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Diagnóstico de especies de Armillaria y Phytophthora en suelo como estrategia de conservación de árboles singulares en Galicia PINTOS VARELA, C.1, AGUÍN CASAL, O.1, MANSILLA SALINERO, P.2, RIAL MARTINEZ, C.1, SAINZ OSÉS, M.J.2, SALINERO CORRAL, M.C.1 y MANSILLA VAZQUEZ, J.P. 1 1

Estación Fitopatológica do Areeiro, Deputación Pontevedra, Subida a la Robleda s/n, 36153 Pontevedra. [email protected] 2 Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario s/n, 27002 Lugo.

Resumen En Galicia, 147 árboles y 31 formaciones arbóreas están legalmente reconocidas como patrimonio objeto de protección. No se realiza ningún control de su estado sanitario ni de su estabilidad estructural, por lo que podría producirse la caída o muerte de algún árbol debido principalmente a plagas y enfermedades que permanecen sin diagnosticar y/o a fuertes vientos. Distintos hongos y oomycetes que causan podredumbres radiculares constituyen una de las principales amenazas para el estado sanitario de estos árboles. El objetivo de este trabajo fue estudiar la presencia de especies de Armillaria y Phytophthora en los suelos en que crecen árboles y formaciones singulares de la provincia de Pontevedra, como estrategia para el diseño de un plan de prevención. Se realizaron técnicas de captura y extracciones de ADN en suelo para determinar las especies de ambos géneros mediante métodos morfológicos y moleculares. Se han identificado tres especies de Armillaria y tres de Phytophthora, entre las que se encuentran Phytophthora cinnamomi, Armillaria mellea y Armillaria ostoyae, consideradas muy agresivas para especies leñosas. Palabras clave Armillaria mellea, Phytophthora cinnamomi, podredumbre radicular, patrimonio natural.

1. Introducción El Decreto 67/2007 de la Xunta de Galicia estableció un Catálogo gallego de árboles singulares (DOG, 2007), en el que actualmente se incluyen 147 árboles y 31 formaciones arbóreas (DOG, 2011), que son merecedoras de medidas específicas de protección, por características excepcionales de su porte, dendrometría, edad, rareza, significación histórica o cultural, interés científico, educativo, estético, paisajístico o cualquier otra circunstancia. Algunos han muerto sin que se conozcan las causas, como un haya del parque de Castrelos en Vigo y el pino manso de Ponteareas (Pontevedra), ambos incluidos en el primer listado del Catálogo; el chopo blanco de Cuntis, incluido en 2011, cayó por acción del viento. Una de las causas que pueden amenazar el estado sanitario de estos árboles y su estabilidad estructural es la presencia de hongos y oomycetes causantes de pudrición radicular, que pueden degradar tallos y raíces gruesas de sujeción y determinar problemas de anclaje del árbol, que se hace más susceptible al derribo por el viento, o causar su muerte. Entre los agentes causantes de podredumbre radicular más importantes destacan especies del

