COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Exactitud relativa ó recuperación: Es la aproximación entre un resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado. Para el propósito de esta guía, es la cantidad de microorganismo recuperado entre la cantidad de microorganismo inoculado o nivel de fortificación. Fase estacionaria.- Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana se hace constante y antecede a la muerte microbiana. En esta etapa se puede conocer con cierta seguridad y durante un lapso corto de tiempo la concentración microbiana. Fortificación de la muestra. Inoculación de una cantidad conocida del o los microorganismos de prueba. Incertidumbre de medida: Parámetro, asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mesurando. Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e inferior, en el cual el analito puede cuantificarse con un nivel satisfactorio de repetibilidad y recuperación. Límite de detección: Es el numero más pequeño de microorganismos en una muestra que puede ser detectado bajo las condiciones de análisis. El limite microbiológico de una prueba determina la presencia o ausencia de microorganismos por ejemplo ausencia de Salmonella spp. en 25 g de muestra. Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito. Método Normalizado: Proceso de medición robusto donde pequeñas variaciones en el procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados. Métodos internacionalmente aceptados y validados. Nivel de fortificación o tamaño del inóculo: Es la cantidad conocida de microorganismos inoculados a una muestra. Protocolo para la evaluación del desempeño: Documento que describe los pasos a seguir durante la evaluación del desempeño de un método analítico microbiológico, cuyo fundamento se encuentra descrito en el presente documento. Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecución de la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente en situaciones normales. Evaluación del desempeño: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un método normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condiciones particulares del laboratorio. Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que un 2/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

método analítico validado internacionalmente cumple con su propósito en las condiciones particulares del laboratorio donde se realiza el análisis. Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos individuales obtenidos por la aplicación de un mismo procedimiento analítico, a diferentes porciones de la misma matriz, en las mismas condiciones de análisis (analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos de tiempo. Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos individuales obtenidos por la aplicación de un mismo procedimiento analítico, a diferentes porciones de la misma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de medición (personal) y en diferentes tiempos (o a intervalos de tiempos más largos).

4

DOCUMENTOS APLICABLES

4.1

USP 32, Validation of Alternative Microbiological Methods.

4.2

USP 32, Validation of Compendial Procedures

4.3

USP 32, Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical Articles

4.4

Dulce Toccheto S. Curso-teórico-práctico Validación de Métodos Microbiológicos bajo un Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia. Proyecto TCC/ Bolivia-México. 2007.

4.5

European Cooperation for Accreditation EA-04/10 Accreditation for Microbiological laboratories. 2002.

4.6

G.A. Leotta, I. Chinen. Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiología. Vol.37, No. 1 2005.

4.7

Guía de Validación de Métodos Analíticos. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos de México, A.C. Edición 2002.

4.8

ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods. First Edition.

4.9

ISO/TR 13843:2000 - Water Quality — Guidance on Validation of Microbiological methods. First Edition.

3/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

4.10

ISO 17994:2004 Water Quality—Criteria for Establishing Equivalence between Microbiological methods. First Edition.

4.11

The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf (febrero 2011)

4.12

Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods of Analysis. 2002. Disponible en http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-GuidelinesAppendix-X.pdf (febrero 2011)

5

DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD.

5.1

Estrategia para la evaluación del desempeño de los métodos de prueba microbiológicos. Para cada método de prueba a evaluar se deberá contar con protocolo para la evaluación del desempeño particular que describa el método a evaluar, la estrategia particular de evaluación, los materiales y reactivos y las especificaciones. Durante la ejecución del protocolo de evaluación se deberán documentar las actividades y los resultados. Verificar que todos los materiales, medios y reactivos cumplen con los criterios de calidad conforme se establece en el sistema de gestión de calidad y conforme a la NMX-EC-17025IMNC-2006. Antes de cada validación deberá comprobarse que el equipo utilizado, cumple con el calendario de mantenimiento y/o calibración de cada laboratorio. Con base en el protocolo de evaluación se deberá verificar que se cuenta con todos los materiales y reactivos, es conveniente contar con un cronograma de las actividades y los analistas que participaran en la evaluación del desempeño. La preparación del inóculo debe ser realizada por un solo analista durante el desarrollo de la evaluación del desempeño del método.

5.2

Selección y obtención de la matriz. Los criterios de selección de la matriz se deberán describir en el protocolo para la evaluación del desempeño de cada método, considerando los siguientes lineamientos:

4/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

•

Se deberán elegir las matrices representativas que tenga el alcance de la metodología a evaluar, una vez elegida, se deben hacer pruebas previas de ella para conocer su microbiota. Se deberá contar con cantidad suficiente de muestra para hacer todos los análisis. Las matrices elegidas y su justificación deben mencionarse en el protocolo de validación.

