Manual del Cultivador de Hongos 1

Parte Ⅲ Hongos alrededor del mundo

Capítulo 11. Hongos para el Trópico

Cultivo del Hongo Ostra

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Parte Ⅲ Hongos alrededor del mundo Capítulo 11 Hongos para el Trópico

CULTIVANDO PLEUROTUS TUBERREGIUM

Omoanghe (Omon.) S. Isikhuemhen1 y David S. LeBauer2 1 North Carolina A&T State University, EE.UU. 2 University of California, EE.UU.

Introducción Historia y distribución El Hongo Rey Ostra Tubérculo, Pleurotus tuberregium (Fr.) Singer es un basidiomiceto tuberoso. Su consumo está muy extendido en Nigeria y en muchas tribus del África sub-sahariana. A diferencia de la mayoría de otros hongos silvestres y cultivados, éste tiene una fase de esclerocio en su ciclo de vida, que es resistente a condiciones ambientales extremas encontradas en algunas partes de sus áreas de distribución, por ejemplo, la estación calurosa y seca en África Occidental. La Figura 1 muestra 2kg de esclerocio recolectado en forma silvestre. Los esclerocios pueden guardarse durante muchos años antes de usarse como comida, medicina o inóculo e inducir la producción de carpóforos (cuerpos de fructificación). Los cuerpos de Figura 1. Anwar Ibrahim sosteniendo un esclerocio de 2kg fructificación (Fig. 2) cosechados en una fase joven son un alimento delicioso, que se puede comer fresco o se puede secar para un uso futuro. La gente local que usa este hongo para alimento y medicina, normalmente recolecta el esclerocio silvestre, pero se está haciendo difícil de encontrar debido a la disminución de su hábitat boscoso. Sin embargo, se ha establecido un método fácil de cultivo de este hongo para producir esclerocios usando una gran variedad de residuos Figura 2. Ebikare Isikhuemhen agrícolas lignocelulósicos como substratos. sosteniendo hongos grandes El P. tuberregium es nativo de África tropical y de las regiones del Pacífico inducidos del esclerocio. Australasiano del mundo (Pegler, 1983; Isikhuemhen et al., 2000a) incluyendo el sub-Sahara de África, Madagascar, Malasia, Papua Nueva Guinea, Norte de Australia, Nueva Caledonia, Indonesia, Myanmar y la Provincia de Yunnan en China. La demanda mundial de esclerocios se mantiene alta mientras que la cosecha en la naturaleza se reduce. El hábitat natural de este hongo está declinando con la deforestación y la conversión de bosques en campos agrícolas; Copyright 2005 by MushWorld All rights reserved.

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mientras tanto, los esclerocios silvestres se han vuelto escasos y muy caros, sobre todo durante la estación seca (octubre a abril) cuando no es fácil recolectarlos en la naturaleza. Los africanos que han dejado sus casas y residen en tierras extranjeras, normalmente llevan con ellos sus hábitos alimenticios, lo cual explica por qué en la actualidad se puede encontrar esclerocio en polvo en tiendas de comida africana a lo largo de EE.UU., Canadá y muchos países europeos. El esclerocio en polvo que se vende en tales tiendas, siempre se importa de África. Debido a que la fuente silvestre está perdida, es probable que la demanda por el cultivo de este hongo continúe aumentando. Una adopción amplia del cultivo por parte de la población nativa permitirá el uso continuo de P. tuberregium en la dieta y proporcionará ingresos. Diversos tipos de residuos agrícolas disponibles pueden servir como un substrato ideal para su cultivo; el costo de producción puede ser bastante bajo y adaptable a métodos de escasa tecnología. Recolección de hongos y utilización por la población local La población indígena de Nigeria incorpora hongos recolectados, incluido el P. tuberregium, en su dieta y medicina (Oso, 1977, Ogundana y Fagade 1982; Akpaja et al., 2003). De manera similar, los habitantes de Ghana (Obodai et al., 2004), Camerún (Kuyper et al., 2002) y República de Benin (Víctor Ekun, comunicación personal) recolectan hongos salvajes y los usan como comida y medicina. Los esclerocios y cuerpos de fructificación de P. tuberregium también son recolectados de la naturaleza y tanto se consumen como se preservan para un uso posterior. Las mujeres y niños recolectan y venden esclerocios en puestos a la orilla del camino para tener un ingreso estacional y un poco de autonomía financiera. Las personas de Igbo, que son los mayores consumidores de P. tuberregium a lo largo de Nigeria, usan el hongo en lugar de carne, así como también por sus propiedades medicinales (Akpaja et al., 2003).

