Comparación de los efectos protectores de extractos de Curcuma longa L. y Mangifera indica L. sobre la hemolisis de eritrocitos inducida por peróxido de hidrógeno E. Pareja; Y. Salazar; O. Ocampo; D. Uribe; S.S. Arango* Facultad de Ciencias Exactas y Aplicadas Instituto Tecnológico Metropolitano, ITM Medellín, Colombia [email protected] Resumen - Los radicales libres son moléculas con electrones desapareados y muy inestables, que tienen la capacidad de interactuar con otros compuestos para transformarlos en especies reactivas. Una de estas moléculas son las especies reactivas de oxígeno (ROS), las cuales se han visto directamente involucradas en la generación de estrés oxidativo, caracterizado por una alta producción de ROS y por deficientes mecanismos antioxidantes en el organismo. Esto es importante, porque las ROS tienen la capacidad de reaccionar con diferentes biomoléculas como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos; siendo los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de las membranas celulares, uno de los blancos más importantes de ROS. Por esta razón, se ha convertido en una atractiva estrategia el uso de compuestos capaces de capturar ROS o de modular positivamente la actividad de los mecanismos antioxidantes de la célula, como los polifenoles, flavonoides y carotenoides, presentes en productos naturales de origen vegetal. En este estudio, se comparó el efecto protector de extractos de Curcuma longa L. y Mangifera indica L. sobre la hemólisis de eritrocitos inducida por peróxido de hidrógeno (H2O2). Los eritrocitos fueron aislados a partir de muestras de sangre de dos donantes sanos, para ser expuestos a H2O2 150mM, en presencia de diferentes concentraciones (10, 30 y 50ug/ml) de los extractos de cúrcuma y mango. Como control antioxidante, se utilizó Butil hidroxitolueno (BHT) a las mismas concentraciones de los extractos. Del mismo modo, una de las muestras de eritrocitos fue tratada con H2O2 700 mM, como control positivo de hemólisis. De cada uno de los tratamientos, se tomó una alícuota del sedimento de eritrocitos y se resuspendió en PBS para observar los cambios morfológicos inducidos por el H2O2. Los porcentajes de inhibición de hemolisis fueron mas altos con los extractos de cúrcuma y mango, que con el BHT a concentraciones de 10 y 30ug/ml. Sin embargo, solo se observaron diferencias estadísticamente significativas con cúrcuma a 30ug/ml (cúrcuma: 29.3% y BHT: 25.25%; p=0.0080). Así mismo, se observó un efecto protector de los extractos, evidenciado por la conservación de la integridad de la membrana de los eritrocitos expuestos a H2O2. Los resultados sugieren que fitoquímicos presentes en Curcuma longa L. y Mangifera indica L. tienen un efecto protector sobre la hemolisis de eritrocitos, evidenciado por la conservación de la integridad de la membrana y por la reducción en el porcentaje de hemolisis. Resumen— ROS, antioxidantes, Curcuma longa L., Mangifera indica L., hemolisis de eritrocitos

I.

INTRODUCCIÖN

Las especies reactivas de oxígeno-ROS (del inglés Reactive Oxygen Species) son moléculas que se generan como subproductos del metabolismo celular, así como por factores ambientales como la hipoxia, consumo de cigarrillo, exceso de ingesta de alcohol, entre otros. Las ROS son moléculas que se caracterizan por tener un electrón desapareado y muy inestable, lo cual les da la capacidad de interactuar con otros compuestos para transformarlos en especies reactivas, generando anión superóxido (O2-), radical hidroxilo (OH-) y oxígeno singlete (*O2), entre otros [1]. El peróxido de hidrógeno (H2O2) no tiene electrones desapareados, por lo que no es considerado como un radical libre estándar; sin embargo, es un importante agente pro-oxidante, dado que esta molécula puede interactuar con oxígeno y con iones férricos y cúpricos presentes en diversas localizaciones celulares, produciendo OH-, una de las especies oxidantes mas perjudiciales por su corta vida media y alta reactividad [2]. En condiciones de estrés oxidativo, caracterizado por una alta producción de ROS y por alteraciones en los mecanismos antiooxidantes del organismo, las ROS adquieren la capacidad de reaccionar con diferentes biomoléculas como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, modificando su estructura molecular e interfiriendo con su normal funcionamiento; siendo los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de las membranas celulares uno de los blancos más importantes de ROS [3]. Este mecanismo ha sido denominado como peroxidación lipídica, caracterizada por la perdida inicial de un átomo de hidrogeno del ácido graso, el cual se constituye como un radical lipídico, generando posteriormente radicales peróxilos (ROO-) [3]. Estos daños producen cambios en la estructura y función de las células, lo cual favorece el envejecimiento prematuro y la aparición de diferentes enfermedades [4] . La sangre es un fluido biológico constituido por plasma sanguíneo y por células como los eritrocitos, leucocitos y plaquetas. La sangre cumple funciones claves para el optimo funcionamiento del organismo, ya que sirve como sustrato en diversas reacciones bioquímicas, en las que se generan cantidades importantes de H2O2 y anión superóxido. Por otro