•

Cuando el método analítico a ser verificado se destina al análisis de varios tipos de alimentos, la matriz se escoge con base al cuadro de categorías que aparece en la ISO 16140, y será aquella donde se esperan las mayores dificultades para la recuperación del microorganismo de prueba con respecto de las matrices más analizadas en el laboratorio.

5.3

Preparación del inóculo

5.3.1

Determinación de la concentración de la cuenta bacteriana en la Fase estacionaria. Este procedimiento es general y adecuado para la mayoría de los microorganismos de prueba, pueden aplicarse variaciones en este, siempre que se obtengan inóculos constantes. Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba en 9ml de caldo BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento, incubar a 35ºC +/- 2ºC, por 22h a 24h, (este tiempo puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y el tipo de microorganismo del que se trate) del cultivo transferir un mililitro a 90ml de BHI e incubar a 35ºC +/- 2ºC, por 22h a 24h, a partir del cultivo hacer diluciones decimales, de cada una de ellas transferir por duplicado un mililitro a cajas de Petri y adicionar agar cuenta estándar, incubar a 35ºC +/- 2ºC, por 18h a 24h, realizar el conteo en cada dilución para conocer la concentración de microorganismos. Registrar los resultados indicando la concentración de microorganismos en cada dilución. Estos resultados servirán de referencia para la estimación de la dilución adecuada a utilizar durante la fortificación de las muestras en la evaluación del desempeño del método de prueba. Antes de cada prueba deberá repetirse la preparación del inóculo de forma idéntica que en la determinación de concentración de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria y cada inóculo deberá ser verificado por vaciado en placa utilizado al menos dos cajas. Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubación, volumen necesario que lleve la concentración microbiana, para fortificar cada una de las alícuotas de acuerdo al protocolo de evaluación de desempeño del método en particular. Durante su manipulación se recomienda sumergir el recipiente que contiene la FE en agua fría. Nota 2: Cuando la matriz sea sólida, fortificar las alícuotas. Si es líquida se puede fortificar la matriz completa o las alícuotas.

5/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

5.4

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Preparación de muestras Registrar la muestra con la siguiente información: • Fecha y hora de muestreo, • Tipo de muestra, • Procedencia ó lugar de muestreo, • Cantidad. Homogeneizar perfectamente y separar la muestra que se utilizará para el análisis. Si es perecedera, el sobrante se debe guardar en refrigeración. Se recomienda iniciar el análisis inmediatamente.

5.4.1

Fortificación de la muestra. En condiciones asépticas dividir la muestra cuantitativamente siguiendo el método de prueba. Inocular la muestra con una concentración conocida del microorganismo de prueba.

5.5

MÉTODOS CUALITATIVOS.

5.5.1

Criterios de Aceptación Parámetro Límite de detección Repetibilidad Reproducibilidad Incertidumbre

5.5.2

Criterio de aceptación Demostrar que el método es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las repeticiones. No más del 20 % de las repeticiones con resultados negativos al inocular menos de 5 UFC Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos en no más del 20 % cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno. Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a las mediciones.

Límite de detección Demostrar que el método es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las repeticiones. Microorganismo de Prueba: Utilizar al menos aquellos microorganismos indicados como control positivo en el método de prueba, el tamaño del inóculo deberá ser menor de 5 UFC. 6/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Matriz seleccionada: Verificar por sextuplicado la ausencia del microorganismo de prueba. Repeticiones: 30 repeticiones. Cálculos: Lectura =

No. de positivos × 100 No. de repeticiones

Ejemplo: Se desea validar el método para aislamiento de un patógeno; para la determinación del límite de detección deberá prepararse un inóculo de menos de 5 UFC del patógeno. Al realizar la estimación de la curva microbiana se determina que en la dilución 10-7, se obtienen 150 UFC/mL. Antes de la prueba deberá preparar un inóculo fresco, y realizar diluciones decimales hasta 10-9, a partir de esa dilución transferir dos mililitros a cada una de las 30 porciones de muestra. En paralelo verificar el inóculo, transfiriendo 1 mililitro de la suspensión a 6 cajas de Petri. Para la verificación del inóculo, incubar en condiciones adecuadas y hacer los cálculos para determinar la cantidad de microorganismos inoculados a la muestra. La prueba es válida si se inoculan menos de 5 UFC. Para las muestras inoculadas proceder como se indica en el método de prueba. Registrar los resultados de ausencia y presencia. Ausencia. 5 Presencia 25 Entonces:

