DETERMINACIÓN DE PESTICIDAS ORGANOCLORADOS EN SUELOS EXTRACCIÓN POR MICROONDAS María Silvina Villemur* Instituto Nacional del Agua - Centro de Tecnología del Uso del Agua (I.N.A. - C.T.U.A.). [email protected] Lic. en Química. Desde 1991, es Investigadora y Responsable del Área de Cromatografía Gaseosa del C.T.U.A. Directora de Beca de Técnicos Químicos en formación en Qca. Analítica del Agua, desde abril de 1995. Representante del I.N.A., ante el I.R.A.M., en el Comité de Calidad Ambiental. Becada por el Gobierno de Japón, a través de JICA, para realizar el curso de entrenamiento “Water Quality Management” (Tokyo, 08 - 10/00). Pasante del I.N.A. para capacitarse en “Análisis de residuos de productos derivados del petróleo en matrices ambientales” (N.T.L. Alaska,1999).

Marta Gabriela Rimini* Instituto Nacional del Agua - Centro de Tecnología del Uso del Agua (I.N.A. - C.T.U.A.). [email protected] Lic. en Química, egresada de la Universidad Nacional del Sur de Bahía Blanca. Se desempeña en el Laboratorio del Programa de Química Analítica del Instituto Nacional del Agua como Profesional Analista/Investigadora. Directora de beca de Técnicos Químicos en el marco del Programa de Entrenamiento Profesional y Técnico del Instituto Nacional del Agua. Becaria del Curso “Monitoreo Ambiental - Calidad de Aguas”, organizado por el Gobierno de Japón a través de la Agencia de Cooperación Internacional del Japón (JICA), en Tokorozawa Saitama - Japón desde 25/09/95 al 9/11/95.

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RESUMEN En el presente trabajo se estudió la optimización del método de extracción por Microondas, para lograr una mejor recuperación en la determinación de Pesticidas Organoclorados en suelos, desarrollando la misma en términos de evaluación del porcentaje de recuperación en función del tiempo y la temperatura de extracción. Para ello, se llevaron a cabo ensayos por triplicado a tres tiempos y a tres temperaturas de extracción. Establecidas las condiciones óptimas de operación, se comparó este método de extracción con el método Soxhlet. La metodología estudiada resultó ser un método de preparación rápido, eficiente, económico y aplicable a muestras provenientes de sitios contaminados. Palabras Clave: Pesticidas organoclorados, extracción por microondas, optimización del método, disminución de costos, sitio contaminado.

