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DE LA SOCIEDAD OFTALMOLÓGICA HISPANO-AMERICANA 1968  –  Enero La importancia biológica del cristalino J. M. Genis Gálvez; J. M. Castro Romero; E. Battaner Arias 69

FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA 1.a CATEDRA DE ANATOMIA Y TECNICA ANATOMICA Pro f.:

J. M.

Genis G A lv e z

Arch. Soc. oftal. hisp.-amer. 2S: 69-111 (1968).

LA

IM PORTAN C IA

B IO LO G IC A

DEL

CRIST A LIN O

(*)

POR

J. M. GENIS CALVEZ, J. M. CASTRO ROMERO y E. BATTANER ARIAS

L o s fenóm enos de naturaleza m orfológica acerca de la inducción del cristalino y su subsiguiente diferenciación celular han sido deta­ lladamente analizados en anfibios y aves, tanto en sus embriones com o en animales adultos. E l esbozo del cristalino se inicia estructuralmente com o un en grosamiento del ectoderm o cefálico (placoaa cristaliniana), que rápida­ mente se invagina para construir una diminuta vesícula, la cual se segrega finalmente del ectoderm o originario. Pron to las células de la pared profunda de dicha vesícula se alargan para form ar las fibras primaria del cristalino, que constituyen el núcleo em brionario del mis­ mo. Las células de la pared superficial de la vesícula cristaliniana no sufren este proceso de elongación y permanecen en su form a cuboidal, constituyendo el epitelio del cristalino. A nivel de la región ecuatorial, se establece una zona de transi­ ción en la que las células epiteliales progresivam ente se alargan, ori­ ginándose asi fibras cristalinianas secundarias, las cuales son deposita­ das com o fibras meridionales alrededor de! núcleo. /Tanto durante el desarrollo pre- com o postnatal, capa tras capa de fibras secunda­ rias se van añadiendo periféricamente, siendo las fibras más antiguas comprimidas ordenadamente hacia el centro del órgan o, donde perma­ necen retenidas, m otivando con ello el crecimiento del mism o. (*)

Com unicación presentada al X L V

C ongreso de la Sociedad O ftalm ológica

Hispano-Americana. L eón , septiembre 19(57. Este trabajo

ha sido subvencionado

Foundation de Nueva Y ork . I '. S. A.

con

una ayuda de

la Crippled Children

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J. M.

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GENIS, J. M. CASTRO Y E. BATTAXER

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J. I

Se establece así una interesantísima secuencia de diferenciación citom o rfo lóg ica de un tipo celular puro, no con ta m in ad o,, en la que se distinguen sucesivas generaciones celulares que inicialmente form an parte del epitelio y posteriorm ente de la región ecuatorial y corteza del órg an o. D ado que este proceso continúa durante toda la vida, aunque con distinta intensidad, y que el cristalino carece de un m eca­ nismo de eliminación celular, el órgan o encierra en su estructura la ¿om pleta historia de su diferenciación embrionaria y post-natal. Esta

Fig. 1.

secuencia de diferenciación cito m o r fo ló g ic a : célula epitelial, célula ecuatorial, célula cortical, célula nuclear, queda respectivamente re­ presentada en el cristalino p or regiones o zonas susceptibles de ser disecadas y analizadas. Dichas regiones son :

el epitelio, la región

ecuatorial, la corteza y el núcleo del órgan o (fig. 1). Téngase presente, por lo que antecede, que, sobre tod o, durante el período em brionario y g-ran parte del post-nasal, las distintas,pobla­ ciones celulares se desplazan especialmente desde el ecuador, hacia ;el centro del órg-ano y que, por lo tanto, una célula fibrilar -localizada en el centro de un cristalino adulto, pudo encontrarse, durante el

p eríod o em brionario, en la región ecuatorial del mismo o form ando parte de su epitelio. Paralelamente a los cambios de diferenciación citológica existen, com o es de suponer, caracteres distintos a un nivel subcelular y subm icroscópico. Así las células del epitelio, que se caracterizan p or su form a cuboidal, p or su basofilia, y subm icroscópicam ente p or un re­ tículo endoplásm ico fuertemente desarrollado, son las únicas que dis­ ponen de un mecanismo adecuado de replicación. Inicialmente, en fases embrionarias, todas las regiones del epitelio gozan de esta p ro ­ piedad germinativa y consecuentemente las m itosis pueden observarse p or todo el epitelio. A medida que el mineral avanza en edad, esta propiedad queda restringida a un anillo preecuatorial al que se puede, con justicia, denominar región o zona germinativa del cristalino. A nivel de la zona ecuatorial, donde se inicia el alargamiento de la célula epitelial, iniciándose así la form ación de las fibras secundarias, las características citológicas se m odifican notablemente. L o s núcleos celulares se agrandan y se hacen m etabólicam ente activos, siendo capaces de sintetizar ambos tipos de ácidos nucleicos. N o es de extrañar, pues, que tanto la población ribosóm ica com o el retículo endoplásm ico aumenten y se desarrollen considerablemente. La célula ecuatorial dispone, en este sentido, de un mecanismo más perfecto y adecuado para la biosíntesis m acrom olecular que el que poseen las células del epitelio. A medida que las células cristalinianas se alargan para form ar las características fibras del órgan o, las propiedades tintoriales cambian, evidenciando ahora el citoplasma una m ayor apetencia por los co lo ­ rantes ácidos. A l mismo tiempo parece existir un decremento gradual de los distintos orgánulos citoplásm icos (m itocrondias, granulos, etc.), resaltando la notable disminución de ribosomas que coincide con el acúm ulo p rogresivo de sustancias de baja densidad en el citoplasma (Resnik, W anko y Gavin, 1960; Brini y Porte, 1961; Brini, P orte y Stoeckel, 1962; R abey y Lagasse, 1965). El retículo endoplásm ico tom a ahora un aspecto liso en su superficie con una acusada disminu­ ción de sus membranas. E l com plejo de G olgi, tiende a alargarse y fragmentarse (L óp ez Enríquez) (fig. 2). El tamaño nuclear y nucleolar disminuye ostensiblemente, deteniéndose la síntesis del D N A y R N A (Papaconstantinou, 1967). E stos datos parecen sugerir que tanto las propiedades de duplicación com o las de transcripción se suprimen

