METODO DE ENSAYO

MET-CNSP-004

DETERMINACION DE SUSCEPTIBILIDAD O RESISTENCIA DE LARVAS DE MOSQUITOS A LOS INSECTICIDAS

Edición Nº 01 Página 1 de 16

DETERMINACION DE SUSCEPTIBILIDAD O RESISTENCIA DE LARVAS DE MOSQUITOS A INSECTICIDAS

ELABORADO POR:

CNSP Blga. Miriam Graciela Palomino Salcedo

REVISADO POR:

CNSP Blgo. Pablo Edilberto Villaseca Castro CNSP Blgo. Leonardo Mendoza Uribe CNSP TM. Julia Espinoza Soto

APROBADO CON:

RD Nº 008-2008-DG-CNSP/INS

FECHA: 30-05-2008

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INDICE Pág. CARÁTULA

1

INDICE

2

1.

OBJETIVO

3

2.

CAMPO DE APLICACIÓN

3

3.

REFERENCIAS

3

4.

DEFINICIONES

3

5.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

4

6.

DESARROLLO DEL MÉTODO DE ENSAYO

4

6.1

Condiciones previas

5

6.2

Aspectos de Bioseguridad

6

6.3

Tipo de muestra

6

6.4

Preparación de la muestra

6

6.5

Materiales

7

6.6

Ejecución del método

8

6.7

Cálculos

11

6.8

Informe de resultados

11

6.9

Interpretación de resultados

11

6.10

Confiabilidad del método

12

7.

REGISTROS

12

8.

ANEXOS

12

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1.

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OBJETIVO Determinar de forma temprana la resistencia a insecticidas en larvas de poblaciones de campo, con vistas a utilizar otras alternativas para el control larval y poder preservar la efectividad del insecticida que se este utilizando.

2.

CAMPO DE APLICACIÓN El presente método de ensayo es aplicable a insecticidas con ingrediente activo organofosforado de uso en Salud Pública.

3.

REFERENCIAS

3.1.

Organización Mundial de la Salud. Resistencia a los insecticidas y lucha contra los vectores. 17° Informe del comité de expertos de la OMS en insecticidas. Serie de informes técnicos Nº 443. 1970.

3.2.

World Health Organization. Criteria and meaning of tests for determining the susceptibility or resistance of insects to insecticides. VBC/81.6

3.3.

Organización Mundial de la Salud. Instrucciones para determinar la susceptibilidad o resistencia de los mosquitos adultos a los insecticidas carbamatos, organoclorados y organofosforados. WHO/VBC/81.806.

3.4.

World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticidas. WHO/VBC/81.807.

3.5.

Mundo Sano. Protocolo para determinar la susceptibilidad o resistencia a insecticidas de mosquitos de la especie Aedes aegypti. Documento propuesto por la Red Latinoamericana de Control de Vectores. RELCOV. 2005.

4.

DEFINICIONES

4.1

resistencia: se describe como un cambio en la composición genética de una población, que se produce en respuesta a una presión selectiva debida a la aplicación de un tratamiento insecticida. Como resultado de ese cambio, el tratamiento insecticida deja de ser efectivo.

4.2

insecticida: Compuesto químico utilizado para matar insectos. Los Insecticidas son utilizados para controlar plagas en la agricultura e insectos que afectan la salud humana y animal.

4.3

concentración o diagnóstica, es el doble de la concentración que normalmente produce la muerte al 99% de los insectos que lo reciben.

4.4

concentración letal: exposición del insecto a superficies tratadas con un toxico por lo tanto no se sabe cuanto insecticida recibió cada insecto pero si se conoce a que concentración estuvo expuesto. Ejemplo Concentraciones letales (CL) como la CL50.

4.5

cepa susceptible: Población de mosquitos de una misma especie que carece de genes de resistencia a los insecticidas.

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4.6

cepa problema: Población de mosquitos de una misma especie que se desconoce la susceptibilidad a los insecticidas.