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INTRODUCCION Estudiar la optimización del método de extracción por microondas, para lograr una mejor recuperación en la determinación de once pesticidas organoclorados en suelos. Comparar este método de preparación de muestras con el método Soxhlet. Evaluar su aplicabilidad en muestras provenientes de un sitio contaminado. Fundamento de la Extracción por Microondas El método de extracción por microondas, es un procedimiento para extraer compuestos orgánicos insolubles o ligeramente solubles en agua, de matrices sólidas (suelos, arcillas, sedimentos, lodos y residuos sólidos). El proceso utiliza energía de microondas proveniente de dos magnetrones independientes con difusor rotatorio logrando una distribución homogénea de las microondas para producir condiciones de presión y temperatura elevadas en recipientes cerrados que contienen la muestra y la mezcla de solventes adecuada. Esto facilita la rápida disolución de los analitos de interés en la mezcla de solventes mencionada, con una alta eficiencia de recuperación. Una vez extraídos los analitos en el solvente adecuado, se está en condiciones de proceder a su análisis, siendo la Cromatografía Gaseosa, el método instrumental utilizado en esta aplicación. METODOLOGÍA EMPLEADA Desarrollo En la extracción por microondas, se hace necesario establecer las condiciones de temperatura de trabajo y también el tiempo de extracción, razón por la cual se planteó la optimización del método por microondas en los siguientes términos: -Evaluación del porcentaje de recuperación en función del tiempo de extracción -Evaluación del porcentaje de recuperación en función de la temperatura de extracción Evaluación del porcentaje de recuperación en función del tiempo de extracción. Se procedió a esta evaluación, a tres tiempos de extracción (5, 10 y 20 minutos) y en cada caso con ensayos por triplicado, manteniendo la temperatura de extracción fija a 120 °C (temperatura tentativa). Para ello, se prepararon blancos fortificados sólidos (BFS), consistentes cada uno en: 5 g. de arena adicionada con los analitos de interés mezclada con 5 g. de sulfato de sodio anhidro, con 30 ml. de mezcla de solventes de extracción calidad grado pesticida (acetona : hexano 1:1), lo que es colocado en los vasos de extracción. La arena fue muflada a 450 °C durante 4 horas y el sulfato de sodio a 650 °C durante toda la noche. A cada vaso de extracción, se le agrega una barra de agitación magnética, dado que un adecuado mezclado de la muestra con la mezcla de solventes, ayuda a una mejor y más rápida extracción. Terminado el proceso de extracción, se deja enfriar por lo menos tres horas y se procede a la filtración con sulfato de sodio para retener algún vestigio acuoso, enjuagando el residuo del vaso de extracción con dos porciones de 5 ml. de la misma mezcla de extracción y filtrando estos enjuagues a través del sulfato de sodio. Este extracto se recoge en tubo graduado y en un evaporador Kuderna - Danish y se concentra bajo corriente de nitrógeno a volumen deseado. La mezcla de solventes consta de hexano, que es un solvente insoluble en agua, y de acetona que es un solvente miscible en agua. El propósito de usar un solvente miscible en agua es el de facilitar la extracción de sólidos húmedos permitiendo que la mezcla de solventes penetre la capa de agua de la superficie de las partículas sólidas. El solvente inmiscible en agua extrae compuestos orgánicos con polaridad similar. La polaridad de la acetona puede también ayudar a extraer analitos polares en los sistemas de mezclas de solventes. (Tabla 1 y Figura 1).

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TABLA 1: Evaluación del porcentaje de recuperación en función del tiempo de extracción ANALITO

Porcentaje de recuperación

Lindano Heptacloro Aldrin Hept. Epóxido Endosulfán I p,p´-DDE Dieldrin Endrin p,p´-DDD p,p´-DDT Metoxicloro

% Recuperación a % Recuperación a % Recuperación a 20 5 min. de t de 10 min. de t de min. de t de extracción extracción extracción 76 81 84 69 76 78 75 79 82 74 78 80 86 89 88 67 75 76 72 78 80 61 67 71 67 73 74 46 53 56 45 50 52

100 80 60 40 20 0

Analitos 5 minutos

10 minutos

20 minutos

Figura 1: Evaluación del tiempo de extracción Al aumentar el tiempo de extracción, se produjo un incremento de las recuperaciones. Si bien el orden del incremento en las recuperaciones es mayor al pasar de 5’ a 10’ de extracción que al pasar de 10’ a 20’, a este último tiempo se alcanzan las mejores recuperaciones para 10 de los 11 analitos en estudio. Evaluación del porcentaje de recuperación en función de la temperatura de extracción. Se procedió a esta evaluación, a tres temperaturas de extracción (80, 120 y 140 °C) y en cada caso con ensayos por triplicado. Se trabajó de igual forma que para la evaluación anterior, manteniendo fijo el tiempo de extracción a 20 minutos (tiempo en el que se obtiene mejor recuperación). (Tabla 2 y Figura 2).

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TABLA 2: Evaluación del porcentaje de recuperación en función de la temperatura de extracción ANALITO

% Recuperación a 80 °C de T de extracción 80 74 77 77 87 73 76 64 71 51 45

Lindano Heptacloro Aldrin Hep. Epóxido Endosulfán I p,p´-DDE Dieldrin Endrin p,p´-DDD p,p´-DDT Metoxicloro

