Profesor Patrocinante Dra. Ilona I. Concha Instituto de Bioquímica y Microbiología Facultad de Ciencias

CLORURO DE LITIO INDUCE AUTOFAGIA EN CÉLULAS DEL TÚBULO SEMINÍFERO Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico

KARINA ANDREA CERECEDA SOLIS

VALDIVIA-CHILE 2012

I

AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer a mi familia, por su apoyo a lo largo de todo el proceso en mis estudios y por creer siempre en mis capacidades. A Daniel por su contención en los momentos que las cosas parecían más difíciles y compartir también mis logros. A mis queridos compañeros y amigos de laboratorio Play, Johanna, Karen, Malro, Petre, Antonia, Camila, Franz y Noe, no solo por su ayuda académica, si no también por toda la paciencia que han tenido a lo largo de estos 2 años de tesis y por hacer ameno cada día de trabajo. A la Doctora Ilona, por confiar en mis capacidades al permitirme trabajar en el laboratorio y por enseñarme a ser perseverante y la importancia de tener tolerancia al fracaso en esta carrera. Y finalmente a FONDECYT, por otorgar el financiamiento que permitió el desarrollo de este trabajo.

II

ÍNDICE DE CONTENIDOS Página

1. RESUMEN ........................................................................................................ 1 1.1 SUMMARY ........................................................................................................ 2 2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 3 2.1

Epitelio seminífero y espermatogénesis. ....................................................... 3

2.2

Autofagia. ...................................................................................................... 7

2.2.1 Regulación de autofagia........................................................................... 14 2.2.2 Vías de regulación independientes de mTOR. ......................................... 16 2.3

Litio. ............................................................................................................. 17

2.3.1 Generalidades. ......................................................................................... 17 2.3.2 Efectos del litio en el túbulo seminífero .................................................... 18 2.3.3 Blancos moleculares del litio. ................................................................... 19

3. MATERIALES Y METODOS ........................................................................... 23 3.1

Materiales. ................................................................................................... 23

3.1.1 Reactivos. ................................................................................................ 23 3.2

Instrumentos. ............................................................................................... 25

3.3

Métodos. ...................................................................................................... 26

3.3.2 Inmunofluorescencia. ............................................................................... 26

III

3.3.3 Extracción y cuantificación de proteínas totales. ...................................... 27 3.3.4 Separación electroforética de proteínas. .................................................. 28 3.3.5 Transferencia de proteínas a membrana de PVDF. ................................. 28 3.3.6 Análisis de Western blot. .......................................................................... 29 3.3.7 Tratamiento de células con moduladores de autofagia. ........................... 30 3.3.8 Microscopía electrónica de transmisión. .................................................. 30 3.3.9 Análisis estadístico. .................................................................................. 30 4. RESULTADOS ............................................................................................... 31 4.1

Formación de posibles vesículas autofágicas al tratar células de Sertoli

42GPA9 con litio.................................................................................................... 31 4.2

Presencia de proteínas involucradas en autofagia en túbulo seminífero. .... 33

4.3

LiCl aumenta la relación LC3-II/LC3 I en células del túbulo seminífero. ...... 36

4.4

Cloruro de Litio induce la formación de autofagosomas en células del túbulo

seminífero.............................................................................................................. 44 4.5

LiCl induce autofagia vía inositol monofosfatasa. ........................................ 47

4.6

LiCl y L-690,330 inducen la formación de autofagosomas en células del

túbulo seminífero. .................................................................................................. 52 4.7

Degradación de p62 en células de GC-1, GC-2 y Sertoli 42GPA9. ............. 55

5. DISCUSIÓN .................................................................................................... 59

IV

5.1

Autofagia en células GC-1, GC-2 y Sertoli 42GPA9 y la inducción de este

proceso al tratar con LiCl....................................................................................... 60 5.2

Posible inducción de autofagia vía Inositol monofosfatasa. ........................ 67

5.3

Niveles de p62. ............................................................................................ 68

6. . CONCLUSIONES ......................................................................................... 70

7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 71

V

ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Ilustración esquemática de la espermatogénesis .................................... 4

Figura 2. Tres tipos de autofagia. ........................................................................... 9

Figura 3. Vía de macroautofagia .......................................................................... 11

Figura 4. Regulación de autofagia ........................................................................ 15

Figura 5. Vía de regulación de autofagia independiente de mTOR ...................... 21

Figura 6. LiCl induce formación de estructuras vesiculares en células de Sertoli. 32

Figura 7. LiCl induce autofagia en células de la línea GC-1 ................................. 34

Figura 8. LiCl aumenta la relación LC3 II/ LC3 I en células GC-1. ....................... 37

Figura 9. LiCl aumenta la relación LC3 II/ LC3 I en células GC-2.. ...................... 39

Figura 10. LiCl aumenta la relación LC3 II/ LC3 I en células GC-1. ..................... 41

Figura 11. LiCl aumenta la relación LC3 II/ LC3 I en células GC-2. . ................... 42

VI

Figura 12.LiCl aumenta la relación LC3 II/ LC3 I en células Sertoli 42GPA9. ...... 43

Figura 13. . Cambios en la distribución de LC3 al inducir autofagia con LiCl en células GC-1.......................................................................................................... 45

Figura 14. Cambios en la distribución de LC3 al inducir autofagia con LiCl en células GC-2.......................................................................................................... 46

Figura 15. L-690,330 induce autofagia en células GC-1. ..................................... 48

Figura 16. L-690,330 induce autofagia en células GC-2. . ................................... 49

Figura 17. L-690,330 induce autofagia en células de Sertoli 42GPA9. ................ 50

Figura 18. LiCl y L-690,330 inducen formación de “dots” autofágicos en células del túbulo seminífero.. ................................................................................................. 54

Figura 19. p62 no varía al tratar células con LiCl 10 mM.. ................................... 56

Figura 20. p62 no varía al tratar células hasta por 24 horas con LiCl 10 mM. ...... 58

