Informe final de proyecto
Determinación de parámetros nutricionales por espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS)
Centro: NEIKER Participantes: Carlos Garbisu (
[email protected]) Estibaliz Alonso, Iratxe Luengas, Alex Aristegieta, Goretti Murua Entidades participantes Convenio con el CIAM de MABEGONDO Año 2005
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Determinación de parámetros nutricionales por espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS) 1.- Introducción El objetivo general del proyecto FEEDNIRS era (i) la obtención de calibraciones para muestras de nutrición animal (principalmente, ensilados de hierba y muestras de maíz) respecto a diferentes parámetros nutricionales, de forma que la tecnología de espectroscopía por infrarrojo cercano por reflectancia difusa (NIRS) complemente las técnicas analíticas convencionales utilizadas hasta el momento en el Laboratorio de Agrosistemas y Producción Animal, y (ii) la implementación de la tecnología de espectroscopía de infrarrojo cercano por reflectancia en la rutina de análisis del Laboratorio. Los objetivos específicos del proyecto FEEDNIRS eran los siguientes: 1. Estandarización/clonaje de nuestro equipo frente al utilizado en el CIAMMabegondo para ensilados de hierba, de forma que nos puedan transferir sus ecuaciones para diferentes parámetros nutricionales y fermentativos, determinados tanto in vitro como in vivo. 2. Estudio de la viabilidad del empleo de las ecuaciones del CIAM-Mabegondo para ensilados de hierba de la CAPV. 3. Búsqueda de calibraciones propias para ensilados de hierba a partir de los datos obtenidos con ensilados de hierba de la CAPV. 4. Optimización de las ecuaciones del CIAM-Mabegondo con datos procedentes de ensilados de hierba de la CAPV, en relación con su capacidad de predicción de las características nutricionales de nuestros ensilados de hierba. 5. Se abordarán estudios similares con muestras de maíz, a las que se aplicarán ecuaciones obtenidas por nosotros o, preferentemente, adquiridas en otros centros. Como queda reflejado en estos objetivos específicos, este proyecto de investigación tenía un carácter eminentemente práctico y de servicio y apoyo al Laboratorio de Agrosistemas y Producción Animal, mediante la obtención de calibraciones/ecuaciones para muestras de la Sección de Nutrición Animal.
A este respecto, cabe mencionar que todos los objetivos han sido cumplidos y que actualmente la tecnología NIRS está implementada en la rutina del Laboratorio de Agrosistemas y Producción Animal. A modo de informe final del trabajo realizado en este proyecto, a continuación se presenta el contenido de dos artículos que se han publicado en los que se resume nuestro trabajo de los últimos años con la tecnología NIRS dentro del FEEDNIRS.
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2.-.Espectroscopía de infrarrojo cercano En los últimos años, dentro del sector agrario vasco, se ha generado una demanda creciente en todo lo referente a la mejora de la calidad de los productos y la racionalización de la producción. Como consecuencia de dicha demanda, la analítica orientada a satisfacer las necesidades del sector agrario está actualmente imbuida en un proceso gradual de sustitución de las técnicas analíticas convencionales, muchas de ellas excesivamente laboriosas y de elevado coste, por otras herramientas analíticas más baratas, rápidas, específicas, y respetuosas con nuestro entorno medioambiental. Por ello, NEIKER, como agente dinamizador de la analítica de muestras agrarias dentro de la CAPV, lleva ya varios años desarrollando una línea de espectroscopía de infrarrojo cercano (NIR) por reflectancia para poder mejorar así la calidad de su oferta analítica en muchos tipos de muestras (léase, piensos, ensilados, materias primas, suelos, etc.). Curiosamente, durante la primera mitad del siglo XX, apenas se prestó interés a la región del infrarrojo cercano del espectro electromagnético, principalmente debido a la presencia en sus espectros de absorción de bandas anchas, solapadas y de poca intensidad, que complicaban sobremanera la asignación de bandas a estructuras o grupos funcionales específicos. No obstante, en la segunda mitad de ese mismo siglo y, sobre todo, gracias a los trabajos pioneros de Karl Norris del Departamento de Agricultura de EEUU, se demostró el gran potencial analítico de esta técnica. En los últimos años, debido a mejoras en la instrumentación y al desarrollo de la quimiometría (disciplina que usa los métodos matemáticos y estadísticos aplicados a la Química Analítica) y la informática, la aplicación de la espectroscopía NIR al análisis de muestras de múltiples sectores (e.g., agrario, alimentario, farmacéutico, petroquímico, textil, etc.) ha sufrido una impresionante expansión. Entre las numerosas ventajas que presenta la espectroscopía NIR frente a técnicas más convencionales, se pueden destacar las siguientes: -
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es un técnica no invasiva y no destructiva de la muestra; las necesidades de preparación de la muestra previas a la analítica son nulas o muy pequeñas; no utiliza reactivos químicos ni produce residuo alguno (esto, además de abaratar costes, como se deriva del hecho de que no hay que adquirir reactivos ni pagar por la recogida de residuos tóxicos y peligrosos, hace de esta técnica un proceso muy respetuoso con nuestro entorno medioambiental); el mantenimiento del equipo es mínimo (se reduce a la sustitución de la lámpara halógena de filamento de tungsteno una vez finalizada su vida útil); una vez obtenida la ecuación de predicción (ver más adelante), permite determinar de forma simultánea en la misma muestra y en menos de 1 minuto todos aquellos parámetros analíticos para los que se haya calibrado el equipo; hoy en día, existen en el mercado equipos NIR portátiles que permiten analizar las muestras in situ (por ej., en el campo, invernadero, etc.), sin necesidad de transportarlas al laboratorio.
