CARACTERIZACIÓN INMUNOLÓGICA DE PROTEÍNAS DE PARED CELULAR EN DIFERENTES AISLADOS DE Candida Ana Lidia Cabrera Rodríguez1, Julio César Villagómez-Castro2 1

DCNyE, Universidad de Guanajuato; [email protected]. 2Departamento de Biología, DCNyE, Universidad de Guanajuato; [email protected]

RESUMEN En México la mayoría de las micosis oportunistas son ocasionadas por Candida albicans (72 - 77%) y otras especies denominadas Candida no Candida albicans, las cuales presentan diferencias en su sensibilidad a antifúngicos y problemas para su diagnóstico. Este comportamiento ha hecho necesaria la búsqueda de nuevos métodos diagnósticos para las diferentes especies de Candida. En este trabajo proponemos la diferenciación inmunológica de las diferentes especies utilizando como antígenos a proteínas de la pared celular de estas levaduras. Se emplearon cuatro cepas diferentes de Candida en las que se observó un patrón diferencial en cuanto a sus proteínas de pared celular, desafortunadamente este patrón diferencial no se reflejó en su inmunoreactividad, ya que los anticuerpos obtenidos contra una especie presentan reacción cruzada con proteínas de otra especie. Este resultado sugiere que es necesario purificar primero las proteínas diferenciales del hongo para utilizarlas como blanco de los anticuerpos y su diagnóstico diferencial. PALABRAS CLAVES Proteínas antigénicas, C. albicans, C. glabrata, C. kruzei, C. parapsilosis INTRODUCCIÓN Los hongos del genero Candida son un grupo de levaduras sumamente ubicuas y con características muy diversas, destacando su comportamiento como agentes etiológicos de micosis oportunistas (candidosis) por excelencia, pues de las 160 especies descritas en éste género se considera a 118 de ellas como patógenas [1]. En México se ha reportado la incidencia de candidosis en el rango de cien mil a cuatrocientos mil casos anuales, con una prevalencia mayor en las infecciones debidas a Candida albicans (72 - 77%) con respecto a otras especies denominadas especies NCAC (nonCandida albicans Candida species, por sus siglas en inglés), tales como Candida glabrata (11-13%), Candida parapsilosis (8%) y Candida tropicalis (11%) [2]. A pesar de que C. albicans es la especie aislada con mayor frecuencia a partir de muestras clínicas, en los últimos años se han informado la emergencia de las especies NCAC como agentes infecciosos. Aunque las razones de esta emergencia no están totalmente definidas, se ha sugerido que un factor importante podría ser su carencia relativa de sensibilidad a fluconazol y otros azoles administrados corrientemente para el tratamiento de infecciones fúngicas. No todas las cepas de una misma especie presentan igual sensibilidad a los mismos medicamentos antifúngicos, ni igual capacidad patógena, sin embargo, tanto C. albicans como algunas de las especies NCAC son capaces de formar biofilmes que les permiten incrementar su resistencia a los antifúngicos y ante el sistema de defensa inmunológica del hospedero. Asimismo, estos biofilmes les confieren la habilidad de adherirse casi a cualquier material, lo que les ha dado el primer lugar como causa primaría de mortalidad en pacientes inmunocomprometidos y hospitalizados a largo plazo [3]. Dado que muchas de las especies de Candida clínicamente relevantes presentan colonias amorfas en agar y carecen de características sexuales (principales características morfológicas en que se basa la clasificación de los hongos), la taxonomía de este grupo heterogéneo de levaduras con base a sus características morfológicas es subjetiva. Como en otros ámbitos de la microbiología, también en la micología se han establecido métodos modernos de diagnóstico utilizando la biología molecular, sin embargo, aún son muy costosos para llevarse a cabo de manera rutinaria tanto en laboratorios clínicos independientes como en hospitales. Actualmente el diagnóstico micológico se lleva a cabo utilizando principalmente agares cromogénicos específicos como el ChromAgar Candida® (Becton-Dickson), que permiten la diferenciación rápida de especies de C. albicans y NCAC. No obstante la ventaja que representan estos medios cromogénicos para el diagnóstico, aún es necesario confirmar la especie utilizando

