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int. Epiz.,

1989, 8 (4), 1021-1029.

Comparación de la especificidad de las pruebas tuberculínicas cervical y caudal en bovinos de Uruguay F. ERRICO *, I.N. DE KANTOR **, J. BALTAR ***, M. SILVA * y A. MILLAN ***

Resumen: Se evaluó la especificidad de las pruebas tuberculínicas cervical y caudal simple y comparativa, realizadas en forma simultánea con tuberculinas PPD bovina y aviar de diferente origen en 60 bovinos de un área de Uruguay libre de tuberculosis. Las respuestas obtenidas, medidas por el aumento del grosor de la piel, variaron para los PPD bovinos entre 0 y 2,2 mm en la prueba cervical, y entre 0 y 1,7 mm en la prueba caudal. De acuerdo con los criterios de interpretación, todos los animales fueron tuberculino-negativos. La diferencia entre las reacciones observadas y el valor mínimo positivo fue menor para la prueba cervical simple que para la caudal y la comparativa cervical. Con esta última, las reacciones a PPD aviar fueron mayores de 2,5 mm en 4 de los 60 animales que fueron sacrificados sin hallarse lesiones, aislándose en dos de ellos micobacterias pertenecientes a los Complejos Mycobacterium avium y M. terrae. De acuerdo con estos resultados y teniendo en cuenta la operatividad y el costo, se recomienda, para la vigilancia epidemiológica en situaciones semejantes a las del estudio, el empleo de la prueba caudal, cuya sensibilidad ha sido también comprobada en otros estudios. En casos de interpretación dudosa, o rebaños con historia de sensibilización por otras micobacterias, podría emplearse como segunda prueba la comparativa cervical. PALABRAS CLAVE: Especificidad - Pruebas tuberculínicas - Tuberculosis bovina - Tuberculina PPD bovina y aviar - Uruguay.

INTRODUCCIÓN El control de la tuberculosis bovina se basa en la identificación del animal reactor a la prueba tuberculínica y su posterior sacrificio. Se observa que algunos animales

* C e n t r o de Investigaciones Veterinarias «Miguel C . R u b i n o » ( C I V E T ) , C . C . 6577, M o n t e v i d e o , Uruguay. ** C e n t r o P a n a m e r i c a n o de Zoonosis ( C E P A N Z O , O P S / O M S ) , C . C . 3092, C o r r e o C e n t r a l , 1000 Buenos Aires, A r g e n t i n a . !

*** Dirección de L u c h a c o n t r a la Fiebre A f t o s a ( D I L F A ) , R u t a 8, Brig. G r a l . J . A . Lavalleja, K m . 29, P a n d o , Canelones, U r u g u a y .

1022 reaccionantes n o presentan lesiones tuberculosas en la autopsia. Este fenómeno es relativamente más frecuente cuando la prevalencia de tuberculosis es m u y baja, en las últimas etapas del p r o g r a m a de control y erradicación ( 1 , 8). C u a n d o u n animal reactor a la tuberculina P P D bovina no presenta lesiones semejantes a tuberculosis y t a m p o c o se cultiva Mycobacterium bovis de muestras de sus tejidos, la reacción tuberculínica se considera « n o específica». Estas reacciones suelen ser debidas a sensibilización del animal por otras micobacterias que poseen antígenos comunes con el M. bovis, y que p o r esa razón determinan una respuesta cruzada al P P D bovino. C u a n d o la frecuencia relativa de estas situaciones a u m e n t a , se recomienda emplear la prueba tuberculínica comparativa, con tuberculinas P P D bovina y aviar (13, 14). Al emplear esta prueba, en los casos de infección debida al M. avium o M. johnei, o bien de sensibilización por otras micobacterias de escasa patogenicidad, especialmente las incluidas en el grupo III de la clasificación de Runyon, las respuestas al P P D aviar son mayores que al P P D bovino, d a n d o así mayor seguridad en la identificación de los animales positivos verdaderos (infectados por M. bovis). E n U r u g u a y se han aislado micobacterias del Complejo M. avium (MAC) de bovinos y de suinos con lesiones granulomatosas, y también de muestras de ganglios suinos sin lesiones (4, 5, 15). Al igual que en varios otros países de América Latina, en Uruguay las tuberculinas P P D se preparan con métodos estandarizados, y la potencia de cada lote es controlada en cobayos (3). La especificidad de la prueba, es decir su capacidad de no dar respuestas positivas en animales no infectados por M. bovis, h a cobrado particular importancia, ya que en base a u n p r o g r a m a voluntario de los productores la prevalencia de infección en ganado lechero disminuyó de 4 , 9 % en 1965 a 0 , 0 1 % en 1984, siendo 0,005% en ganado de carne (2). El objetivo del presente trabajo h a sido determinar la especificidad del P P D y de los distintos métodos de prueba tuberculínica en bovinos de u n área libre de tuberculosis.