5.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO El propósito de los bioensayos con larvas de mosquitos e insecticidas se realizan para obtener relaciones dosis-respuesta, de tal manera que se pueda determinar de forma temprana la resistencia de larvas en poblaciones de campo, con vistas a utilizar otras alternativas para el control larval y poder preservar la efectividad del insecticida que se esté utilizando. Con los datos obtenidos, se calculan parámetros que resultan muy útiles para comparar la toxicidad del insecticida. Cuando se aplica una dilución serial del insecticida, los individuos de un mismo grupo reciben la misma dosis y se evalúa la mortalidad a un tiempo predeterminado. Los grados de susceptibilidad son determinados mediante el establecimiento de la relación directa entre exposición y mortalidad. A fin de fijar en toda su amplitud los márgenes de variación natural, conviene en lo posible repetir la operación en varias localidades y en diferentes épocas del año. Cuando se investiga la resistencia en poblaciones larvales se deben tener en cuenta dos enfoques: El establecimiento de una línea base de susceptibilidad de una población normal. Por ¨normal¨ se entiende que es una población que nunca ha sido sujeta a presión de selección con insecticidas y por lo tanto muestra susceptibilidad a insecticidas. La exposición de la población a una serie de concentraciones de insecticidas debe producir una línea recta de regresión que relaciona el logaritmo de la concentración del insecticida que se evalúa con el % de mortalidad. A partir de estos resultados se determina por extrapolación la concentración en la cual normalmente morirán todos los individuos de la población susceptible. El doble de esta concentración es la concentración discriminante o diagnóstica que normalmente producirá la muerte total de la población susceptible. La frecuente exposición de una población a una presión de selección con insecticidas a la concentración diagnostica genera la aparición de individuos anormalmente tolerantes ó resistentes y genera mutaciones genéticas en sitios blancos de los insecticidas o sobreproducción de genes que codifican para enzimas que metabolizan insecticidas. La frecuencia de estos cambios puede monitorearse en una población bajo presión de selección, lo cual nos permite comprender mejor el desarrollo de resistencia y la creación de mejores políticas de uso de insecticidas.

6.

DESARROLLO DEL MÉTODO DE ENSAYO Se debe tomar en cuenta: Establecimiento de la línea-base Las larvas de mosquitos son expuestas a diferentes concentraciones de insecticidas y se determina la mortalidad para cada una de ellas. Esto se

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sugiere para un examen preliminar el cual debe ser realizado con un rango amplio de concentraciones, esto indicará el nivel general de susceptibilidad. Posteriormente se deben realizar evaluaciones con al menos 4 concentraciones diferentes que causen entre un 2 y 98 % de mortalidad en 24 horas. Se deben realizar cuatro (4) réplicas de cada concentración para poder establecer la línea recta de regresión logaritmo-probit en un papel logarítmico. A medida que la población es más homogénea para la resistencia esta recta será de mayor pendiente. Con estos resultados se calcula el nivel de susceptibilidad, comparando los valores de concentración letal 50 (CL50) ó 90 (CL90) de la cepa a evaluar con la cepa normal o susceptible de la misma especie, dando como resultado el factor de resistencia (FR50 ó FR90). Chequeo de rutina para concentraciones diagnósticas Se realiza como una rutina de monitoreo de la resistencia y no es necesario emplear todas las concentraciones usadas para establecer la línea base de susceptibilidad, solamente se usa la concentración diagnóstica. Las concentraciones diagnósticas tentativas para larvas de mosquitos se muestran en la tabla 1. Estos datos fueron obtenidos con larvas de IV estadio a 23°C. Es posible que no correspondan a los datos que se obtendría de larvas salvajes capturadas bajo condiciones de campo, considerar estos datos como referencia; estas concentraciones deberían ser evaluadas bajo varias condiciones de campo antes de ser usados. (WHO/VBC/81.807) Las pruebas con la concentración diagnóstica deben ser repetidas periódicamente con al menos ocho (8) réplicas de 25 larvas. La ocurrencia de sobrevivientes a esta concentración es poco probable que se deba a una variabilidad normal siempre que la edad fisiológica, la condición de la larva y las condiciones experimentales sean las mismas como cuando se estableció la línea-base. Si se encuentra repetidamente sobrevivientes, se confirma la resistencia. 6.1

Condiciones previas

6.1.1 6.1.1.1 6.1.1.2 6.1.1.3

Condiciones que deben reunir las larvas de los mosquitos: Se emplean larvas de mosquitos de tercer estadio tardío o cuarto temprano. Las larvas deben ser de campo, es decir salvajes. Cuando no sea posible conseguir un número suficiente larvas de mosquitos se pueden obtener huevos y mantenerlos en condiciones de laboratorio hasta obtener el tercer o cuarto estadio.

6.1.2 6.1.2.1

Condiciones que debe reunir el ensayo: Conviene efectuar las pruebas en un local cerrado, no contaminado por insecticidas ni expuesto a condiciones extremas de temperatura (no debe exceder los 30°C (25°C± 2°C), humedad relativa (entre 70% a 80% HR), iluminación o ventilación. Siempre que sea posible las pruebas comparativas se ejecutan en condiciones idénticas de humedad relativa y temperatura. El transporte de las larvas de mosquitos a un laboratorio alejado produce con frecuencia muertes por causas ajenas a la acción del larvicida, lo que se pone de manifiesto por la alta mortalidad de los testigos o controles.