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métodos bioquímicos. Un proceso que permite un diagnóstico efectivo es el uso de marcadores inmunológicos específicos de especie [4]. En este trabajo se pretende iniciar la búsqueda de marcadores antigénicos específicos de diferentes especies de Candida con el fin de en un futuro desarrollar un método de diagnóstico inmunológico para C. albicans y especies NCAC. Para ello, en este trabajo se presenta un análisis en la respuesta inmune a proteínas de la pared celular de distintos aislados clínicos de Candida. MATERIALES Y MÉTODOS Cepas y condiciones de cultivo. Se utilizaron 4 aislados clínicos caracterizados bioquímica y molecularmente como C. albicans, C. glabrata, C. kruzei, C. parapsilosis donados por la Dra. Mayra Cuéllar-Cruz. Las cepas se cultivaron en medio YPD, pH 6.5, durante 24 horas a 28°C en un baño metabólico con agitación (150 rpm) con un inóculo de 1,000,000 blastoconidias por ml. Cosecha de levaduras. Al término de la incubación, se recuperó el medio de cultivo y se separaron las levaduras por centrifugación a 4ºC durante 5 minutos a 3000 rpm en el rotor JA-10 utilizando una centrifuga Beckman J2-21. Las pastillas celulares se recuperaron y lavaron cuatro veces, por centrifugación, con agua desionizada estéril fría y se colocaron sobre hielo en una botella del homogenizador Braun conteniendo perlas de vidrio de 0.5 mm de diámetro.. Extracción de proteínas de la pared celular. Las levaduras recuperadas se adicionaron del inhibidor de proteasas PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro) a concentración de 1 mM y se sometieron a 6 ciclos de rompimiento balístico (medio minuto cada uno), intercalados por ciclos de reposo (1 minuto cada uno) en una corriente de CO2 para evitar el calentamiento de la muestra. Al final del proceso se recuperó el homogenado celular y se centrifugo a 500 x g durante 5 minutos para eliminar las células que no se rompieron. El resto del homogenado celular se lavó por centrifugación a 2500 x g a 4ºC durante 10 minutos con agua desionizada estéril fría adicionada de PMSF (1 mM final). Al término de la centrifugación, el sobrenadante se descartó y el residuo (paredes celulares) se lavó hasta que el sobrenadante de la centrifugación quedó transparente (6-9 lavados). Las paredes celulares lavadas se resuspendieron en un volumen conocido de agua desionizada y en una alícuota se determinó proteína por el método de Lowry, para finalmente ajustar la concentración de proteína de las paredes celulares lavadas a 2 mg/ml. Protocolo de inmunización. Se utilizaron 4 conejos de la raza Nueva Zelanda de 1 kg de peso, uno para cada cepa de Candida. Previo a la inmunización se recuperó suero pre-inmune (10 ml sangre total obtenida de la oreja) de cada conejo. La inmunización se llevo a cabo mediante la inoculación de 1 mg de proteína resuspendida en 1 ml de solución preparada con adjuvante de Freund completo (primera inoculación) e incompleto (resto de las inmunizaciones). Se realizaron 5 inmunizaciones (1 cada 4 días) y, 4 días después de la última se recuperó el suero inmune por sangría total de cada conejo. La sangre se dejo coagular a 37ºC durante 30 minutos y se centrifugó para separar el suero que se almacenó en alícuotas a -20ºC. Titulación del suero. El título de anticuerpos se determinó por el método de ELISA utilizando como control el suero pre-inmune. Se colocó en la placa de ELISA 20 mg del antígeno (proteína de pared celular) y se dejó en incubación toda la noche. Se lavó el exceso de antígeno y se bloqueo cada pozo con caseína al 1% p/v en amortiguador de fosfatos (PBS). Se lavaron los pozos y se les adicionaron diferentes diluciones del suero a probar, se dejaron en incubación durante 1 hora y se lavo el exceso de suero. Se adicionó el segundo anticuerpo (chivo anticonejo acoplado a peroxidasa) a una dilución 1:2000 y se incubó durante 1 hora. Se lavó el exceso de anticuerpo y se realizó la determinación de actividad de peroxidasa con el reactivo ABTS. Se leyó la absorbencia en un lector de ELISA utilizando una longitud de onda de 700 nm para determinar el título del anticuerpo. Electroforesis e inmunodetección en membrana de nitrocelulosa. Se cargaron diferentes cantidades de los antígenos (paredes celulares de los aislados de Candida) en los pozos de geles de poliacrilamida al 10% preparados en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Se aplicó la corriente eléctrica y al final de la electroforesis se tiñeron los geles con azul de Coomassie o con tinción de plata para revelar las bandas de proteínas y, finalmente, se fotografiaron. Otros geles se utilizaron para la inmunodetección en membranas de nitrocelulosa, colocándolos al término de la electroforesis en una cámara de electrotransferencia y se transfirieron a 30 V durante toda la noche. Al término de la transferencia, las membranas se tiñeron con rojo de Ponceau al 1% p/v para verificar la transferencia, se destiñeron y bloquearon con caseína al 3% en PBS durante toda la noche. Las membranas se lavaron con PBS-Tween y se incubaron durante 2 horas con los sueros correspondientes; posteriormente se lavaron con PBS-Tween y se incubaron con el segundo