Lectura =

25 × 100 ⇒ Lectura = 83.33% 30

Conclusión: Se cumple con el criterio de aceptación

7/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

5.5.3

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Repetibilidad Los resultados de métodos cualitativos se registran comúnmente como positivo ó negativo ó presencia-ausencia por lo que la repetibilidad se calcula utilizando los datos obtenidos en la prueba de limite de detección. El criterio de aceptación es igual o menor al 20%. Ejemplo: Usando los datos del ejemplo de límite de detección. Supongamos que: Ausencia 5 Presencia 25 Entonces:

Lectura =

5 ×100 ⇒ Lectura = 16.66% 30

Conclusión: Se cumple con el criterio de aceptación 5.5.4

Reproducibilidad Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos menores o iguales al 20 % cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno. Las repeticiones deberán suceder en momentos diferentes. Ejemplo: Analista Uno Ausencia: 1 Presencia: 9 Analista Dos Ausencia: 2 Presencia: 8

5.5.5

Lectura =

1 ×100 ⇒ Lectura = 10% 10

Cumple el criterio de repetibilidad

Lectura =

2 ×100 ⇒ Lectura = 20% 10

Cumple el criterio de repetibilidad

Se cumple el criterio de reproducibilidad

Incertidumbre del método Microbiológico (Eurachem:2002) El concepto de incertidumbre no puede ser aplicado directamente a resultados cualitativos en pruebas microbiológicas por lo que solo se mencionan las siguientes: 8/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Fuentes de Incertidumbre Distribución de los microorganismos en la muestra; Efecto de la matriz; Personal operativo; Mediciones (pesada o medición de la muestra); Diluciones y volúmenes; Homogeneización; Calidad de los medios; Tiempo hasta la inoculación; Temperatura de incubación;

5.6

MÉTODOS CUANTITATIVOS. Parámetro Repetibilidad Reproducibilidad Recuperación Sesgo Incertidumbre

5.6.1

Criterio de aceptación r < 30 % R < 30 % Entre el 90% y el 110% log La diferencia absoluta de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log a) Especificar el mensurando. b) Identificar las fuentes de incertidumbre

Selección de Matrices Muestras naturalmente contaminadas. Para evaluar la capacidad de un método para recuperar de forma consistente un microorganismo o grupo de microorganismos de interés, es importante contar con muestras naturalmente contaminadas, estas deberán de ser comprobadas por el método de prueba por duplicado. Estas muestras deberán ser utilizadas para la comparación de muestras. Muestras no contaminadas. Se debe contar con matrices no contaminadas, es decir, que no cuenten con el microorganismo de interés (en algunos casos pueden producirse artificialmente mediante esterilización). Se deberá comprobar usando el método de prueba por duplicado. Los resultados de las matrices deberán registrarse e incluirse en el informe de validación.

9/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

5.6.2

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Repetibilidad. La determinación de la repetibilidad (r) sirve para verificar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por el mismo analista, en las mismas condiciones, en la misma muestra, en intervalos cortos de tiempo. Analito: Usar una cepa del microorganismo de interés asociado a la prueba. Número de repeticiones: 30 (a excepción NMP 10 repeticiones) Nivel de fortificación: 1 nivel (valor medio) 5.6.2.1 Muestras no contaminadas. Fortificación de la muestra. Inocular una concentración conocida de microorganismos tal que al concluir el análisis se recuperen cuentas de aproximadamente el valor medio del intervalo de lectura. 5.6.2.2 Muestras naturalmente contaminadas. Verificar por duplicado la concentración de los microorganismos. Ejemplo Cuando el método de prueba indica que se deben contar cajas con cuentas entre 25 y 250 UFC, se utilizan 25 g de muestra y se coloca 1 ml de cada dilución por placa. El inóculo en la muestra debe ser tal que después del método de análisis se recuperen aproximadamente 80 UFC Límite Inferior log(25) La diferencia Diferencia log(25) + 0.5 UFC entre log(250) y log(25) entre 2 25 1.40 Límite Superior log(250) 1 0.5 1.90 79 250 2.40 Límite Inferior log(15) La diferencia Diferencia log(15) + 0.5 UFC entre log(150) y log(15) entre 2 15 1.18 Límite Superior log(150) 1 0.5 1.68 47 150 2.18 Si se considera que se realizará una sola dilución entonces la concentración del microorganismo en la dilución 10-1 deberá ser de aproximadamente 800 UFC, pero considerando que el tamaño de la muestra es de 25 g entonces se deberían inocular aproximadamente 2000 UFC Nota 3: Todos los inóculos deben ser verificados utilizando la técnica de vaciado en placa, empleando para el cálculo 6 cajas.

10/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Desarrollo Partiendo de 30 porciones inoculadas de la muestra o de muestras naturalmente contaminadas, proceder como se indica en el método de prueba.