VII

LISTA DE ABREVIATURAS AC: Adenililciclasa AMPK: Quinasa activada por monofosfato de adenina BSA: Albúmina de suero bovino CMA: Autofagia mediada por chaperonas DAG: Diacilglicerol DMEM-F12: Medio Dulbelcco`s Eagle modificado enriquecido con F-12 eIF2B : Factor eucariótico de iniciación de la traducción 2B FBS: Suero fetal bovino FIP200: Proteína de 200KDa que interactúa con familia de quinasas de adhesión focal GS: Glucógeno sintasa GSK3β: Glucógeno sintasa quinasa 3 β IMPasa: Inositol monofosfatasa InsP1: Fosfatidil inositol IP3R: Receptor de inositol 1,4,5 trifosfato IPPasa: Inositol pirofosfatasa

VIII

LAMP-2A: Proteína 2A asociada a membrana lisosomal LC3: Proteína 1 de cadena liviana 3 asociada a microtúbulos MARCKS: Sustrato de quinasa C miristoilado rico en alanina MIT: Transportador de inositol mTOR: Blanco de rapamicina en mamíferos PI: Inositol fosfato IP3: Inositol trifosfato PE: Fosfatidiletanolamina PKC: Proteína quinasa C PLC: Fosfolipasa C PRB1: Proteína 1 básica salival rica en prolina PI3K: Fosfatidilinositol 3 quinasa UBD: Dominio de unión a ubiquitina ULK1: Quinasas 1 tipo unc 51 ULK2: Quinasas 2 tipo unc 51 V-ATPasa: ATPasa tipo vacuolar Vsp34: Proteína vacuolar de destinación 34

1

1. RESUMEN La autofagia es un proceso celular que mantiene la homeostasis, permitiendo la supervivencia en situaciones de estrés. La activación de autofagia es regulada por la vía de mTOR, además se han descrito vías de regulación independientes de mTOR. En este proceso, la inhibición de inositol monofosfatasa (IMPasa) reduce los niveles de inositol, lo cual lleva a la activación de autofagia. Se ha demostrado la inducción de autofagia en espermatocitos de rata pero no existen estudios sobre autofagia regulada por los niveles de IP3 en células del túbulo seminífero. En este estudio tratamos células de Sertoli y germinales con LiCl el cual se ha demostrado induce autofagia vía IMPasa en otros tipos celulares. Usamos rapamicina como control positivo y además las células fueron co-tratadas con bafilomicina A1 para evitar la degradación de LC3. Tras estos tratamientos la inducción de autofagia fue evaluada midiendo la razón LC3 II/LC3 I por Western blot, este aumento en los niveles de LC3 II sugiere la inducción de autofagia. Los mismos tratamientos fueron evaluados por inmunofluorescencia para estudiar la distribución de LC3, la cual fue uniforme en el citoplasma en el control pero cambió a un patrón punteado en las células tratadas sugiriendo la formación de autofagosomas. Para confirmar que LiCl induce autofagia vía IMPasa las células fueron tratadas con L-690,330, un inhibidor de la IMPasa y los resultados fueron similares a los observados en los tratamientos con LiCl. Estos resultados sugieren que se induce autofagia por una vía independiente a mTOR en células germinales y somáticas del túbulo seminífero.

2

1.1 SUMMARY Autophagy is a cellular process that maintains the homeostasis of the normal cell, allowing cell survival in times of stress. Autophagosome formation is negatively regulated by the mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway. Apart from mTOR-dependent pathway, mTOR-independent pathway has been described. In this process, the inhibition of inositol monophosphatase (IMPase) reduces free inositol and myoinositol-1,4,5-triphosphate levels, which leads to an upregulation of autophagy. It has been demonstrated that rat spermatocytes are able to undergo autophagy but there are no studies about autophagy regulated by IP 3 in seminiferous tubule cells. In this study we treated Sertoli cells and germ cells with lithium chloride which is known to induce autophagy via inositol monophosphatase (IMPAse) in other cells types. We used rapamycin as positive control and cotreated the cells with bafilomycin A1 to prevent LC3 degradation. After these treatments, the induction of autophagy was assessed via LC3 II/LC3 I ratio by Western Blot, the increase in LC3 II levels suggests autophagy induction. The same treatments were evaluated by immunofluorescence to study the LC3 distribution, which was uniform in all cytoplasm in control cells but changed to a speckle pattern in treated cells, suggesting the formation of autophagosomes. To confirm that LiCl induces autophagy via IMPAse cells were treated with L-690,330, an IMPase inhibitor and the results were similar to those observed in LiCl-treated cells. These results suggest that autophagy is induced by mTOR-independent pathway in germ and somatic cells of the seminiferous tubule.

3

2. INTRODUCCIÓN 2.1

Epitelio seminífero y espermatogénesis.

El epitelio seminífero está constituido esencialmente por dos tipos celulares (Figura 1): un componente somático (células de Sertoli) y otro germinal (espermatogonias, espermatocitos, espermátidas y espermatozoides). Las células de Sertoli son grandes y de forma triangular con la base fijada en la membrana basal y el ápice extendido hacia el interior del túbulo mirando al lumen. Mientras que el citoplasma exhibe un elaborado sistema de finos procesos que envuelven las células germinales, excepto a las células troncales llamadas espermatogonias, quienes están en estrecho contacto con la membrana basal (Hess y Franca, 2008). La totalidad de las funciones de las células de Sertoli en la espermatogénesis aún es incierta. Sin embargo, estas células proveen un soporte mecánico para el desarrollo de las células germinales y juegan un rol en la liberación del espermatozoide maduro desde el túbulo, la reabsorción de los “cuerpos residuales” durante la diferenciación de las espermátidas (De Kretser et al, 1971) y la eliminación de células en apoptosis (Nakanishi y Shiratsuchi, 2004) Además, cabe destacar que existe una estructura que divide el epitelio seminífero en dos compartimentos, uno basal y otro adluminal denominada barrera hematotesticular. Esta barrera es generada por las uniones estrechas (tight junctions) entre las células de Sertoli, originando de este modo un compartimento en contacto con la circulación sanguínea, el basal, y otro casi totalmente aislado de ella, el adluminal (Russell, 1977; Yan et al, 2008). En este último compartimento se encuentra el linaje germinal masculino más avanzado, y por ende, esta barrera

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Rato, et al. (2012) Nat. Rev. Urol. 9, 330–338

Figura 1. Ilustración esquemática de la espermatogénesis. El epitelio seminífero está compuesto por las células de Sertoli y las células germinales en desarrollo en diferentes estados. Las células de Leydig y los vasos sanguíneos se encuentran en el intersticio. En este esquema se observan las células de Sertoli que actúan como soporte energético y estructural para las células germinales en desarrollo. Además se observan uniones estrechas entre células de Sertoli que permiten la formación de la barrera hematotesticular (BTB).

