Conocimientos moleculares y patológicos de la infección latente de VIH-1 en el cerebro humano Paula Desplats, PhD Wilmar Dumaop, BS David Smith, MD Anthony Adame, BS Ian Everall, PhD Scott Letendre, MD Ronald Ellis, MD, PhD Mariana Cherner, PhD Igor Grant, MD Eliezer Masliah, MD

RESUMEN

Objetivos: Quisimos investigar si la latencia de VIH en el SNC tiene consecuencias moleculares, patológicas y clínicas adversas. Métodos: Esta fue una comparación de casos y controles de pacientes VIH-1 positivos (VIH+) con evaluación clínica y neuropatológica. Basándonos en los niveles de ADN, ARN y p24 de VIH-1 en el cerebro, los casos fueron clasificados como controles, infección latente por VIH en el SNC y encefalitis por VIH (EVIH). Se realizaron análisis de marcadores epigenéticos, que incluían BCL11B, neurodegeneración y neuroinflamación, utilizando inmunoblot, microscopía confocal, análisis de imagen/inmunoquímica y PCRq. Estaban disponibles los datos neurocognitivos pre-mortem detallados de 23 de los 32 casos. Resultados: Los controles VIH+ (n = 12) no tenían ADN, ARN o p24 de VIH-1 detectables en el SNC; los casos de VIH+ latente (n = 10) mostraron niveles altos de ADN de VIH-1, pero no ARN o p24; y los casos de EVIH (n = 10) tenían niveles altos de HIV-1 ADN, ARN y p24. En comparación con los controles VIH+, los VIH+ latentes mostraron un deterioro cognitivo moderado con alteraciones neurodegenerativas y neuroinflamatorias, a pesar de ser de menor grado que en los casos de EVIH. Llamativamente, los casos de VIH+ latente mostraron niveles más altos de BCL11B y otros modificadores cromatínicos involucrados en el silenciamiento. El aumento de BCL11B estuvo asociado con desregulación de los genes proinflamatorios tipo interleukina-6, factor de necrosis tumoral Įđ\&'

Dirección para correspondencia a Dr. Masliah: [email protected]

Conclusión: La persistencia de infección latente por VIH-1 en el SNC estuvo asociada con niveles aumentados de modificadores cromatínicos, incluso BCL11B. La alteración de estos factores epigenéticos podría resultar en transcriptomas anormales, que conducen a la inflamación, neurodegeneración y deterioro cognitivo. El BCL11B y otros factores epigenéticos involucrados en el silenciamiento podrían representar objetivos potenciales en el compromiso del SNC por VIH-1. Neurology® 2013;80:1415–1423. GLOSARIO DAV= demencia asociada al VIH; DNAV = desórdenes neurocognitivos asociados al VIH; EVIH = encefalitis por VIH; HNRC = HIV Neurobehavioural Research Center; IL = interleukina; PAGF = proteína ácida gliofibrilar; TARGA = terapia antirretroviral de gran actividad; TNF = factor de necrosis tumoral; UCSD = University of California, San Diego.

La infección del SNC por VIH está asociada a condiciones neurológicas: desde la demencia asociada al VIH (DAV)1 hasta desórdenes neurocognitivos más leves asociados al VIH (DNAV).2 La terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) ayuda a prolongar la vida de los pacientes infectados, reduciendo la incidencia de DAV.3 A pesar de que los casos de deterioro congnitivo severo relacionado al VIH se han reducido, la frecuencia de encefalitis por VIH (EVIH), caracterizada por la presencia de macrófagos infectados en el SNC, microgliosis, astrogliosis y pérdida de mielina, se ha mantenido igual o ha aumentado levemente.4-6 La erradicación completa del VIH-1 no es factible debido a la persistencia de formas virales latentes integradas al genoma del huésped.7 El cerebro representa un reservorio desde donde pueden emerger infecciones productivas e injurias crónicas del SNC, ya que la resistencia a la TARGA podría permitir la replicación del virus residual,8-10 resaltando la importancia de los mecanismos del huésped en la mediación de la latencia. En las células microgliales humanas, el factor de transcripción BCL11B (conocido también como CTIP2) inhibe la transcripción de VIH mediante el reclutamiento de un complejo modificador de cromatina a la región LTR, que resulta en el silenciamiento del VIH.11 Sin embargo, poco se sabe sobre los mecanismos de la latencia del VIH-1 en el cerebro humano y sus potenciales efectos a largo plazo. La persistencia del virus latente en el cerebro podría generar deterioro cognitivo y neurodegeneración mediante la expresión alterada de genes y respuestas proinflamatorias. De los Departments of Neurosciences (P.D., A.A., R.E., E.M.), Pathology (W.D., E.M.), Medicine (D.S., S.L.), and Psychiatry (I.E., M.C., I.G.), University of California San Diego, La Jolla. Dr. Everall actualmente está afiliado al Department of Psychiatry, University of Melbourne, Melbourne, Australia. Ir a Neurology.org para declaraciones de intereses completas. La información sobre fondos y aquellas declaraciones relevantes para los autores, si existiesen, se encuentran al final del artículo. © 2013 American Academy of Neurology