MATERIALES Y MÉTODOS Tuberculinas PPD Se emplearon tuberculinas-PPD producidas en el Centro « M . C . Rubino» (CIVET) y en C E P A N Z O ( C P Z ) : los lotes de P P D bovino 1-86 C I V E T y 1-85 C P Z y P P D aviar: 1-86 C I V E T y 1-85 C P Z , todos elaborados de acuerdo con métodos ya descriptos (3), a partir de las cepas M. bovis A N 5 (origen Centraal Diergeneeskundig Instituut; CDI, Holanda) y M. avium D4. El P P D bovino se empleó en concentración de 1,0 m g / m l , y el P P D aviar, 0,5 m g / m l .

Sensibilidad de los PPD La potencia demostrada en cobayos es u n indicador de la sensibilidad de cada P P D bovino p a r a detectar tuberculosis en el g a n a d o . E n este caso la potencia del P P D C I V E T fue ajustada a la del P P D C P Z , de acuerdo con los resultados de esas

1023 pruebas en cobayos (3). El lote de P P D bovino C P Z , a su vez, había presentado u n a potencia relativa frente al P P D M. bovis estándar de la C o m u n i d a d Económica Europea (ECS), de 0,89. Este último P P D ECS fue t o m a d o como referencia (16). La potencia del lote de P P D aviar C P Z , cuantificada en relación al estándar internacional de P P D aviar, fue de 20.000 U l / m l . La sensibilidad del P P D bovino 1-86 C I V E T h a sido controlada p o r su uso en el diagnóstico de rebaños infectados, seguida p o r el sacrificio y autopsia de los reactores de acuerdo con las normas del p r o g r a m a de Uruguay.

Prueba de especificidad Se emplearon 60 bovinos hembras identificados con caravanas, de raza Hereford y Polled Hereford, de 4 a 9 años de edad y con pesos entre 300 y 600 kg, pertenecientes a D I L F A , criados en la única área de Uruguay que lleva m á s de 10 años c o m p r o b a d a m e n t e libre de tuberculosis bovina: las islas y penínsulas del Lago de Rincón del Bonete. E n cada animal se efectuaron simultáneamente las pruebas siguientes: a) Ano-caudal: Se inocularon por vía intradérmica 0,1 ml de cada P P D bovino, en el tercio medio del pliegue ano-caudal derecho el P P D C I V E T y en el izquierdo el P P D C P Z . Previamente a la inoculación se midieron los pliegues con u n calibre (cutímetro) con precisión de 0,5 m m . A las 72 ( ± 6) horas se volvieron a medir, anotándose los incrementos del espesor observados. L a misma persona realizó todas las lecturas. El criterio de interpretación de esta prueba en Uruguay es: - positiva:

5 m m o m á s de aumento del espesor de la piel;

- dudosa:

entre 3 y 4,9 m m ;

- negativa:

menor de 3 m m .