en las células fibrilares, pero que el m ecanismo de traducción se esta­ biliza y conserva. P or otro lado, un m étodo valioso de medir la actividad genética, durante el desarrollo, consiste en analizar y registrar, a nivel del p ro­ ceso de traducción, los cam bios en el contenido proteico de las células en los diferentes estadios de su diferenciación m orfo ló g ica (Ingram , 1963; M arkert, 1963-1964). Estudios realizados p or em briólogos y bioquím icos sugieren que los cambios on togénicos de las proteínas deben ser interpretados com o

F ír . 2.

fiel reflejo de una biosíntesis proteica diferencial, a un nivel de trans­ cripción o de traducción, más que una expresión de cam bios en la actividad o degradación de dichas proteínas (U rsprung, 1965). Sin em bargo, en el caso del cristalino que no puede eliminar adecuada­ mente sus células de desgaste, las cuales quedan en su m ayoría co n ­ servadas en la estructura del órgan o, permite pensar en la posibilidad de que los cam bios ontogén icos de las proteínas cristalinianas, puedan ser debidos, en parte, a una natural degradación de dichas sustancias. E n los últimos veinte años, num erosos investigadores han analiza­ do, con la ayuda principalmente de m étodos inm unológicos, el m o­ mento de aparición, durante el desarrollo, de las proteínas específicas

de la lente (cristalinas), las cuales habían sido químicamente caracte­ rizadas a finales d e l,s ig lo pasado (M órner, 1894; T en Cate y van Doorenm aalen, 1950 ; Clayton, 1951; B eloff, 1959; Langm an, 1959; Maisel y Langm an, 1961 y Zwaan, 1963). Dichos autores analizaron, pues, en el cristalino, el com ienzo de una actividad genética esp ecífica : el m om ento del «encendido» de los genes responsables de !a biosíntesis de tales proteínas estructu­ rales. Inicialmente se creyó que 'de las tres proteínas solubles del cristalino, la cristalina alfa era la primera en sintetizarse (M aisel y Langm an, 1961), pero posteriorm ente el empleo de nuevos m étodos de caracterización proteica y de técnicas histoinm unológicas con el em­ pleo de antisueros de alta especificidad, han p roporcion ado una infor­ mación contraria a dicho concepto. En efecto, se ha señalado que con anterioridad a la aparición de la cristalina alfa, otra importan­ tísima fracción soluble se encuentra ya presente en. el esbozo del cris­ talino, predominando en el patrón electroforético e inm unoelectroforético durante la totalidad del período em brionario. Esta fracción pro­ teica, en las aves, fue denominada inicialmente «primera cristalina soluble im portante» o «First important soluble crystallin» (Rabaey, 3962) y posteriorm ente «cristalina delta» (Zwaan e Ikeda, 1965). En el em brión de pollo se ha investigado la aparición de las p ro­ teínas cristalinianas utilizando la técnica de anticuerpos fluorescentes con antisueros específicos a las distintas fracciones proteicas (Zwaan e Ikeda, 1965 ; van Doorenm aalen, 1966). Estos estudios han pro­ porcionado la interesante inform ación de que la cristalina delta es el primer antígeno en sintetizarse, localizándose en las células más p ro­ fundas de la placoda cristaliniana (em brión de 23 som itos, 50-53 h o­ ras de incubación), extendiéndose el proceso de manera que en el em­ brión de tres a tres y medio días, de incubación, la síntesis de la cristalina delta puede observarse tanto en el epitelio com o en las fibras del cristalino. Precisamente en esta última fecha es cuando viene a detectarse p or vez primera la cristalina alfa, cuya síntesis se inicia en las fibras centrales del órgan o, aunque posteriorm ente la reacción se extiende progresivam ente a las fibras corticales, zona ecuatorial y finalmente epitelio. H acia el octavo día del desarrollo todas las cé­ lulas del epitelio se hacen positivas al suero antialfa, al mismo tierna po que la reacción se expresa progresivam ente con m enor intensidad a nivel de las fibras centrales. La tercera fracción soluble del crista-* lino, la cristalina beta, rio hace su aparición hasta el séptimo día de

incubación. Estos resultados se encuentran, de acuerdo con los datos conseguidos p or Rabay (1962) mediante técnicas electroforéticas e inm unoelectroforéticas y con los de Stemmermann y W allner (1955), van Dam y colaboradores (19G3). De una manera indirecta y basándonos en dicha inform ación, hemos p od id o

demostrar que los antisueros contra cristalinos

totales no

Fig. 3.