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Nuestra hipótesis fue que los pacientes con infección latente por VIH desarrollarían alteraciones neurocognitivas, neurodegenerativas y neuroinflamatorias similares, pero en menor medida que en los pacientes con EVIH. Los niveles aumentados del BCL11B y de otros componentes del complejo silenciador de VIH podrían desregular las cascadas neuroinflamatorias, lo que conduce a la anatomía patológica observada en pacientes con infección de VIH latente. MÉTODOS Población del estudio. Incluimos 32 casos VIH+ del HIV Neurobehavioral Research Center (HNRC) y del California NeuroAIDS Tissue Network en la Universidad de California, San Diego (UCSD; tabla 1). El examen neurocognitivo estuvo disponible en 23 de los 32 casos estudiados. Los sujetos tenían exámenes médicos neurológicos y neuropsicológicos con una mediana de 12 meses previos a su muerte. La mayoría de los individuos murió por una bronconeumonía aguda o septicemia (tabla 1). Los hallazgos de autopsia fueron consistentes con SIDA y la patología sistémica asociada que se encontró incluyó citomegalovirus diseminado, infección por Mycobacterium avium, neumonía por Pneumocystis carinii e infección por hepatitis C. Los sujetos eran excluidos si tenían historia de una infección oportunista del SNC o condiciones del desarrollo, neurológicas, psiquiátricas o metabólicas no relacionadas con VIH, que podrían afectar el funcionamiento del SNC. Los métodos para la evaluación neuropsicológica consistieron en una batería de tests, que incluían aprendizaje, memoria, atención, velocidad de procesamiento de la información, abstracción y habilidades verbales y motoras, como ha sido descripto previamente.12 Para este estudio, el Tabla 1

estado neurocognitivo de los casos fue definido como neurocognitivamente normal, deterioro neurocognitivo leve a moderado (incluyó casos subsindromáticos/asintomáticos y desorden cognitivo-motor menor) y desorden neurocognitivo severo (equivalente a la demencia por VIH). Aprobaciones de protocolos estándar, registros y consentimiento de pacientes. Obtuvimos tejido cerebral post-

mortem que ya se encontraba en el banco del HNRC, bajo el estudio California NeuroAIDS Tissue Network. La aprobación para el estudio principal fue recibida del comité de revisión institucional local. Se obtuvo un consentimiento informado por escrito de todos los pacientes participantes del estudio y que donaban tejido. Análisis de ADN, ARN y p24 de VIH y clasificación por categorías. Se extrajo ADN y ARN de muestras congeladas

de corteza frontal humana con DNeasy mini kit y RNeasy Lipid tissue mini kit (Qiagen, Hilden, Alemania). La cuantificación del ADN del VIH-1 fue realizada en el HIV Neurobehavioral Research Program, Neurovirology Core (UCSD), bajo protocolos estándar en 50 ng de ADN. El ARN de VIH en el cerebro fue cuantificado con PCRq usando VIH-1 pol estándar (aportado por el HIV Neurobehavioral Research Program, Neurovirology Core) y GAPDH estándar (Invitrogen, Carlsbad, CA). El número de copias de VIH-1 se normalizó a 1×106 copias de GAPDH estándar. El total de los homogeneizados de proteínas fueron preparados de muestras congeladas de corteza frontal humana como fue descripto.13 El p24 de VIH-1 fue cuantificado por ELISA (PerkinElmer, Waltham, MA) en alícuotas homogeneizadas que contienen 20 µg de proteína total.

Población del estudio Control VIH+

VIH+ latente

EVIH

No.

12

10

10

Edad, años, media ± DE

47.3 ± 2.5

45 ± 2.8

43 ± 2.7

M/F

1/11

1/9

3/7

Peso cerebral, g, media ± DE

1.360 ± 34,5

1.255 ± 45

1.280 ± 42,2

Intervalo post-mortem, h, media ± DE

18.6 ± 1.7

15.9 ± 1.9

13.5 ± 3

Causa de muerte

Sepsis (5), neumonía (5), insuficiencia cardíaca (2)

Carcinoma metastático (3), neumonía (3), embolia pulmonar (2), insuficiencia cardíaca (2)

Sepsis (5), neumonía (2), embolia pulmonar (2), insuficiencia cardíaca (1)

2003 (2000-2006)

2004 (2001-2006)

2001 (1999-2004)

Duración estimada de VIH, a, mediana (IIC)

16.3 (10.4-21.1)

11.3 (8.2-18.5)

10.5 (4.3-13.1)

TARGA previa a la muerte, n (%)

Año de muerte, mediana (IIC) a

5/10 (50)

4/9 (44)

2/7 (29)