Ciclo de Vida El ciclo de vida que aquí se describe está basado en observaciones informadas previamente (Isikhuemhen et al., 2000a, Oso 1977, Pegler 1983) en la naturaleza y en experimentos realizados en el cultivo de P. tuberregium (Isikhuemhen et al., 2000b). En la naturaleza, la madera muerta es colonizada tanto por el micelio presente en el suelo como por esporas transportadas por el aire, descargadas de cuerpos fructíferos individuales. P. tuberregium es un hongo de la pudrición blanca que obtiene nutrientes de la degradación de material lignocelulósico (normalmente madera dura). Durante la estación lluviosa es posible ver un leño deteriorándose, lleno de hongos, fructificando durante los primeros años de su colonización. Una vez que el substrato está totalmente colonizado y ha alcanzado una fase avanzada de deterioro, se formarán los esclerocios al final de la estación lluviosa. El esclerocio sobrevive la estación seca y calurosa hasta que la lluvia vuelve, momento en que el esclerocio puede continuar agrandándose o puede formar carpóforos (hongos). Los esclerocios son una masa compacta de tejido micelial que sirve para almacenar alimento durante condiciones desfavorables y es capaz de fructificar cuando retornan las condiciones favorables. El esclerocio es castaño oscuro en la superficie, blanco en el interior, de forma esférica a ovoide y puede medir hasta 30cm en diámetro. Normalmente se cosechan esclerocios que pesan hasta 6kg y se venden entre junio y septiembre en Nigeria (Oso, 1977). En la naturaleza, se cosechan en los leños deteriorados y en la tierra adyacente. Se usan como esclerocio o se entierran y se riegan regularmente para inducir los cuerpos de fructificación (Okhuoya y Etugo 1993; Oso, 1997). La fase de esclerocio no es común entre los hongos de la pudrición blanca. Entre los hongos cultivados, sólo Morchella spp. forma esclerocios como parte de su ciclo vital. Sin embargo, sólo los esclerocios de P. tuberregium son valorados como alimento y medicina, independientemente de su habilidad para producir hongos. No todas las cepas de P. tuberregium forman esclerocios; se han observado algunas cepas de Australia e Indonesia que fructifican directamente sin formar nunca esclerocios (Isikhuemhen, 2000a). El estadío de esclerocio proporciona

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una ventaja única al cultivo de esta especie porque elimina la necesidad de condiciones costosas de fructificación y porque los esclerocios pueden guardarse durante muchos años sin pérdida de viabilidad. Bajo cultivo, es común encontrar 1 y hasta 3 esclerocios por bolsas de 1 kg (peso seco) de substrato de aserrín. Los primordios abortados de esclerocios de menos de 10cm de diámetro pueden ser más numerosos en substrato de paja de trigo, el cual es incapaz de generar micelio nuevo y por consiguiente no es apropiado para aplicar las técnicas de propagación descriptas debajo (Isikhuemhen et al., 2000b). Las cepas silvestres de Nigeria han exhibido una colonización más lenta y un rendimiento mayor en paja de trigo cuando se comparan con cepas de las regiones del Pacífico Australasiano; algunas cepas híbridas tuvieron los rendimientos más altos (Isikhuemhen et al., 2000b). Recientemente, en experimentos de laboratorio hemos obtenido una eficiencia biológica del 73.5%, usando una cepa mejorada cultivada en aserrín suplementado (Isikhuemhen y Vaughans, inédito). Generalmente, P. tuberregium por ser un hongo tropical crece mejor a una temperatura de aproximadamente 30°C. La fructificación requiere una humedad alta para proporcionar el gran volumen de agua requerido para el desarrollo del cuerpo de fructificación.

Productos y Usos Alimento El esclerocio puede empaparse en agua, durante 12-24 horas y después de que se pela la piel, el tejido blanquecino interno se muele hasta obtener una pasta. Esta pasta se usa para sustituir, en parte o completamente, a las semillas de melón (Citrulus lanatus) en la preparación de 'la sopa de egusi', o mezclado con harina de maíz y frito (Isikhuemhen y Okhuoya, 1995; Nwokolo, 1987). Los esclerocios se inducen para que formen esporóforos, y la fase ideal para cosecharlos es 5-7 días después de emerger, antes de que los sombreros se tornen hacia arriba. Estos hongos se cortan en pedazos y se usan como carne en sopas (Nwokolo, 1987). El análisis, tanto de los esclerocios como de los esporóforos, muestra que son ricos en hidratos de carbono, proteínas, vitaminas, y minerales, mientras que son bajos en grasas (Nwokolo, 1987; Okhuoya y Ajerio, 1988). Medicina Durante mucho tiempo, varias tribus de Nigeria usaron el esclerocio de P. tuberregium como comida y medicina, (Akpaja et al., 2003; Isikhuemhen y Okhuoya, 1995). Los Igbo lo usan para tratar problemas cardíacos, mientras que entre la población del Estado de Edo se usa para tratar asma, tos, y obesidad (Isikhuemhen 1995, Isikhuemhen et al., 2000a). Otros usos conocidos incluyen el tratamiento del dolor de cabeza, enfermedades del estómago, resfrío y fiebre, viruela y presión sanguínea alta (Oso, 1977). Okhuoya et al., (1998) informó que en Ghana se usa en medicina para enfermedades relacionadas con la desnutrición y la anemia en niños y en las áreas rurales se usa como uno de los ingredientes para embalsamar los cadáveres.