Cálculos Calcular el log de las UFC contadas por placa en cada repetición A

B

C

D

E

1

Repetición

Placa 1

Placa 2

log(Placa 1)

log(Placa 2)

2

Repetición 1

70 UFC

90 UFC

1.85

1.95

3

Repetición 2

71 UFC

91 UFC

1.85

1.96

4

Repetición 3

80 UFC

80 UFC

1.90

1.90

5

Repetición 4

76 UFC

82 UFC

1.88

1.91

6

Repetición 5

78 UFC

82 UFC

1.89

1.91

7

Repetición 6

77 UFC

88 UFC

1.89

1.94

8

Repetición 7

56 UFC

80 UFC

1.75

1.90

9

Repetición 8

87 UFC

80 UFC

1.94

1.90

10

Repetición 9

77 UFC

86 UFC

texto

# "UFC"

# "UFC"

Excel

1.89 =LOG(B2)

1.93 =LOG(C2)

Calcular la desviación estándar relativa (DSR) y elevar al cuadrado s RSD = x 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Excel

D log(Placa 1) 1.85 1.85 1.90 1.88 1.89 1.89 1.75 1.94 1.89 =LOG(B2)

E log(Placa 2) 1.95 1.96 1.90 1.91 1.91 1.94 1.90 1.90 1.93 =LOG(C2)

F Desviación Estándar 0.077 0.076 0.000 0.023 0.015 0.041 0.110 0.026 0.034 =DESVEST(D2:F:2)

G MEDIA 1.900 1.905 1.903 1.897 1.903 1.915 p1.826 1.921 1.910 =PROMEDIO(D2:E2)

H DSR 0.0406 0.0400 0.0000 0.0123 0.0081 0.0214 0.0600 0.0134 0.0178 =(F2/G2)

Calcular la media cuadrática de la DSR usando la siguiente fórmula

RDS12 + RDS2 2 +... + RDSn2 RSDA = n 11/23

I DSR2 0.001651 0.001600 0.000000 0.000151 0.000065 0.000458 0.003600 0.000180 0.000316 =H2^2

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Para determinar la repetibilidad del método se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la distribución normal de Z con 95% de confianza. Repetibilidad (r)= 2.8 X RSD de repetibilidad I DSR2 0.001651 0.001600 0.000000 0.000151 0.000065 0.000458 0.003600 0.000180 0.000316 "=H2^2

5.6.3

J DSR(a)

K r

0.0299

0.0836

"=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR(I2:I10)))

"=J2*2.28

Reproducibilidad La determinación de la reproducibilidad (R) sirve para verificar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por diferentes analistas, en las mismas condiciones, en la misma muestra, en diferentes tiempos. Desarrollo. Utilizando el método de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes procederán como se describió para repetibilidad hasta el cálculo del cuadrado de la DSR Ejemplo: 1

Analista

2 3 4 5 6 7 8 9 10

A

11

Analista

12 13 14 15 16 17 18 19 20

B

A

B

C

Repetición Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 Repetición 4 Repetición 5 Repetición 6 Repetición 7 Repetición 8 Repetición 9

Placa 1 79 UFC 60 UFC 77 UFC 77 UFC 89 UFC 69 UFC 77 UFC 80 UFC 78 UFC

Placa 2 80 UFC 67 UFC 86 UFC 70 UFC 70 UFC 89 UFC 80 UFC 80 UFC 83 UFC

Repetición Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 Repetición 4 Repetición 5 Repetición 6 Repetición 7 Repetición 8 Repetición 9

Placa 1 70 UFC 89 UFC 80 UFC 70 UFC 70 UFC 89 UFC 80 UFC 80 UFC 83 UFC

Placa 2 79 UFC 80 UFC 77 UFC 77 UFC 89 UFC 69 UFC 77 UFC 80 UFC 78 UFC

D Log (Placa 1) 1.90 1.78 1.89 1.89 1.95 1.84 1.89 1.90 1.89 Log (Placa 1) 1.85 1.95 1.90 1.85 1.85 1.95 1.90 1.90 1.92

12/23

E Log (Placa 2) 1.90 1.83 1.93 1.85 1.85 1.95 1.90 1.90 1.92 Log (Placa 2) 1.90 1.90 1.89 1.89 1.95 1.84 1.89 1.90 1.89

