). El uso de la especie menos patógena A. centrale, que proporciona una protección parcial cruzada frente a A. marginale, es el método aceptado más ampliamente, aunque no se utiliza en América del Norte. Otro método implica el uso de una cepa de A. marginale atenuada por pases en hospedadores no bovinos, como el ciervo o la oveja (32). En esta sección, se describe la producción de vacuna viva de A. centrale. Incluye la infección de un ternero esplenectomizado susceptible y el uso de su sangre como vacuna. Existen descripciones detalladas del procedimiento de producción y se debe hacer referencia a estas publicaciones para detalles de los procedimientos que se resumen aquí (4, 10,25). Las directrices para la producción de vacunas se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de la producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7. intentan ser de naturaleza general y pueden completarse con requisitos nacionales y regionales. La vacuna para Anaplasma centrale puede suministrarse en forma congelada o refrigerada dependiendo de la demanda, redes de transporte y la disponibilidad de servicios de nitrógeno líquido o de hielo seco. En la mayor parte de los casos se recomienda la vacuna congelada, ya que permite un control de calidad de cada lote después de la producción. Sin embargo, es más costosa de producir y más difícil de transportar que la vacuna refrigerada. El riesgo de contaminación hace que el control después de la producción sea esencial, pero puede ser prohibitivamente costoso.

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Capítulo 2.3.7. — Anaplasmosis bovina

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Anaplasma centrale se aisló por primera vez en 1911 en Sudáfrica y se ha utilizado como vacuna en Sudamérica, Australia, África, Oriente Medio, y Sudeste Asiático. Solo suministra protección parcial, pero adecuada, en regiones donde las cepas que provocan la enfermedad son de una virulencia moderada (como Australia) (10). En los trópicos húmedos, donde A. marginale parece ser un parásito muy virulento, la protección suministrada por A. centrale puede ser inadecuada para evitar la enfermedad en algunos animales. Normalmente, Anaplasma centrale causa infecciones benignas, especialmente en terneros menores de 9 meses de edad. Se han descrito reacciones graves después de la vacunación cuando se inocula ganado adulto. El pase rápido de A. centrale por terneros esplenectomizados parece reducir su virulencia (10).

b)

Preparación y conservación de los estabilizados El material infeccioso se conserva fácilmente en nitrógeno líquido o en hielo seco como estabilizados congelados de la sangre infectada. El crioconservante recomendado es dimetil sulfóxido (DMSO), ya que permite la administración intravenosa del estabilizado después de la descongelación. En otra parte (10) se describe con detalle la técnica de congelación pero, en resumen, se basa en lo siguiente: se recoge sangre infectada, se enfría a 4ºC, y se añade, lentamente y con agitación, crioconservante frío (4 M DMSO en PBS) en una proporción final sangre/conservante de 1:1, para dar una concentración final 2 M de DMSO. Todo el proceso de dilución se realiza en un baño de hielo y la sangre diluida se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml), que se congelan tan pronto como sea posible en la fase de vapor de un contenedor de nitrógeno líquido.

c)

Validación como vacuna La idoneidad de un aislamiento de A. centrale como vacuna se determina inoculando ganado susceptible, observando las reacciones posteriores, y estimulando luego a los animales y a controles susceptibles con una cepa virulenta local de A. marginale. Tanto la seguridad como la eficacia se pueden estimar observando las parasitemias en extensiones de sangre teñida y el descenso volumétrico de células empaquetadas de ganado vacuno durante la vacunación y durante los períodos de reacción estimulante. Se puede determinar la pureza del aislamiento, para posibles contaminantes presentes, mediante un estudio serológico de sueros en parejas del ganado bovino utilizado en la prueba de seguridad (26).

2.

Método de fabricación

a)

Producción de vacuna congelada Se descongelan las cantidades del estabilizado congelado (5-10 ml) por inmersión de los viales en agua precalentada a 40ºC. El material descongelado se mantiene en hielo y se usa tan pronto como sea posible (en 30 minutos) para infectar un ternero susceptible esplenectomizado por inoculación intravenosa. La parasitemia del ternero donante de analiza diariamente examinando extensiones de sangre teñida de la yugular, y se recoge la sangre para producción de la vacuna cuando se alcanza una parasitemia adecuada. El mínimo requerido para producción de la vacuna es una parasitemia de 1 x 108/ml (aproximadamente 2% de parasitemia en la sangre de la yugular). Si no se obtiene una parasitemia adecuada, puede ser necesario realizar un pase de la cepa mediante subinoculación de 100-200 ml de sangre a un segundo ternero esplenectomizado. La sangre del donante se recoge mediante canulación aséptica de la yugular o la carótida, utilizando heparina como anticoagulante (5 Unidades Internacionales [UI] de heparina/ml de sangre). En el laboratorio, la sangre parasitada se mezcla a 37ºC con un mismo volumen de glicerol 3M en PBS, suplementado con 5mM de glucosa (concentración final de glicerol 1,5 M). La mezcla se equilibra a 37ºC durante 30 minutos y se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml). Los viales se enfrían en la fase de vapor de nitrógeno líquido a una velocidad aproximada de 10ºC/minuto y, cuando están congelados, se guardan en la fase líquida (5). En lugar de glicerol se puede utilizar DMSO como crioconservante. En este caso se lleva a cabo del mismo modo que para la preparación del estabilizado (20,24).