% Recuperación a 120 °C de T de extracción 84 78 82 80 88 76 80 71 74 56 52

% Recuperación a 140 °C de T de extracción 66 65 65 65 79 65 66 60 61 51 43

Porcentaje de recuperación

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

A nalitos 80°C

120°C

140°C

Figura2: Evaluación de la temperatura de extracción Para los analitos hubo un incremento de las recuperaciones al aumentar la temperatura de extracción de 80 a 120 °C, con incrementos que van desde un 3% (4,4’-DDD; 4,4’-DDE; Hept. Epóx.) a un 7 % (Metoxicloro, Endrin). Por el contrario, se produjo una disminución en la recuperación, al aumentar la temperatura de 120 a 140 °C, con pérdidas que van desde un 9 % (Metoxicloro, Endosulfán I) hasta un 17 - 18 % (Aldrin, Lindano).

Condiciones óptimas operativas: 20 minutos y 120 °C El equipo utilizado fue un microondas modelo Ethos 1600, marca Milestone. Este equipo cuenta con un sensor de temperatura que permite un monitoreo directo del contenido de los vasos de extracción, hasta temperaturas de 260 °C por períodos cortos. Posee un rotor con capacidad para diez vasos de extracción y una terminal de control, permitiendo

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almacenar hasta 20 programas con posibilidad de asignar valores diferentes a los parámetros operativos en cada paso del proceso de extracción. (Foto 1).

FOTO 1: Microondas marca Milestone COMPARACIÓN DE DOS METODOLOGÍAS DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS: MICROONDAS – SOXHLET Posteriormente, se procedió a la evaluación de algunos aspectos, a fin de comparar dos metodologías de preparación de muestras: Microondas y Soxhlet. Este último método de preparación de muestras, tiene el mismo alcance que el método de microondas, y es ampliamente usado en laboratorios. Se observaron las siguientes ventajas del método microondas frente al método Soxhlet: ♦ Se determinaron los Límites de Detección Metodológicos (L.D.M.), para ambos métodos de preparación de muestras. Los L.D.M. fueron calculados sobre siete réplicas (siete blancos fortificados sólidos con igual nivel de adición de los analitos de interés), siguiendo las recomendaciones de la E.P.A. (Appendix A: Definition and Procedure for the Determination of the Method Detection Limit, July 1982). (Ecuación 1 y Tabla 3). Cálculo: L.D.M. = t(n-1, 1-αα

= .99)

.S

ecuación (1)

Siendo: L.D.M.: Límite de Detección Metodológico. t(n-1, 1-α = .99): el valor Student apropiado para un nivel de confianza del 99% y una desviación estandar estimada con n-1 grados de libertad. S: desviación estandar de los análisis réplicas.

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TABLA 3: Comparación de los límites de detección ANALITO Lindano Heptacloro Aldrin Hep. Epóxido Endosulfán I p,p´-DDE Dieldrin Endrin p,p´-DDD p,p´-DDT Metoxicloro

L.D.M. µg./Kg. (Microondas) 3.46 4.78 2.86 2.46 3.51 2.28 2.67 5.21 2.39 2.35 5.93

L.D.M. µg./Kg. (Soxhlet) 3.61 4.29 2.19 3.09 9.50 2.76 2.45 4.88 5.38 1.67 5.80

Para el método Soxhlet, la extracción se llevó a cabo con el agregado de 300 ml. de la misma mezcla de solventes de extracción, siendo el tiempo de extracción de 18 horas. Los valores de sensibilidad alcanzados por ambos métodos fueron similares para la mayoría de los analitos, pero el número de las interferencias provenientes de los reactivos resultaron mayores para el método Soxhlet. ♦ Menor costo de operación, debido fundamentalmente al menor volumen de solvente de extracción a usar (10 veces menos). ♦ Menor tiempo de proceso de extracción, siendo del orden de por lo menos un cuarto del tiempo total del necesario para la extracción Soxhlet. ♦ Mayor cantidad de muestras a procesar por proceso de extracción. ♦ Automatización, lo que implica una independencia en el control de operación por parte de los analistas. ♦ Menor exposición de los analistas a los solventes de extracción (menor cantidad y tiempo de exposición). ♦ Mayor seguridad al medio ambiente por el menor consumo de mezcla de solventes. APLICACIÓN

3000

Concentración µg./Kg.