Basada en IP, n (%)

2 (40)

2 (50)

1 (50)

Basada en ITRNN, n (%)

1 (20)

2 (50)

0 (0)

Otros, n (%)

2 (40)

0 (0)

1 (50)

CV en plasma log10, c/mL, mediana (IIC)

3,3 (1,8-5,8)

3,9 (2,8-5,5)

6,2 (4,2-6,4)

Nadir de CD4, mediana (IIC)b

13 (8-75)

5 (4-150)

24 (18-147)

Último CD4, mediana (IIC)

23 (7-387)

48 (17-208)

16 (7-78)

CV en LCR log10, c/mL, mediana (IIC)a

2,7 (1,7-3,4)

1,9 (1,7-2,7)

5,3 (5,0-6,3)

Evaluados neurocognitivamente, n (%)d

9/12 (75)

8/10 (80)

6/10 (60)

c

Abreviaturas: CV = carga viral (ARN VIH); EVIH = encefalitis por VIH; TARGA = terapia antirretroviral de gran actividad (highly active retroviral therapy); IIC = intervalo intercuartil; IP = inhibidor de proteasa; ITRNN = inhibidor de la transcriptasa reversa no nucleosídico. a No. de casos con datos disponibles: 24. b No. de casos con datos disponibles: 20. c No. de casos con datos disponibles: 25. d No. de casos con datos disponibles: 23.

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Neurology Edición Argentina Octubre 2013

Figura 1

Análisis de la expresión de VIH-1 y patología neurodegenerativa en controles VIH+, VIH+ latente y cerebros con EVIH

p24 VIH pg/20 ug (log)

ARN Copias VIH ARN (log)

Número de copias VIH (log)

ADN

VIH+CT

VIH+CT

VIH+latente

EVIH

VIH+latente

VIH+CT VIH+latente

VIH+CT VIH+latente EVIH

EVIH

EVIH Sinaptofisina (sinapsis) % área de neurópilo

% área de neurópilo

MAP2 (dendritas)

VIH+CT VIH+latente EVIH

Iba-1 (microglía) Densidad óptica

Densidad óptica

PAGF (astroglía)

Se analizaron el ADN y ARN del VIH-1 por PCR y proteína viral p24 por ELISA en muestras de corteza frontal de grupo de controles (CT) VIH+, de VIH+ latente y de encefalitis por VIH (EVIH). (A) La detección del ADN VIH-1 corroboró la presencia del provirus en los cerebros de todos los grupos infectados. (B,C) La replicación activa de VIH-1, indicada por ARN viral y detección de p24, es solo evidente en el grupo EVIH. Test t de Student no apareado, 2 colas, p < 0,001. (D) Inmunomarcación de células neuronales y estructuras dendríticas con anticuerpo anti-MAP2. (E) Inmunotinción de las terminales presinápticas con anticuerpo anti-sinaptofisina. (F) Las células de la astroglía fueron inmunomarcadas para proteína ácida gliofibrilar (PAGF) y las células de la microglía fueron identificadas mediante anticuerpo anti-Iba1 (G). La barra representa 10 µm. (H, I) Análisis de la imagen para el porcentaje del área del neurópilo cubierto por marcadores dendríticos y sinápticos. (J, K) Análisis de la imagen de los niveles de inmunorreactividad para PAGF e Iba1 expresada como densidad óptica corregida por grupo. Se utilizó un análisis de varianza con un sentido con Dunnet post hoc para comparar grupos control vs latente y EVIH, *p < 0,05.

Análisis de PCR de la expresión génica en tiempo real.

Los experimentos con PCRq fueron realizados con iCycler iQ5 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA), como fue descripto.14 El ARN total fue transcripto inversamente usando iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad) con 1 µg de ARN total. La amplificación fue realizada en una cantidad de ADNc equivalente a 100 ng de ARN total. Los oligonucleótidos fueron designados utilizando Oligoperfect (Life Technologies, Carlsbad, CA, secuencias disponibles a pedido). Los cálculos fueron hechos con un software Bio-Rad con el método del ciclo de umbral comparativo (Ct) y expresado como 2-exp (ΔΔCt) usando PPIA como control interno. Análisis neuropatológico. La evaluación neuropatológica

fue realizada en cortes de parafina de las cortezas frontal, parietal y temporal, y tinciones con hematoxilina & eosina del hipocampo; los ganglios basales y el tronco encefálico, con inmunomarcación con anticuerpos anti p24 (1:250, Dako, Glostrup, Dinamarca), Iba1 (marcador microglial, 1:1.000, Wako, Richmond, VA) y proteína ácida gliofibrilar (PAGF, marcador de astrogliosis, 1:500, Millipore, Billeri-