F

G

H

I

D.E. 0.004 0.034 0.034 0.029 0.074 0.078 0.012 0.000 0.019

MEDIA 1.900 1.802 1.910 1.866 1.897 1.894 1.895 1.903 1.906

DSR 0.0020 0.0188 0.0178 0.0157 0.0389 0.0413 0.0062 0.0000 0.0100

DSR2 0.000004 0.000354 0.000316 0.000246 0.001511 0.001703 0.000038 0.000000 0.000100

D.E. 0.037 0.033 0.012 0.029 0.074 0.078 0.012 0.000 0.019

MEDIA 1.871 1.926 1.895 1.866 1.897 1.894 1.895 1.903 1.906

DSR 0.0198 0.0170 0.0062 0.0157 0.0389 0.0413 0.0062 0.0000 0.0100

DSR2 0.000394 0.000289 0.000038 0.000246 0.001511 0.001703 0.000038 0.000000 0.000100

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Calcular la media cuadrática utilizando la siguiente fórmula:

RDS12 + RDS2 2 +... + RDSn2 RSDAB = n Para determinar la reproducibilidad del método se multiplica la RSD por 2.8 que es el valor de la distribución normal de Z con 95% de confianza. Reproducibilidad (R) = 2.8 X RSD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

I DSR2 0.000004 0.000354 0.000316 0.000246 0.001511 0.001703 0.000038 0.000000 0.000100 DSR2 0.000394 0.000289 0.000038 0.000246 0.001511 0.001703 0.000038 0.000000 0.000100

J DSR(ab)

0.0309

K R

J

K

"=RAIZ((SUMA(I2:I10,I12:I20)/CONTAR(I2:I10,I12:I20)))

"=J2*2.28

0.0865

5.6.4 Recuperación Es la cantidad de UFC que el método de prueba es capaz de recuperar cuando es inoculado un numero conocido de microorganismos. Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la cantidad de UFC, en cada repetición y calcular el logaritmo de cada cuenta, promediar los logaritmos. Calcular el logaritmo del inóculo verificado. Finalmente calcular el % de recuperación % Recuperación= Media de la cuenta de logaritmo de las cuentas x100 Logaritmo de las UFC inoculadas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A Analista

A

B Repetición Repetición 1 Repetición 2 Repetición 3 Repetición 4 Repetición 5 Repetición 6 Repetición 7 Repetición 8 Repetición 9

C Placa 1 79 UFC 60 UFC 77 UFC 77 UFC 89 UFC 69 UFC 77 UFC 80 UFC 78 UFC

D Placa 2 80 UFC 67 UFC 86 UFC 70 UFC 70 UFC 89 UFC 80 UFC 80 UFC 83 UFC

E Cuenta 80 UFC 64 UFC 82 UFC 74 UFC 80 UFC 79 UFC 79 UFC 80 UFC 81 UFC =PROMEDIO(B2:C2)

F log(Cuenta ) 1.90 1.80 1.91 1.87 1.90 1.90 1.89 1.90 1.91 =LOG(E2)

13/23

G Media (log(Cuenta ))

H Inóculo

I log (Inóculo)

J % Recuperación

1.89

80 UFC

1.90

99%

"=LOG(H2)

"=G2/I2

=PROMEDIO(F2:F10)

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

5.6.5

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Sesgo

El sesgo es la diferencia absoluta entre el valor conocido como verdadero y el valor obtenido experimentalmente. A partir de los cálculos de recuperación, calcular el valor absoluto de la diferencia de la media de los logaritmos de las cuentas menos el logaritmo del inóculo utilizado. Sesgo=
 − 
Donde Ve= valor esperado Vo= valor obtenido 5.6.6

Incertidumbre.

Especificar el mensurando. Identificar las fuentes de incertidumbre 5.7 Criterios de aceptación para la evaluación de métodos microbiológicos. Cuantitativos Parámetro Repetibilidad Reproducibilidad Recuperación Sesgo Incertidumbre

Criterio de aceptación r < 30 % R < 30 % Entre el 90% y el 110% log La diferencia absoluta de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log a) Especificar el mensurando. b) Identificar las fuentes de incertidumbre

Cualitativos Parámetro Límite de detección Repetibilidad Reproducibilidad Incertidumbre

Criterio de aceptación Demostrar que el método es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80 % de las repeticiones. No más del 20 % de las repeticiones con resultados negativos al inocular menos de 5 UFC Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos menores o iguales al 20 % cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno. Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a las mediciones.