En los últimos años, NEIKER ha obtenido diferentes ecuaciones/calibraciones que cubren un rango considerable de las necesidades analíticas de la Sección de Nutrición Animal de nuestro Laboratorio de Agrosistemas y Producción Animal (i.e., ecuaciones Informe técnico final FEEDNIRS 3
para muestras de ensilados, materias primas, piensos, etc.). Estas ecuaciones han sido obtenidas de diversas formas: (i) algunas han sido desarrolladas en el propio NEIKER, a partir de los datos obtenidos durante la analítica de las diversas muestras que llegan a nuestro Centro; (ii) otras han sido cedidas bajo convenio por otros centros de investigación similares al nuestro; y, finalmente, (iii) algunas ecuaciones han sido adquiridas comercialmente. Asimismo, en este momento, en NEIKER, estamos desarrollando de forma activa ecuaciones/calibraciones para diferentes parámetros físico-químicos en muestras de suelos. A este respecto, cabe mencionar que, aunque el suelo es sin duda una matriz de gran complejidad por su heterogeneidad espacial y temporal, esta tecnología permite determinar un número importante de propiedades físico-químicas del suelo con mucha precisión. En cualquier caso, aunque el presente artículo no pretende, en absoluto, realizar una revisión exhaustiva de la espectroscopía NIR, debido al gran interés que esta técnica está suscitando en el sector técnico de la CAPV, nos parece interesante dar aquí unas nociones básicas que permitan entender los fundamentos teóricos y los procedimientos prácticos de la espectroscopía NIR. Por consiguiente, el objetivo del presente artículo es contribuir a la difusión del gran potencial analítico y de los principios teóricos y prácticos de la espectroscopía NIR, lógicamente en el contexto del sector agrario. Fundamentos Teóricos La región del infrarrojo cercano, conocida habitualmente como NIR (del inglés NearInfrared), fue descubierta en 1800 por el astrónomo y compositor Sir Frederick William Herschel (1738-1822) durante un experimento diseñado inicialmente para, mediante un prisma, determinar la contribución de cada uno de los colores que componen la porción visible de la luz solar dispersa en el aumento de la temperatura causado en diversas sustancias expuestas a dicha radiación. En un ejemplo de perspicacia e intuición científica, además de en las diversas zonas de la porción visible del espectro electromagnético (violeta, azul, verde, amarillo, naranja, rojo), Herschel colocó muestras más allá del rojo y observó que aumentaba la temperatura de las sustancias allí expuestas. Por ello, denominó a esta región “rayos caloríficos”, más tarde, conocidos como radiación infrarroja. Dentro del espectro electromagnético (Figura 1), la radiación infrarroja comprende la zona situada desde aproximadamente los 800 a los 105 nm. Esta región puede dividirse a su vez en tres sub-regiones: infrarrojo cercano (NIR), infrarrojo medio (MIR o IR) e infrarrojo lejano (FIR). La zona NIR que nos ocupa se encuentra localizada entre el visible y el infrarrojo medio, cubriendo la región entre 800 y 2500 nm (4000 – 12500 cm-1).