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género Phytophthora y del género Armillaria. Son especies cosmopolitas, polífagas y saprófitas, sus daños son graves y son muy difíciles de controlar. Desde una perspectiva global, más del 66% de las enfermedades radiculares y más del 90% de las podredumbres de cuello de las plantas leñosas son causadas por especies de Phytophthora (JUNG, 2012). Sin embargo, a menudo no se detecta su presencia, lo que conduce a diagnósticos erróneos. La mayoría de las veces, cuando los síntomas se hacen visibles en la parte aérea, los daños en el sistema radicular se encuentran en una fase avanzada. El género Phytophthora engloba a más de 100 especies, la mayoría patógenos de raíces que producen importantes daños en cultivos, viveros, parques y ecosistemas naturales (ERWIN & RIBEIRO, 1996; BRASIER, 2009). Algunas son específicas al hospedador, sin embargo otras son polífagas, como P. cinnamomi que es patógena de 266 géneros en 90 familias, frecuentemente frondosas (CLINE et al., 2008). El género Armillaria presenta una amplia distribución, con especies localizadas en los cinco continentes (GUILLAUMIN et al., 1993). En Europa las más patógenas son A. mellea y A. ostoyae. Su presencia en un terreno representa un grave peligro, dada la gran capacidad destructiva e infecciosa que poseen. Las características definitorias de estos hongos, como son su carácter saprófito, la presencia de rizomorfos, el que todos los órganos estén en el suelo, a veces a profundidades considerables, y que el micelio se encuentre protegido debajo de la corteza, hacen más difícil su control (WEST, 2000). 2. Objetivos El objetivo de este trabajo fue estudiar la presencia de especies de Armillaria y Phytophthora en suelos en que crecen árboles y formaciones singulares de la provincia de Pontevedra, como estrategia para el diseño de un plan de prevención. 3. Metodología En invierno de 2011 se tomaron muestras de 57 suelos, en los que crecían árboles y formaciones singulares catalogados en la provincia de Pontevedra, a una profundidad de 0-50 cm. En el laboratorio, se procedió a una inspección visual de las muestras para detectar la presencia de micelio y/o rizomorfos, característicos de las especies de Armillaria. Posteriormente se almacenaron a 4 °C hasta su análisis. 3.1. Phytophthora Para detectar la presencia de especies de Phytophthora en muestras de suelo, se siguió un procedimiento basado en la utilización de trampas vegetales que permite “capturar” al oomycete, el cual se aísla posteriormente en medios de cultivo selectivos para poder identificar la especie (JUNG et al., 1996). Se pesaron 125 g de suelo y se suspendieron en 500 ml de agua destilada estéril. La suspensión se agitó y, antes de que decantase, se vertió en placas Petri estériles. En la superficie de cada placa se dispusieron 10-15 trozos de hojas de aguacate (cuatro placas por muestra de suelo). Las placas se taparon con papel de filtro, para limitar la luz, y se incubaron 5-8 días a temperatura ambiente. A partir del tercer día de incubación, las placas se observaron periódicamente al microscopio (100X) para registrar la presencia o ausencia de esporangios de Phytophthora. Los trozos de hojas en los que se observaron esporangios se sembraron en medio V8 y se incubaron a 22-24 ºC en oscuridad.