Materiales En este capítulo, discutimos los materiales específicos usados como substratos. Sin embargo, debería notarse que P. tuberregium puede cultivarse en una variedad de substratos lignocelulósicos, incluidos muchos subproductos agrícolas, residuos de aserradero, y hasta el cartón. El productor debería evaluar primero qué substratos están fácilmente disponibles a bajo costo, y experimentar con combinaciones de substratos para determinar cuál produce mayores rendimientos. El maíz, arroz, paja de trigo (Zea mays, Oryza sativa, y Triticum aestivum), fibra de fruta de la palma aceitera, yuca (Manihot escunlenta), hojas de banana, tusa de maíz, residuos de algodón, aserrín de madera dura, papel, y cartón son todos substratos convenientes. Cuando está disponible, la fibra de fruta de la palma aceitera no tiene comparación en cuanto al rendimiento y la incidencia baja de contaminación (Okhuoya y Okogbo 1990). Copyright 2005 by MushWorld All rights reserved.

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Bolsas: Las bolsas hechas específicamente para el cultivo de hongos con filtros para intercambio de gases están disponibles en Unicorn (www.unicornbags.com), aunque las bolsas para comestibles son una alternativa conveniente.

Semilla (Spawn o blanco de hongo) Cultivo de partida (aislamiento) El método que usted elija emplear para el cultivo de este hongo puede determinar su material o cultivo de partida. Si usted quiere cultivar este hongo en un substrato estéril, usando un proceso de cultivo semi-intensivo o intensivo, puede aislar un cultivo puro desde los cuerpos de fructificación germinados del esclerocio del hongo. Es posible obtener un cultivo puro de los cuerpos de fructificación silvestres, del esclerocio, o de las esporas, usando técnicas patrones de cultivo de tejido descritas por Stamets (1984). Se puede obtener un cultivo puro del micelio de este hongo, incubando tejido del interior del estípite cerca de la base del sombrero o del interior del esclerocio en medio estándar de agar-extracto de malta en caja de Petri incubando a 30°C. Hemos observado que puede ser difícil aislar cultivos puros directamente del esclerocio debido a problemas de contaminación asociados con la carga de microbios inherente a los esclerocios silvestres. Los cultivos puros de este hongo están disponibles por el autor y hay bancos mayores de cultivos por todo el mundo. Preparación de substrato para la producción de semilla Pueden usarse muchos substratos para la preparación de semilla (spawn). Aquellos informados hasta ahora son fibra de fruta de la palma aceitera (Elaeis guineensis), en lo sucesivo llamado OPF, aserrín suplementado con salvado de trigo (T. aestivum) y granos enteros: arroz sin trillar (0. sativa), mijo (Setaria macrochaeta), sorgo o pasto Sudán (S. bicolor) y trigo (T. aestivum). El uso de los granos mencionados se hace siguiendo métodos estándar de utilización de granos para preparar semilla (Stamets, 1984). Aquí proporcionamos una variedad de métodos de producción de semilla que se han usado en el pasado, comenzando con nuestro grano de trigo estándar. Grano de trigo Primeramente, el grano de trigo entero se remoja en agua durante la noche y luego se sancocha (se cuece a medias) por 10 min. Se drena el exceso de agua. Se agrega carbonato de calcio (CaCO3) al 1% p/p y los granos se desparraman para secarse al aire por 20 minutos. Se llenan las bolsas de semilla con 500g de estos granos y se esterilizan a 121°C por 30 minutos. Después de enfriarse, las bolsas se inoculan con 8-10 bloques de agar (aproximadamente de 1 cm2) colonizados por micelio de P. tuberregium en activo crecimiento. Es mejor realizar este proceso de inoculación bajo flujo de aire, estéril como el de una campana de flujo laminar, para disminuir la contaminación. Los materiales de semilla inoculados se incuban tanto en incubadoras como en cuartos limpios a 30°C. La colonización de las bolsas de substrato de semilla de 500g usualmente demora menos de diez días (Isikhuemhen et al., 2000b). A temperaturas menores, la colonización total requerirá más tiempo. Se debe tener especial cuidado para evitar la contaminación, y cualquier bolsa contaminada se debe retirar y luego esterilizar en autoclave antes de su eliminación. La semilla colonizada se puede almacenar a 5-10°C sin pérdida de vigor o vitalidad por un periodo de hasta seis meses. No obstante, periodos de almacenamiento más largos pueden aumentar las chances de que la semilla se contamine. No se aconseja usar pedazos de agar de esclerocio recolectado en la naturaleza para la inoculación de semilla de este tipo, porque en la mayoría de los casos habrá problemas de contaminación. Es posible usar pedazos de esclerocio cultivados en substrato estéril para la inoculación de semilla, pero la proporción de contaminación sigue siendo mayor que cuando se usan cultivos puros en bloques de agar.