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anticuerpo (chivo anticonejo acoplado a peroxidasa) durante 1 hora. Se lavó el exceso de anticuerpo y se realizó la reacción enzimática de revelado de peroxidasa utilizando 3,3-diaminobencidina (1 mg/ml en PBS) y H2O2. La reacción se paró por dilución en agua y se fotografiaron las membranas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Mediante el cultivo de levaduras y el posterior rompimiento balístico se obtuvieron concentraciones de proteína suficientes para la posterior inoculación de conejos como se muestra en la Tabla 1. Tabla 1. Cepa

Concentración de proteínas de pared celular recuperadas de las diferentes especies de Candida Proteína (µg/µL)

Candida cruzei

7.3

Candiad parapsilosis

6.1

Candida glabrata

4.8

Candida albicans

9.3

Las proteínas presentes en la pared celular de las cuatro especies de Candida analizadas se muestran en el gel de electroforesis teñido con azul de Coomasie (Figura 1). Como se observa en el gel, se obtuvo un mayor número de proteínas en las paredes recuperadas de C. albicans y el menor en las de C. glabrata. El rango de peso molecular de las proteínas recuperadas fue de 121 a 15 kDa, obteniéndose un mayor número de proteínas de peso molecular menor a 40 kDa en C. albicans y C. glabrata, y un menor número de proteínas en C. parapsilosis. Esta recuperación diferencial de proteínas se manifiesta también al comparar los pesos moleculares (PM) de las proteínas recuperadas, ya que aunque existen proteínas con PM semejantes entre las diferentes especies (Tabla 2, números en negritas), predominan las diferencias, lo cual podría indicar la posibilidad de obtener anticuerpos diferentes para cada especie de levadura y por lo tanto, permitir el diagnóstico inmunológico diferencial entre ellas. .

Figura 1. Patrón de proteínas de la pared celular recuperadas de las diferentes especies de Candida. Gel del electroforesis al 10% en condiciones desnaturalizantes de las proteínas recuperadas de la pared celular de C. cruzei (carriles 1 y 8), C. parapsilosis (carriles 2 y 7), C. glabrata (carriles 3 y 6) y C. albicans (carriles 4 y 5). PM, marcadores de peso molecular. Carriles 1 a 4 con 50 µg de proteína por carril; carriles 5 a 8 con 30 µg de proteína/carril.

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Tabla 2. Pesos moleculares de las proteínas de pared celular de Candida Proteína

PM (kDa) C. kruzei

C. parapsilosis

C. glabrata

C. albicans

1

120923

119352

2

111797

110345

111797

111797

3

102017

4

96818

93093

96818

96818

117801

5

90690

6

88348

87201

7

81681

81681

82756

8

78539

75517

78539

76511

9

73567 64549

64549

64549

58137

58902

58902

10

67132

11

63710

12

60463

13 14

51010

15

47161

48410

16

44757

17

41924

18

38760

39270

49693 46548

46548 43035

38257

37760

19

32700

32700

20

29840

29840

21

26182

22

24847

23

22972

24

21239

23581

24847 22972

21518

21518

25 26

23891 21801 20156

18393

27 28

16351

29

15517

18635 17455

17455

16566

16566

30

16566

15517 14726

14160

Con las paredes celulares de las diferentes especies de Candida se inocularon cuatro conejos (uno para cada especie) conforme al protocolo descrito en materiales y métodos. El suero recuperado se tituló utilizando un ensayo de ELISA y utilizando como control el suero preinmune correspondiente en cada caso. El título recuperado fue de 100 para C. parapsilosis, de 300 para C. cruzei y C. glabrata, y de 900 para C. albicans. Estos resultados sugieren que se debe incrementar el número de inoculaciones, la cantidad de proteína inoculada a los conejos o el esquema de tiempo de este protocolo.