b) Comparativa cervical: Se recortó el pelo en dos áreas de 3 cm de diámetro, situadas en el tercio medio del cuello, distantes 10 cm entre sí, tanto en el lado cervical derecho como en el izquierdo. E n esas áreas se midió el grosor de u n pliegue de piel, con el cutímetro. c) Cervical simple: Se t o m a r o n en cuenta las reacciones a los P P D bovinos, obtenidas en la inoculación cervical. Se considera reacción positiva u n incremento de 3 m m o más en el grosor de la piel y negativa c u a n d o este es menor que 3 m m . Del lado derecho se inocularon intradérmicamente 0,1 ml de P P D aviar (área superior) y 0,1 ml de P P D bovino (área inferior) producidos en C I V E T . Se hizo lo mismo en el lado izquierdo con los P P D aviar y bovino producidos en C P Z . Las lecturas se efectuaron en igual forma que p a r a la prueba ano-caudal. Se considera en Uruguay positiva esta prueba cuando la reacción a P P D bovino es mayor en 5 m m o más a la del P P D aviar; dudosa cuando la reacción al P P D bovino es de 3,0 a 4,9 m m mayor que la del P P D aviar y negativa c u a n d o la reacción al P P D bovino es menor de 3 m m .

Estudios anatomopatológicos y bacteriológicos Se seleccionaron animales de "acuerdo con las reacciones presentadas y fueron sacrificados y autopsiados. Se investigó la. presencia de lesiones compatibles con tuberculosis y se efectuaron cultivos en medios apropiados para aislamiento de

1024 micobacterias, de muestras de ganglios submaxilares, retrofaríngeos, mediastínicos, brónquicos, retrohepáticos y mesentérico-ilíacos. Se emplearon métodos ya descriptos para el cultivo y la identificación de las micobacterias aisladas (11, 12).

Análisis estadístico Se efectuó la comparación de las respuestas a cada P P D en prueba caudal o cervical de acuerdo con la prueba t de Student p a r a muestras pareadas.

RESULTADOS Pruebas tuberculínicas Los resultados obtenidos se detallan en el C u a d r o I. CUADRO I Resultados de las pruebas tuberculínicas cervical (con tuberculinas PPD bovina y aviar) y caudal (con PPD aplicadas a 60 bovinos de un área libre de tuberculosis en

bovino) Uruguay

Milímetros de aumento grosor de piel Media

Desviación estándar

Intervalo

N° de animales sin respuesta

Bovino C P Z Bovino CIVET

0,74 0,69

0,60 0,61

0-1,8 0-2,2

11 15

Aviar CPZ*) Aviar CIVET

0,89 0,50

0,82 0,58

0-3,5 0-3,1

13 22

Bovino CPZW Bovino CIVET

0,46 0,34

0,42 0,39

0-1,4 0-1,7

17 21

Prueba

PPD

Cervical

Caudal

(a)

(a) Diferencia no significativa (b) P < 0,001 (c) 0,1 > P > 0,05 E n la prueba cervical las reacciones a P P D bovino fueron menores de 2 m m , salvo en un caso (2,2 m m a P P D CIVET). E n la prueba caudal las reacciones fueron menores de 1,5 m m en todos los casos salvo en u n o (1,7 m m a P P D C I V E T ) . E n la Figura 1 se presentan las respuestas medias a las pruebas tuberculínicas cervical y caudal, a las que se le suman dos desvíos estándar (media + 2DS), a fin de apreciar los márgenes de seguridad (diferencias) entre las respuestas halladas y los criterios mínimos de positividad. Estos márgenes son altos para ambas pruebas - cervical y caudal - pero mayores en esta última. Las diferencias en las respuestas obtenidas en la prueba cervical simple, con P P D bovino C I V E T y C P Z , no fueron significativas (P > 0,1). E n la prueba caudal la respuesta al P P D C P Z fue mayor (0,1 > P > 0,05). C o m p a r a n d o los resultados de la prueba cervical con la caudal, las reacciones en esta última fueron significativamente menores, con ambos P P D bovinos (P < 0,01).

Aumento del grosor de la piel (mm)

1025

FIG.