actúan sobre los determinantes antigénicos de la cristalina alfa, com o piensa Langm an, Maisel y Squires (1962), sino muy posiblemente sobre las de la cristalina delta (Génis-Gálvez, Castro y Battaner, 1967). En efecto, el tratamiento de embriones de pollo con tales antisueros durante loa estadios 9 y 11 detiene la diferenciación del cristalino én fase de placoda o en el de vesícula (fig. 3). En tales estudios el único an'tigeno detectado en el esbozo de la lente, según los datos de Zwaan e Ikeda (1966), corresponde a la cristalina delta.

Pero dentro de los grandes procesos de la B iología m olecular, ño sólo es interesante con ocer cuándo los genes quedan activados o libe­ rados, sino también cuándo los genes se ven reprimidos y qué causas son las responsables de esa regulación y control que conduce a la diferenciación, al crecimiento y a la consecución de la forma típica del organ o, a través siempre del com plejo fenóm eno de la biosíntesis m acrom olecular. Fue primeramente postulado p or Francois y R abaey (1957), utili­ zando en sus estudios cristalinos de buey, que la. síntesis de una de las tres fracciones proteicas solubles (fracción gam m a) cesaba o dis­ minuía considerablemente durante el desarrollo. Este hecho nos sugirió la posibilidad de una represión del gen o genes incriminados en la síntesis de tal fracción, y por lo tanto la existencia de una biosíntesis proteica diferencial íntimamente relacionada con la secuencia de cam ­ bios existentes a un nivel m o rfo ló g ico (Génis Gálvez, 1986). Las observaciones

de Papaconstantinou y colaboradores

(1962-

1965) sobre las propiedades crom atográficas de las cristalinas gammas de la corteza y núcleo de cristalinos de buey de distintas edades, les han permitido concluir que las cristalinas gammas son proteínas espe­ cíficas cuya síntesis se asocia estrechamente con la diferenciación fibrilar. Según los autores citados, las cristalinas gammas sintetizadas du­ rante la diferenciación fibrilar embrionaria y perinatal son bioquím ica­ mente distintas a las sintetizadas por las fibras del cristalino adulto. El t:po de cristalina gam m a sintetizada dependería, pues, de la edad del animal. Diferencias significativas en la com posición proteica de las fibras corticales y nucleares del pollo adulto han sido demostradas por R a­ baey (1962), así com o p or Maisel y G oodm an (1965). N osotros hemos tenido ocasión de com unicar también estas notables diferencias, no sólo en el pollo adulto, sino también durante el período peri- y post­ natal del desarrollo (Génis-Gálvez, 1966 ; Génis-Gálvez, Berstein y M ai­ sel, 1966 ; Génis-Gálvez, R íos y Battaner, 1966 ; Génis-Gálvez y M ai­ sel 1967; Génis-Gálvez, Maisel y C astro, 1967). L os datos bioquím icos que se poseen sobre los factores que regulan la actividad genética responsable de la síntesis de proteínas estruc­ turales en el cristalino son muy escasos. L a inform ación que se lia obtenido sobre factores reguladores de la diferenciación cristaliniana se sitúan fundamentalmente en el terreno de la m orfogénesis, y aunque a un nivel distinto del gen ético, dicha inform ación es significativa, ya

que podría ser la base para un correcto conocim iento de los p rocesos reguladores incriminados a un nivel bioquím ico y molecular. El análisis em b riológico experimental del esbozo ocular en los animales vertebrados ha m ostrado que existe una correlación de di­ ferenciación entre la retina neural y el cristalino (Génis-Gálvez, 19(35 ; Génis-Gálvez, Santos y R íos, 1967). La diferenciación citológica del cristalino depende, además de su relación espacial con la retina neural, conservando ésta hasta incluso en períodos muy avanzados del desarrollo, la propiedad de evocar la diferenciación de la célula epitelial cristaliniana en fibras (C oulom bre y C oulom bre, .1963 ; Génis-Gálvez, 1965, 1967), fenóm eno que parece estar, según queda indicado, en íntima relación con la biosíntesis de las proteínas estructurales y específicas del cristalino (la fracción gam m a). El análisis bioquím ico de las proteínas estructurales y enzimáticas del cristalino y su correlación con la secuencia de datos m o rfo ló g ico s que se suceden durante la diferenciación citológica del mismo consti­ tuye, por lo que antecede, un m odelo apropiado de correlación m orfobioquím ica, cuyo estudio puede contribuir a un m ejor conocim iento de la expresión genética. La aplicación de las distintas técnicas, propias de la em briología experimental, podría contribuir sustancialmente a dilucidar los facto­ res incriminados durante la regulación de la actividad genética en los organism os superiores. Bajo este punto de vista, el estudio del cristali­ no, aparte de los relacionados con su función y patología, cobra un aspecto b io ló g ico de trascendental importancia. Desde hace años hemos venido analizando las características de la diferenciación del cristalino desde un nivel genético a un nivel m orfologen ético y m o r fo ló g ico

en un intento de com prender m ejor su

papel e importancia b iológica. La presente com unicación forma parte de este análisis y se encuentra en relación con la dinámica de la bio­ síntesis proteica y de determinadas enzimas, en las distintas partes del cristalino del p ollo, durante el período peri- y postnatal, con ob jeto de correlacionar la secuencia de diferenciación m orfológica con posi­ bles cambios de naturaleza bioquímica. Para ello hemos com binado el clásico procedim iento anatóm ico de la m icrodisección con las técnicas bioquímicas destinadas a la caracterización de proteínas y enzimas.