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Aserrín Las recetas de aserrín suplementado usadas por los cultivadores comerciales de hongos (Stamets, 1984) funcionan bien para esta especie. El aserrín de madera dura suplementado con 20% p/p de salvado de trigo o arroz y humedecido hasta 65% de contenido de humedad soporta un crecimiento saludable del micelio. Bajo condiciones menos estériles, se puede hacer la semilla agregando pedazos del esclerocio al aserrín a una humedad del 65%, el cual ha sido hervido durante 3 horas. Cuando no están disponibles las condiciones de esterilidad, no se debe suplementar el aserrín. Fibra de fruta de la palma aceitera Para la preparación de semilla se puede usar la fibra de la fruta de la palma aceitera (OPF). Se sabe que tiene una baja incidencia de contaminación, atribuida a su contenido de nutrientes, que permite al P. tuberregium crecer rápidamente para colonizar el substrato (Okhuoya y Okogbo, 1990). El OPF es un residuo abundante generado en el procesado de la fruta de la palma aceitera, una industria mayor en muchos países tropicales donde se encuentra P. tuberregium. Se remoja el OPF fresco en agua durante seis horas, se drena y se coloca en las bolsas para semilla, se esteriliza, se inocula y se incuba como para la semilla en grano, descrito anteriormente. Normalmente, las bolsas de 2kg preparadas de esta manera alcanzan la colonización total dentro de los siete días a 30°C, formando una masa compacta que puede romperse fácilmente en pedazos más pequeños y puede usarse para la inoculación. El OPF también es un material muy bueno para usar en la preparación de semilla bajo condiciones sub-óptimas de esterilidad. El OPF fresco se remoja en agua durante seis horas, se hierve a 100°C por 3 horas y el agua se drena antes de la inoculación con las partes internas de pedazos de esclerocio colectados frescos o pre-remojados. De manera similar, se puede preparar la semilla en aserrín. Sin embargo, dicho aserrín no debe suplementarse, para reducir la incidencia de contaminación. En algunos casos, hemos podido hacer semilla de aserrín fresco que se humedeció hasta un contenido de agua del 65% y se inoculó con pedazos de esclerocio. Estos métodos de preparación de semilla bajo condiciones sub-óptimas de esterilidad o no estériles pueden ser muy útiles en países en vías de desarrollo, donde la obtención de facilidades para trabajar en condiciones de esterilidad puede ser muy onerosa. También es común el uso directo del esclerocio como semilla (inóculo), o sea, la inoculación del substrato con pedazos de esclerocio. Sin embargo, la carga contaminante del esclerocio recolectado de la naturaleza es muy alta. Para hacer esto, recomendamos remojar el esclerocio en agua durante la noche si están secos o se han guardado por más de tres meses (esto no es necesario si se recolectó fresco). Se lavan los esclerocios empapados con agua hervida y luego se quita la piel exterior con un cuchillo limpio. Se corta el centro blanquecino interno del esclerocio en pedazos (normalmente no menos de 2cm2 por pedazo) y se usa para la inoculación. Se informó el uso de una solución de blanqueador en el remojado para lograr la esterilización de la superficie, pero nosotros no lo recomendamos, debido al hecho de que los compuestos o sub-productos que resultan de su degradación o ruptura pueden ser tóxicos para la salud humana. Esto es especialmente así si el producto va a calificar como alimento orgánico o se intenta exportar a los países donde hay controles estrictos de las sustancias químicas usadas en la producción y elaboración de los alimentos.

Substrato Preparación de substrato en masa Muchos residuos lignocelulósicos pueden utilizarse para el cultivo de P. tuberregium. (Fasidi y Olorumaive, 1994; Isikhuemhen y Okuoya, 1995; Okhuoya y Etugo, 1993; Okhuoya y Okogbo, 1990). El aserrín y la paja están fácilmente disponibles a bajo o ningún costo, su pre-tratamiento es fácil, y son menos proclives a la contaminación, comparados con otros residuos agrícolas.

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Paja Se pica la paja seca con un cortador de madera o con una cortadora de césped y se apila en un montón. A medida que la pila crece, el riego periódico combinado con el volteo frecuente del substrato puede ayudar para llevar el contenido de agua al óptimo (proporción de 1:3, paja:agua) dentro de un período de 24 horas. Alternativamente, se puede lograr el contenido de humedad apropiado por remojo (inmersión completa del substrato en agua) durante la noche y permitiendo que el substrato empapado drene por lo menos 3 horas antes del tratamiento de calor. Después de alcanzar el contenido de agua apropiado, se puede colocar el substrato en las bolsas de cultivo antes de la pasteurización o tratamiento de calor en masa. Las bolsas de cultivo, que pueden contener hasta 5kg de substrato húmedo, se pueden esterilizar por calor a 100°C durante 1 hora en 2-3 días consecutivos. La esterilización por vapor puede hacerse en tambores de 55 galones llenos hasta los 20cm con agua que se calientan sobre un fuego o cocina de propano, asegurándose de mantener agua en el tambor durante el calentamiento a vapor. Se deben usar ladrillos o alambres para mantener las bolsas sobre el agua. Se puede lograr la pasteurización en masa del substrato, cociendo al vapor la masa de substrato a 100°C en una cámara adecuada, pero un volumen de substrato de más de 5kg debe tener períodos más largos de exposición al vapor para asegurarse que todo el substrato alcance los 100°C durante el tratamiento de calor durante 2-3 días consecutivos. El substrato tratado con calor se debe enfriar por debajo de los 45°C antes de la inoculación con la semilla. En el caso de las bolsas, se debe agregar la semilla (5-10% p/p) y se debe agitar cuidadosamente para permitir la distribución homogénea de la misma en todo su interior. Después, la bolsa se sella al calor o la boca de la bolsa se pliega en una protuberancia apretada y se cierra con una banda de caucho. Para el substrato en masa, los materiales de semilla deben agregarse en una proporción similar y se mezclan cuidadosamente dentro del substrato, antes o durante el llenado de las bolsas de cultivo. Este proceso es más eficiente, pero no es tan efectivo para controlar la contaminación que puede introducirse durante la inoculación. Normalmente, la inoculación del substrato con la semilla se hace bajo flujo de aire estéril en una campana de flujo laminar. Sin embargo, puede usarse un cuarto limpio para este proceso y lograr una baja incidencia de contaminación, siempre que se observen estrictamente las reglas de higiene personal. Aserrín composteado y OPF Se recogen el aserrín de madera dura fresco y el OPF y se secan al sol. En una plataforma de cemento, se mezclan el aserrín y el OPF en una proporción de 1:1 (p/p). Se agrega agua en una proporción de substrato: agua de 1:2. El substrato se amontona en pilas de 2m de diámetro y 1,5m de alto y se cubre con una lámina de plástico negra. Se producirá calentamiento solar y metabólico. Se voltea la pila y se mezcla una vez por semana durante cuatro semanas. El substrato se fermenta parcialmente y se vuelve bajo en contaminantes. Entonces se pueden llenar las bolsas con el substrato y se esterilizan al vapor como se mencionó anteriormente, antes de la inoculación (Fig. 3). El substrato que no se usa inmediatamente después de la fermentación puede secarse al sol y guardarse para un uso futuro, pero requerirá llevar el contenido de agua a la capacidad óptima (1:2 a 1:3, relación substrato:agua) y esterilizarse inmediatamente antes de usar. En áreas rurales donde no se dispone de un equipo de esterilización, el substrato pasteurizado puede inocularse con pedazos de esclerocio. En este caso, los pedazos de esclerocio deben ser más grandes (5-l0cm2) y la proporción de inoculación de por lo menos 10% por peso de substrato. Cuando el esclerocio se usa para inocular substrato no esterilizado o parcialmente esterilizado, tiene un poder alto para superar contaminantes como el moho azul (Trichoderm spp.). El micelio que crece del inóculo de esclerocio se une en forma de cordones rizomórficos que se usan para penetrar y colonizar áreas contaminadas del substrato (Fig. 4).