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lo protege de cualquier daño (por ejemplo alguna toxina o droga) que pudiese afectar su normal desarrollo. El desarrollo de las células germinales es un proceso complejo denominado espermatogénesis el cual es altamente regulado y que está dividido en 4 procesos fundamentales (mitosis, meiosis, espermiogénesis, espermiación), los cuales se completan en alrededor de 54 días en ratas (Lie et al, 2009). Todos estos eventos han sido descritos como una serie de cambios celulares los cuales están divididos en etapas. En ratas, existen 14 etapas donde cada una está caracterizada por una disposición particular de espermatogonias, espermatocitos y espermátidas. Las espermatogonias, definidas como las células germinales indiferenciadas, están compuestas por 3 tipos: A-singles, que son las células troncales de la línea germinal, A-paired y A-aligned que se encuentran ubicadas adyacentemente a la membrana basal (Lie et al, 2009). Las espermatogonias A-singles entran a mitosis y algunas eventualmente darán origen a espermatogonias tipo A, intermedias y espermatogonias tipo B (Hess y Franca, 2008). Posteriormente, solo las espermatogonias tipo B se diferenciarán en espermatocitos leptoténicos (células germinales diploides, 2n), quienes cruzan la barrera hemato-testicular para llegar al compartimento adluminal (Russell, 1977). Una vez en el compartimento adluminal, los espermatocitos leptoténicos se desarrollan a espermatocitos paquiténicos los cuales sufren dos procesos de meiosis (llamados espermatocito primario en meiosis I, luego, espermatocios secundarios en meiosis II) después de los cuales se originan las células germinales haploides, llamadas espermátidas.

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Las espermátidas, ubicadas más hacia el lumen del túbulo, experimentan una serie de cambios morfológicos (espermiogénesis) hacía espermatozoide, como la condensación de su cromatina y formación del acrosoma, cola y cuerpos residuales (Lie et al, 2009).Una vez que se completa la espermiogénesis, las espermátidas elongadas se encuentran en el lumen del túbulo preparadas para desprenderse del epitelio seminífero al ocurrir la espermiación (Lie et al, 2009). El espermatozoide formado a partir de las espermátidas no es funcionalmente maduro mientras permanece libre en el lúmen del túbulo seminífero. Éste debe migrar hasta el epidídimo donde experimenta diferentes cambios estructurales y citoquímicos, tales como, modificación del perfil acrosomal, incremento en la condensación nuclear, eliminación de la “gota” citoplasmática, lo que en síntesis se conoce como “capacitación espermática” (Setty y Jehan, 1977; Cheng y Mruk, 2009). Se ha demostrado que durante este proceso de espermatogénesis el número de lisosomas varía en las células de Sertoli, así como también en las células germinales (Chemes, 1986). Se ha determinado que existen lisosomas en todos los tipos celulares, incluyendo células de Sertoli y células germinales desde la espermatogonia hasta la espermátida, los cuales varían dependiendo del tipo celular, encontrándose el mayor número de lisosomas y la mayor actividad fosfatasa ácida en las células de Sertoli. Como ya se mencionó, las células de Sertoli participan en la reabsorción de cuerpos residuales y se cree que esta actividad fosfatasa ácida podría estar relacionada con esta función, dado que el contenido de lisosomas y fosfatasas ácidas aumentan justo antes de la espermiación, sugiriendo que lo hacen en respuesta al proceso de reabsorción de

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cuerpos residuales, ya que estos niveles disminuyen una vez que ha ocurrido este proceso. Por lo tanto es posible pensar que el proceso de reabsorción de cuerpos residuales está compuesto por dos mecanismos: en primera instancia se estaría activando autofagia y finalmente la reabsorción es completada por fagocitosis. 2.2

Autofagia.

La autofagia es un proceso celular de degradación altamente conservado en el cual una porción del citoplasma y/u organelos son secuestrados en una vesícula de doble membrana denominada autofagosoma la cual después es llevada a un organelo degradativo (vacuola/lisosoma) para la degradación del cargo y eventual reciclaje de las moléculas resultantes (Cuervo, 2004; Levine y Klionsky, 2004; Shintani y Klionsky, 2004; Klionsky, 2005, 2007; Mizushima y Klionsky, 2007). Este proceso ayuda a la célula a sobrellevar condiciones de estrés. La autofagia juega un rol fundamental durante el desarrollo y diferenciación celular y supresión de tumores, también tiene diferentes roles en la inmunidad innata y adaptativa, tales como resistencia a invasión de patógenos. De esta forma, la autofagia se considera generalmente como un mecanismo de supervivencia aunque su desregulación ha sido vinculada a muerte celular no apoptótica. La autofagia puede ser no selectiva o selectiva en la degradación de organelos específicos, ribosomas y agregado proteicos. Además de la eliminación de agregados intracelulares y organelos dañados, esta promueve longevidad celular y presentación de antígenos, protección contra inestabilidad genética y previene la necrosis, lo cual le otorga un rol en la prevención de enfermedades tales como

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cáncer, neurodegeneración, cardiomiopatía, diabetes, enfermedad del hígado, enfermedades autoinmunes e infecciones. Se han definido tres tipos de autofagia: macro-autofagia, micro-autofagia y autofagia mediada por chaperona, todas promueven la degradación proteolítica de componentes del citoplasma en el lisosoma (Figura 2). En la macro-autofagia el cargo es llevado al lisosoma a través de una vesícula de doble membrana (autofagosoma),

la

cual

se

fusiona

con

el

lisosoma

para

formar

un

autofagolisosoma. Por ser este el tipo de autofagia más estudiada generalmente se conoce como solo autofagia y los procesos descritos a continuación son con respecto a este tipo de autofagia. Al contrario, en la micro-autofagia, los componentes citosólicos son directamente llevados al lisosoma a través de invaginación de la membrana lisosomal. En ambas, micro y macro autofagia, es posible secuestrar grandes estructuras a través de mecanismos selectivos y no selectivos. En la autofagia mediada por chaperona (CMA) las proteínas blanco son translocadas a través de la membrana lisosomal en complejo con proteínas chaperonas (tales como Hsc-70) que son reconocidas por el receptor de membrana lisosomal, proteína 2A asociada a la membrana lisosomal (LAMP-2A), resultando en su desplegamiento y degradación (Saftig et al, 2008) La autofagia comienza con el aislamiento de parte del citoplasma rodeado de una membrana, esto se conoce como fagoforo y se cree que esta membrana podría derivar de la bicapa lipídica proveniente del retículo endoplasmático (ER) y/o el trans-Golgi y endosomas (Axe et al, 2008; Simonsen y Tooze, 2009). Este fagoforo se expande y atrapa el cargo intracelular, ya sea agregados proteicos,