M

a t e r ia l y

m étodos

Las proteínas solubles del cristalino han sido clásicamente dividi­ das en tres fracciones denominadas cristalinas alfa, beta y gamma, v en una fracción insoluble que ha recibido el nom bre de albunoide. Esta clasificación se basa principalmente en estudios de cristalinos b o ­ vinos. La nomenclatura de las proteínas cristalinianas utilizada en el pre­ sente estudio, ofrece una ligera variación con la anterior. Denom ina­ mos «cristalina delta» a la fracción únicamente presente en las aves y que previamente ha sido denominada cristalina beta (Maisel y L angman, 1961) o First Im portant soluble crystallin (F isc), Rabaey, 1962). El nombre de «cristalina beta» hace referencia a todas las restantes proteínas del cristalino, independientemente de su movilidad electroforética, con exclusión de las cristalinas «alfa» y «delta». Seguim os, pues, las recom endaciones de Zwaan e Ikeda (1965) y de Zwaan (1967). H em os utilizado com o animal de experimentación pollos de raza L egh orn blanca, desde embriones de doce días hasta una serie de animales adultos que comprendía finalmente animales de dos a tres años. Con ob jeto de obtener extractos del epitelio, células ecuatoriales, células fibrilares corticales y células fibrilares nucleares, realizamos la disección manual del cristalino según el siguiente procedim iento : Con una fina tijera se seccion ó ecuatorialmente el epitelio, aislándolo junto con la p orción anterior de la cápsula, del resto del cristalino. Con ayuda de finas pinzas de relo jero se separó todo el anillo ecuatorial (annular pad, ringwulst) que fácilmente se desprende acom pañado de! resto de la cápsula, la cual posteriorm ente también se aísla de los ele­ mentos celulares. A partir del punto central de sutura existente en la cara superficial del cuerpo del cristalino se van separando las fibras, creándose un plano de clivage que corre desde la cara mencionada a la cara medial o profunda. Consideram os a estas fibras superficiales meridionales, com o la corteza del órgan o, independientemente de la edad del mismo. Creando un plano de deslizamiento más profundo se separa la parte central del cristalino, en un tamaño aproxim ado al de una lente com pleta de un em brión de doce días. Esta porción central la con ­

sideramos convencionalm ente com o el núcleo de la lente (fig. 1). La. parte intermedia entre la corteza y el núcleo 11 0 ha sido ob jeto de análisis en el presente estudio. Este procedim iento de disección lo hemos empleado, sobre tod o, con cristalinos a partir de emrbiones de diecinueve días. En embriones más jóvenes la separación del epitelio y región anular no pudo realizarse. D e todas estas regiones disecadas, así com o de cristalinos enteros,, se hicieron separadamente hom ogeneizados, en solución salina fisio­ lógica, ajustando su concentración a 100 y 250 m g. de tejido p or mi­ ligram os. L o s hom ogeneizados se centrifugaron entre 12.000 y 17.000 r. p. m. a 4o C, y el líquido decantado fue utilizado para los distintosanálisis. La estim ación de las proteínas solubles contenidas en tales extrac­ tos fue determinada según el m étodo de L ow ry, R oseb rou g h , Randall y Farr (196.1). L os sueros anticristalinos fueron producidos en con ejos mediante la inyección subcutánea, de un hom ogeneizado obtenido p or mezcla, de 2 mi. de extracto de cristalino adulto (50 m g. proteína/m l.), con 3 mi. de Freund adjuvant (D ifeo), que se repitieron con diez días deintervalo. Cuanto el título de anticuerpos fue lo suficientemente ele vado, p or regla general tras la tercera inyección, se realizó la sangría del con ejo y su suero fue recogido y preparado para análisis inm unoló g ico . Este análisis se realizó mediante las técnicas de doble difusión en agar (O uchterlony, 1953) e inm unoelectroforesis (Grabar y W il­ liams, 1953). La identificación y observación del precipitado inmune serealizó sobre luz reflejada o tras tinción con amido black B. treinta minutos, utilizándose un tampón de barbital a un p H de 8,6. El material fue ob jeto de fraccionación en acetato de celulosa. L a electroforesis se realizó en una cámara Beckman M icrozon e, durante treinta minutos, utilizándose un tampón de barbital a un pH de 8,6.. Las tiras de acetato de celulosa se tiñeron con Ponceau - S, y una vez aclaradas fueron registradas en un densitómetro Beckman m odelo R B Analitrol. En otras ocasiones la eiectroforesis se realizó en tiras de Sephraphore. Tam bién se utilizaron las técnicas de gel de almidón en sus distin­ tas variantes propuestas p or Smithies (1959) y Poulik (1959). E l gel se hizo unas veces utilizando un tampón de Tris y ácido cítrico

a.-

pH 8,6 y otras en un tapón de Tris Edta y ácido b órico a pH 8,8. En las cubetas de electroforesis se utilizó un tampón de N a O H y