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Figura 3. Cultivo de P. tuberregium en bolsas en columna

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Figura 4. Micelio rizomórfico proveniente de aserrín inoculado con esclerocio colonizando substrato no estéril

Aserrín suplementado Se han probado aserrines de diversas maderas duras para el cultivo de P. tuberregium. Okhuoya et al., (1998) informó varios niveles de rendimiento de esclerocios en aserrín de diferentes maderas duras tropicales. Aún para los mejores substratos de aserrín, la suplementación con fuentes diferentes de nitrógeno orgánico puede mejorar significativamente los rendimientos de esclerocios; por ejemplo, usando una de nuestras cepas seleccionadas, hemos obtenido 735g de esclerocio fresco de 1 kg de substrato de aserrín suplementado con 5 % de salvado de trigo (Fig. 5). La carga contaminante puede ser alta sin las facilidades adecuadas para trabajar en esterilidad. Se recomienda un 20% p/p de suplementación, y el cultivo utilizando este substrato debe hacerse en bolsas para minimizar la contaminación. Sin embargo, el aserrín fresco no suplementado puede ponerse en camas y usarse para el cultivo tanto en los pisos de cuartos sin usar, suelos de bosque o bajo plantaciones como caucho (Hevea brasilenses), cacao (Theobroma cacao) u OPF. En un estudio de este tipo de método de cultivo, las camas de aserrín de 1m2 de dimensión dispuestas en cuartos dieron un rendimiento de 4.0 ± 0.57kg (peso fresco) por cama (Isikhuemhen, 1993). De manera similar, Akpaja y Begho (1999) han producido esclerocios en camas de cultivo puestas bajo una plantación de caucho. Se recoge el aserrín de una madera dura conveniente, se ajusta el contenido de agua (1:3 proporción substrato:agua) y se pone en camas en pisos de hormigón o en hojas de plástico colocadas en suelos de bosque o de plantación. En este caso, no se debe hacer ningún tratamiento de calor y la inoculación es mejor hacerla directamente con pedazos de esclerocio como se describió anteriormente.

Figura 5. Esclerocio creciendo en substrato de aserrín suplementado

Figura 6. Cultivo de P. tuberregium. en cama de aserrín cubierta con tierra de jardín. Los puntos marcados son los sitios donde los esclerocios se están formando y están atravesando el material de cobertura.