14/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

5.8 Elaboración del protocolo Elaborar un protocolo de validación que incluya lo siguiente: Título 1.Objetivo 2. Campo de aplicación 3. Método de ensayo 4. Equipo 5. Materiales 6. Reactivos y Medios de Cultivo

Protocolo para la evaluación del desempeño del método: el nombre y clave del método que se pretende evaluar. Considerar los parámetros de desempeño a evaluar y el analito a determinar Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la validación Elaborar un diagrama de flujo del método en cuestión Mencionar el equipo a utilizar y las condiciones que requiere (verificación y/o calibración, si aplica) Indicar los materiales a utilizar a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado. b) Indicar los medios de cultivo a utilizar c) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los inóculos

Indicar las características, forma de almacenamiento y cantidades de 7. Muestras muestra estimadas para llevar a cabo la validación. Detallar la preparación de los blancos de muestra o muestras adicionadas. 8. Desarrollo Detallar las instrucciones para cada uno de los parámetros de desempeño experimental a ensayar. 9. Resultados Formato para el registro de resultados Establecer para cada parámetro de desempeño la herramienta estadística 10. Análisis estadístico a utilizar para su evaluación. 11. Criterios de Establecer los criterios de aceptación que deben cumplirse con su aceptación respectiva referencia bibliográfica. Nota: El protocolo debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó.

5.9 Ejecución del protocolo Deberán documentarse todos los resultados en los formatos descritos en sus protocolos, todos los registros deberán estar firmados por el personal que realiza la actividad y mostrar evidencia de supervisión. Cuando se realice un cambio con respecto al protocolo establecido, este deberá estar documentado y autorizado.

15/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

5.10 Elaboración del Informe Elaborar un informe de resultados de validación que incluya lo siguiente: Título 1.Objetivo 2. Campo de aplicación 4. Equipo 5. Materiales 6. Reactivos y Medios de cultivo

7. Muestras

8. Método de ensayo

Informe de resultados de la evaluación del desempeño del método: el nombre y clave del método que se evalúo. Considerar los parámetros de desempeño evaluados y el analito determinado. Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplicó la validación Listado de los equipos utilizados y su estado de calibración/verificación/mantenimiento Listado de los materiales utilizados. Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad. Indicar las características, forma de almacenamiento, marca, presentación, caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar a cabo la validación. Detallar la preparación de los blancos de muestra o muestras adicionadas utilizadas. Incluir el diagrama de flujo del método.

9. Desarrollo experimental

Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los parámetros de desempeño. Presentación de resultados en forma de tablas, señalando fechas de inicio 10. Resultados y término, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba, matriz, unidades y clave de bitácora o registro primario Presentar en forma de tabla los criterios de aceptación considerados y los 11. Análisis de resultados resultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes. Efectuar una conclusión final en donde se señale que el método se ajusta al 12. Conclusión uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025) 13. Bibliografía Referencias utilizadas. Los que aplique: • Registros primarios, • Bases de datos utilizadas • Certificados de equipos, 14. Anexos • Medios de cultivo • Cepas • Formatos de verificación, • Gráficos de control, etc. Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elaboró, revisó y aprobó. 16/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

6.0 NOTIFICACIÓN DE VIGENCIA Se otorga un periodo de transición de 180 días contados a partir de la fecha de publicación para que los laboratorios que se encuentren autorizados o en proceso del mismo se apeguen a éstos criterios. Para los laboratorios que soliciten autorización posterior a la fecha de publicación, deberán cumplir éstos criterios de inicio. Estos criterios se aplicarán en todos los procesos de evaluación que se realicen a los 180 días naturales, a partir de la fecha de publicación del documento en la página web de la COFEPRIS.

17/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Anexo Informativo 1 Guía Informativa para la fortificación de una matriz La fortificación de muestras se hace por medio de la adición de diluciones conocidas del microorganismo a prueba, a partir de su Fase Estacionaria (FE), en la matriz en cuestión, como sigue: Estimación de la dilución de trabajo A partir de un cultivo del microorganismo de interés en BHI (o cualquier otro medio de enriquecimiento). Hacer diluciones decimales hasta 10-9 en agua peptonada amortiguada al 0.1%; o el diluyente que utilice el laboratorio. Hacer recuento por triplicado de las diluciones, 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9 en agar soya tripticaseina o Agar cuenta estándar. Realizar las lecturas y cálculos de los números de células en cada una de las diluciones para establecer la dilución que será usada en la fortificación de la matriz y registrar los resultados de los recuentos y cálculo. Preparación del Inóculo Preparar un nuevo cultivo en caldo BHI, preparar las diluciones necesarias con base en los resultados obtenidos en la estimación de la dilución de trabajo, verificar la concentración del inóculo por sextuplicado.