ácido b órico a p H 8,(5. La electroforesis duró cuatro horas, con una intensidad de 0 voltios p or cm ., cuando fue realizada en placas hori­ zontales para separación en doble dimensión. Cuando la electroforesis se realizó en m oldes verticales duró dieciséis horas a 12 voltios p or centímetro y a 4° C. L os geles fueron seccionados y teñidos una mitad con amidoblack para evidenciar las proteínas, utilizándose la otra mitad para detectar las isoenzimas dé la L D H y las esterasas inespecíficas. Las isoenzimas de la L D H fueron puestas de manifiesto p o r el proceder de K orn b erg (1936) y las bandas con actividad esterásica por el de H unter y M arkert (1957), usando com o substrato el a-naftilacetato. En la mayoría de los experim entos se ha intentado siempre realizai' la electroforesis de los extractos procedentes de las distintas regiones del cristalino de una manera simultánea. Estas regiones convencional­ mente se han señalado con la letra T o W para los extratos totales,. C para los de la corteza, N para los de los núcleos, P para los de la zona ecuatorial (annular pard) y E para los del epitelio. En este último' extracto el material no pudo ser pesado. L o s análisis espectrofotométricos de la actividad L D H in vit.ro fueron realizados a una tem ­ peratura de 35° C, en un espectrofotóm etro Beckmann D B , haciéndose el registro a 310 m v p or el proceder de K orn berg (1963).

R

e s u l t

a d o s

El patrón im nunoelectroforético de las proteínas solubles de un cristalino de pollo adulto joven evidencia ya claramente, a los dos días después de la eclosión, a un pH alcalino, la existencia de tres líneas de precipitación de distinta movilidad (fig . á). El arco de m igra­ ción más rápida corresponde a la cristalina alfa, la proteína más acida y de m ayor peso m olecular. U n segundo arco prominente, de movilidad intermedia, co rre s ­ ponde a la cristalina delta. Esta línea de precipitación exhibe una evi­ dente heterogeneidad inm unológica, pues presenta reacción de iden­ tidad parcial con la tercera línea de precipitación. Esta última es una alargada línea (lo n g . line) que se extiende en el inm unoferogram a, desde el cátodo al ánodo. N osotros, y por lo que antecede, denom i­ namos cristalina beta a todo este arco en el que, por lo menos, un determinante antigénico se encuentra form ando parte de una pobla­ ción de moléculas proteicas heterogéneas y p or lo tanto de diferente

m ovilidad electroforética. La heterogeneidad de esta fracción es asi­ m ism o evidente, com o se desprende de los spurs o flecos que se ob­ servan a nivel de sus extrem os. El patrón inm unoelectroforético que sucintamente hemos descrito, es la suma de reacciones antigénicas de las distintas regiones del cristalino, y p or lo tanto, otológica m en te se trata de un patrón falso que sólo la separación regional citológica puede esclarecer. En efecto, ya en embriones de catorce y quince dias (fig. 5), se aprecia que las diferentes partes del cristalino poseen un com ponente antigénico distinto. Así, aunque las tres principales cris-

Kig. 4.

talinas son sintetizadas por las células ecuatoriales (/>) y p or las corti­ cales (c), a nivel de las células nucleares (« ), sólo pudo ser destacada la cristalina delta. La concentración relativa de dichas proteínas va­ rían significativamente, existiendo un apreciable decrem ento de las cristalinas alfa y beta a medida que pasamos de las células ecuato­ riales a las corticales y nucleares. Alarios días después del nacimiento, el patrón inm unoelectroforético de las distintas regiones del cristalino ofrece datos de acusado interés (fig. (i). Las células de la región ecuatorial ofrecen ahora un notable cam bio en relación a fases embrionarias. Claramente puede apreciarse que dichas células han dejado de sintetizar o al menos han reducido

considerablemente la síntesis de la cristalina delta. Las células de la región del ecuador parecen, pues, ahora ser capaces solamente de sintetizar la cristalina alfa y aquellas de em igración perteneciente a las cristalinas beta. A m bos grupos, catódico y anódico, de las crista­ linas beta, son sintetizados intensamente por las células corticales, sien­ do más prominente también la reacción para la cristalina alfa y per-

FiK. 5.

m aneciendo al parecer estacionaria la síntesis de la delta. A nivel de las fibras centrales nucleares predominan por el contrario las crista­ linas beta de em igración anódica. En el cristalino adulto las células epiteliales ecuatoriales y corti­ cales carecen de cristalina delta, en contraposición a las células nuclea­ res que muestran una reacción prominente para dicho antígeno (fig . 7). Las cristalinas beta de m igración catódica, son todavía manifiestas y

predominantes en las células ecuatoriales, siendo las cristalinas beta de m igración anódica fuertemente detectadas en las células corticales y predominantes en las células nucleares. La característica inm unológica de las células nucleares consiste en la progresiva com plicación, con la edad, del patrón de precipitación

Fig. 6.