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Decuypere et al (2011) Cell Calcium 50 242– 250

Figura 2. Tres tipos de autofagia. El recuadro izquierdo superior corresponde a la autofagia mediada por chaperonas las cuales ayudan a llevar proteínas mal plegadas al lisosoma esta entrada al lisosoma es mediada por chaperonas lisosomales (como LAMP-2ª). En el recuadro derecho superior se observa un esquema de la micro-autofagia que consiste en la invaginación y fisión de la membrana lisosomal, capturando material citosólico. El recuadro inferior corresponde a la macro-autofagia, la cual comienza con la formación del complejo ULK1-Atg13-FIP200, al mismo tiempo la fosforilación de beclin 1 permite la formación del complejo PI3K, ambos complejos son necesarios para la formación del fagoforo, el cual elonga en un vesícula de doble membrana (autofagosoma). Esta elongación requiere del complejo Atg12-Atg5-Atg16L y la lipidación de la proteína LC3. Finalmente el autofagosoma se fusiona con el lisosoma, promoviendo la degradación del contenido autofagosomal por las proteasas lisosomales.

10

organelos o ribosomas, secuestrando así el cargo en el autofagosoma de doble membrana (Mizushima, 2007). Permeasas lisosomales y transportadores exportan amino ácidos y otros productos de la degradación de regreso al citoplasma, donde pueden ser reutilizados para

la

generación

de

macromoléculas

necesarias para

el

metabolismo (Mizushima, 2007). Así, el proceso de autofagia se puede considerar como una “fábrica de reciclaje” que también promueve la eficiencia energética a través de la generación de ATP y media el control de daño removiendo proteínas y organelos no funcionales. Este proceso está compuesto de cuatro pasos claves: A) Comienzo de la formación del autofagosoma; B) Elongación; C) Maduración y Fusión (Figura 3). A diferencia de la mayoría de los procesos de formación de vesículas en sistema de tráfico de endomembranas, los autofagosomas de doble membrana aparentemente se forman en la estructura denominada PAS (estructura preautofagosomal) por adición de nuevas membranas. Así, la formación de una vesícula de secuestro del cargo es probablemente el paso más complejo del proceso de autofagia. Muchas proteínas Atg son reclutadas al fagoforo para participar en la formación del autofagosoma, este paso requiere la regulación de la coordinación de todas estas proteínas.

11

Rodriguez-Rocha et al (2011) Mutat Res. June 3; 711(1-2)

Figura 3. Vía de macroautofagia. La autofagia involucra el secuestro de proteínas

y

organelos

dentro

de

una

estructura

de

doble

membrana

(autofagosoma) para su posterior degradación. La actividad del sistema Atg12 tipo ubiquitina es esencial en la elongación del fagoforo, ya que media la lipidación de LC3 I para convertirla en LC3 II, la cual se localiza en la membrana del autofagosoma. La fusión del autofagosoma con el lisosoma lleva a la degradación del cargo.

12

La nucleación y el ensamblaje de la membrana inicial del fagoforo requieren del complejo fosfatidilinositol 3 – quinasa (PI3K), el cual está compuesto por PI3K, Vsp34 (proteína vacuolar de destinación 34), una serina/treonina quinasa miristoilada p150, mAtg14 y beclin 1 (Itakura et al, 2008; Kihara et al, 2001; Liang et al, 1999; Sun et al, 2008). La función de beclin 1 en autofagia es regulada por Bcl-2, una proteína antiapoptótica que inhibe la autofagia uniendo y secuestrando a beclin 1 bajo condiciones ricas en nutrientes; para la inducción de autofagia se requiere la disociación de beclin 1 de Bcl-2. El complejo PI3K, junto con varias proteínas Atg, recluta dos sistemas de conjugación tipo ubiquitina (Ubl) interrelacionados, Atg12-Atg5-Atg16 y LC3 (cadena

ligera

3

de

la

proteína

1

asociada

a

microtúbulo)-PE

(fosfatidiletanolamina) al fagoforo (Suzuki et al, 2001 y 2007), los cuales juegan un rol esencial en la regulación de la elongación y expansión del autofagosoma en formación. Las dos proteínas Ubl, Atg12 y LC3, experimentan un proceso de conjugación similar al de ubiquitinación. Atg12 es activada por Atg7 (Enzima activadora E1), transferida a Atg10 (Enzima conjugadora E2) y unida covalentemente a una lisina interna (K130) de la proteína sustrato Atg5. A diferencia de la ubiquitinación, la conjugación de Atg12-Atg5 es constitutiva e irreversible, y aparentemente el proceso no requiere una proteína homóloga de la E3 ligasa sustrato específica (Geng y Klionsky, 2008). Las proteínas Atg12-Atg5 conjugadas posteriormente interactúan con la proteína Atg16, la cual une el complejo Atg12-Atg5-Atg16 en un tetrámero por auto-oligomerización y lo une al fagoforo (Mizushima et al, 2003 y