6.1.1.2

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6.1.1.3 6.1.1.4

6.1.1.5

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El kit de susceptibilidad y/o los larvicidas pueden ser comprados separadamente. La exactitud de las concentraciones será afectada si el alcohol se evapora de las soluciones estándares. Las botellas deben ser bien tapadas después de usar. El contenido no debe ser usado cuando ha decrecido por debajo de 5 mL. Se deben preparar soluciones estándares frescas a partir de soluciones stock. Los beaker de vidrio para la prueba deben ser cuidadosamente lavados después de usar para quitar las trazas de insecticida, se deberán enjuagar, lavar con detergente (o limpiar con dicromato de potasio y acido sulfúrico), y enjuagar nuevamente. Los vasos descartables usados para la prueba serán eliminados. Las pipetas deben ser completamente lavados con acetona o alcohol.

6.2

Aspectos de bioseguridad

6.2.1

Los analistas del laboratorio para la ejecución de este método, deben estar especialmente capacitados e instruidos de los peligros potenciales provenientes de los productos a manipular y de las operaciones relacionadas a su trabajo y con conocimiento de las medidas de bioseguridad correspondientes y pertinentes. Para una debida protección es necesario que los analistas del laboratorio de Entomología conozcan la toxicidad de los productos a manipular, las propiedades físicas, así como las vías de entrada al cuerpo, los síntomas de intoxicación y el tratamiento de primeros auxilios para atender cualquier caso de intoxicación. Los analistas del laboratorio de Entomología no deben ingerir alimentos durante la manipulación del insecticida, y al final de la jornada deben de mudarse la ropa antes de consumir alimento alguno.

6.2.2

6.2.3

6.3 6.3.1

Tipo de muestra Larvas de mosquitos de Anopheles spp. y Aedes aegypti de tercer estadio tardío o cuarto temprano. Para reportar un resultado más cercano a la realidad se debe trabajar con la generación F1 de una cepa de campo. La cepa de campo tiene la desventaja de tener un material genético muy variado, es preferible entonces que se cruce el material de campo para analizar la descendencia que va a dar los genes de resistencia de esa población.

6.4 6.4.1 6.4.2

Preparación de la muestra Las larvas de mosquitos Anopheles spp. son colectados de fuentes de aguas tranquilas y sombreadas. Las larvas de mosquitos Aedes aegypti son obtenidos a partir de huevos colectados de ovitrampas o de larvas provenientes de criaderos artificiales de campo. Una vez colectados son acondicionados y mantenidos en el laboratorio hasta obtener la F1.

6.5

Materiales

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Componentes del Kit de susceptibilidad - 4 pipetas de 1 mL para los insecticidas, 1 pipeta para el etanol y 5 bulbos de succión. - 3 goteros con bulbo de jebe para succión. - Material para confeccionar un colador: 2 alambres metálicos, 1 pieza de red de nylon (30 cm2) y 1 tubo de cemento. Se sugiere que 2 piezas de red sean cortadas y pegadas para colocarse a los lados terminales del alambre metálico. Luego se debe poner más pegamento alrededor del lado exterior del alambre para unir las dos piezas de red. Cuando seque la red puede ser recortada con ayuda de una tijera. El kit contiene suficiente red para reemplazar. - Hoja de instrucciones para realizar la prueba, 20 formatos y 3 papeles logarítmicos para trazar la línea de regresión. - Vasos para la prueba. Vasos plásticos disponibles con 250 mL hasta el borde. Material para Línea-base - 4 pipetas de 1 mL para las soluciones estándar (156.25, 31.25, 6.25 y 1.25 mg/litro ). - 1 pipeta de 1 mL para el etanol (control). - 5 bulbos de jebe para succión - 3 goteros con bulbo de jebe para succión - 4 pipetas de transferencia descartables - 2 redecillas - 2 varillas de vidrio - 24 vasos descartables de 12 onzas (aprox. 8 cm de diámetro) - 24 vasos descartables de 3 onzas (aprox . 5 cm de diámetro) - Probeta de 250 mL - Pipeta de 50 mL x 1 - Plumón indeleble - Formato de Registro de la prueba de Susceptibilidad o resistencia de larvas de mosquitos a insecticidas. - 600 larvas de tercer estadio tardío o cuarto temprano de Aedes aegypti. - Insecticida grado técnico Material para dosis diagnostica - 1 pipeta de 1 mL para la solución estándar 6,25 mg/L. - 1 pipeta de 1 mL para el etanol (control). - 2 bulbos de jebe para succión - 2 pipetas de transferencia descartables - 2 redecillas - 2 varilla de vidrio - vasos descartables de 12 onzas (aprox. 8 cm de diámetro) - vasos descartables de 3 onzas (aprox . 5 cm de diámetro) - Probeta de 250 mL - Pipeta de 50 mL x 1 - Plumón indeleble - Formato de Registro de la prueba de Susceptibilidad o resistencia de larvas de mosquitos a insecticidas.