ofrecido p or las cristalinas beta, tanto de lenta com o de rápida m igra­ ción electroforética (fig. 8). La electroforesis comparativa de extractos corticales de edad cre­ ciente muestra claramente ¡a progresiva desaparición de la cristalina delta, que al parecer deja de sintetizarse en las células corticales adultas. La técnica de doble difusión en agar corrobora la inform ación recogida o o r la inm unoelectroíoresis. Así con relación a las células

ecuatoriales, puede apreciarse (fig. 9) que sintetizan la cristalina alfa con sostenida intensidad a pesar de la edad. Las cristalinas beta, re­ presentadas al menos p or cuatro antígenos, en cristalinos jóvenes, aumentan en intensidad acusadamente también con la edad. Final­ mente, la cristalina delta rápidamente deja de sintetizarse en las célu­ las ecuatoriales a partir de las fases perinatales del desarrollo, pero siendo claramente detectada en las células ecuatoriales embrionarias

Fig. 7.

(flecha). El com portam iento de la cristalina delta en las células corti­ cales embrionarias contrasta grandemente con el que ofrece en las células adultas, donde la reacción es totalmente negativa (fig. 10). La fraccionación en acetato de celulosa, en donde, com o en otros casos, la electroforesis de los distintos extractos se realizó simultánea­ mente, a rrojó una serie de datos de interés que en parte ratifican los recogidos p or el estudio inm un ológico. En las condiciones básicas en: que fue realizada la electroforesis, casi siempre se evidenció tres ban­ das que corresponden a las tres principales proteínas solubles. En¡

condiciones experimentales idénticas y a partir de la sexta semana del desarrollo postnatal, se pudo, no obstante, detectar una nueva frac­ ción proteica que fue principalmente observada a nivel de las células nucleares y corticales, pero nunca en el epitelio ni en las células del ecuador (fig . 11). C om o la movilidad de esta fracción es m ayor que la que corresponde a la cristalina delta y com o en el análisis inmuno-

ló g ico del córtex, no ofreció reacción de identidad con la cristalina delta del núcleo, hemos considerado a la citada fracción com o perte­ neciente al grupo de las cristalinas beta. Sobre la base de la determinación de proteínas totales y su p or­ centual distribución, tras el correspondiente registro densitométrico pudo observarse que en los extractos totales de cristalino, las tres principales proteínas solubles aumentan progresivam ente con la edad, y que de ellas es la cristalina delta, la fracción predominante durante el desarrollo pre- y postnatal. La concentración de la cristalina alfa se incrementa suavemente durante el desarrollo, en contraposición a

las cristalinas beta que aumentan considerablemente, sobre todo a partir de la quinta a la sexta semana después de la eclosión. A partir de embriones de diecinueve días, las células de la región •ecuatorial no parecen sintetizar la cristalina delta (figs. 12 y 13). El patrón electroforético de las células ecuatoriales es típico, con dos bandas únicas de muy distinta m ovilidad que corresponden a las cris­ talinas alfa y beta. La concentración de la cristalina alfa aumenta m o­ deradamente con el desarrollo. Después del nacimiento la concentra­ ción de las cristalinas beta aumenta considerablemente. Este fenóm eno

Fig. 11.

es muy significativo, ya que fue precisamente a nivel de las células ecuatoriales donde no pudo detectarse la desconocida cuarta fracción proteica que con fines de clasificación se consideró com o perteneciente al grupo de las cristalinas beta. Un fenóm eno semejante, aunque más tardío, ofrecen las células fibrilares de la corteza (fig . 14). En efecto, la cristalina delta decrece progresivam ente y deja de ser detectada hacia la séptima semana del desarrollo postnatal. La concentración de las cristalinas alfa y beta, a nivel de las células corticales de cristalinos jóvenes es muy parecida, pero mientras que la cristalina alfa permanece a un nivel estacionario, las cristalinas beta aumentan marcadamente, después de la sexta se-

mana del período postnatal, incluso teniendo presente que la cuarta fracción se registra a nivel del córtex. Las células de la región central del cristalino exhiben una alta concentración de cristalina delta que predomina además con la edad. Las cristalinas alfa y beta muestran concentraciones bajas pero, a pe­ sar de ello, se incrementan suavemente con la edad. Las cristalinas betas parecen en este sentido incrementarse un p o co más que la alfa. Señalemos que la cuarta fracción proteica fue claramente detectada en estas fibras centrales.

Fig. 14.

El análisis electroforético en acetato de celulosa parece indicar, en resumen, que la cristalina delta deja de ser sintetizada en fases em ­ brionarias a nivel de las células del ecuador, donde tan sólo dos ban­ das, que corresponden a alfa y beta, pueden ser desde entonces detec­ tadas. Las fibras corticales, aunque en cristalinos jóvenes poseen un contenido proteico com pleto, ofrecen idéntico fenóm eno, aunque más tardíamente. En las fibras nucleares la concentración de la cristalina delta no sufre en absoluto un cam bio com o el registrado en las cé­ lulas corticales o en las ecuatoriales, siendo dicha fracción siempre