lado, los eritrocitos transportan el oxígeno y el CO2 en el organismo, por lo que están continuamente expuestos a ROS; esto es importante, porque los eritrocitos en su membrana celular tienen un contenido elevado de PUFA y proteínas que pueden ser blanco de las ROS, afectando la integridad de la membrana por la peróxidación de los lípidos y por la fragmentación y degradación de las proteínas, lo cual deriva en alteraciones en la fluidez de la membrana, cambios morfológicos, inactivación de enzimas y hemolisis [5], [6]. Una estrategia para remover o proteger a la célula de ROS, es el consumo de antioxidantes obtenidos a partir de productos naturales de origen vegetal. Diferentes estudios experimentales in vitro e in vivo, han mostrado que los daños inducidos por el estrés oxidativo pueden ser detenidos, reducidos y/o revertidos con antioxidantes provenientes de la alimentación, ya que han demostrado tener la capacidad de inhibir la formación de ROS [7]. El mango (Mangifera indica) pertenece a la familia Anacardiaceae, es una de las frutas más importantes del mundo en términos de producción (aproximadamente 27 millones de toneladas), superficie cultivada y consumo. Más de 1000 variedades de mango están disponibles en todo el mundo, lo cual explica que se cultive en una superficie de aproximadamente 3,7 millones de hectáreas en todo el mundo [8]. Los frutos de mango son una importante fuente de micronutrientes, vitaminas y otros fitoquímicos, proporcionan energía, fibra, hidratos de carbono, proteínas, grasas y compuestos fenólicos; componentes que han demostrado un importante potencial anti-inflamatorio, anti-microbiano, y antidiabético, así como protector cardiovascular y como agente preventivo y terapéutico del cáncer, entre otros [9][10]. El mango es un alimento que ha demostrado ser una fuente importante de ácido ascórbico, carotenoides y polifenoles presentes en la parte comestible de la fruta, que le confieren capacidad antioxidante. Es así, como la calidad nutracéutica del mango ha sido estudiada en función de su capacidad antioxidante, el contenido de polifenoles y carotenoides totales [11][12]. Curcuma longa L., es una hierba perenne con rizomas subterráneos aromáticos con color amarillo brillante en su interior, pertenece a la familia Zingiberaceae, se encuentra distribuida a lo largo de regiones tropicales y subtropicales del mundo y se cultiva ampliamente en países asiáticos, principalmente en la India y China [13]. La planta es conocida por su uso como alimento o aditivo alimentario, además de su valor terapéutico en el tratamiento clínico; de hecho, la cúrcuma se ha utilizado en la medicina ayurvédica y china tradicional desde 3000 A.C (Antes de Cristo) para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades, incluyendo la tos, diabetes, trastornos hepáticos, reumatismo y varios tipos de cáncer, vitíligo, reumatismo, entre otros [14]. La cúrcuma es rico en curcuminoides, entre los que se destacan la curcumina, demetoxicurcumina y bisdemetoxicurcumina, ya que han sido los componentes mas estudiados. Diferentes trabajos in vitro e in vivo sugieren una amplia gama de efectos potenciales terapéuticos o preventivos asociados con la curcumina, la cual puede unirse a diferentes moléculas, como los receptores de factores de crecimiento,