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El cultivo en cama de P. tuberregium requiere de una cobertura (casing), que normalmente se pone después de que se observa la colonización completa de la cama. Esto se hace porque las camas de aserrín pueden secarse muy fácilmente bajo condiciones de clima tropical. Generalmente, cuando el substrato de aserrín está colonizado por el micelio, es difícil regar, dado que el agua aplicada va a escurrir simplemente o va a permanecer en la parte superior de la cama hasta evaporarse. Sin embargo, por medio de la cobertura, el contenido de agua del substrato se conserva y además, ayuda para conservar el agua agregada para mantener los niveles acuosos en la cama hasta que se absorba lentamente dentro de ella. Se puede utilizar el material de cobertura que se usa normalmente en la producción de Agaricus: turba suplementada con cal. Sin embargo, se ha informado el uso de tierra de jardín (Fig. 6). La formación de esclerocios será visible luego de dos semanas de colocada la cobertura. Las camas colonizadas y sin cobertura necesitan mucho más tiempo para empezar la formación de los esclerocios. Sin embargo, no se entiende el mecanismo por el cual la cubierta acelera la formación de esclerocios en las camas. Troncos Se pueden usar leños de madera dura de aproximadamente 10-20cm de diámetro y 1m de longitud para producir tanto esclerocios como cuerpos de fructificación. Okhuoya y Okogbo (datos no publicados) probaron leños de diferentes especies de maderas duras y encontraron que casi todos los leños probados eran capaces de producir esclerocios. Sin embargo, las maderas duras relativamente menos densas producían antes los esclerocios y, en algún caso, como los leños de la palma, se produjeron tanto esclerocios como cuerpos fructíferos no asociados a esclerocios. Pueden usarse los leños de menor valor económico, como las ramas sobrantes de las operaciones de talado y los tocones o troncos caídos por la tormenta, para el cultivo de P. tuberregium para obtener esclerocios. El tiempo que lleva producir esclerocios en leños depende de las especies de árboles, diámetro del leño, y cepas de P. tuberregium. Los métodos estándar para la inoculación de leños usados en el cultivo del shiitake son aplicables a este proceso. En leños apropiados, se perforan agujeros (0.5 x 2cm) en un patrón de diamante con 15 cm de espaciado y la semilla se inyecta en esos agujeros con ayuda de un émbolo, seguido por el encerado con queso o cera de abeja. Los leños se apilan durante un año a la sombra y se previenen del secado. Cualquier material local de origen orgánico puede usarse para cubrir los agujeros inoculados, dado que su función es principalmente prevenir que el inóculo inyectado se seque antes de que el micelio crezca en los leños. En la tribu de Esan de Nigeria, la pomada de la pepita de la palma, Ori-eyo (pronunciado ori-ehyor) podría servir para este propósito. Los leños inoculados pueden ponerse en suelos de bosque para la colonización y producción de esclerocios. Los troncos grandes caídos pueden inocularse in situ y dejar que sean colonizados y produzcan esclerocios. En tales casos, el leño puede ser una fuente de esclerocios, año tras año, hasta que los leños estén completamente podridos. Hemos observado que los esclerocios producidos en leños bajo condiciones naturales son más densos, más pesados y, generalmente, se conservan más tiempo que aquéllos provenientes de substratos de paja o de aserrín de madera dura.

Métodos de cultivo Inoculación de substrato en masa Cuando el material de semilla está totalmente colonizado, será una masa compacta de micelio y substrato. Delante de una campana de flujo laminar, la semilla se corta en pedazos de 2-4cm2, los cuales están listos entonces para inocular el substrato final. En ambientes no estériles o parcialmente estériles, donde por ejemplo, se usa OPF para generar semilla a partir del esclerocio, la semilla también puede cortarse en pedazos y usarse para la inoculación del substrato en masa.

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Colonización del micelio y formación de esclerocios El crecimiento micelial es más rápido a 30°C y humedad relativa > 80%. La colonización del micelio tomará 20-30 días, dependiendo del substrato. La colonización del micelio y la producción de esclerocios pueden hacerse en camas, si está disponible la facilidad de cultivo apropiada o en bolsas similares a aquellas utilizadas para la producción de semilla. Para una producción a gran escala, las casas de cultivo maximizarán la productividad y la eficiencia. Alternativamente, el uso de bolsas permite adaptar la producción a una variedad de escalas y elimina la necesidad de mantener la humedad. El cultivo en bolsas también puede disminuir la contaminación. No se requiere luz para la formación del esclerocio (Fig. 7). Figura 7. Esclerocio en formación en una bolsa de cultivo llena con substrato de aserrín