la predominante con relación a las otras dos cristalinas. La razón de que los extractos totales presenten un alto contenido en cristalina delta, se debe precisamente a la alta concentración de dicha fracción en las fibras nucleares. El notable incremento de las cristalinas beta con la edad, parece estar m otivado por aumentos localizados a nivel de las células ecuatoriales y corticales. Con relación a la cristalina alfa, cuyo débil incremento parece localizarse en las fibras ecuatoriales y corticales, hemos de resaltar que ofrece una movilidad distinta, siendo de más rápida m igración en las células ecuatoriales que en las corticales y nucleares. La con ­ centración de las cristalinas alfa y beta, que es predom inante en las células corticales de las lentes jóvenes, cambia con la edad, siendo su concentración en animales adultos m ayor en las células ecuatoriales que en las corticales. La electroforesis unidimensional en gel de almidón es capaz de separar, por lo m enos, seis bandas proteicas cuyo proceso de carac­ terización hemos efectuado con un criterio inm unológico. El patrón de separación es un tanto diferente al que se obtiene en otras electro­ foresis zonales, ya que en el gel dinámico de almidón las distintas fracciones son separadas 1 1 0 sólo p or sus cargas eléctricas, sino tam­ bién p or su peso m olecular. Aunque el patrón es más com plicado, la inform ación recogida es en esencia semejante a la proporcionada por las técnicas previamente empleadas. Así, en el proteinogram a corres­ pondiente a la disección reglada de cristalino de dos años (fig . 15), puede observarse cóm o las jóvenes células ecuatoriales contienen prin­ cipalmente cristalinas alfa (banda 1) y betas de m igración catódica (bandas 2 y 4), pero carecen claramente de cristalina delta (banda 3), así com o de las fracciones 5 y 6, que creem os corresponden a la porción anódica de la «lon g line» del inm unoelectroferogram a y a la proteica, desconocida, clasificada dentro de las cristalinas betas, que repetidamente evidenció la electroforesis en acetato de celulosa. Las células corticales carecen claramente de cristalina delta, detectándose en ellas solamente la cristalina alfa y ambos tipos de cristalinas beta. Las células evidencian un patrón proteico com pleto, aunque con un evidente predom inio de la cristalina delta. U n patrón de distribución semejante, puede observarse ya desde la sexta semana (fig . 1G). Existen, sin em bargo, diferencias que jamás podrían evidenciarse a través de un análisis de extractos totales. En efecto, las células corticales muestran que aún sintetizan cristalina

delta y que la concentración de cristalina alfa ofrece un neto pre­ dom inio en relación con la que se observa en las restantes regiones del órgan o. L os cristalinos de alrededor de una semana (fig . 17) señalan clara­ mente que a nivel de las.células corticales, la cristalina delta es incluso más prominente que en el córtex de seis semanas. Las cristalinas beta de m igración catódica parecen ser sintetizadas en las jóvenes fibras de

Fig. 15.

la región ecuatorial, mientras aue las cristalinas beta de m igración anódica se encuentran principalmente contenidas en las alargadas fi­ bras corticales. P or lo tanto, el dato más característico observado durante el desarrollo postnatal, mediante la técnica de electroforesis en g el de almidón, consiste en el decremento progresivo de la crista­ lina delta, sobre todo a nivel de las células ecuatoriales y corticales, y en el incremento manifiesto y también progresivo de las cristalinas beta de m igración anódica, localizado principalmente en las fibras corticales.

El análisis de las esterasas solubles ele tipo no especifico reveló, en esencia, que su distribución y actividad electroforética varía mar­ cadamente con la edad y con la diferenciación citologica del cristalino. Un zim ogram a típico de esterasas solubles de cristalinos totales com ­ parado con el de retina neural de dos semanas, queda registrado en la figura 18, donde se observan al menos cuatro principales fracciones de actividad enzimàtica. En el cristalino joven existe un predominio

Fig. 16.

evidente de la fracción número 1. Durante el desarrollo postnatal la citada fracción ofrece un notable decremento que se acompaña con el predom inio manifiesto y característico de las esterasas 2 y 3. Este patrón de las esterasas del cristalino adulto queda descifrado al analizar los zim ogram as de las distintas regiones citológicas del órgan o (fi­ gura 1!)). Así, se aprecia ahora que la actividad más intensa corres­ ponde a las células ecuatoriales y la menor a las células nucleares. El predom inio de las fracciones 2 y 4 se debe a la actividad de las células ecuatoriales y corticales donde aún se registra una débil actividad de

la esterasa 1. El notable decremento de esta fracción se debería a la pérdida de tal actividad en las fibras nucleares, donde la ligera acti­ vidad enzimàtica queda restringida a la esterasa 3. Una evidenciación

Fig. 20.

simultánea de las proteínas cristalinas y de la actividad esterásica recién descrita, se aprecia ahora en la figura 20 con objeto de dem os­ trar que tal actividad se localiza globalm ente en la región de las cris­ talinas betas de m igración anòdica.

La caracterización principal del patrón isozim ático de las esterasas durante el periodo embrionario y gran parte del pcrstnatal, se recoge en la figura 21. En ella se aprecia que el patrón que se observa en el em brión de diecinueve días (A ) es muy semejante al que ofrece el cristalino en el m om ento de la eclosión (B ). La esterasa 1 predomina claramente sobre la 2, en especial a nivel de las células corticales.

Fig. 21.