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150 larvas de tercer estadio tardío o cuarto temprano de Aedes aegypti. Insecticida grado técnico

Insecticida Soluciones estándares de Temephos. Todas las soluciones alcohólicas son adecuadamente almacenadas en botellas de 50 ml. Una de las botellas de 50 ml de alcohol es para control y esta es suministrada por cada 4 soluciones estándares o menos. Precaución: El alcohol usado para las soluciones y el control ha sido desnaturalizado por la adición de butanona al 2%. 6.6

Ejecución del método

6.6.1

Ensayo de la concentración discriminante o diagnóstica sobre larvas

6.6.1.2

Para una prueba completa con un insecticida, es suficiente colectar del campo 500 individuos de la misma especie, éstos deberán ser seleccionados. Las larvas deben ser de tercer estadio tardío o cuarto temprano.

6.6.1.3

Colocar de de 20 a 25 larvas en cada uno de los 20 vasos pequeños (3 onzas), cada vaso debe contener 25 mL de agua. Las larvas se transfieren una por una a través de un colador o por un gotero; durante el proceso deben ser lavadas suavemente con agua limpia.

6.6.1.4

En cada uno de los vasos medianos descartables de aproximadamente 7.5 a 10 cm de diámetro (12 onzas), se agrega 224 ml de agua. El agua debe alcanzar una altura de 2.5 a 7.5 cm del recipiente. Se puede usar agua destilada, agua de lluvia o agua reposada (declorada), agua de arroyo pero debe estar libre de posibles contaminantes clorados u orgánicos. Se debe tener cuidado con el agua destilada obtenida comercialmente porque puede contener trazas de metales pesados venenosos y esto dará altas mortalidades en los controles. La temperatura del agua debe ser aproximadamente 25°C, esta no debe estar por debajo de 20°C o sobre 30°C.

6.6.1.5

Preparar las concentraciones pipeteando 1 mL de la solución insecticida estándar justo sobre la superficie del agua en cada uno de los vasos medianos y agitar vigorosamente por 30 segundos con una varilla de vidrio. En la preparación de una serie de concentraciones, primero se deben preparar las soluciones mas diluidas. Cada concentración debe tener 8 réplicas y 4 réplicas de control. Los controles deben ser preparados por la adición de 1 mL de alcohol a cada vaso que contiene agua.

6.6.1.6

Después de 15 a 30 minutos de la preparación de la concentración, añadir las larvas de mosquitos contenidas en los vasos pequeños (3 onzas).

6.6.1.7

Después de un periodo de 24 horas se hace el recuento de la mortalidad. Se reporta el porcentaje de mortalidad de cada concentración, las larvas moribundas y muertas en ambas replicas deben ser sumadas. Las larvas muertas no se mueven cuando se les toca con un palillo en el sifón o región

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cervical. Las larvas moribundas son incapaces de subir a la superficie (dentro de un periodo razonable de tiempo) o de mostrar la característica reacción de buceo¨ cuando es perturbada; también puede mostrar decoloraciones, posiciones no normales, temblores, incoordinación o rigidez. 6.6.1.8

Descartar las larvas que hayan pupado durante la prueba. Si más del 10% de las larvas han pupado en el control, la prueba debe ser descartada. Las pruebas con una mortalidad de 20% o más en el control son insatisfactorias y deben ser repetidas. Tabla 1. Concentración Diagnostica Tentativa para larvas de Mosquitos (mg/litro)* Insecticidas

Anophelinos

Culex quinquefasciatus

Malathion Fenitrothion Fenthion Temephos Clorpyrifos

3.125 0.125 0.05 0.25 0.025

1.00 0.125 0.05 0.02 0.01

Aedes aegypti 1.0 0.06 0.05 0.02 0.01

*WHO/VBC/81.807 A partir de las soluciones estándares de Temephos se puede obtener la concentración diagnóstica de Temephos 0.020 mg/l para larvas de Aedes aegypti y para mosquitos Anophelinos la dosis diagnostica es 0.25 mg/l. Cc Inicial mg/L 5