18/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Anexo Informativo 2 Guía informativa de formatos Cuadro 1: VALIDACIÓN PARCIAL DE:

FASE ESTACIONARIA Analista: Nombre del microorganismo: Caldo:

Fecha:

Volumen de caldo:

Intervalos de tiempo de lectura: Horas

vol. de inóculo en placa

Dilución

Temperatura y tiempo total de incubación: FE en UFC/mL=

Cuenta UFC Placa 1

Cuenta UFC Placa 2

Promedio de cuentas

UFC/mL

Cálculos:

Cuadro 2: VALIDACIÓN PARCIAL DE:

CÁLCULO DE INÓCULOS Analista: Nombre del microorganismo:

Fecha:

Parámetro de desempeño: FE en UFC/mL= Dilución de FE

Concentración de UFC/mL

Dilución

Nivel y concentración a la que se quiere llegar en UFC/g ó mL

Cálculos:

19/23

Dilución seleccionada

Volumen necesario

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Cuadro 3: Análisis de la matriz en estudio (prueba de ausencia del analito). Matriz:

Método de prueba:

Fecha:

Analito:

UFC/mL en FE: _________________

Analista: Parámetro de desempeño: Alícuotas de 25 g 1 2 3 4 5 6

Resultado del análisis

Observaciones

Cuadro 4: Cálculos para la obtención de los datos de la dilución y el volumen seleccionado de la FE para fortificar las alícuotas de la matriz en estudio del LD. Matriz: Fecha: Parámetro de desempeño: Límite de detección Nivel a confirmar: LD no declarado: _______ UFC/25g LD declarado:_______ No. de alícuotas: _____________

Analista(s): Método de prueba: Analito: ________________________________________ No. de UFC/mL en FE: ____________________________ Niveles que se prueban:

Cantidad de muestra por alícuota: _________

Nivel: ________ Dilución seleccionada de la FE: Concentración en UFC/mL que corresponde a la dilución seleccionada: Cálculos:

RESULTADOS: Dilución de FE:___________ Volumen de FE:___________

20/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Cuadro 5: Resultados del parámetro de Límite de Detección Matriz:

Método de prueba:

Fecha:

Analito:

UFC/mL en ________

No. de replicas del nivel declarado: 30 FE:

Analista: Nivel de fortificación (N1)

Concentración esperada en UFC/25g

Resultado (registrar (+) o (-) )

No. total de positivos x 100 / No. total de alícuotas

1 2

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15…….30 R= resultado, en esta tabla se registran 3 porque se hace la determinación por nivel para 3 medios de cultivo en el caso de Salmonella. N1= nivel declarado en el método de prueba.

21/23

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Anexo Informativo 3 Guía informativa para la construcción de hojas de cálculo Porcentaje de recuperación Analista

Repeti ción

Placa 1

Placa 2

Cuenta =PROMEDIO(C2:D2) =PROMEDIO(C3:D3) =PROMEDIO(C4:D4) =PROMEDIO(C5:D5) =PROMEDIO(C6:D6) =PROMEDIO(C7:D7) =PROMEDIO(C8:D8) =PROMEDIO(C9:D9) =PROMEDIO(C10:D10)

=CONCATENAR("log(",E 1,")") =LOG(E2) =LOG(E3) =LOG(E4) =LOG(E5) =LOG(E6) =LOG(E7) =LOG(E8) =LOG(E9) =LOG(E10)

Cuenta =AVERAGE(C2:D2) =AVERAGE(C3:D3) =AVERAGE(C4:D4) =AVERAGE(C5:D5) =AVERAGE(C6:D6) =AVERAGE(C7:D7) =AVERAGE(C8:D8) =AVERAGE(C9:D9) =AVERAGE(C10:D10)

=CONCATENATE("log(",E 1,")") =LOG(E2) =LOG(E3) =LOG(E4) =LOG(E5) =LOG(E6) =LOG(E7) =LOG(E8) =LOG(E9) =LOG(E10)

=CONCATENAR("Media (",F1,")")

Inóculo

=PROMEDIO(F2:F10)

=CONCATENAR("log (",H1,")")

=LOG(H2)

% Recuperación

=G2/$I$2

Sesgo Analista

Repeti ción

Placa 1

Placa 2

=CONCATENATE("Media (",F1,")")

Inóculo

=CONCATENATE("log (",H1,")")

=AVERAGE(F2:F10)

=LOG(H2)

SESGO

=ABS(G2I2)

Reproducibilidad Analista

Analista

R ep eti ci ón

R ep eti ci ón

Plac a1

Plac a1

Plac a2

Plac a2

=CONCATENAR("log( ",C1,")")

=CONCATENAR("log( ",D1,")")

=LOG(C2)

=LOG(D2)

=LOG(C3)

=LOG(D3)

=LOG(C4)

=LOG(D4)

=LOG(C5)

=LOG(D5)

=LOG(C6)

=LOG(D6)

=LOG(C7)

=LOG(D7)

=LOG(C8)

=LOG(D8)

=LOG(C9)

=LOG(D9)

=LOG(C10)

=LOG(D10)

=CONCATENAR("log( ",C11,")")

=CONCATENAR("log( ",D11,")")

=LOG(C12)

=LOG(D12)