1

R e s p u e s t a s o b t e n i d a s en las p r u e b a s t u b e r c u l í n i c a s e f e c t u a d a s en 6 0 b o v i n o s de un área libre de t u b e r c u l o s i s u t i l i z a n d o t u b e r c u l i n a s P P D b o v i n a y aviar C I V E T y C P Z

Valores medios + 2 desvíos estándar Los resultados de la prueba cervical considerada como prueba comparativa también dieron u n margen de seguridad elevado en cuanto a la separación de positivos y negativos. Ninguno de los animales presentó una reacción mayor de 2,2 m m al P P D bovino. En la Figura 2 se muestra la distribución de reacciones a los P P D bovino y aviar. En el sector superior izquierdo de cada gráfico se sitúan los animales que m o s t r a r o n mayor reacción al P P D aviar que al bovino; sobre la línea diagonal, los que dieron igual reacción a ambos; en el vértice, los negativos, y en el sector inferior derecho, aquellos en los que la diferencia de reacción favoreció al P P D bovino. Empleando los P P D producidos en C E P A N Z O las respuestas se hallan más corridas hacia el sector «aviar» (32 casos con P P D C P Z contra 19 con P P D C I V E T , P < 0,001; cf. Figura 2, a y b). Estudios anatomopatológicos y bacteriológicos

Cuatro de los 60 bovinos, senalados en la Figura 2 como A, B, C y D , presentaron reacciones mayores de 2,5 m m a P P D aviar C P Z y uno de ellos (D), también a P P D

PPD aviar CPZ (reacciones en mm)

1026

PPD bovino CPZ (reacciones en mm)

PPD bovino CIVET (reacciones en mm)

A, B, C, D : Animales necropsiados FlG. 2

Prueba tuberculínica comparativa con tuberculinas PPD bovina y aviar CPZ (a) y CIVET (b) Resultados obtenidos en 60 bovinos de un área libre de tuberculosis, Uruguay, 1988 aviar C I V E T . A u n q u e el nivel de las respuestas fue débil, se los sacrificó y autopsió. E n ninguno de ellos se observaron lesiones. De las muestras de ganglios de los animales D y B se aislaron, respectivamente, u n a cepa de M A C y u n a de Complejo M. terrae (Grupo III de Runyon).

DISCUSIÓN Si bien las respuestas medias al P P D bovino C P Z fueron algo mayores que al P P D C I V E T , la diferencia alcanzó escasa significación (Cuadro I). De acuerdo con estos resultados podríamos inferir que la especificidad del P P D C P Z sería algo menor que la del P P D C I V E T . C o n respecto al P P D aviar, las respuestas medias al C P Z fueron significativamente mayores que al C I V E T . Ello no se debería a u n a potencia más elevada, ya que la de ambos productos había sido ajustada de acuerdo con el resultado de la prueba en cobayos. N o obstante, sabemos que n o existe estricto paralelismo entre la potencia de un P P D determinada en cobayos sensibilizados con micobacterias muertas, en adyuvante oleoso (que es el m é t o d o que empleamos), con