ca, MA). El diagnóstico de EVIH se basó en la presencia de células VIH-p24-positivas, nódulos microgliales, astrogliosis y palidez de la mielina. Análisis inmunocitoquímico. Cortes de la corteza frontal media (grosor de 40 µg) de controles y casos VIH fueron procesados como está descripto15, usando anticuerpos contra MAP2 (marcador dendrítico, 1:200, Millipore) y sinaptofisina (marcador presináptico, 1:500, Millipore).15,16 Las secciones codificadas en ciego inmunomarcadas fueron fotografiadas de forma seriada con LSCM (MRC1024, Bio-Rad) y analizadas con el programa Image 1.43 (NIH), como está descripto.17 Fueron inmunomarcados cortes adicionales con anti-GFAP, Iba1, BCL11B (1:250, Bethyl Labs, Montgomery, TX), interleukina (IL)-6 (1:250, Abcam, Cambridge, UK), CD74 (1:250, Abcam) y CXCR4 (1:100, Chemicon, Temecula, CA) y reaccionaron con diaminobenzidina. Se analizaron 3 cortes (10 imágenes digitales por sección a 400×) por caso para estimar el número promedio de células inmunomarcadas por unidad de área (mm2) y la intensidad promedio de la inmunotinción (densidad óptica corregida). Neurology Edición Argentina Octubre 2013

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BCL11B se expresa en gran cantidad en el cerebro de casos de VIH+ latente y se colocaliza con marcadores gliales

VIH+CT

Actina

VIH+CT

VIH +CT VIH+latente EVIH

EVIH

VIH+latente

Unidades/Actina

Figura 2

EVIH

VIH+latente

Bcl11b (neuronas) Densidad óptica

Corteza Frontal

Corteza Frontal Densidad óptica

Bcl11b (glía)

Sustancia Blanca

Fusión

VIH-p24

Fusión

HIV Latente

EVIH

PAGF PAGF

Fusión

VIH+latente EVIH % de células

HIV Latente

EVIH

VIH+CT

VIH+latente

EVIH

Densitometría unidades/mL

PAGF

Proteína Bcl11b en LCR

VIH+CT VIH+latente EVIH

(A) Un inmunoblot representativo muestra un duplex alrededor de los 120 kDa que corresponde a BCL11B. (B) Análisis de la imagen de las bandas inmunorreactivas de BCL11B normalizadas a actina. (C) Patrones de inmunorreactividad para BCL11B en la corteza frontal y la sustancia blanca. Las flechas indican la inmunorreactividad en neuronas y las puntas de flecha en las células gliales. La barra representa 10 µm. (D-E) Análisis de la imagen de los niveles de inmunorreactividad de BCL11B en células neuronales o gliales expresadas como densidad óptica corregida por grupo. Se utilizó un análisis de varianza con un sentido (ANOVA) con Dunnet post hoc para comparar con control, *p < 0,05; **p < 0,01 y con post hoc Tukey-Krammer para comparar con VIH latente #p < 0,05. (F–H) Se realizaron estudios con doble marcación en la corteza frontal con anticuerpos anti BCL11B (canal rojo) y proteína ácida gliofibrilar (PAGF), Iba1 o p24 (canal verde) y fueron analizados con microscopía confocal con escaneo láser. (F) Colocalización de BCL11B con el marcador microglial Iba1 (flechas) en casos de VIH+ latente, pero no en casos de encefalitis por VIH-1 (EVIH). (G) Células expresando altos niveles de proteína viral p24 en casos de EVIH, exhiben menor contenido de BCL11B, mientras que casos latentes no muestran expresión viral y muestran mayor señal inmunorreactiva BCL11B. Las flechas indican células p24-positivas que son BCL11B-negativas. (H) Colocalización de células astrogliales BCL11B a PAGF en casos de VIH+ latente en (Continúa)

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Neurology Edición Argentina Octubre 2013

Figura 3

Los niveles de proteínas remodeladoras de cromatina están alterados en casos de VIH+ latente VIH+CT VIH+latente EVIH

VIH+latente

EVIH

Actina

Densitometría unidad/Actina

Densitometría unidad/Actina

Densitometría unidad/Actina

VIH+CT

(A) Análisis representativo de inmunoblot mostrando la inmunorreactividad para HP1Į, MeCP2, HDAC1, HDAC2, SP1, y SUV39H1 mediante Western blot en muestras de la corteza frontal. (B–G) Cuantificación densitométrica de la inmunorreactividad a la proteína remodeladora de cromatina, expresada como señal según unidades de actina. El análisis unidireccional de la varianza con post hoc Dunnet, *p < 0,05. CT = control; EVIH = encefalitis por VIH.