=LOG(C13)

=LOG(D13)

=LOG(C14)

=LOG(D14)

=LOG(C15)

=LOG(D15)

=LOG(C16)

=LOG(D16)

=LOG(C17)

=LOG(D17)

=LOG(C18)

=LOG(D18)

=LOG(C19)

=LOG(D19)

=LOG(C20)

=LOG(D20)

Desviación Estandar =DESVEST(E2 :F2) =DESVEST(E3 :F3) =DESVEST(E4 :F4) =DESVEST(E5 :F5) =DESVEST(E6 :F6) =DESVEST(E7 :F7) =DESVEST(E8 :F8) =DESVEST(E9 :F9) =DESVEST(E1 0:F10)

Desviación Estandar =DESVEST(E1 2:F12) =DESVEST(E1 3:F13) =DESVEST(E1 4:F14) =DESVEST(E1 5:F15) =DESVEST(E1 6:F16) =DESVEST(E1 7:F17) =DESVEST(E1 8:F18) =DESVEST(E1 9:F19) =DESVEST(E2 0:F20)

22/23

MEDIA =PROMEDIO(E 2:F2) =PROMEDIO(E 3:F3) =PROMEDIO(E 4:F4) =PROMEDIO(E 5:F5) =PROMEDIO(E 6:F6) =PROMEDIO(E 7:F7) =PROMEDIO(E 8:F8) =PROMEDIO(E 9:F9) =PROMEDIO(E 10:F10)

MEDIA =PROMEDIO(E 12:F12) =PROMEDIO(E 13:F13) =PROMEDIO(E 14:F14) =PROMEDIO(E 15:F15) =PROMEDIO(E 16:F16) =PROMEDIO(E 17:F17) =PROMEDIO(E 18:F18) =PROMEDIO(E 19:F19) =PROMEDIO(E 20:F20)

DSR =G2/H 2 =G3/H 3 =G4/H 4 =G5/H 5 =G6/H 6 =G7/H 7 =G8/H 8 =G9/H 9 =G10/ H10

DSR 2 =I2^ 2 =I3^ 2 =I4^ 2 =I5^ 2 =I6^ 2 =I7^ 2 =I8^ 2 =I9^ 2 =I10 ^2

DSR =G12/ H12 =G13/ H13 =G14/ H14 =G15/ H15 =G16/ H16 =G17/ H17 =G18/ H18 =G19/ H19 =G20/ H20

DSR 2 =I12 ^2 =I13 ^2 =I14 ^2 =I15 ^2 =I16 ^2 =I17 ^2 =I18 ^2 =I19 ^2 =I20 ^2

DSR(ab)

R

=RAIZ((SUMA(J2:J10,J12:J20)/CO NTAR(J2:J10)))

=K2* 2.8

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA GUIA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE MÉTODOS DE PRUEBA MICROBIOLÓGICOS. Rev. No.: 0

FECHA: 2011-03-28

CLAVE: CCAYAC-P-062

Repetibilidad Repetici ón

Placa 1

Placa 2

=CONCATENAR("log(", B1,")")

=CONCATENAR("log(", C1,")")

=LOG(B2)

=LOG(C2)

=LOG(B3)

=LOG(C3)

=LOG(B4)

=LOG(C4)

=LOG(B5)

=LOG(C5)

=LOG(B6)

=LOG(C6)

=LOG(B7)

=LOG(C7)

=LOG(B8)

=LOG(C8)

=LOG(B9)

=LOG(C9)

=LOG(B10)

=LOG(C10)

Desviación Estandar =DESVEST(D2:E 2) =DESVEST(D3:E 3) =DESVEST(D4:E 4) =DESVEST(D5:E 5) =DESVEST(D6:E 6) =DESVEST(D7:E 7) =DESVEST(D8:E 8) =DESVEST(D9:E 9) =DESVEST(D10: E10)

23/23

MEDIA =PROMEDIO(D2: E2) =PROMEDIO(D3: E3) =PROMEDIO(D4: E4) =PROMEDIO(D5: E5) =PROMEDIO(D6: E6) =PROMEDIO(D7: E7) =PROMEDIO(D8: E8) =PROMEDIO(D9: E9) =PROMEDIO(D10: E10)

DSR =F2/G2 =F3/G3 =F4/G4 =F5/G5 =F6/G6 =F7/G7 =F8/G8 =F9/G9 =F10/G 10

DSR2 =H2^ 2 =H3^ 2 =H4^ 2 =H5^ 2 =H6^ 2 =H7^ 2 =H8^ 2 =H9^ 2 =H10 ^2

DSR(a)

r

=RAIZ((SUMA(I2:I10)/CONTAR (I2:I10)))

=J2*2 .8