Camas de substrato en masa con cobertura El substrato se pone en camas de 1m2 y 20cm de altura. Son convenientes las casas de bambú (Bambusa sp.) con suelos de cemento y techos de hoja de palma. Pueden usarse soportes para apilar las camas y aumentar al máximo el uso del espacio. Se inoculan las camas de substrato en una proporción de 5-15% (p/p), dependiendo de la carga de contaminantes y del método de esterilización empleado. En climas tropicales, la pérdida de agua de las camas puede ser alta. Debe agregarse agua en una proporción de 5L/m2 cada día durante las primeras tres semanas antes de que la colonización sea completa. Después de tres semanas, se mantendrá la humedad con recipientes llenos de agua colocados en los espacios disponibles. Se mantienen las ventanas cerradas hasta que la colonización esté completa, salvo por una hora durante la noche. La cobertura se realiza cuando el substrato está completamente colonizado, normalmente seis-ocho semanas después de la inoculación. Se usa tierra de jardín, arena, o turba para cubrir las camas colonizadas, hasta una altura de 4-5cm. Se mantiene la humedad de la cubierta regando ocasionalmente. Los esclerocios emergerán a través del material de la cubierta 2-4 semanas después de colocar la cobertura. Se ha demostrado que la cobertura incrementa los rendimientos en varias especies de hongos (Stamets 1984), incluidos los cuerpos de fructificación del P. tuberregium (Okhuoya y Okoobo, 1990) aunque no se ha informado todavía el efecto de la cubierta sobre el rendimiento de esclerocios. En esta fase, se aumenta el riego para impedir que se sequen los esclerocios. Se pueden abrir las ventanas por seis horas durante el día para permitir la ventilación y bajar la temperatura del ambiente. Los esclerocios jóvenes son blancos y se vuelven de color castaño oscuro con el tiempo. El uso de este método con un manejo apropiado, puede rendir 2-4 kg esclerocio/m2. Método en bolsa También se puede inocular el substrato en bolsas de hasta 8kg cada una. Se agrega una proporción de semilla de 5% (p/p). El substrato puede inocularse con semilla o directamente con pedazos de esclerocio. Sin embargo, cuando no están disponibles los medios estériles y la posibilidad de una pasteurización homogénea del substrato es remota, se pueden usar pedazos de esclerocio para inocular substratos de aserrín colocados en las bolsas después de mezclar con agua. Bajo tales condiciones, la inoculación a una tasa de 10% de semilla puede tener éxito. Cuando se usa substrato no esterilizado, nunca debe emplearse la suplementación con fuentes de nitrógeno orgánico como granos, porque los contaminantes competirán con el hongo y reducirán los rendimientos. Los esclerocios pueden cultivarse en las bolsas con filtros similares a aquellos usados para la producción de semilla, con la misma variedad de substratos mencionada y sin requerimiento de cubierta. El cultivo en bolsas requiere sólo que la temperatura se mantenga alrededor de 30°C, dado que la humedad será retenida por la bolsa. Los esclerocios estarán listos para cosechar dentro de las 12 semanas, cuando se usan cepas de rápido crecimiento y alta productividad.

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Cosecha y almacenamiento Se cosechan los esclerocios al llegar a la madurez, se limpian con agua, y se secan al aire (o al sol) durante una semana. Los esclerocios frescos son aproximadamente 50% de agua. Los esclerocios secos mantendrán su viabilidad durante por lo menos dos años si se guardan a 5-10°C, o durante un año a 28°C. El Dr Roy Watling pudo fructificar un esclerocio recogido en Camerún después de siete años en el invernadero, en Edimburgo (comunicación personal). Pueden esperarse rendimientos del 10% de esclerocios frescos en substrato húmedo (aproximadamente 5% de masa seca del substrato seco). lnducción de carpóforos a partir del esclerocio Para inducir la fructificación del hongo a partir de esclerocios, primero remoje el esclerocio en agua durante 6-12 horas (dependiendo del tamaño). Es necesario enterrar el esclerocio en turba, arena, o tierra. Se pueden poner los esclerocios en bandejas o en agujeros poco profundos excavados en la tierra y se cubren con una capa de cubierta de turba y/o tierra. La humedad del ambiente debe ser mayor de 85%, y puede ser necesario regar la capa de cobertura diariamente con aproximadamente 40mL/esclerocio. La formación del cuerpo de fructificación debe ocurrir dentro de los 5-15 días. Los hongos destinados a la gastronomía deben cosecharse antes de que se abra el sombrero, aproximadamente 3 - 5 días después de emerger bajo condiciones de temperatura de 25-30°C. Pueden esperarse dos y posiblemente más oleadas, dependiendo del tamaño del esclerocio. El esclerocio se formará, normalmente en menos de 90 días, si el substrato se coloniza a una temperatura alta. Sin embargo, la fructificación puede inhibirse a esta temperatura, y no ocurrirá mientras esté dentro de la bolsa. Hemos encontrado que 25°C son ideales para la fructificación y Okhuoya y Okogbo (1990) informaron que el uso de material de cobertura incrementa los rendimientos en una variedad de substratos. El rendimiento de hongos será aproximadamente de 25% del peso del esclerocio, y 90% de humedad. El rendimiento de hongos a partir de esclerocios y la calidad del hongo no son comparables a otros Pleurotus spp. en substratos similares.

Comercialización y Exportación Pleurotus tuberregium no es tan ampliamente cultivado o bien conocido como otros hongos, tales como Agaricus bisporus (hongo botón) y Lentinula edodes (shiitake), los cuales constituyen industrias de muchos miles de millones de dólares en el mundo occidental. Sin embargo, los esclerocios de P. tuberregium, son muy importantes debido a sus usos múltiples como alimento y medicina (Akpaja et al., 2003, Nwokolo 1987, Oso 1977). Los esclerocios son un artículo esencial para el consumo local, sobre todo en la sub-región de África Occidental, también se han vuelto un artículo para la exportación a los países desarrollados, dado que ellos se venden en locales de comida de especialidad en muchos continentes. La posibilidad de un incremento en la exportación se basa en dos hechos mayores: 1. Las personas que habitan en las regiones del mundo donde el esclerocio se usa como alimento y medicina y que ahora viven en Europa y América, buscan activamente este material en negocios de comida africana en esos continentes. Isikhuemhen ha encontrado esclerocio en polvo en tiendas del Reino Unido, EE.UU. y Canadá. 2. El segundo impulso para las exportaciones se debe a estudios científicos recientes que muestran que el esclerocio de este hongo contiene polisacáridos y otros compuestos con beneficios medicinales positivos. Las publicaciones de Asia han mostrado que los esclerocios frescos de este hongo tienen un contenido alto de compuestos útiles como β-glucanos y lectinas, que tienen propiedades medicinales prometedoras (Zhang et al., 2003; Wang y Ng, 2003). En nuestros laboratorios estamos encontrando que este hongo tiene propiedades antibióticas, así como también de inhibición in vitro de diferentes líneas celulares de cáncer (Isikhuemhen y Goktepe, inédito). En el IMC 7 en Oslo, 2002, el Dr. Jae Sung Lee del Departamento de Bioquímica, Copyright 2005 by MushWorld All rights reserved.