Esta metodología de preparación fue probada en la determinación de once pesticidas organoclorados en muestras de suelos provenientes de un sitio contaminado. Para la totalidad de muestras analizadas (la mitad en superficie y la otra mitad en profundidad) los pesticidas detectados en mayor concentración corresponden a: 4,4’-DDT; 4,4’-DDD; 4,4’-DDE; Dieldrin; Metoxicloro. Se detectó presencia de: Heptacloro, Hept. Epóxido y Metoxicloro en dos muestras; Lindano en cuatro muestras; Aldrin, Dieldrin y Endosulfán I en seis muestras; 4,4´-DDD en siete muestras; 4,4´-DDE en doce muestras y 4,4´-DDT en quince muestras. En algunas muestras se evidenció presencia de otro isómero de BHC distinto del Lindano. La distribución que mostraron los pesticidas hallados, según se trate de muestras superficiales o en profundidad, y en orden desde el punto más alejado al más cercano al área comprometida, se visualiza en los siguientes gráficos (Figuras 3 y 4).

2500 2000 1500 1000 500 0 1

2

3

Ubicación de muestras p,p´-DDE

p,p´-DDD

p,p´-DDT

Dieldrin

Figura 3: Concentraciones a nivel superficial

6

Concentración µg./Kg.

120 100 80 60 40 20 0 I

II

Ubicación de muestras p,p´-DDE

p,p´-DDD

p,p´-DDT

Dieldrin

Figura 4: Concentraciones a profundidad Equipamiento utilizado en la determinación analítica: Todas las determinaciones se llevaron a cabo en un Cromatógrafo Gaseoso marca Hewlett Packard modelo 6890 A, que cuenta con software adecuado para el control del equipo, almacenamiento y procesamiento de datos y con detector de micro captura de electrones (µECD). La columna utilizada es una HP – 1701 de 30 m. de largo, 250 µm. de diámetro interno y 0.25 µm. de espesor de film, a flujo constante de 2.2 ml./min., con nitrógeno de alta pureza como gas carrier. Se trabajó con inyección automática (Inyector serie 7683 de Hewlett Packard), en modo Splitless pulsado, con temperatura del inyector de 250 °C, temperatura del detector de 300 °C y el siguiente programa de temperaturas del horno: temperatura inicial de 80 °C durante 1 min., una primer rampa de calentamiento hasta 190 °C a una velocidad de 30 °C/min. y una segunda rampa de calentamiento hasta 260 °C a una velocidad de 6 °C/min., manteniendo esta temperatura final durante 2 min. Durante la aplicación, también se trabajó con el mismo equipo con un segundo detector para confirmaciones: detector de masas (MS) modelo 5973 de Hewlett Packard, en modo SIM (Selected Ion Monitoring). En este caso, se usó la columna HP – 5MS de 30 m. de largo, 250 µm. de diámetro interno y 0.25 µm. de espesor de film, a flujo constante de 1.2 ml./min., con helio de alta pureza como gas carrier. La temperatura del inyector y el programa de temperaturas del horno fueron iguales que para las determinaciones con detector de µECD, mientras que la línea de transferencia del Masas se mantuvo a 280 °C, la temperatura del cuadrupolo a 150 °C y la temperatura de la fuente de iones a 230 °C. (Foto 2 y Figuras 5, 6, 7 y 8)

Foto 2: Cromatógrafo Gaseoso con detectores de µECD y Masas

7

Response_ 589.D\ECD1A

4.5e+07

15.35 4e+07

3.5e+07

3e+07 10.70 7.80

2.5e+07

15.24

8.64 8.14

2e+07

10.11 11.17 11.56 12.06

1.5e+07

13.12 13.54 1e+07

5000000

6.11

6.00

7.40 7.217.94 7.00

8.00

14.82 13.27 13.93 14.18 14.36

9.13

16.20 16.65

18.03

9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00

Time

Figura 5: Cromatograma de blanco fortificado con once pesticidas organoclorados. GC/µECD