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Para la identificación morfológica de los aislados de Phytophthora, se observaron los siguientes caracteres: aspecto de la colonia y morfología del micelio, presencia o ausencia de hinchamientos hifales y clamidosporas, producción de órganos sexuales (anteridio y oogonio), tamaño de oogonio y posición del anteridio en relación al oogonio, tamaño de la oospora (plerótica o aplerótica), morfología de los esporangios, longitud, anchura, ratio longitud/anchura. Para cada aislado, se determinaron las temperaturas cardinales de crecimiento (mínima, óptima y máxima). Para aquellos que no produjeron esporangios en medio V8, se indujo su producción sumergiendo porciones de micelio, procedentes del borde de la colonia, en extractos filtrados de suelo no estéril (ERWIN & RIBEIRO, 1996). Tras incubación durante 3-4 días a temperatura ambiente, se midieron 25 esporangios maduros y se estudiaron sus características. Para la identificación molecular de los aislados, se extrajo el ADN de micelio del borde de la colonia mediante el kit comercial E.Z.N.A.® Fungal DNA Mini (Omega Bio-tek), siguiendo las instrucciones del fabricante para el protocolo corto. Se amplificaron las regiones ITS del ADN ribosomal mediante una nested-PCR, utilizando los primers DC6, ITS4 e ITS6 (COOKE et al., 2000), y una región del gen del factor de elongación 1 alfa (EF-1 alpha) con una PCR en la que se emplearon los primers ELONGF1-ELONGR1 (KROON et al., 2004). Los productos amplificados se secuenciaron y las secuencias se compararon con las disponibles en el GenBank utilizando la aplicación BLAST. 3.2. Armillaria Se extrajo ADN fúngico de cada muestra de suelo con el kit UltraClean Soil® DNA Isolation (Mo Bio Laboratories, Inc.). Se amplificaron regiones ITS del ADN molde mediante nested-PCR. En la primera PCR se utilizaron los primers ITS1 e ITS4 (WHITE et al., 1990) y en la segunda, tomando 2 µl de la primera reacción, se amplificó una región delimitada por los primers AR1 y AR2, específicos para el género Armillaria (LOCHMAN et al., 2004). El producto de PCR de la segunda amplificación se digirió con las enzimas de restricción Mbo I y Hinf I (Takara Bio Inc.) según el método descrito por LOCHMAN et al. (2004). Los resultados de la digestión se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 3%. Se obtuvieron así patrones identificativos de cada una de las especies del género Armillaria. 4. Resultados Hubo 25 suelos en los que se detectó la presencia de especies causantes de podredumbre radicular: 12 con solo Armillaria, 10 con solo Phytophthora y 3 con ambas (Tabla 1). Las características morfológicas y el análisis molecular permitieron identificar 3 especies de Phytophthora: P. cinnamomi, P. gonapodyides y P. undulata. Phytophthora cinnamomi se encontró en el suelo en el que crecían Araucaria angustifolia, Araucaria bidwillii, Buxus sempervirens, Castanea sativa, Quercus robur y Rhododendrum arboreum. Se detectó P. undulata en el suelo del Quercus robur del Parque de Caldas de Reis y P. gonapodyides en el suelo del Quercus robur de la capilla de Santa Margarida en Pontevedra. En 6 suelos en los que se obtuvieron aislados del género Phytophthora, no fue posible identificar la especie por presentar características morfológicas y moleculares no concluyentes (de posible adscripción a P. citricola o P. multivora), por lo que se han identificado como Phytophthora sp.

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Tabla 1. Especies del género Armillaria y Phytophthora identificadas en suelos en los que crecen árboles (código A) y formaciones (código F) singulares de la provincia de Pontevedra incluídos en el Catálogo de Árboles Singulares de Galicia. Código en el Catálogo

Especie

Localización - Ayuntamiento

Especie de Armillaria

Especie de Phytophthora

-

P. cinnamomi

6A

Araucaria angustifolia

Parque de Caldas - Caldas de Reis

31A

Chamaecyparis lawsoniana

Castelo de Soutomaior - Soutomaior

A. mellea

-

35A

Cryptomeria japonica

Castelo de Soutomaior - Soutomaior

A. mellea

-

37A

Cunninghamia lanceolata

Pazo de Gondomar- Gondomar

A. gallica

-

46A

Eucalyptus globulus

Pazo de Castrelos - Vigo

-

Phytophthora sp.

57A

Liriodendron tulipifera

Pazo de Castrelos - Vigo

A. gallica

-

80A

Quercus robur

Capela de Santa Margarida - Pontevedra

-

P. gonapodyides

93A

Quercus suber

Os Hórreos - A Estrada

98A

Sequoia sempervirens

Castelo de Soutomaior - Soutomaior

104A

Thuja plicata

108A

-

Phytophthora sp.

A. mellea

-

Pazo de Torres de Agrelo - Redondela

-

Phytophthora sp.

Araucaria bidwillii

Carballeira - Pontevedra

-

P. cinnamomi

109A

Araucaria heterophylla

Pazo de Rubiáns - Vilagarcía de Arousa

A. mellea

-

117A

Corylus avellana

Pazo de Lourizán - Pontevedra

A. mellea

-

118A

Cryptomeria japonica

Pazo de Lourizán - Pontevedra

A. gallica

-

126A

Pinus pinaster

Alxan - Salvaterra do Miño

A. ostoyae

-

128A

Quercus robur

A Portela - Mondariz

A. gallica

-

139A

Rhododendrum arboreum

Serantellos - Cambados

A. mellea

P. cinnamomi

142A

Sophora japonica

Pazo de Lourizán - Pontevedra

A. gallica

-

147A

Ulmus x hollandica

Pazo de Lourizán - Pontevedra

A. mellea

Phytophthora sp.