Análisis de inmunoblot. El contenido proteico fue determina-

do mediante ensayo BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se disolvieron 20 microgramos de proteína total en geles Bis-Tris 4%–12%. Se usaron técnicas estándar de Western blot con anticuerpos: BCL11B (1:1.000, Bethyl Labs), HP1α (1:1.000, Abcam), HDAC1 (1:1.000, Active Motif), HDAC2 (1:2.000, Abcam), MECP2 (1:20.000, Active Motif), SP1 (1:1.000, Active Motif), SUV39H1 (1:1.000, Abcam), CD74 (1:50, Abcam), CXCR4 (1:1.000 Abcam) o Actina (1:1.000, C4, Chemicon). Se realizó análisis semicuantitativo con un sistema de imagen VersaDoc y software Quantity One (Bio-Rad). Inmunomarcación doble e imágenes de microscopía confocal. Se realizó análisis de doble inmunocitoquímica

con el sistema Tyramide Signal Amplification–Direct (NEB Life Sciences, Ipswich, MA) para detectar BCL11B. Los cortes fueron doblemente marcados con anti-BCL11B (1:20.000, Bethyl Labs) detectado con Rojo Tiramida y anti-p24, GFAP o Iba1 detectados con anticuerpos secundarios conjugados fluoresceína isotiocianato (1:75, Vector). Los cortes fueron procesados simultáneamente y los experimentos se realizaron por duplicado. Análisis estadístico. Los análisis fueron conducidos en

muestras codificadas ciegas usando StatView (SAS Institute, Inc.). Las comparaciones entre grupos fueron realizadas con análisis en una dirección de la varianza con el Dunnet post hoc test, al comparar los grupos VIH+ latente y EVIH al VIH+ control y con el post hoc Tukey-Krammer al comparar los grupos VIH+ latente y EVIH. El test Ȥ2 fue utilizado para comparar la distribución de la frecuencia de alteraciones neuromédicas y neurocognitivas entre los 3 grupos VIH. Todos los resultados fueron expresados como media ± EEM.

Analizamos 32 casos, cuyas características demográficas, clínicas, virológicas y anatomopatológicas, se presentan en la tabla 1. Basándonos en los niveles de ADN, ARN y p24 de VIH-1, los casos fueron clasificados como: 12 controles VIH+, sin ADN, ARN o p24 de VIH-1 detectable; 10 casos VIH+ latente, con niveles altos de ADN de VIH-1 y sin ARN detectable o p24 significativo (figura 1, A-C). Como contraste, aquellos casos clasificados como EVIH (n = 10) tenían niveles altos de ADN, ARN y p24 de VIH-1 (figura 1, A-C). La infección productiva por VIH en este último grupo estuvo acompañada por la presencia de nódulos microgliales, astrogliosis y palidez de la mielina (no mostrado). En la anatomía patológica, los casos de VIH latente mostraron algo de rarefacción del neuropilo acompañada de astrogliosis, mientras que los controles VIH+ no mostraron alteraciones histopatológicas (datos no mostrados). Como se muestra en la tabla 1, la proporción de sujetos que habían recibido TARGA fue similar en el grupo control y en el latente (50% vs 44%, respectivamente), mientras que en el grupo EVIH menos pacientes habían recibido TARGA (29%). La supresión virológica sostenida con TARGA también fue similar en los grupos control y latente (60% vs 67%), en contraste con el grupo EVIH, donde ninguno de los pacientes mostró evidencia de supresión viral. Los grupos no tenían diferencia significativa en cuanto a edad, duración estimada de la infección por VIH, año de muerte, nadir de CD4, CD4 actual o carga viral plasmática al momento de la visita más cercana a la muerte. RESULTADOS

comparación con casos EVIH. (I) El análisis de la imagen muestra el porcentaje de células BCL11B-positivas del total de células registradas positivas para Iba1, PAGF y p24 en casos de VIH latente o EVIH. Test t de Student no apareado, 2 colas, *p < 0,05. (J) La mancha representativa muestra las bandas inmunorreactivas BCL11B en muestras de LCR. (K) Análisis densitométrico de BCL11B en LCR. ANOVA con un sentido con Dunnet post hoc para comparar grupos control vs latente y EVIH, *p < 0,05.

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EVIH

Señal/Actina

VIH+latente

Señal/Actina

VIH+CT

Doble cambio

Doble cambio

Doble cambio

Doble cambio

VIH+CT VIH+latente EVIH

Doble cambio

Expresión alterada de objetivos proinflamatorios regulados por BCL11B en casos de VIH+ latente

Doble cambio

Figura 4

VIH+latente

EVIH

VIH+CT VIH+latente EVIH

Densidad óptica

Densidad óptica

VIH+CT

Densidad óptica

Actina

(A–C) Cuantificación de objetivos de niveles posteriores a BCL11B ARNm de CEBP, CXCR4 y CD74 mediante PCRq en muestras de corteza frontal. (D–F) La cuantificación de la abundancia relativa de ARNm de marcadores inflamatorios mediante PCRq reveló alteraciones en los grupos VIH+ latente y encefalitis por VIH (EVIH), sugestivo de procesos proinflamatorios. El análisis de varianza (ANOVA) con un sentido con Dunnet post hoc para comparar grupos control (CT) vs latente y EVIH, *p < 0,05. (G) Un análisis inmunoblot representativo de proteínas CXCR4 y CD74 en muestras de corteza frontal. (H, I) Análisis densitométrico de la inmunorreactividad de CXCR4 y CD74 expresada como razón a actina. El ANOVA con un sentido con Dunnet post hoc para comparar grupos control (CT) vs latente y EVIH, *p < 0,05. (J) Inmunodetección de interleukina (IL)-6, CD74 y CXCR4 en células neuronales y gliales en secciones de corteza frontal. La barra representa 10 µm. (K-M) Un análisis de la imagen de células neuronales y gliales muestra la densidad óptica corregida de cada proteína estudiada por grupo.

