CONTROL DE CALIDAD SET-UP DEL CITÓMETRO, BACKGROUND, AUTOFLUORESCENCIA Y FALSOS POSITIVOS/NEGATIVOS

Òscar Fornas [email protected]

Unitat de Citometria de Flux Universitat Pompeu Fabra – UPF / Centre de Regulació Genòmica - CRG Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona – PRBB

Ajuste del equipo y experimento

Rendimiento del citómetro - Mantenimiento del equipo: encender/apagar, limpieza, etc. (múltiples usuarios???). - Verificación del correcto funcionamiento del equipo. Utilización de beads para revisión periódica del estado de equipo. Rango y linealidad:

Equipos digitales (CS&T-BD). Equipos analógicos (establecer protocolos internos).

- Índice de Resolución: Todos los equipos son distintos (incluso 2 FACScalibur). Rendimiento del experimento - Controles: Negativos, positivos, isotípicos, FMO y experimentales. - Adquisición de la muestra. - Preparación de la muestra.

Rendimiento del citómetro Estudio del rango de voltaje y linealidad Existen sistemas automáticos pero podemos personalizarlo

Útil para verificar el estado del citómetro pero no siempre se puede utilizar. ej: Muy alta AF y muy alto nivel de expresión. (analógico y digital puede ser muy distinto)

S Perfetto et al. 2006

Rendimiento del citómetro Estudio del rango de voltaje y linealidad FACScalibur (analógico)

M1=lower bead peak and M2=upper bead peak PMT linearity: (M2-M1) / M1 Ratio: MFI of M1 (Rb8x) / MFI (unst CompBeads)

Fornas, O (PRBB) 2005

Rendimiento del citómetro Índice de Resolución : Grado de separación entre dos poblaciones, es instrumento dependiente La velocidad de paso de muestra (flow rate) puede condicionar la resolución. En poblaciones dim/low puede ser muy peligroso (perderlas).

Efecto de la presión de muestra en CV y SD Indispensable para ciclo celular, trabajar a mínimo flow rate . Porqué no en el inmunofenotipado? - Pérdida de poblaciones dim. - Problemas de compensación. Cuanto más spreading más spillover.

Muestras: 1-6 low flow rate (99%) pero la recuperación depende de muchos factores: 1.  Preparación de la muestra (agregados, viabilidad, titulo Ac incorrecto, etc.) 2.  setup del equipo (nozzle, presiones, frecuencia, etc). 3.  Rmax depende directamente de una alta precisión en el Drop Delay. Si el producto obtenido no cumple la pureza deseada, la primera conclusión es que… EL EQUIPO NO FUNCIONA BIEN, O EL OPERADOR. Un equipo bien controlado (setup, settings, etc…) separa perfectamente pero separa LO QUE LE DECIMOS, todo y que igual no es lo deseado. EL ANALISI ES CRUCIAL NORMALMENTE ES MAYOR EL ERROR HUMANO QUE EL TÉCNICO

RESUMEN Software Dependiendo de la flexibilidad del software, podremos jugar mucho más durante la adquisición con: - Las compensaciones al adquirir controles simples y una vez adquiridos. - Posibilidad Biexponencial (verificación compensaciones correctas) y visualización / análisis de los pseudopicos. - Colorear poblaciones para su fácil seguimiento en el gating y determinación correcta de las poblaciones de interés. CMF multicolor (>2 colores) es relativamente sencilla cuando las poblaciones son bien conocidas y/o bien representadas y de superficie (CD3,4,8,14,19, 56, etc). Cuando estas son escasas vienen los problemas. - Si son de bajo nivel de expresión. - Qué combinación Ac-FL usamos y como resuelve la población. - Tipo celular: variaciones en autofluorescencia. Cuando a todo esto le añadimos marcadores intracelulares PUEDE SER MUY COMPLEJO!!! - Mucha más inespecificidad. - Variaciones raras en la autofluorescencia. - Permeabilizaciones / fijaciones. Para un marcador es mejor el EtOH pero para otros PFA, etc. Entonces es muy difícil adaptarlo para todos a la vez. Casi siempre funcionan mejor las soluciones comerciales que llevan varias mezclas (más versátiles).

RESUMEN La Citometría de Flujo es compleja o muy compleja: Depende del ensayo IDEALMENTE…. - Para poner apunto ensayos multicolor, es necesario disponer de amplias baterías de anticuerpos. A ser posible cada uno de ellos conjugado a todos los fluorocromos utilizados en el ensayo. - Disponibilidad de controles isotípicos para cada marcador, aunque no siempre son útiles… - Equipos con muchos láseres y muchos detectores. - Idealmente para cada punto de un ensayo debemos tener sus controles simples. - Según qué ensayos eso es prácticamente inviable, pero podemos usar beads de compensación “Compbeads” (pero no siempre ayudan). - Cada vez que cambiamos marcador o fuente de células debemos hacer nuevos controles. Y titular !!!

ed.

Referencias de interés

Mahnke YD, Roederer M. Optimizing a Multi-colour Immunophenotyping Assay. Clin Lab Med. 2007 Sep;27(3):469-85, v. Review. Baumgartha N, Roederer M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods 243 (2000) 77–97. S Perfetto, D Ambrozak, R Nguyen, P Chattopadhyay, M Roederer. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protocols. 2006 vol 1, no 3, 1522-1530 Ruud Hulspas,1* Maurice R.G. O Gorman,2 Brent L. Wood,3 Jan W. Gratama, and D. Robert Sutherland. Considerations for the Control of Background Fluorescence in Clinical Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 76B:355–364 (2009) Roederer M. Spectral Compensation for Flow Cytometry: Visualization Artifacts, Limitations, and Caveats. : Cytometry 45:194–205 (2001). Roederer M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry (2002) 1.14.1-1.14.20 Copyright © 2002 by John Wiley & Sons, Inc.