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Si se tiene que diluir la vacuna preparada en glicerol, el diluyente debe ser PBS con 1.5 M de glicerol y 5 mM de glucosa (15). Las vacunas crioconservadas con DMSO deben diluirse con diluyente que contenga la misma concentración de DMSO que la sangre original crioconservada (27).

b)

Producción de vacuna refrigerada El material infeccioso para vacunas refrigeradas se preparara como para las vacunas congeladas, pero debe ser procesado y utilizado tan pronto como sea posible después de su recogida. La sangre infecciosa 7 se puede diluir para lograr 1 x 10 parásitos por dosis de vacuna. Un diluyente adecuado es 10% de suero bovino estéril en una solución de glucosa/solución salina equilibrada que contenga las siguientes cantidades por litro: NaCl (7,00 g), MgCl2.6H2O (0,34 g), glucosa (1,00 g), Na2HPO4 (2,52 g), KH2PO4 (0,90 g), y NaHCO3 (0,52 g). Si no se dispone de diluyente, se debería utilizar como anticoagulante dextrosa citrato ácido (20% [v/v]) o dextrosa citrato fosfato (20% [v/v]) para suministrar la glucosa necesaria para la supervivencia de los organismos.

c)

Utilización de la vacuna En el caso de las vacunas congeladas, los viales se descongelan por inmersión en agua precalentada a 40ºC, y el contenido se mezcla con un diluyente adecuado hasta la dilución requerida. Si se preparan vacunas con glicerol, deben mantenerse frías y utilizarlas en un tiempo de 8 horas después de la preparación (5). Si se utiliza DMSO como crioconservante, las vacunas preparadas deben mantenerse en hielo y utilizarse en 15-30 minutos (24). El modo más común de administración de la vacuna es por vía subcutánea. Las vacunas refrigeradas se deben mantener en frío y utilizarse dentro de los 6 días siguientes a su preparación. La cepa de A. centrale que se usa en las vacunas es de virulencia reducida, pero no es por completo segura. En consecuencia, un consejo práctico es limitar el uso de las vacunas a terneros, en los que la inmunidad inespecífica reducirá el riesgo de reacciones debidas a la vacunación. Cuando se tienen que vacunar animales de mayor edad, existe el riesgo de reacciones graves. Estas reacciones no son frecuentes, pero la presencia de animales de reproducción valiosos o en estado de gravidez merece atención, y deberían observarse los animales entre las 4 y 6 semanas después de la vacunación. Los animales clínicamente enfermos deben tratarse con tetraciclina o imidocarb a dosis recomendadas por los fabricantes. La inmunidad de protección se desarrolla en 6-8 semanas y por lo general persiste varios años. A menudo se utilizan en paralelo las vacunas contra la anaplasmosis y la babesiosis, pero no es recomendable utilizar simultáneamente otras vacunas.

3.

Control interno

a)

Origen y mantenimiento de los donantes de vacuna Debe identificarse una fuente de terneros exentos de infección natural por Anaplasma y de otras enfermedades transmitidas por garrapatas. Si no se dispone de ellos, puede ser necesario criar los terneros bajo condiciones libres de garrapatas con el propósito específico de producción de vacunas. Los terneros deben mantenerse en condiciones que eviten su exposición a enfermedades infecciosas y a garrapatas e insectos picadores. En ausencia de servicios adecuados, debe valorarse el riesgo de contaminación con agentes de enfermedades infecciosas que estén presentes en el país concreto, y se deben comparar los beneficios derivados de la producción local de vacunas frente a las posibles consecuencias adversas de difundir enfermedades (10).

b)

Cirugía Para permitir el máximo rendimiento de obtención de organismos para producción de vacunas, los terneros donantes deben ser esplenectomizados. Esto se lleva a cabo con preferencia en terneros jóvenes con anestesia general. Los detalles de esta técnica, incluyendo los procedimientos pre- y post-operatorios, se describen en otra parte (10).