3F

Buxus sempervirens

Pazo de Oca - A Estrada

A. mellea

P. cinnamomi

5F

Castanea sativa, Quercus robur

Pazo de Quintela- Lalín

-

P. cinnamomi

7F

Eucalyptus globulus

Pazo de Barrantes - Ribadumia

-

Phytophthora sp.

17F

Quercus robur

Parque de Caldas - Caldas de Reis

-

P. undulata

24F

Buxus sempervirens

Illa de San Simón - Redondela

-

Phytophthora sp.

29F

Quercus suber

Magán –Estacas - Curtis

A. mellea

-

La especie de Armillaria de mayor prevalencia fue A. mellea, que se detectó en suelos de Araucaria heterophylla, Buxus sempervirens, Chamaecyparis lawsoniana, Corylus avellana, Cryptomeria japonica, Quercus suber, Rhododendrum arboreum, Sequoia sempervirens y Ulmus x hollandica. En 5 suelos (en los que crecían Cryptomeria japonica, Cunninghamiama lanceolata, Liriodendron tulipifera, Quercus robur y Sophora japonica) se registró la presencia de A. gallica y, en el suelo de un Pinus pinaster en Salvaterra do Miño, A. ostoyae. Las tres especies de Armillaria fueron inequívocamente identificadas a través de sus patrones de restricción (Figura 1). El suelo del Rhododendrum arboreum del Pazo Serantellos (Cambados) y de un Buxus sempervirens en el Pazo de Oca (A Estrada) presentaron propágulos tanto de A. mellea como de P. cinnamomi. En el suelo del Ulmus x hollandica del Pazo de Lourizán (Pontevedra) estaban también a la vez A. mellea y una especie de Phytophthora.

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Figura 1. Gel de agarosa al 3% mostrando los fragmentos de restricción del ADN amplificado con los primers AR1AR2 y digerido con la enzima Mbo I de 6 muestras que se corresponden con las especies A. mellea y A. gallica. Calle 1: marcador XIV; calle: 8 marcador Hyperladder V. Calles 2, 3, 5 y 6: A. mellea; calles 4 y 7: A. gallica.

5. Discusión En 13 de los 57 suelos muestreados se registró la presencia de especies de Phytophtora, y en 15, de especies de Armillaria, en su mayoría patógenos de raíz y cuello que pueden causar decaimiento, disminución de crecimiento e incluso la muerte del árbol. En el caso de Phytophthora, hubo 6 suelos que presentaron una especie de posible adscripción a P. citricola o P. multivora, pero cuya identificación definitiva está por concretar. En los últimos años, se ha propuesto la secuenciación de distintas regiones del ADN de Phytophthora para su identificación molecular. Esto ha llevado a que P. citricola, reconocido inicialmente como un único taxón en reconstrucciones filogenéticas (COOKE et al., 2000), esté ahora dividido en un grupo de especies que incluye a P. multivora y P. plurivora. En el GenBank secuencias de algunas regiones son comunes a P. citricola y P. multivora, lo que dificulta la identificación. En todo caso, todas las especies del complejo de P. citricola son patógenas. Phytophthora citricola, P. plurivora y P. multivora parecen ocupar nichos similares, causando la destrucción de raíces finas y produciendo podredumbres de cuello y cancros aéreos en la corteza (JUNG & BURGESS, 2009). Phytophthora cinnamomi se encontró en 5 suelos. Dentro del género, es la especie con mayor diversidad de hospedadores, causando graves daños a árboles y arbustos de alto valor ornamental en viveros productores de planta y afectando, aunque no hay ninguna evaluación de pérdidas, a árboles de distintas especies en plantaciones y bosques de todo el mundo (EPPO, 2012). En Europa, hasta comienzos de los años 1990, hubo una gran preocupación económica y ambiental respecto al castaño europeo (Castanea sativa) debido a la enfermedad de la tinta, causada por P. cinnamomi y P. cambivora (BRASIER, 2000). La tinta es una de las enfermedades más destructivas que afectan a los árboles adultos, por lo que la formación singular del pazo de Quintela (Lalín), en cuyo suelo se detectó P. cinnamomi, debería ser objeto de control para su protección. En un suelo se detectó P. gonapodyides y en otro P. undulata, ambas en árboles singulares de Quercus robur. La presencia de P. gonapodyides es habitual en cursos de agua y suelos muy húmedos o cercanos a cursos de agua en Europa y en el noroeste de Estados