13

1999). Este complejo es esencial para la elongación de la membrana preautofagosomal pero se disocia del autofagosoma completamente formado. En el sistema de conjugación de LC3, esta es primero procesada por Atg4, una cisteín proteasa, exponiendo un residuo de glicina en el carboxilo terminal. La misma enzima tipo E1, Atg7, activa LC3 y la transfiere a Atg3 (E2). LC3 es finalmente conjugado al lípido PE a través de un enlace amida, facilitado por el conjugado Atg12-Atg5 tipo E3 (Fujita et al, 2008; Hanada et al, 2007). En condiciones ricas en nutrientes LC3 se encuentra en el citosol mayoritariamente, durante la inducción de la autofagia LC3 se ubica predominantemente en su forma lipidada y se localiza en ambas membranas del fagoforo (Itakura et al, 2008; Kirisako et al, 1999). Además LC3 controla el tamaño del autofagosoma (Xie et al, 2008) lo cual se puede deber a su capacidad de determinar la curvatura de la membrana. Cuando la formación del autofagosoma está completa, LC3 unido a la membrana externa sufre un corte proteolítico, fosfatidiletanolamina es clivado y luego LC3 es liberada al citosol (Kirisako et al, 2000). Posteriormente ocurre la fusión del autofagosoma con el lisosoma, la cual requiere de la proteína de membrana lisosomal LAMP-2 y la GTPasa Rab 7 (Jager et al, 2004; Tanaka et al, 2000). Tras la fusión, la degradación de la vesícula interna es dependiente de una serie de hidrolasa ácidas lisosomales catepsina B, L y proteinasa K. Las moléculas resultantes de la degradación son transportadas de regreso al citosol para su utilización en síntesis de macromoléculas (por ejemplo proteínas) ayudando a mantener las funciones celulares durante condiciones de estrés.

14

2.2.1 Regulación de autofagia. Existen situaciones de estrés en la célula que pueden inducir el proceso de autofagia, entre ellos privación de nutrientes, hipoxia y estrés del retículo endoplasmático. Uno de los principales reguladores de autofagia es mTOR (blanco de rapamicina en mamíferos) quinasa. La vía de mTOR incluye 2 complejos funcionales: mTORC1 y mTORC2. Ambos complejos participan en la regulación de autofagia. mTORC1 es sensible a rapamicina y contiene la subunidad catalítica de mTOR y raptor (proteína reguladora asociada de mTOR, una proteína que actúa como proteína de andamiaje para la fosforilación de sustratos de mTOR). La unión de FKBP12 (receptor de rapamicina) a mTOR inhibe la interacción de mTOR con raptor, sugiriendo un mecanismo para la inhibición especifica de la vía de señalización de mTOR por rapamicina (Oshiro et al, 2004). mTORC1 inactiva a ULK1 y 2 por fosforilación, estas dos proteínas forman un complejo estable con FIP200 y Atg13 el cual se localiza en la membrana del fagoforo al inicio del proceso de autofagia (Ganley et al, 2009; Jung et al, 2009). Cuando mTORC1 es inhibido por rapamicina o por falta de nutrientes las proteínas ULK1 y 2 se activan y fosforilan a FIFP200 y Atg13 permitiendo la formación del complejo, desencadenando autofagia (Figura 4). Una de las vías que determina la inhibición de mTOR, y por lo tanto la iniciación del proceso de autofagia es la de AMPK. En células de mamíferos, un reducido

15

Kimmelman (2010) J Pathol. June; 221(2): 117–124.

Figura 4. Regulación de autofagia. mTORC1 es un regulador clave de autofagia en respuesta a cambios en la disponibilidad de nutrientes. Durante condiciones normales de nutrientes, la vía de mTOR se encuentra activa y la autofagia es inhibida a través de la represión de ULK1/2. Durante privación de nutrientes ULK1/2 es activado y puede promover el comienzo del proceso de autofagia. ULK también es activado por estados de deficiencia energética (aumento de la relación AMP/ATP) que resulta en la fosforilación de AMPK, al activarse esta quinasa inhibe la vía de mTOR.

16

nivel de energía celular (ATP) es censada por AMPK. AMPK es activada por una disminución de la razón ATP/AMP a través de la quinasa LKB1. La activación de AMPK lleva a la fosforilación y activación del complejo TSC1/2, el cual inhibe la actividad de mTOR a través de Rheb (Inoki et al, 2003). La autofagia estimulada por la inhibición de la vía de mTOR resulta en el aumento de la producción de ATP a través del reciclaje de nutrientes. 2.2.2 Vías de regulación independientes de mTOR. Otra de las vías de regulación de autofagia es a través de derivados de inositol. Uno de los inhibidores endógenos de autofagia es mio-inositol-1,4,5- trifosfato (IP3) (Sarkar et al, 2005), un segundo mensajero producido principalmente en respuesta a la activación de receptores acoplados a proteínas G o receptores con actividad tirosina quinasa, esto activa fosfolipasa C (PLC), la cual hidroliza el fosfolípido PIP2 para producir los segundos mensajeros IP3 y diacilglicerol (DAG) (Berridge, 1987). Lo niveles de IP3 son restaurados por las enzimas IPPasa e IMPasa y convertido en inositol (principalmente mio-inositol), el cual es requerido para la re-síntesis de PIP2 (Maeda y Eisenberg, 1980). Se ha demostrado que fármacos estabilizadores de humor, como litio, carbamazepin y ácido valproico, que reducen los niveles de inositol al inhibir a la enzima inostol monofosfatasa (IMPasa) intracelular son capaces de inducir autofagia (Williams et al, 2002).

17

2.3

Litio.

2.3.1 Generalidades. Litio es un catión monovalente que fue introducido en 1949 para el tratamiento de desorden bipolar. En la actualidad sigue siendo recomendado como el tratamiento de primera línea contra la manía aguda y profilácticamente para episodios maníacos recurrentes y episodios de depresión. Clínicamente, el litio ha sido utilizado junto a otros estabilizadores de humor, antidepresivos y medicamentos anti sicóticos para facilitar, aumentar o prolongar el tratamiento y la remisión (Goodwin, 2003; Lin et al, 2006). El Litio también tiene propiedades antisuicidas (Tondo y Baldessani, 2009). Litio es el más liviano de los metales con una densidad de solo la mitad del agua. Induce múltiples efectos bioquímicos y moleculares en la cascada de transducción de señale gatilladas por la interacción neurotrasmisor-receptor, regulación hormonal y circadiana, transporte de iones y expresión génica. Estos efectos han sido ampliamente asociados con la activación de vías neurotróficas, y la neuroprotección en humanos y estudios preclínicos. Sin embargo, se ha descrito también que en pacientes intoxicados con litio se produce neurotoxicidad (Adityanjee et al, 2005; Mangano et al, 1997). Litio causa también leucocitosis benigna y puede incrementar el número de células troncales hematopoyéticas (Boggs y Joyce, 1983). Otros de los efectos colaterales asociados a los tratamientos con litio incluyen la diabetes insípida, nefrotoxicidad (Singer et al, 1972; Eustatia-Rutten et al 2001) y trastornos a la tiroides junto al desarrollo de bocio (Lazarus et al, 1972).