glutatión, proteína C quinasa, lipoxigenasa, factores de transcripción como factor nuclear kB (NFkB), o acción sobre múltiples genes y vías de señalización implicadas en la adhesión celular y la apoptosis [15]. El ensayo de hemolisis de eritrocitos ha sido ampliamente utilizado para determinar los daños inducidos por los radicales libres sobre las membranas [5] [6]. Por esta razón, el objetivo de este estudio es comparar el efecto protector de extractos de Curcuma longa L. y Mangifera indica L. sobre la hemólisis de eritrocitos inducida por peróxido de hidrógeno (H2O2). II. MATERIALES Y MÉTODOS A. Obtención de la fruta El mango fue obtenido a partir de un productor local. Se utilizaron frutas maduras de acuerdo a la Norma NTC-5139, las cuales fueron seleccionadas, lavadas y desinfectadas con hipoclorito a 100 ppm. La cúrcuma fue obtenida a partir de un producto comercial, el cual viene en una presentación en polvo. B. Preparación de los extractos El mango sin cáscara, se cortó en pedazos y se guardó a 20°C, el extracto se preparó con la dilución de la pulpa en agua (1:4), con adición de gelatina sin sabor (estabilizante), sucralosa, y sacarosa hasta alcanzar entre 12 y 13° Brix, finalmente se pasteurizó 10 min entre 80 y 85°C, se envasó, y se almacenó a 4°C. El néctar se liofilizó en cámara de vacío a presión 0,427 ± 0,5 mm Hg, a temperatura de 50°C y se almacenó a 25°C ± 2°C y protegido de la luz en empaque de polietileno de baja densidad. En una báscula de presión, se pesaron 200µg del liofilizado de mango o 200µg del polvo de cúrcuma, para preparar una solución madre a 200 µg/ml en PBS. Las soluciones se almacenaron a temperatura ambiente y protegidas de la luz, para ser utilizadas el mismo día. C. Preparación de la suspensión de eritrocitos Las muestras fueron obtenidas a partir de dos individuos voluntarios sanos, no fumadores, no consumidores habituales de bebidas alcohólicas, con previa lectura y firma del consentimiento informado. Siguiendo la metodología de Duran, et al 2013 [16], se obtuvieron de cada individuo por venopunción 4ml de sangre periférica heparinizada, la cual se centrifugó a 2500 rpm durante 15 minutos para separar el plasma y los leucocitos de los eritrocitos. El pellet de eritrocitos, se lavó dos veces con 2.5ml de buffer fosfato salino (PBS) al 5% pH 7.4 y se centrifugó a 2500 rpm durante 12 minutos a temperatura ambiente. Los eritrocitos fueron resuspendidos en (PBS) al 5 % con pH 7.4 hasta alcanzar un volumen final de 6 ml. D. Actividad Antihemolítica Se evaluó de acuerdo con lo descrito por Aguillón et al 2013 [17], Para las muestras se tomaron 250µl de suspensión de eritrocitos, más 300µl de H2O2 (concentración final de 150 mM) y se adicionaron a 950µl de los tratamientos con extracto de mango o cúrcuma a una concentración final de (10-30-50 µg/ml) en PBS. Como control se utilizó Butil hidroxitolueno

(BHT), el cual fue diluido en etanol y posteriormente en PBS para preparar soluciones a 10-30-50µg/ml. Las muestras fueron mantenidas en incubadora a 37°C durante 3 horas, posteriormente se centrifugaron a 5.000 rpm durante 15 minutos, se tomaron los sobrenadantes y se leyeron en el lector de microplacas Glomax multidetection system (Promega) a una longitud de onda de 560nm. Como control positivo de hemolisis se utilizó una muestra de eritrocitos tratados con H2O2 a 700 mM. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. El porcentaje de inhibición de hemólisis se calculó usando la ecuación: % de inhibición de hemólisis = [(Ac - A) / Ac] x 100. Donde Ac es la absorbancia del control negativo y A es la absorbancia de la muestra (Mango, Cúrcuma o BHT). E. Cambios morfológicos de los eritrocitos De cada uno de los tratamientos anteriores se tomaron 30µl del sedimento de eritrocitos y se resuspedieron en 30µl de PBS, para ser observados en un microscopio Nikon en contraste de fase para observar cambios en la membranas celulares. Las imágenes fueron adquiridas con una cámara digital Nikon DsFilc con un aumento de 60x (apertura numérica de 0,25) y con una resolución de imagen de 1280 x 960 pixeles, cada imagen fue capturada bajo 15ms de exposición y ganancia de 1,70x, con un contraste bajo, además, en todos los registros de la microfotografía se equilibró la selección de la función de blancos automático de interfaz de la cámara. F. Análisis estadísticos Los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DE) de por lo menos tres experimentos independientes. Se evaluaron las diferencias estadísticas entre los grupos mediante ANOVA con medidas repetidas y los valores de p se ajustaron por la corrección de Benforroni (p < 0.05 fue considerada como estadísticamente significativa) utilizando el software Statgraphics Centurion XV.

Fig. 1 Comparación del porcentaje (%) de inhibición de hemolisis de eritrocitos inducido por H2O2 en presencia de cúrcuma o BHT. p