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Con los anticuerpos recuperados en los sueros de los conejos inoculados con las paredes celulares de las diferentes especies de Candida se realizó la inmunodetección de las proteínas presentes en cada una de las muestras. Una vez verificada la electrotransferencia tiñendo las membranas con rojo de Ponceau, se procedió a la inmunodetección. Para verificar si existía una reacción cruzada entre los diferentes sueros y las proteínas de las distintas especies de Candida se cargaron geles con 100 µg de cada una de las muestras de paredes y se retaron contra los 4 sueros recuperados. Como se observa en la Figura 2, se indujo una alta reactividad en el suero anti-C. cruzei que además presenta una marcada inmunorreactividad frente a las proteínas de C. glabrata y un poco menor frente a C. albicans y muy escasa frente a C. parapsilosis (Figura 2, carriles 1 a 4 respectivamente). Este comportamiento es semejante al observado con los otros sueros inmunes recuperados (datos no mostrados) sugiriendo que es necesario separar las proteínas de la pared celular de las diferentes especies de Candida, si se quiere tratar de obtener un protocolo para identificar específicamente cada una de las especies de levaduras por métodos inmunológicos como lo sugieren otros autores [4] .

Figura 2. Inmunodetección de proteínas de pared celular de diferentes especies de Candida con un suero anti-C. cruzei. Se electrotransfirieron 100 µg de proteína de pared celular de C. cruzei (carril 1), C. parapsilosis (carril 2), C. glabrata (carril 3) y C. albicans (carril 4) y se realizó la inmunodetección con un suero anti-C. cruzei (título, 300) y se reveló con un anticuerpo chivo anticonejo acoplado a peroxidasa utilizando 3,3-diaminobencidina y peróxido de hidrógeno como agente revelador.

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CONCLUSIONES Se logró inducir la respuesta inmune en conejos frente a proteínas de pared celular de cuatro especies de Candida, sin embargo se recuperaron títulos bajos y con reactividad cruzada, si bien se habían observado proteínas diferenciales para las distintas especies de levadura, lo cual sugiere que es necesario purificar las proteínas antes de inocularlas a los conejos para tener una mayor especificidad y mejorar el protocolo de inoculación para obtener un título mayor de anticuerpos. Tinci´n

AGRADECIMIENTOS Agradecemos infinitamente a la M. en C. Ma. del Carmen Sánchez por su apoyo incondicional en los aspectos técnicos de la realización de este trabajo. A la Dra. Mayra Cuellar-Cruz del CIATEJ por la donación de las cepas y a la Universidad de Guanajuato por el apoyo económico brindado a la C. pasante de QFB Ana Lidia Cabrera Rodríguez para el desarrollo de su verano de investigación. REFERENCIAS [1] C. LÓPEZ*, L. GIRO, L. RAMOS, S. RAMADÁN, L. BULACIO (2005), Comparación de diferentes métodos para la identificación de especies del género Candida, Revista Argentina de Microbiología (2005) 37: 16-21 [2] Cuéllar-Cruz M, Villagómez-Castro JC, Ruiz-Baca E y López-Romero E. (2012), Geographic distribution of Candida species and its correlation with blood type and biofilm formation, Current Trends in Microbiology, en Prensa. [3] Cuéllar-Cruz M, Vega-González B, Mendoza-Novelo E, López-Romero E, Ruiz-Baca E, QuintanarEscorza A y Villagómez-Castro JC, (2012), The effect of biomaterials and antifungals on biofilm formation by Candida species: a review, Eur J Clin Microbiol Infect Dis DOI 10.1007/s10096-0121634-6. [4] Quindós G, Moragues MD y Pontón J, (2004), Is there a role for antibody testing in the diagnosis of invasive candidiasis?, Rev. Iberoam Micol 21: 10-14.

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