A partir, sin em bargo, de la primera semana del nacimiento (C ), este predom inio se debe a una m ayor actividad de las células ecuato­ riales en la síntesis de tal esterasa. El estudio de cristalinas de seis meses (D ) aún señala dicho predom inio en las células ecuatoriales, que ofrecen ya una m ayor actividad enzimàtica que el resto de las células cristalinas. Esta m ayor actividad esterásica 1 1 0 queda limitada a un

p+E

5 4 3 21 Fig. 22.

predominio de la esterasa número 1, sino también de la número 2. P o r lo tanto, el patrón enzimàtico para las esterasas solubles del cristalino adulto se establece al menos a partir de la sexta semana del desarrollo postnatal. La actividad de las lactodehidrogenasas fue analizada mediante determinación espectrofotom étrica y zim ográfica. Durante el desarro­ llo em brionario existe un progresivo incremento de la actividad enzi­ màtica en la totalidad del cristalino, con una m ayor actividad en con ­

centraciones altas de piruvato, lo que indica un predominio de las isozimas catódicas. Aproxim adam ente hacia el final de la primera semana después de la eclosión se produce el cruce de las curvas de bajo y alto piruvato, lo que indica que a partir de dicho m om ento existe un predom inio de las isozimas anódicas.

54 3 2 1 Fig. 23.

A nivel de las células ecuatoriales la actividad enzimática perma­ nece estacionaria y en un grado relativamente b ajo hasta la primera semana después de la eclosión, en que se acentúa progresivam ente para finalmente descender levemente. Entre la primera y séptima semana se produce un cruce de las curvas de alto y bajo pivurato, aunque no tan ostensiblemente com o a nivel de las células corticales. En estas últimas el predom inio de las curvas de bajo piruvato es muy marcado. Este dato está de acuerdo con el predom inio que se observa en el ■córtex, de las isozimas anódicas.

Finalmente, a nivel de las células nucleares, la actividad enzimà­ tica, aunque p o co intensa, se sostiene en un suave incremento. E1 registro zim ogràfico del cristalino total v de sus regiones top o­ gráficas evidencia que la actividad isoenzimàtica para las L D H cambia progresivam ente con la edad, y que dicho fenóm eno es reflejo de cam­ bios que se suceden, en parte, de acuerdo con la diferenciación citológ'ica del cristalino.

|

Mil +N

Fig. 24.

En fases embrionarias (fig. 22) existe un predominio de las isozimas catódicas en todas las regiones del cristalino. En el pollo recién nacido aún se retiene esta polaridad catódica, aunque se inicia un cierto predom inio hacia el lado anódico (fig. 23). En el cristalino total se aprecia una m ayor actividad de la L D H -5 y L D H -3 , patrón que es aún más claro en las células epiteliales y en las ecuatoriales. En las fibras nucleares se aprecia indicios de L D H -1 , pero el predominio corresponde aún a la L D H -5.

El patron isoenzim àtico que se observa en cristalinos de alrededor de una semana es esencialmente distinto (fig. 21). El cristalino entero ofrece un patrón simétrico de predom inio igualado para la L D H -1 y L D H -5. Sin em bargo, el análisis de las isoenzimas a nivel de las dife­ rentes regiones del cristalino, descubre un cam bio radical de la acti­ vidad enzimàtica por parte de las células corticales y nucleares, que evidencian un claro predom inio de las L D H -1 y L D H -2. En las células epiteliales y ecuatoriales la situación no ha cam biado, correspondiendo la actividad predominante a las L D H -5 y L D H -3 . C om o puede verse,, este cam bio radical del patrón zim ográfico coincide con el cruce de las curvas de alto y bajo piruvato, en las determinaciones espectrofotométricas. Finalmente, en el cristalino del pollo adulto y con excepción del epitelio que conserva una actividad catódica manifiesta, la actividad predomina principalmente por parte de la L D H -1 , sobre todo a nive! de las células corticales y en m enor intensidad en las nucleares. Bandas anódicas adicionales pueden ser detectadas predominantemente en las células corticales y nucleares (fig. 25). Las bandas isoenzimáticas no guardan relación alguna con las proteínas estructurales específicas (fig . 20).

D

i s c u s i ó n

El problema central que la b iología m olecular se plantea, en su con ex ión con la progresiva diferenciación, crecimiento y m orfogénesis de los animales superiores, radica en el conocim iento de aquellos pro­ cesos a través de los cuales los genes, en su actividad regulada co n ­ trolan jr determinan la síntesis y estructura de las proteínas. D e acuerdo con el actual dogm a genético, el C ódigo de bases pre­ sente en el ácido dexosirribonucleico (D N A ), es transcrito o copiado por los ácidos ribonucleicos (R N A ). La traducción, a un nivel citoplásmico de dicho C ód ig o, especifica la secuencia de am inoácidos de una cadena polopéptida, determinando con ello la estructura secunda­ ria y terciaria de una proteína. La síntesis y organización estructural de las proteínas se expresa fenom enològicam ente a distintos niveles de organización b iológica, desde el primitivamente molecular hasta los estamentos de estructuración subm icroscópica, m icroscópica o m acros­ cópica.

El estudio de los cambios que tanto las proteínas estructurales ■específicas com o enzimátic.as sufren durante el desarrollo

(ontogenia

proteica), han sido directamente relacionados con cambios en la acti­ vidad de los genes. La dinámica de las proteínas específicas, que en el curso