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Universidad de Yeungnam, de Corea, nos dijo que ellos estaban probando la incorporación de polvo de esclerocio al pan, como una fuente barata de suplemento para aumentar el contenido proteico del pan. El mundo se está volviendo consciente de la importancia y beneficios para la salud de los alimentos y suplementos naturales. El esclerocio y los carpóforos de P. tuberregium son algunos de tales alimentos naturales. Es muy caro producir esclerocios en lugares donde las temperaturas son sub-óptimas para este hongo debido al costo elevado del control ambiental. La producción que nosotros hacemos para obtener esclerocios para nuestra investigación se hace en incubadoras a una temperatura fija de 30°C durante todo el año. Eso sería oneroso para que las empresas comerciales lo adopten en lugares como Europa central y boreal y la mayor parte de América del Norte y Asia. Sin embargo, el mismo hongo puede producirse, incluso bajo cultivo abierto o al aire libre, sin necesidad de control ambiental en lugares del Africa sub-sahariana (del Oeste al Este), Madagascar, sur de India, China y Sudeste asiático. Por consiguiente, dondequiera que haya necesidad de esclerocios de este hongo, será más barato importarlo de las regiones donde se cultiva fácilmente. Afortunadamente, las regiones arriba mencionadas están principalmente en países en vías de desarrollo. El método descrito anteriormente para el cultivo de P. tuberregium es simple y barato y es adecuado para el uso en países tropicales en desarrollo. Sin embargo, este modelo puede ajustarse en ambas direcciones con poca o ninguna modificación, tanto para el uso por habitantes rurales (sobre todo mujeres), como para pequeños productores o aficionados, empresas de pequeña escala o grandes productores comerciales.

Posibilidad de estos Métodos para Países Tropicales en Desarrollo Los métodos descritos aquí se desarrollaron específicamente para proporcionar métodos de cultivo de hongos para alimento y medicina en países en vías de desarrollo con recursos tecnológicos limitados. Con este fin, hemos descrito el uso de residuos agrícolas, los cuales están fácilmente disponibles a bajo o ningún costo. Hemos descrito una variedad de métodos aplicables a diversas situaciones. Se recomienda el uso de OPF y de OPF/aserrín por su mayor rendimiento y baja contaminación, facilidad de uso, y adaptación a granjeros con recursos limitados. Si se puede producir una buena semilla de aserrín, el cultivo en leños maximiza la inoculación y producción del substrato a partir de cantidades pequeñas de semilla, y tiene un riesgo mínimo de contaminación. Otra ventaja de los leños es que ellos producen durante muchos años. Cuando está disponible un laboratorio estéril, se recomienda el uso de semilla de aserrín para inocular la paja, OPF, u otros substratos en masa. Un principiante o un cultivador de hongos inexperto puede tener dificultad en el desarrollo de cultivos puros y semilla pura, porque esto requiere alguna habilidad técnica y es más seguro cuando se dispone de una campana de flujo laminar y un autoclave. Esto se puede superar, obteniendo la semilla de los fabricantes de semilla comercial, o creando una cooperativa para desarrollar una facilidad especializada en la producción de semilla para servir a muchas granjas. Por otra parte, los substratos con bajos nutrientes, como el OPF no suplementado o el aserrín, no contendrán la mayoría de los contaminantes. La contaminación por otros hongos indeseables y organismos patógenos puede minimizarse siguiendo las instrucciones dadas aquí para la preparación de la semilla y del substrato, y manteniendo condiciones higiénicas estrictas dentro de y alrededor de los predios de cultivo. Se recomienda un cuarto limpio para la producción de semilla y la inoculación del substrato. Deben limpiarse completamente los cuartos de cultivo entre una cosecha y otra. Las ventanas y puertas protegidas pueden mantener lejos a la mayoría de los insectos. No hemos observado insectos atraídos por los cuerpos de fructificación de este hongo tanto como vemos para otras especies de Pleurotus. Reconocimientos Este capítulo se dedica a Magda y Ebikare Isikhuemhen, y Joseph y Joslin LeBauer. Agradecemos a nuestro mentor, Dr. Rytas Vilgalys (Duke University, Durham, EE.UU.) por su continuo apoyo y disponibilidad para algunas de Copyright 2005 by MushWorld All rights reserved.

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nuestras investigaciones en especies de Pleurotus. Deseamos reconocer el apoyo de Unicorn bags (www.unicornbags.com) por el suministro de las bolsas que usamos para el cultivo y de The Golden Leaf Foundation (www.goldenleaf.org) que nos está proporcionando apoyo financiero para nuestra investigación continua en hongos de especialidad, incluido el P. tuberregium.

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