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c)

Selección de donantes para vacunas antes de la inoculación Los terneros donantes deben examinarse en cuanto a todas las infecciones sanguíneas que sean prevalentes en el país productor de la vacuna, incluyendo Babesia, Anaplasma, Cowdria, Theileria y Trypanosoma. Esto se lleva a cabo mediante examen rutinario de extensiones de sangre teñidas después de la esplenectomía, y preferiblemente también por serología. Cualquier ternero que muestre evidencias de infecciones naturales debe ser rechazado. También debe confirmarse la ausencia de otros agentes infecciosos. Estos pueden incluir a los agentes de la leucosis enzoótica bovina, enfermedad de las mucosas, rinotraqueitis bovina infecciosa, fiebre efímera, enfermedad de Akabane, lengua azul, glosopeda o fiebre aftosa y peste bovina. Las pruebas dependerán de las enfermedades prevalentes en el país y de la disponibilidad de ensayos, pero en último término deberían contemplar la serología de sueros pareados y, en algunos casos, el aislamiento del agente (5, 24, 26).

d)

Observación de parasitemias después de la inoculación Es necesario determinar la concentración de parásitos en la sangre recogida para vacunas. Existen técnicas cuidadosas para determinar el contaje de los parásitos (10), pero, en ausencia de éstas, la concentración de parásitos se puede calcular a partir del contaje de eritrocitos y de la parasitemia (porcentaje de eritrocitos infectados).

e)

Recolección de sangre para vacunas Antes del uso, debe esterilizarse todo el equipo (por ejemplo, en autoclave). Una vez alcanzada la parasitemia deseada, la sangre se recoge con heparina utilizando técnicas asépticas estrictas. Esto se realiza más fácilmente si se seda al ternero y se usa un circuito cerrado de recolección. Se pueden extraer hasta 3 litros de sangre con niveles de infección elevados de un ternero de 6 meses. Si el ternero va a permanecer vivo, es adecuada la transfusión de una cantidad similar de sangre de un donante apropiado. Alternativamente, el ternero debe ser sacrificado inmediatamente después de la extracción de la sangre.

f)

Distribución de las vacunas Todo el proceso se realiza en un ambiente apropiado, como en una cabina de flujo laminar, utilizando técnicas estériles estándar. El uso de un agitador mecánico o magnético asegura una buena mezcla de la sangre y del diluyente a través de todo el proceso de distribución.

4.

Control de lotes

En el caso de las vacunas refrigeradas, la potencia, seguridad y esterilidad de los lotes de vacuna no se puede determinar, y para las vacunas congeladas las especificaciones dependen del país concreto. Las siguientes indicaciones se aplican a las vacunas congeladas producidas en Australia.

a)

Esterilidad y ausencia de contaminantes Para cada lote de vacuna y diluyente se emplean técnicas estándar de esterilidad (ver Capítulo I.1.5). La ausencia de contaminantes se confirma inoculando ganado y observándolo serológicamente en cuanto a agentes infecciosos que potencialmente podrían contaminar la vacuna. El ganado inoculado durante la prueba de potencia (ver sección C.4.c) es adecuado para este fin. Dependiendo del país de origen de la vacuna, estos agentes incluyen los microorganismos que causan la leucosis enzoótica bovina, rinotraqueitis bovina infecciosa, enfermedad de las mucosas, fiebre efímera, enfermedad de Akabane, virus Aino, lengua azul, parainfluenza, glosopeda o fiebre aftosa, enfermedad nodular, rabia, fiebre del Valle del Rift, peste bovina, pleuroneumonía bovina contagiosa, enfermedad de Jembrana, cowdriosis, especies patógenas de Theileria y Trypanosoma, Brucella abortus, Coxiella y Leptospira (5).

b)

Seguridad Las reacciones vacunales del ganado inoculado en la prueba de potencia (ver sección C.4.c) se observan mediante la medición de la parasitemia y el descenso volumétrico en células empaquetadas. Solo se ponen en circulación para uso los lotes con niveles de patogenicidad iguales o inferiores a un estándar predeterminado.

c)

Potencia La vacuna se descongela y se diluye 1/50 con un diluyente adecuado (15). La vacuna diluida se incuba luego 8 horas a 30ºC, y se inoculan subcutáneamente cinco cabezas de ganado con dosis de 2 ml. Los

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animales inoculados se observan para presencia de infecciones examinando frotis de sangre, teñidos. Para que un lote sea aceptable todos deberían estar infectados. Un lote que sea infeccioso al 1/50 se recomienda para uso a una dilución 1/5 con diluyente isotónico.

d)

Duración de la inmunidad Después de una inoculación se logra inmunidad parcial, pero duradera. No existe evidencia de que la vacunación repetida tenga un efecto estimulante.

e)

Estabilidad Cuando se almacena en nitrógeno líquido, la vacuna se puede mantener durante 5 años. Una vez que se descongela, pierde rápidamente su potencia. La vacuna descongelada no puede congelarse de nuevo.

f)

Conservantes No se añaden conservantes. En la fase de distribución, se añade a la vacuna penicilina (500.000 UI/litro) y estreptomicina (370.000 UI/litro).

g)

Precauciones (riesgos) La vacuna no es infecciosa para humanos. Cuando el producto se almacena en nitrógeno líquido, se aplican las precauciones normales en cuanto a conservación, transporte y manejo del material ultracongelado.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Ver Sección C.4.b

b)

Potencia Ver Sección C.4.c

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