Entre los 32 casos, el diagnóstico neurocognitivo previo a la muerte estuvo disponible para 23 sujetos, lo que representa el 75% de los controles VIH+ (9 de 12), el 80% de los VIH+ latente (8 de 10) y el 60% de los casos de EVIH (6 de 10) (tabla 1). Se reportó deterioro cognitivo severo solo en casos de EVIH. El deterioro neurocognitivo leve a moderado ocurrió en 6/8 (75%) de los casos latentes y 5/9 (56%) de los casos control. La tasa relativamente elevada de deterioro leve 26

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en los casos control puede reflejar injuria cerebral ocurrida previo al inicio del tratamiento con TARGA, ya que estos sujetos habían estado infectados durante una década o más. Para entender los correlatos anatómicos de la infección latente por VIH, analizamos la neurodegeneración por microscopía confocal (figura 1, D-K). Los casos de VIH latente mostraron una pérdida considerable de dendritas inmunorreactivas a MAP2 (figura 1, D y H) y terminales nervio-

sas inmunorreactivas a sinaptofisina en la corteza frontal (figura 1, E e I), alteraciones similares a las observadas en casos de EVIH (figura 1, D, E, H e I). Además, se detectó astrogliosis (figura 1, F y J) y microgliosis en el grupo de VIH latente cuando se lo comparó con los controles (figura 1, G y K). Como era esperable, los casos de EVIH mostraron los mayores niveles de PAGF (figura 1, F y J) e Ibal (figura 1, G y K), acompañados por la presencia de células microgliales con inmunotinción + para p24 (no se detectó inmunorreactividad para p24 en los casos de controles VIH o VIH latente, no mostrado). El silenciamiento de la transcripción de VIH-1 en los cultivos de células microgliales está mediado por el regulador transcripcional BCL11B, que recluta un complejo multienzimático modificador de cromatina para suprimir la expresión génica.11 Por lo tanto, también analizamos los niveles de BCL11B y de otros componentes del complejo remodelador de cromatina en muestras de cerebro humano. La proteína BCL11B fue significativamente más alta en el grupo latente que en los casos control y EVIH (figura 2, A y B). En coherencia con esto, la inmunorreactividad a BCL11B se encontraba elevada en las células neuronales (figura 2, C y D) y gliales (figura 2, C y E) en la corteza frontal y la sustancia blanca de casos de VIH latente. El análisis de doble marcado confirmó que se detectaron niveles elevados de BCL11B en células microgliales (figura 2, F y G) y astrogliales (figura 2, H e I) solo en casos de VIH latente, donde no había p24 detectable, lo que apoya el rol de la BCL11B en el silenciamiento del VIH-1. Por el contrario, en casos de EVIH, la células gliales p24-positivas fueron negativas para BCL11B (figura 2, G e I). No hubo cambios aparentes en la detección de ARNm de BCL11B en los grupos estudiados (figura e-1 en el sitio Web de Neurology® www.neurology.org), lo que sugiere que el aumento de BCL11B asociado con los casos latentes podría estar regulado al nivel de traslación o estabilidad proteica. Para evaluar si las alteraciones de BCL11B en el cerebro podrían trasladarse a los fluidos periféricos, se realizaron análisis similares en muestras de LCR. El LCR de casos de VIH latente mostró aumento de BCL11B en comparación con el grupo EVIH (figura 2, J y K). Luego investigamos los niveles de otros componentes del complejo silenciador de VIH (figura 3). HP1α, MeCP2 y HDAC1 se encontraban aumentados significativamente en los casos latentes, en comparación con las muestras de EVIH (figura 3, A, B, D y F), mientras que los niveles de HDAC2, SP1 y SUV39H1 eran similares en todos los grupos (figura 3, A, C, E y G). Como se reportó para BCL11B, la regulación positiva de modificadores de cromatina parece operar a nivel proteico, sin cambios significativos en la expresión génica (figura e-1).