Abundance

TIC: 928.D 10.87 11.09 18000 16000

10.38

14000

7.14

11.32 11.26 10.57 10.79 10.44 11.67 10.62 12.10 10.67 11.54

12000

11.60

5.27 100005.22 8000 6000 4000

15.25 14.55

11.16

8.98 9.79 8.33

11.90

5.35 9.97 8.52 6.05 6.59 6.17 10.20 10.13 9.69 10.26 5.87 10.06 9.58 9.34 9.88 6.47 8.66 8.78 9.54 9.47 5.82 6.68 9.16 9.23 7.99 6.44 7.73 6.97 5.92 5.57 5.98 6.26 5.52 7.23 7.43 7.78 7.83 6.12 7.52 8.18 6.32 6.74 6.91 7.28 7.93 6.82 5.70 8.08 7.64 7.37 5.77 6.40

2000 6.00

7.00

8.00

13.03

13.43 12.01 12.34 12.25 12.47 12.66 12.93 13.76 12.84 15.46 13.18 13.70 13.26 13.36 13.83 13.92 13.99 15.94 15.99 15.77 14.02 16.55 16.74 17.37 17.13 17.42 16.18 16.36 15.62 15.85 14.76 16.79 17.08 17.55 16.83 17.75 16.43 16.07 17.62 16.68 17.20 17.30 16.28 15.06 14.12 17.67 17.86 18.07 16.62 17.51 16.11 14.34 18.01 14.23 18.20 14.27 17.81 15.02 14.93 18.23 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00

Figura 6: Cromatograma de blanco fortificado con once pesticidas organoclorados. CG/MS-SIM. TIC (Cromatograma de Iones Totales)

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Abundance Ion 235.00 (234.70 to 235.70): 928.D 13.03

3000 2500 2000 1500 1000 500

13.13

13.27

0 12.95

13.00

13.05

13.10

13.15

13.20

13.25

13.30

Time--> Abundance Ion 237.00 (236.70 to 237.70): 928.D

3000 2500

13.03

2000 1500 1000 500

13.18

13.23

0 12.95

13.00

13.05

13.10

13.15

13.20

13.25

13.30

Time--> Abundance Ion 165.00 (164.70 to 165.70): 928.D

3000 2500

13.03

2000 1500 1000

13.13

13.18

13.26 13.29

500 0 12.95

13.00

13.05

13.10

13.15

13.20

13.25

13.30

Time-->

Figura 7: Cromatograma de blanco fortificado con once pesticidas organoclorados. GC/MS-SIM. EIC (Cromatograma de Iones extraídos: 235, 237, 165 - p,p’-DDT)

Abundance

Scan 765 (13.033 min): 928.D

3000

235

2800

2600

2400

2200

2000 165 1800

1600

1400

1200

1000

800

600

400

152

200 227 0 145150155160165170175180185190195200205210215220225230235240

Figura 8: Cromatograma de blanco fortificado con once pesticidas organoclorados. GC/MS-SIM. Espectro de masas correspondiente al p,p’-DDT

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CONCLUSIONES Esta metodología de extracción sobre la que se llevó a cabo la optimización, demostró ser un proceso de preparación de muestras rápido, eficiente, económico, ofreciendo además mayor seguridad para los operadores y para el ambiente, debido al menor consumo de solvente. Asimismo resultó ser una herramienta útil de diagnóstico en la evaluación de contaminación de muestras sólidas. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Manual de Operador Ethos 1600 - Milestone Srl. Method 3540 C: Soxhlet Extraction (Rev. 3, Dec. 1996). Test Methods for evaluating solid waste, physical/chemical methods (E.P.A. SW - 846). Method 3546: Microwave Extraction (Rev. 0, Nov. 2000). Test Methods for evaluating solid waste, physical/chemical methods (E.P.A. SW - 846). Method 8081 B: Organochlorine Pesticides By Gas Chromatography (Rev. 2, Nov. 2000). Test Methods for evaluating solid waste, physical/chemical methods (E.P.A. SW - 846).

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