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2.3.2 Efectos del litio en el túbulo seminífero. El testículo no se encuentra ajeno a los efectos tóxicos observados a raíz de los tratamientos con litio. No obstante, existen escasos estudios acerca de lo perjudicial que es este ión para el sistema reproductor masculino. Uno de los pocos reportes que ha descrito los efectos deletéreos del litio en el sistema reproductor en humanos, indicó que en dos pacientes tratados con dosis terapéuticas de carbonato de litio (900 mg/día) se observó disfunción sexual (Blay et al, 1982). Otro estudio un poco más reciente, evaluó la función sexual de pacientes que se encontraban en tratamientos con litio, concluyendo que un 30% de los pacientes evaluados presentaban disfunción sexual (Aizenberg et al, 1996). En ratas, la administración de dosis terapéuticas de cloruro de litio inhiben la actividad de la enzima deshidrogenasa de hidroxiesteroides testicular, la esteroidogénesis testicular y la espermatogénesis (Ghosh et al, 1990), además de alteraciones en la morfología de la vesícula seminal (Chatterjee et al, 1990). Mientras que a dosis elevadas de litio, el peso de los testículos, epidídimo y órganos sexuales accesorios disminuye significativamente, se produce la degeneración de las células germinales y de Leydig, la vacuolización del citoplasma de las células de Sertoli y una reducción de la producción de espermatozoides (Thakur et al, 2003). A nivel ultraestructural, las células espermatogénicas de etapas tempranas presentaron protrusiones nucleares debido a una extensión de la membrana nuclear externa, en las espermátidas redondas se observaron los acrosomas con forma de campana y una dilatación del espacio subacrosomal. Mientras que las espermátidas tardías se encontraban orientadas de una forma azarosa, o más bien no ordenadas como se encuentran

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normalmente, observándose tanto hacia la zona basal como adluminal del epitelio seminífero (Zarnescu y Zamfirescu, 2006). En aves machos, los tratamientos con cloruro de litio generaron también la reducción en el peso de los testículos, disminución del diámetro y descamación del túbulo seminífero, además de evidentes cambios degenerativos en las células germinales, espermátidas y espermatozoides, quienes estaban despegados del epitelio y mostraron características necróticas (Banerji et al, 2001). 2.3.3 Blancos moleculares del litio. Estos diversos efectos que tiene el litio se deben a su amplio número de moléculas blanco. Se ha identificado un número importante de fosfoproteínas cuya fosforilación o nivel de expresión es sensible al tratamiento con litio, incluyendo proteínas de neurofilamento (Bennett et al, 1999), proteínas asociadas a microtúbulo (Burstein et al, 1985), y sustratos de la proteína quinasa C (PKC) tales como MARCKS. Entre las principales moléculas que se ha demostrado que litio inhibe directamente se encuentra GSK3β (Klein y Melton, 1996), la cual es una de las dos isoenzimas de GSK3, esta enzima fue identificada inicialmente como un inhibidor de la síntesis de glucógeno que fosforila e inhibe a la enzima glucógeno sintasa (GS) (Cohen et al, 1982; Plyte et al, 1992). Otro de los blancos de GSK3 es eIF2B, el cual es una proteína que actúa como factor intercambiador de nucleótidos y convierte la forma inactiva del factor de iniciación de la traducción eIF2-GDP a la forma activa eIF2-GTP. Esta activación es seguida por la fosforilación de la subunidad alfa del factor de iniciación eIF2 y por lo tanto inhibe la síntesis de

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proteínas. De esta forma, el litio al inhibir a GSK3 estaría activando la síntesis de proteínas. Otra de las principales moléculas blanco del litio es la inositol monofosfatasa (IMPasa). Como ya se mencionó anteriormente es sabido que inhibidores de la enzima IMPasa son capaces de inducir autofagia, se ha demostrado que litio es capaz de inducir autofagia por esta vía (Sarkar et al, 2005; Sarkar et al, 2006). Litio disminuye los niveles intracelulares de inositol inhibiendo directamente IPPasa, IMPasa y el transportador de inositol (MIT) que capta inositol extracelular. Como consecuencia de la disminución de los niveles intracelulares de inositol disminuyen también los niveles de PIP2 evitando la formación de IP3 y DAG, dado que se ha demostrado que altos niveles de IP 3 inhiben autofagia. La disminución de IP3 provocada por litio estaría activando el proceso. Es probable que la regulación de autofagia a través de los niveles intracelulares de IP3 se deba a la liberación de calcio desde el retículo endoplasmático (ER), debido a que niveles citosólicos elevados de IP3 este se une a su receptor residente en el ER, IP3R, para movilizar el calcio almacenado y aumentar así los niveles de calcio citosólico, el cual tiene efectos inhibitorios en la autofagia. Los niveles citosólicos elevados de calcio activan calpaínas, las cuales activan receptores acoplados a proteínas G (Gαs), tras esta activación aumenta la actividad de la adenililciclasa, aumentando así los niveles de cAMP, el cual se sabe inhibe autofagia por una vía independiente de mTOR, dado que se ha demostrado que litio inhibe autofagia sin afectar la vía de esta quinasa, es posible que litio esté induciendo autofagia a través de la inhibición del flujo de calcio (Figura 5).

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Ravikumar et al (2010) Physiol Rev 90: 1383–1435

Figura 5. Vía de regulación de autofagia independiente de mTOR. Los niveles intracelulares de cAMP aumentan por la actividad de la adenililciclasa (AC), activando así Epac, la cual a su vez activa una proteína G pequeña Rap2B, la cual activa fosfolipasa C, resultando en la producción de IP 3 y la subsecuente liberación de calcio almacenado en el retículo endoplasmático. El aumento del calcio citosólico activa una familia de cisteín proteasas dependientes de calcio denominadas calpaínas, las cuales activan Gs, la activación de esta aumenta la actividad de adenililciclasa, aumentando los niveles de cAMP. La activación de esta vía inhibe autofagia. Múltiples drogas o fármacos cuyos blancos participan en estas

vías

inducen

autofagia.