El BCL11B es un importante regulador transcripcional del cerebro.14,18 Debido a que la transcripción de varios genes, incluso aquellos involucrados en la apoptosis y la muerte celular, se encuentra alterada en los cerebros infectados por VIH-1,19 investigamos si este grupo funcional de genes podría representar un objetivo para la BCL11B, mediante un análisis computacional de la presencia de BCL11B en sitios consensuados.20 Llamativamente, 18 de los 25 genes candidatos contenían al menos 1 sitio de unión para BCL11B en su región promotora proximal (tabla e-1). Entre estos, el CEBP, CD74, CXCR4, SOX9, CFLAR y PDCD6 tuvieron la mayor representación de sitios y, por lo tanto, son los objetivos más probables de la regulación mediada por BCL11B. El análisis de su relativa abundancia en las muestras de corteza frontal mediante PCRq reveló que la CEBP estaba reducida (figura 4A) y que CD74 y CXCR4 estaban elevadas en el grupo de VIH+ latente (figura 4, B y C). Como estos genes están involucrados en respuestas proinflamatorias, extendimos nuestro análisis para incluir marcadores inflamatorios importantes. Detectamos una disminución de la transcripción de IL-1 (figura 4D), mientras que se observó un importante aumento de IL-6 en casos de VIH latente (figura 4E). Además, las proteínas CD74 y CXCR4 estaban aumentadas en el grupo de VIH latente y, en menor medida, en los casos de EVIH al compararlos con los controles VIH (figura 4, G-I). De forma similar, la inmunorreactividad CD74 y CXCR4 estaba elevada en neuronas y células microgliales de los casos de VIH latente y EVIH, en comparación con las muestras control (figura 4, J, L y M). La inmunorreactividad a IL-6 también estaba elevada en las células astrogliales en el grupo latente (figura 4, J y K). Investigamos las alteraciones neuropatológicas y moleculares asociadas con las infecciones latentes de VIH-1 en el SNC, definidas como casos con ADN proviral en el cerebro, pero sin infección productiva. Nuestros resultados sugieren que los pacientes con VIH latente tienen déficit cognitivo, alteraciones neurodegenerativas y cambios neuroinflamatorios, apoyando la noción de que la latencia viral no es inocua para el cerebro y podría representar una condición definida con características anatomopatológicas particulares. Aunque los casos de VIH+ latente y EVIH muestran rasgos neurocognitivos y clínicos similares, la extensión de las alteraciones cognitivas y anatomopatológicas fue mayor en el grupo EVIH. A nivel molecular, los casos latentes mostraron niveles aumentados de proteína BCL11B, un regulador transcripcional que media el silenciamiento del provirus integrado, mientras que este modulador epigenético de la infección por VIH estaba reducido en casos de EVIH. DISCUSIÓN

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Estudios previos sugieren que el SNC es un reservorio importante para el VIH, donde pueden ser detectados tanto el ADN proviral como infecciones productivas.8,21 A pesar de que la TARGA benefició ampliamente a los pacientes infectados, no tiene la capacidad de curar la infección debido a la persistencia de los provirus transcripcionalmente silenciosos de larga vida que pueden integrarse al genoma del huésped en subpoblaciones de células susceptibles, generando reservorios virales en sangre periférica y órganos. El cerebro, en particular, representa un santuario para la latencia del VIH-1, ya que el provirus puede persistir debido a las penetración pobre y variable de las drogas antirretrovirales.22,23 Aunque la replicación viral fue considerada siempre necesaria para la inflamación y la neurodegeneración, estudios recientes mostraron una alta prevalencia de DNAV incluso en pacientes avirémicos de larga data.24 Nosotros aportamos una novedosa explicación, mediada por desregulación de BCL11B, que contribuye a la latencia sostenida de VIH-1 y podría también alterar la expresión de genes relacionados con la inflamación. Las respuestas neuroinflamatorias juegan papeles importantes en la neurodegeneración en grupos de VIH+ latente y EVIH, pero basándonos en los análisis de BCL11B, las vías hacia la inflamación podrían diferir entre los distintos grupos. En EVIH, se ha propuesto que los monocitos infectados con VIH atraviesan la barrera hematoencefálica durante la infección temprana y luego inician una cascada de mecanismos inflamatorios a través de la liberación de proteínas y citoquinas/quimioquinas de progenie viral.25,26 Los monocitos infectados migrantes expresan IL-1, IL-6, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, factor de crecimiento tumoral-β, GM-CSF y prostaglandina E2,27 que se unen a receptores de la glía y activan genes inflamatorios adicionales a través de un mecanismo de retroalimentación positiva. Además de la neuroinflamación mediada por moléculas celulares fisiológicas, las proteínas de VIH expresadas por los monocitos, vpr, tat, nef y gp120 activan vías de interferón, apoptosis y MAPK en las microglía y astrocitos, contribuyendo a la inflamación crónica y a la neurotoxicidad.28-31 En contraste, nosotros propusimos que en los pacientes con infecciones latentes por VIH, los niveles aumentados de BCL11B podrían gatillar directamente cascadas neuroinflamatorias mediante desregulación transcripcional de CD74, IL-6 y TNF-α. Aunque no podemos excluir que los casos clasificados aquí como VIH+ latente hayan sido previamente EVIH en los cuales la TARGA haya suprimido la replicación viral, esto no parece probable, ya que el 50% de los sujetos del grupo latente nunca habían recibido TARGA y el resto solo la había recibido intermitentemente, favore28