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Figura 1: Regiones del espectro electromagnético La espectroscopía de infrarrojo se emplea para investigar las propiedades vibracionales de una muestra. De hecho, la radiación infrarroja, a diferencia de las radiaciones visible y ultravioleta, no tiene la suficiente energía para producir transiciones electrónicas, y su absorción se limita principalmente a transiciones con pequeñas diferencias de energía entre diferentes estados vibracionales de una molécula. Aplicando la mecánica cuántica y el modelo del oscilador anarmónico para representar los enlaces químicos entre átomos dentro de una molécula, se demuestra que las bandas de absorción que aparecen en un espectro infrarrojo se deben a transiciones cuantizadas vibracionales entre niveles de energía en los que el número cuántico vibracional cambia en una unidad (banda fundamental) o en más de una unidad (sobretonos). Asimismo, se observan bandas como consecuencia de la interacción de vibraciones diferentes (bandas de combinación). Las vibraciones pueden ser de dos tipos principalmente (Figura 2): -
tensión o elongación (“streching”): cambios en la distancia interatómica a lo largo del eje del enlace. Pueden ser simétricas o asimétricas. flexión (“bending”): cambios en el ángulo de enlace. Pueden ser simétricas en el plano (balanceo, “rocking”), asimétricas en el plano (tijereteo, “scissoring”), simétricas fuera del plano (aleteo, “wagging”), y asimétricas fuera del plano (torsión, “twisting”).
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Figura 2: Tipos de vibraciones moleculares. El signo + indica desplazamiento desde la página hacia al lector; el signo – indica desplazamiento alejándose del lector Las vibraciones moleculares originan bandas de absorción fundamentales, principalmente, en la zona del MIR (400 – 4000 cm-1). Por su parte, en la región NIR, mayoritariamente se observan bandas de absorción correspondientes a los sobretonos y a combinaciones de vibraciones fundamentales. Las bandas más frecuentes en un espectro NIR son debidas a enlaces que contienen átomos ligeros como C-H, N-H, O-H y S-H debido a su mayor anarmonicidad. Finalmente, mencionar que cuando la radiación infrarroja interactúa con una muestra, dicha radiación puede ser absorbida, transmitida o reflejada. Si la radiación atraviesa la muestra, se habla de transmisión (se suele utilizar la transmisión para muestras líquidas), mientras que si es reflejada se trabaja en reflectancia (para muestras sólidas). Esta reflectancia puede ser especular que no aporta información sobre la composición de la muestra y difusa que tiene lugar en todas direcciones como consecuencia de los procesos de absorción y dispersión (Figura 3). Recientemente, los nuevos equipos NIR permiten trabajar en transflectancia, en la cual parte de la radiación incidente es reflejada y otra parte atraviesa la muestra para, posteriormente, ser reflejada por un material colocado en la cara opuesta de la muestra. Karl Norris fue el primero en demostrar que el método más idóneo para analizar muestras agrícolas por NIR era la reflectancia difusa.
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Figura 3: Interacción de la radiación NIR con las partículas sólidas de una muestra Fundamentos prácticos Dentro de este apartado, se pretenden describir los principales pasos metodológicos necesarios para la obtención de la ecuación/calibración y, posteriormente, la predicción de los parámetros analíticos en las muestras objeto de estudio (Figura 4).
Figura 4: Pasos principales en un análisis por espectroscopía NIR Tanto para la calibración como para la predicción, la técnica NIR comienza con la obtención de un espectro de absorción (entre 800 y 2500 nm) durante el proceso de escaneado de la muestra (Figura 5). Como se ha mencionado anteriormente, dicho espectro refleja las transiciones cuantizadas vibracionales producidas en las moléculas como consecuencia de la interacción entre la radiación emitida por una lámpara halógena de filamento de tungsteno y la muestra. Informe técnico final FEEDNIRS 7
Figura 5: Representación de la información espectral de 375 muestras de ensilados de hierba Calibración El objetivo de una calibración consiste en la obtención de ecuaciones predictivas que correlacionen la información espectral con los valores analíticos generados por métodos tradicionales de referencia. Lógicamente, para la calibración, es esencial seleccionar una población de muestras que representen la mayor heterogeneidad del producto a calibrar. Con la información espectral de las muestras y los valores analíticos de laboratorio correspondientes a las mismas, se obtiene el denominado “fichero de calibración”. Los valores analíticos pueden visualizarse gráficamente mediante un histograma (Figura 6), el cual nos permite comprobar si existen muestras en todo el rango de referencia para cada constituyente (fichero correcto), o, por el contrario, aparecen zonas vacías que puedan afectar al cálculo de interpolación (fichero incorrecto). Asimismo, la representación espectral (Figura 5) permite detectar anormalidades debidas, por ejemplo, al mal encapsulamiento de la muestra o a resultados laboratoriales no correctos.