Volumen Inicial 1 ml

Cc Final mg/L 0.020

Volumen Final 250 ml

Se debe usar la concentración de 5 mg/l como una concentración estándar a partir de la concentración de 156.25 mg/l. Para obtener la concentración requerida se aplica la siguiente fórmula: C1V1=C2V2 C1= Concentración inicial V1=Volumen inicial C2= Concentración final V2= Volumen final Ejemplo 1: C1= 156.25 mg/l V1= ? C2=5 mg/l V2=100 ml V1 = C2V2 C1

= 5 mg/l 100 ml 156.25 mg/l

= 3.2 ml

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Calculo de la cantidad de solvente (etanol absoluto) Solvente a agregar = V 2 –V1 Solvente = 100 ml – 3.2 ml Solvente = 96.8 ml Ejemplo 2. Si se quiere obtener la concentración 5 mg/l a partir de la concentración 31.25 mg/l, se procede de la siguiente manera: C1= 31.25 mg/l V1= ? C2=5 mg/l V2=100 ml V1= C2V2 C1

= 5 mg/l 100 ml 31.25 mg/l

= 16 ml

Calculo de la cantidad de solvente (etanol absoluto) Solvente a agregar = V 2 –V1 Solvente = 100 ml – 16 ml Solvente = 84 ml De esta manera se puede obtener la solución 5 mg/l en cantidad suficiente de 100 ml para colocar 1 ml en cada vaso con 249 ml y se obtiene un volumen final de 250 ml y una concentración diagnóstica de 0.02 mg/l.

6.6.2 6.6.2.2

Ensayo de la línea-base para la determinación de (CL 50) de larvicida Cuando el ensayo de concentración diagnóstica antes descrito indica que la población de mosquitos en evaluación ha desarrollado algún grado de resistencia es recomendable determinar la concentración letal 50% del temephos (producto técnico) sobre larvas provenientes de la población de mosquitos evaluada y sobre larvas de la cepa susceptible de referencia, a los fines de establecer el factor de resistencia (FR). El FR es cuantas veces mas concentración de Temephos se necesita para matar el 50% de la población de larvas resistentes respecto a la que se requiere para matar el 50% de la población de larvas susceptibles. El FR se obtiene de la siguiente ecuación: FR = CL50R / CL50S

6.6.2.3

Para realizar la determinación de CL50 de larvicida se usa una técnica similar a la descrita para aplicación de concentración diagnóstica, pero a diferencia de usar una sola concentración de Temephos como tratamiento, se utilizan 5 concentraciones diferentes de Temephos.

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6.6.2.4

6.6.2.5

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Se deben realizar, al menos, 5 replicas de cada concentración del temephos y es necesario utilizar como mínimo 5 concentraciones distintas. La preparación de las concentraciones de temephos deben ser tales que al menos 4 de ellas causen una mortalidad entre un 2% y un 98%. La siguiente es una tabla con diferentes concentraciones a utilizarse de acuerdo a los resultados que se obtienen de la cepa problema: Cc Inicial mg/L 31.25 25.00 18.75 12.50 6.25 1.25

Volumen Inicial 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Cc Final mg/L 0.125 0.100 0.075 0.050 0.025 0.005

Volumen Final 250 ml 250 ml 250 ml 250 ml 250 ml 250 ml

Para preparar las concentraciones a 25 mg/l, 18.75 mg/l y 12.50 mg/l se usarán los ejemplos 1 y 2. 6.7

Cálculos Con el programa EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM. Used for calculating LC/EC values. Versión 1.5, se calcula varias concentraciones letales (CL), comprendidas entre la CL5 (la concentración que teóricamente mata al 5% de los insectos que la reciben) y la CL99 (la concentración que teóricamente mata al 99% de los insectos que lo reciben). Con este programa se calcula el parámetro toxicológico que se necesita.

6.8

Informe de resultados Los resultados de las evaluaciones descritas en el presente documento son reportados en los formularios autorizados por el CNSP (Anexos).

6.9 6.9.1

Interpretación de resultados Los resultados de los ensayos de susceptibilidad por el método de susceptibilidad o resistencia de larvas de mosquitos a larvicidas, se expresan como el porcentaje de mortalidad de larvas de mosquitos expuestas a 24 horas.

6.9.2

Cuando se usa la dosis diagnóstica o discriminante, la interpretación de resultados se realiza considerando los rangos sugeridos por la OMS en los mosquitos adultos: - De 98 a 100% de mortalidad indica Susceptibilidad (SS). - De 80 a 97% de mortalidad sugiere la posibilidad de Resistencia a confirmar (RC). -