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Unidos (JUNG et al. 1996; REESER et al., 2011). Phytophthora gonapodyides puede ser un saprófito (ERWIN & RIBEIRO, 1996), pero también un patógeno agresivo en especies leñosas, ya que, en Europa, se ha encontrado que causa episódicamente podredumbre de raíz y cuello y cancros aéreos en Fagus sylvatica, Quercus robur y Alnus glutinosa (JUNG et al. 1996; JUNG & BLASCHKE, 2004; BROWN & BRASIER, 2007) durante periodos extremadamente húmedos. Su presencia en el suelo de un roble singular debe propiciar medidas de control para la protección del árbol. Phytophthora undulata, junto con P. citricola, P. cactorum, P. cambivora, P. gonapodyides y varias especies de Pythium, es una de las especies aisladas en suelos en los que crecían Quercus robur y Quercus petraea con síntomas de decaimiento en varios países europeos, demostrándose su patogenicidad para Quercus robur en ensayos bajo condiciones controladas (JUNG et al., 1996). Las especies patógenas del género Phytophthora pueden pudrir las raíces más finas de árboles que crecen en condiciones sin estrés sin causar daños aparentes, ya que las raíces infectadas que mueren son reemplazadas por otras nuevas, pero también pueden causar una podredumbre rápida si el hospedador sufre estrés por condiciones favorables para Phytophthora, como encharcamiento o alta humedad prolongada en el suelo (BRASIER et al., 1993). Estas condiciones podrían ser frecuentes en Pontevedra, la provincia gallega en la que se recoge una mayor precipitación anual, con 1200-1400 mm en altitudes bajas y medias, llegando a 1800-2000 mm en las sierras litorales (NARANJO y PÉREZ MUÑUZURI, 2006). La especie de Armillaria que se detectó con más frecuencia (9 suelos) fue A. mellea, una de las especies más agresivas del género, que causa una podredumbre radicular difícil de controlar una vez extendida en las raíces de la planta. Se trata de un hongo muy polífago cuya acción patógena se ve favorecida por los mismos factores comentados para Phytophthora. En 5 suelos, creciendo en dos de ellos especies de la familia Cupressaceae (Cryptomeria japonica y Cunninghamiama lanceolata) se detectó Armillaria gallica, que se ha encontrado frecuentemente como saprófito o parásito de debilidad en las familias Abietaceae y Cupressaceae (GUILLAUMIN et al., 1993). Solo en un suelo, en el que crece un ejemplar de Pinus pinaster, se encontró Armillaria ostoyae, una especie de alta patogenicidad frecuente en coníferas (LEGRAND & GUILLAUMIN, 1993). ESCOFET et al. (2006) también observaron una alta presencia de A. mellea en 26 suelos de especies ornamentales, frutales y forestales en diferentes localidades de la provincia de Pontevedra. AGUÍN et al. (2004) encontraron que, en Galicia, A. mellea es la especie del género más frecuente en arbustos ornamentales y frondosas sintomáticos de podredumbre radicular, mientras que A. ostoyae causa la enfermedad con más frecuencia en coníferas y A. gallica coloniza un amplio rango de especies leñosas (coníferas, frondosas, ornamentales de otros grupos botánicos). Las especies de Phytophthora se pueden controlar, tanto en suelo como en planta, mediante productos sistémicos, como el fosetil-aluminio y el metalaxil, aplicados por empapamiento de tierra, pulverización foliar o inyección en el tronco. En el caso de Armillaria, en la actualidad no se dispone de ningún método de control que sea totalmente eficaz, si bien el cubiet, recomendado para el control preventivo de las podredumbres de raíz y cuello, ha demostrado, en algunos casos, su utilidad para el control del hongo en planta. 6. Conclusiones La presencia de especies patogénicas de Armillaria y Phytophthora en suelos en que crecen árboles singulares de la provincia de Pontevedra aconseja la aplicación de tratamientos