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Figura 6: Histograma de valores laboratoriales para el parámetro “proteína” en muestras de soja A partir de este punto, la conversión de los datos en información útil requiere el uso de herramientas matemáticas y estadísticas pertenecientes a la quimiometría que, inicialmente, se utilizan para anular fuentes de variabilidad de la señal (e.g., información repetida sobre enlaces específicos en bandas de combinación y en regiones del segundo y tercer sobretono, humedad de la muestra, tamaño de partícula, variaciones en el paso óptico efectivo, etc.) mediante el uso de derivadas, corrección de la desviación de la línea base y de la dispersión causada por el tamaño de partícula, etc. A este respecto, la aplicación de derivadas nos permite aumentar la resolución espectral y diferenciar así picos solapados (Figura 7).
Figura 7: Representación de la información espectral sin tratamiento matemático (izquierda) y tras la aplicación de la primera (centro) y segunda (derecha) derivada Posteriormente, se simplifica la información espectral a través del centrado de la población mediante un análisis de componentes principales, de mínimos cuadrados parciales, o similar. Después del análisis de componentes principales, el conjunto de muestras aparece formando un elipsoide, en el cual se establece un radio que permitirá la detección de anómalos (“outliers”) utilizando la distancia de Mahalanobis global (GH) (se suele emplear un valor de GH de 3) (Figura 8). La casuística de este tipo de muestras anómalas es ciertamente diversa: muestras que pertenecen a una variedad distinta a las demás, espectros recogidos en el equipo sin estabilizar, muestras con concentraciones fuera del rango seleccionado para la calibración, encapsulamientos incorrectos, etc.
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Figura 8: Representación tridimensional de la población de muestras. Las muestras anómalas (outliers) aparecen en rosa Durante la calibración, es posible eliminar información redundante, identificando las muestras con un espectro muy similar a otras presentes en la misma población, seleccionando así aquellas que recogen la máxima variabilidad. Para ello, se emplea el concepto de distancia entre vecinos (NH, de “neighborhood”), que mide la semejanza entre muestras mediante el cálculo de la distancia entre una muestra y su vecino (normalmente, en este paso, se establece un valor de NH de 0,6). En el centro de la población, muchas muestras son vecinas, mientras que en los extremos las muestras tienen un número menor de vecinos. Una vez eliminada la información redundante, se procede al cálculo de la ecuación que nos permitirá correlacionar los valores laboratoriales con la información espectral NIR, y obtener así el modelo de calibración necesario para la futura predicción de muestras desconocidas. Para este proceso, se pueden utilizar diferentes métodos de regresión multivariante como PCR (“principal component regression”), PLS (“partial least squares”), MPLS (“modified partial least squares”), etc. La fiabilidad del modelo de calibración se evalúa inicialmente mediante un proceso de validación cruzada, en el que se calculan distintas ecuaciones y se procede a seleccionar aquella que mejor predice las muestras (la que tiene un valor más alto del coeficiente de correlación y más bajo del error estándar de validación cruzada). Esta ecuación se valida nuevamente con muestras externas no implicadas en el desarrollo de la calibración, utilizando para ello diversos estadísticos (e.g., desviación estándar del conjunto laboratorial, error estándar de predicción, etc.). Se considera buena práctica de laboratorio ampliar y actualizar la ecuación, con una periodicidad anual, hasta alcanzar una robustez óptima (i.e., un 95% de predicción). Análisis predictivo El objetivo final de todo proceso de calibración NIR es el desarrollo de un método de trabajo de rutina que permita predecir valores de parámetros analíticos sin necesidad de analizar las muestras en el laboratorio por los métodos tradicionales. Para ello, una vez obtenida una ecuación robusta, sólo es necesario escanear una muestra y, a partir de la Informe técnico final FEEDNIRS 10
información espectral generada, el equipo predecirá todos los parámetros para los que se haya calibrado el equipo. En este paso, el porcentaje de predicción NIR está condicionado por los valores de los estadísticos GH (GH