1027 la potencia p a r a detectar sensibilización natural producida por micobacterias viables, en bovinos (9). Estas diferencias entre los P P D no afectaron sin embargo la interpretación de la prueba en bovinos. De acuerdo con lo aquí observado en cuanto a especificidad, con trabajos anteriores sobre sensibilidad (10, 14) y con la experiencia en el curso del p r o g r a m a de control de Uruguay, la p r u e b a tuberculínica simple, t a n t o cervical como caudal, con P P D bovino, empleando los criterios de interpretación antes señalados, daría un margen de seguridad m u y aceptable p a r a la diferenciación entre los bovinos infectados por M. bovis y los no infectados. E n la prueba efectuada en 60 animales en un área libre de tuberculosis, no h u b o ningún caso de positividad (que hubiera sido falsa positividad) ni tampoco casos calificados como dudosos, según los criterios de interpretación empleados en Uruguay. A ú n teniendo en cuenta que la aplicación simultánea de varias inyecciones de P P D puede haber disminuido la respuesta a cada u n a de ellas, la diferencia entre las respuestas observadas y el límite de positividad fue amplia, y mayor en la p r u e b a caudal, vale decir que ésta se mostró más específica que la prueba cervical. De acuerdo con los resultados de la p r u e b a comparativa, todos los animales también fueron calificados como tuberculino-negativos. Esta prueba permitió detectar cierta reacción a P P D aviar, mayor al emplear el P P D aviar C P Z , en 4 de los 60 animales, que no tuvo significación en cuanto a presencia de lesiones. N o obstante, de ganglios linfáticos de 2 de los 4 animales se aislaron micobacterias, que pudieron haber sido causantes de esa sensibilización al P P D aviar. La prueba simple caudal demostró en Australia sensibilidad y especificidad elevadas (8). Asimismo, en estudios efectuados en rebaños infectados en Argentina, la sensibilidad de la prueba caudal fue igual o mayor - de acuerdo con la potencia del P P D y al criterio de interpretación empleado - que la de la p r u e b a comparativa cervical (10, 14). T o m a n d o en consideración, además, el aspecto operacional y el costo, la prueba simple caudal sería la más a p r o p i a d a p a r a la vigilancia epidemiológica, en las condiciones del área estudiada. Además de su sencillez y m e n o r costo relativo, esta prueba presenta la ventaja - p a r a los países que han adquirido amplia experiencia en su empleo a lo largo de programas de control - de n o deber cambiar el m é t o d o de diagnóstico tuberculínico al alcanzar las etapas cercanas a la erradicación. Además, existe siempre la alternativa de adoptar la prueba comparativa cervical como segunda prueba p a r a los casos de interpretación dudosa o en rebaños con antecedentes de sensibilización n o específica (13). C a d a región puede presentar características propias en cuanto a niveles de sensibilización por micobacterias ambientales. P o r lo tanto, para la toma de decisiones, es recomendable efectuar u n a evaluación de la eficiencia diagnóstica de las distintas pruebas tuberculínicas aplicadas en el g a n a d o en cada región. Consideramos que los resultados y conclusiones del presente estudio pueden tener aplicación en otros países en que se emplean métodos similares en el control de la tuberculosis bovina (1). * * *

1028 C O M P A R A I S O N D E L A SPÉCIFICITÉ D E S T U B E R C U L I N A T I O N S CERVICALE ET C A U D A L E CHEZ LES BOVINS E N U R U G U A Y . - F . Errico, I . N . de Kantor, J. Baltar, M. Silva et A . Millán.

Résumé : Les auteurs ont évalué la spécificité des tuberculinations simples et comparées, pratiquées dans l'encolure et le pli caudal, en les appliquant simultanément au moyen de tuberculines PPD bovines et aviaires d'origines diverses à 60 bovins d'une zone de l'Uruguay indemne de tuberculose. Les réponses obtenues avec les PPD bovines, mesurées par l'épaississement de la peau, ont varié entre 0 et 2,2 mm après épreuve cervicale et entre 0 et 1,7 mm après épreuve caudale. Selon les critères d'interprétation, tous les animaux se sont montrés négatifs à la tuberculination. La différence entre les réactions observées et la valeur positive minimale a été moindre pour l'épreuve cervicale simple que pour les épreuves caudale et cervicale comparée. Avec cette dernière, les réactions à la PPD aviaire ont été supérieures à 2,5 m chez 4 animaux sur 60. Ceux-ci ont été sacrifiés. L'examen nécropsique n'a révélé aucune lésion mais, chez deux d'entre eux, des mycobactéries appartenant aux groupes Mycobacterium avium et M. terrae ont été isolées. Compte tenu de ces résultats ainsi que des modalités d'application et du coût de la tuberculination, l'emploi de l'épreuve caudale, dont la sensibilité a été confirmée par d'autres travaux, est recommandé pour la surveillance épidémiologique dans des situations comparables à celles de cette étude. Lorsque son interprétation est douteuse, ou pour des troupeaux ayant des antécédents de sensibilisation par d'autres mycobactéries, on peut utiliser comme deuxième épreuve l'épreuve cervicale comparée. MOTS-CLÉS : Spécificité - Tuberculination - Tuberculines PPD bovine et aviaire - Tuberculose aviaire - Uruguay.

* * *

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