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para minimizar su capacidad de dispersión y evitar así la infección del árbol o controlarla si ya se ha producido, así como tomar medidas para evitar el encharcamiento y la humedad excesiva en el suelo. 7. Bibliografía AGUÍN, O.; MANSILLA, J.P.; SAINZ, M.J.; 2004. Intraspecific variation in Armillaria species from shrubs and trees in Northwestern Spain. Phytopathol. Mediterr. 43, 299-304. BRASIER, C.M.; 2000. The role of Phytophthora pathogens in forests and semi-natural communities in Europe and Africa. En: HANSEN E.M.; SUTTON, W (eds.): Proceedings from the First International Meeting on Phytophthoras in Forest and Wildland Ecosystems of the International Union of Forest Research Organizations (IUFRO) Working Party 7.02.09: Phytophthora Diseases of Forest Trees. pp. 6-13. Forest Research Laboratory, Oregon State University. Corvallis, Oregon (USA). BRASIER, C.; 2009. Phytophthora biodiversity: How many Phytophthora species are there? En: GOHEEN E.M.; FRANKEL, S.J. (eds.): Proceedings of the fourth meeting of the International Union of Forest Research Organizations (IUFRO) Working Party S07.02.09: Phytophthoras in Forests and Natural Ecosystems. pp. 101-115. Gen. Tech. Rep. PSW-GTR221. Department of Agriculture, Forest Service. Albany, California (USA). BROWN A.; BRASIER, C.M.; 2007. Colonization of tree xylem by Phytophthora ramorum, P. kernoviae and other Phytophthora species. Plant Pathol. 56, 227-241. BRASIER, C.; HAMM, P.B.; HANSEN E.M.; 1993. Cultural characters, protein patterns and unusual mating behavior of Phytophthora gonapodyides isolates from Britain and North America. Mycol. Res. 97, 1287-1298. CLINE, E.T.; FARR, D.F.; ROSSMAN, A.Y.; 2008. A synopsis of Phytophthora with accurate scientific names, host range, and geographic distribution. Online. Plant Health Progress doi:10.1094/PHP-2008-0318-01-RS. COOKE, D.E.L.; DRENTH, A.; DUNCAN, J.M.; WAGELS, G.; BRASIER C.M.; 2000. A molecular phylogeny of Phytophthora and related Oomycetes. Fungal Genet. Biol. 30, 17-32. DOG; 2007. Decreto 67/2007, de 22 de marzo, por el que se regula el Catálogo Galego de Árbores Senlleiras. Consellería de Medio Ambiente e Desenvolvemento Sostible. Diario Oficial de Galicia (DOG) nº 74, 6136-6142. DOG; 2011. Orden de 3 de octubre de 2011 por el que se actualiza el Catálogo Galego de Árbores Senlleiras. Consellería do Medio Rural. DOG nº 196, 30078-30080. EPPO, 2012. Phytophthora cinnamomi. En: http://www.eppo.int/QUARANTINE/fungi/ Phytophthora_cinnamomi/PHYTCN_ds.pdf (último acceso: 20-12-2012). ESCOFET, P.; AGUIN, O.; MANSILLA, J.P.; 2006. Detección e identificación por técnicas moleculares de especies del género Armillaria a partir de muestras de suelo. Bol. San. Veg. Plagas 32, 231-240.

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