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Con todos los antecedentes presentados anteriormente se ha planteado la siguiente hipótesis: LiCl induce autofagia a través de la vía de inositol monofosfatasa, una vía independiente de mTOR en las líneas celulares del túbulo seminífero, GC-1, GC-2 y Sertoli 42GPA9. Por lo tanto los objetivos específicos de la tesis son los siguientes: 1. Determinar la presencia de proteínas que participan en el proceso de autofagia en las líneas celulares del túbulo seminífero. 2. Determinar si LiCl induce el proceso de autofagia a través de diferentes marcadores específicos. 3. Establecer si la inducción de autofagia es por la vía de inositol monofofatasa.

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3. MATERIALES Y METODOS 3.1

Materiales.

3.1.1 Reactivos. De Sigma Chemical Co. (USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: azul de Coomassie G-250, Tritón X-100, rojo fenol, solución de colágeno tipo I de cola de rata, policlonal anti-GAPDH (G9545), monoclonal anti--Tubulina (T5168), bafilomicina A1, cloruro de litio.

De Merck & Co, Inc. (Alemania) se obtuvieron los siguientes reactivos: cloruro de mercurio II, ácido clorhídrico, cloruro de potasio, alcohol metílico, alcohol etílico, fosfato diácido de sodio, fosfato dihidrógeno de potasio, acrilamida, bisacrilamida, alcohol isopropílico, hidróxido de sodio.

De Winkler Ltda., se adquirió albúmina de suero de bovino (BSA), glicina, Tris, carbonato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS), persulfato de amonio, cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, reactivo de Bradford, agua ultra pura libre de nucleasas.

De Gibco-BRL Laboratorios Life Technologies, Inc. (USA) se adquirió tripsinaEDTA, penicilina/estreptomicina/fungizona.

De Hyclone (USA), se obtuvo medio de cultivo Dulbecco´s Eagle modificado enriquecido con F-12 (DMEM-F12) y suero fetal bovino (FBS).

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De Cell Signaling (USA) se adquirió policlonal anti LC3B (2775).

De Abnova (USA) se obtuvo monoclonal anti p62/SQSTM1.

De INVITROGEN Corporation (USA), anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a Alexa Fluor 488, anticuerpo anti-igG de cabra conjugado a Alexa Fluor 568 y medio de montaje para fluorescencia.

De Pierce Biotechnology, Inc. (USA) (Thermo Scientific), se adquirieron los anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa, anti-IgG de ratón, anti-IgG de cabra y anti-IgG de conejo, reactivo ECL para quimioluminescencia, cocktail de inhibidores de proteasas 100X y el estándar de peso molecular pre-teñido para geles de poliacrilamida-SDS.

De bio-WORLD (USA), se adquirió TEMED.

De Calbiochem, EMD Chemicals Inc (USA), se adquirió tween 20, βmercaptoetanol y rapamicina.

De Tocris Bioscience (USA), se adquirió L-690, 330.

De Bio-Rad (USA), se adquirió el reactivo de Bradford.

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3.2

Instrumentos.

Los equipos utilizados fueron los siguientes: pHmetro Radiometer Copenhagen PHM 83 Autocal, balanza Precisa 180ª, cámara de Neubauer VWR, centrífuga Eppendorf 5417-R, centrífuga Beckman Coulter Allegra 6, centrífuga Microv Fisher Scientific, incubador para cultivo NuaireTMDH Autoflow, gabinete de seguridad biológica NuaireTM Class II UN-425-600-E, microscopio confocal OLYMPUS Fluoview FV 1000, microscopio de epifluorescencia OLYMPUS BX 50 con cámara OLYMPUS U-TV0 5XC-3, microscopio invertido OLYMPUS CKX41, fuente de poder EPS 250 de Scientific Company, agitador magnético IKAMAGR RCT, sonicador Ultrasonic Homogenizer 4710 Cole Parmer Instruments Co. espectrofotómetro Aligent 8453, sistema de electroforesis y transferencia Mini ProteanR Tri-Carb 1600 TR, agitador orbital Lab-Line, baño 40 termorregulado Haake D8, freezer a -70ºC Foma Scientific Bio-freezer 8425, freezer a -20ºC Consul, refrigerador Fensa y Whirlpool, UltraLum Omega, lector de microplacas para luminiscencia Synergy 2 Biotek.

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3.3

Métodos.

3.3.1 Cultivo de células GC-1, GC-2 y Sertoli 42GPA9. Las células de la líneas celulares GC-1 (espermatogonia tipo B), GC-2 (espermatocito primario) y Sertoli 42GPA9 se cultivaron en medio DMEM-F12 suplementado con FBS (suero bovino fetal) al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 mg/ml y fungizona 50 ng/ml a 37ºC y CO2 al 5 %. 3.3.2 Inmunofluorescencia. Las células GC-1, GC-2 y Sertoli 42GPA9 fueron cultivadas sobre cubreobjetos redondos de vidrio (12mm), previamente tratados con colágeno, y una vez que alcanzaron la confluencia adecuada se les eliminó el medio de cultivo y se lavaron con PBS 1x frío, luego las células se fijaron con p-formaldehído 4% durante 15 minutos. Transcurridos los 15 minutos se agregó inmediatamente metanol frío para permeabilizar las células y se incubó por 10 minutos, posteriormente para bloquear se incubó con TBS 5% BSA 45 minutos todo esto se realizó a temperatura ambiente con agitación. Posteriormente se incubó con anticuerpo primario, se utilizó anti LC3B, el cual fue diluido en solución de bloqueo 1:100 y anti LAMP-2A 1:50 la incubación se realizó en una cámara húmeda a 4°C durante toda la noche. Luego las células en los cubreobjetos se lavaron 3 veces por 5 minutos con TBS 0,1% tween-20 y se incubó con anticuerpo secundario preparado en solución de bloqueo con una dilución de 1:400. Los anticuerpos fueros anti IgG de ratón conjugado a Alexa-flúor 488 y anticuerpo anti-igG de cabra conjugado a Alexa Fluor 568. Se utilizó DAPI (1:1000) como marcador de núcleo, la incubación fue de 2 horas a temperatura ambiente en un cámara oscura y húmeda. Posterior a esta incubación se