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ciendo la idea de que la ausencia de ARN viral era el resultado de mecanismos silenciadores. La latencia de VIH-1 requiere de un evento integrado exitoso, donde el ambiente cromatínico del huésped juega un rol clave.8 En células microgliales, el BCL11B reúne un complejo multienzimático lo que recluta SP1, HP1α, HDAC1, HDAC2 y SUV39H a la región viral LTR y establece un ambiente heterocromático en el sitio de inserción viral, silenciando la transcripción de VIH-1.11 En el presente trabajo, investigamos por primera vez el estado del BCL11B y sus factores epigenéticos asociados en el cerebro humano en el contexto de una infección por VIH-1. Reportamos un aumento de BCL11B, HP1α, MECP2 y HDAC1 en la infección latente por VIH, probablemente debido a mecanismos postranscripcionales, incluyendo traslación o recambio proteico. El BCL11B es un regulador común de la transcripción de genes en el cerebro14 implicado en la regulación negativa de la señalización de BDNF, que se encuentra alterado en varios trastornos neurodegenerativos.18 Nuestros resultados sugieren que el reclutamiento de BCL11B a los sitios de inserción viral durante la latencia podría alterar la transcripción de sus genes proinflamatorios blanco, gatillando respuestas inflamatorias crónicas. Sugerimos que la presencia del provirus silente en el cerebro podría gatillar la anatomopatología crónica y podría estar asociado con el deterioro neurocognitivo en pacientes infectados de forma latente. El diagnóstico de VIH-1 en el SNC puede lograrse mediante la detección de VIH en el LCR; sin embargo, la presencia de formas virales latentes solo puede ser corroborada post mortem, dificultando los esfuerzos para detectar el virus residente antes, para determinar posibles intervenciones terapéuticas. Un importante hallazgo de este trabajo es la observación de niveles anormales de BCL11B en el LCR de pacientes con infección latente, en correlación con las alteraciones en el cerebro. Más investigaciones van a determinar el uso potencial del BCL11B como un biomarcador de infecciones latentes por VIH-1 y el SNC. El descubrimiento reciente de la participación de metilasas y deacetilasas de histonas en la latencia de VIH, impulsó la investigación enfocada a reactivar reservorios latentes reactivos y facilitar la erradicación apuntándole activamente a la replicación viral.32 El ácido valproico y la tricostatina A no pudieron reactivar al VIH en células T CD4 primarias infectadas de forma latente,33 lo que provocó dudas acerca de su uso potencial en neuroSIDA. La modulación de BCL11B podría representar una estrategia terapéutica alternativa para la erradicación de reservorios. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la infección latente por VIH-1 en el SNC podría

estar asociada con niveles aumentados de modificadores cromatínicos, incluso el BCL11B. La alteración de estos factores epigenéticos podría activar cascadas proinflamatorias asociadas con neurodegeneración y deterioro neurocognitivo. El BCL11B y otros factores silenciadores podrían representar objetivos novedosos para reducir los efectos de las infecciones por VIH-1 en el SNC. CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES

Dr. Desplats y Dr. Masliah diseñaron el estudio. Dr. Smith realizó los estudios de ADN y ARN. Dr. Everall, Dr. Letendre, Dr. Ellis, Dr. Cherner,y Dr. Grant evaluaron clínicamente a los pacientes. Dr. Desplats, Dr. Masliah, Dr. Dumaop, Dr. Smith y Dr. Adame realizaron el trabajo experimental. Dr. Desplats y Dr. Masliah analizaron los datos y escribieron el manuscrito. Dr. Desplats, Dr. Masliah, Dr. Grant, Dr. Ellis y Dr. Letendre contribuyeron a la discusión. RECONOCIMIENTOS

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15. 16.

17.

18.

Los autores agradecen al Dr. Jerel Fields por contribuciones a la discusión. FONDOS PARA EL ESTUDIO

Apoyado por becas NIH NS057096, AG03197, AG5131, MH62962 (a E.M.) y MH076681, MH79881, MH45294, MH5974, MH58164, y DA12065, California NeuroAIDS Tissue Network U01 MH83506 (a I.G.). Este trabajo también fue solventado por el HIV Neurobehavioral Research Center (HNRC) CSPAR Developmental Core Grant HNRC-859 (P.D.). El HNRC es apoyado por el Center award MH62512 de NIMH.

19. 20.

21.

DECLARACIÓN DE INTERESES

Los autores no tienen declaraciones relevantes a este manuscrito. Ir a Neurology.org para declaraciones completas.

22.

Recibido el 14 de marzo de 2012. Aceptado en su formato final el 29 de noviembre de 2012.

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