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realizaron 3 lavados de 5 minutos con TBS tween-20 en agitación a temperatura ambiente. Finalmente las muestras fueron montadas en portaobjetos con aproximadamente 5 μl de medio de montaje DAKO por cada cubre objeto y visualizadas en un microscopio confocal invertido. 3.3.3 Extracción y cuantificación de proteínas totales. A las células previamente cultivadas en placas se les extrajo el medio de cultivo y se lavaron con PBS 1x frío, luego se agregó tampón de lisis (0,1 M Tris-HCl, 15 mM NaCl, 0,5% NP40, pH 7,4). Se esperó aproximadamente 5 minutos y se despegaron las células de forma mecánica utilizando un rascador. Luego estas células fueron traspasadas a un tubo de 1,5 ml y centrifugadas por 12 minutos a 12000xg a 4 °C, se rescató el sobrenadante y se procedió a la cuantificación de las muestras. Las proteínas se cuantificaron utilizando el método de Bradford (Bradford et al, 1976). Se construyó una curva de calibración entre 0 y 40 μg de proteína en un volumen final de 200 μl. Se utilizó como estándar BSA (2 ug/μl) diluido en agua destilada. Para todas las lecturas se utilizó un blanco de agua destilada. Se adicionó a cada tubo de la curva y al blanco 40 μl del reactivo de Bradford y se incubó por 10 minutos a temperatura ambiente, todo esto se preparó en placas multipocillos de 96 pocillos. Finalmente se realizó la lectura de absorbancia en un lector de microplacas para luminiscencia a una longitud de onda de 595 nm.

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3.3.4 Separación electroforética de proteínas. Las muestras de proteínas fueron separadas electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 10% al 12%. El gel separador y el espaciador se prepararon a partir de una solución de acrilamida:bisacrilamida 29:0,8%. El gel separador se preparó con una concentración final de poliacrilamida de 15% para la detección de LC3 y 10% para la detección de p62, conteniendo Tris (pH 8,8) 175 mM; SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,04% y TEMED 0,03%. Mientras que el gel espaciador se preparó con una concentración final de poliacrilamida de 5% incluyendo Tris 75 mM (pH 6,8), 0,1% SDS, 0,01% persulfato de amonio y 0,04% TEMED. Las muestras de proteínas se calentaron a 95ºC por 5 minutos, las cuales posteriormente fueron cargadas en el gel (se cargaron 60µg de proteínas para la detección de LC3 y 40 µg para la detección de p62) realizándose la electroforesis a 110V por aproximadamente 2 horas en tampón de corrida (Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS 10%). Las proteínas separadas fueron transferidas a membranas de PVDF. 3.3.5 Transferencia de proteínas a membrana de PVDF. Finalizada la electroforesis, las muestras se electrotransfirieron a membranas de PVDF (difluoruro de polivinildeno; 0,45 micrones de poro, 100-145 μm de espesor). Sobre una esponja embebida en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 190 mM, metanol 20%) se depositó secuencialmente un trozo de papel de filtro (Whatman n° 1), la membrana de PVDF (previa activación de la membrana en metanol por 15 segundos), el gel a transferir, otro papel de filtro y luego otra esponja embebida en el misma tampón. Esto se colocó en una cámara de

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electrotransferencia conteniendo el tampón mencionado y se aplicó una intensidad de corriente de 400 mA por 90 minutos. 3.3.6 Análisis de Western blot. Las membranas se bloquearon durante 30 minutos con aproximadamente 25 ml de solución de bloqueo TBS 0,1% tween-20, 5% leche, luego se lavaron 2 veces con TBS 0,1% tween-20. Posteriormente se incubaron con los anticuerpos primarios de interés en diluciones de 1:5000 o 1:1000 dependiendo del anticuerpo. Esta incubación se realizó durante toda la noche a 4°C con agitación. Al día siguiente se recuperó el anticuerpo primario y se lavó 3 veces por 5 minutos con TBS 0,1% tween-20 en agitación a temperatura ambiente. Luego se procedió a la incubación con los respectivos anticuerpos secundarios conjugados a HRP con diluciones de 1:5000. Esta incubación fue a temperatura ambiente, durante una hora y en agitación. Una vez finalizada esta incubación las membranas se lavaron en las mismas condiciones que se lavó el anticuerpo primario. Finalmente el revelado del conjugado se realizó utilizando un método de quimioluminiscencia, el cual se basa en la emisión de luz no radiactiva detectando antígenos inmovilizados unidos directa o indirectamente con anticuerpos conjugados con HRP. Se vertió sobre las membranas una solución que contenía peróxido de hidrógeno y luminol. La exposición para el revelado de las membranas se realizó en un equipo UltraLum de Omega.

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3.3.7 Tratamiento de células con moduladores de autofagia. Los tres tipos celulares se cultivaron como ya se describió hasta alcanzar una confluencia de 80% o 50% dependiendo del experimento. Luego fueron tratadas con los diferentes moduladores de autofagia, cambiando el medio de cultivo antes de agregar los moduladores, las concentraciones de estos fueron las siguientes: LiCl 10 mM, rapamicina 5μM, bafilomicina 10 nM y L-690,330 100µM. Estos tratamientos se realizaron durante una hora. Para el control solo se realizó el cambio de medio de cultivo, excepto en los primeros experimentos en los que se agregó 0,1 % DMSO (solución en la que se re-suspendieron rapamicina, bafilomicina A1 y L-690, 330). Para la evaluación de los niveles de p62 se realizaron los mismos tratamientos y además se realizaron incubaciones durante 2, 6,12 y 24 horas. 3.3.8 Microscopía electrónica de transmisión. Células de Sertoli 42GPA9 fueron tratadas con LiCl 90mM por 24 horas y luego fueron analizadas mediante microscopía electrónica de transmisión como se describe en Picoli et al, 2006. 3.3.9 Análisis estadístico. La significancia de las diferencias entre tratamientos, para datos que cumplieron con los supuestos de pruebas paramétricas, fue obtenida con análisis de prueba tStudent. Para estas pruebas, diferencias con valores p