Diagnóstico de especies en Genética de la Conservación

Susana González,

Genética de la conservación Estudia los factores genéticos que afectan el riesgo de extinción, así como cuales son las condiciones de manejo genético adecuados a emplear para minimizar dicho riesgo.

GENETICA DE LA CONSERVACIÓN • Es la aplicación de la genética para preservar las especies como entidades dinámicas capaces de adaptarse a los cambios ambientales.

GENETICA DE LA CONSERVACIÓN • Incluye el manejo genético de las poblaciones pequeñas • Comprender la biología de las poblaciones y de las especies

GENETICA DE LA CONSERVACIÓN • Definición de unidades de manejo en las especies. • Resolución de inciertos taxonómicas • Aplicaciones forenses

Taxonomía

Conservación

• El manejo in situ y ex situ de las especies raras y amenazadas requiere del entendimiento de las relaciones con otras especies y de las unidades genéticas. • La información genética es usada para definir unidades de manejo dentro de las especies.

Nuevas metodologías para explorar la biodiversidad y la clasificación taxonómica • Para colecta • Depósito (Colecciones morfológicas, células, genómicas, sonidos, imágenes) • Análisis • Estrategias para la Conservación

¿Que es una especie? • La identificación de especies, de individuos y la determinación de su sexo utilizando solo la morfología puede ser muchas veces difícil ej. en: invertebrados, insectos, plantas. • En las especies raras y con problemas de conservación puede ser más fácil encontrar restos de animales, plumas, pelos o excrementos que localizar los individuos.

¿ Que es una especie? • La combinación de información molecular, morfológica o comportamiento pueden dar una aproximación mas robusta para definir unidades taxonómicas.

¿ Que es una especie? • La identificación molecular puede ayudar a resolver cuestiones ecológicas como el estudio de las interacciones presapredator.

% Taxa descriptos

Descripción de especies 50 40 30 20 10 0 Año 69- 73- 77- 81- 85- 89- 9372 76 80 84 88 92 96 Años

• Los marcadores moleculares ofrecen una gran variedad de opciones para identificar especies, contribución substancial a: – Global Taxonomic Initiative of the Convention on Biological Diversity (http://www.biodiv.org) y – a Global Biodiversity Information Facility (http://www.gbif.org).

• DNA-barcoding puede proveer solución a varios casos de difícil discriminación de especies utilizando el gen mitocondrial de la Citocromo Oxidasa I (COI) http://www.barcodinglife.org

• Este gen tiene muchas propiedades deseables de los organismos aeróbicos y que se encuentran en el genoma mitocondrial en muchas copia por célula. • Tiene aproximadamente 650 bp

• Tiene alto poder discriminante de especies en una variedad de organismos insectos, aves. Por esto se le denomina el código de barras de la vida “Barcode of Life” http://www.barcodinglife.org • Tiene baja variación intraespecifica.

Desventajas de los Geles de Agarosa * * * * * * * *

Baja precisión Baja sensitividad Corto rango < 2 logs Baja resolución No-automatizado Discriminación por tamaño Resultados no se expresan en números Tinción con Bromuro de Etidio no es muy cuantitativa

Real-Time PCR Real-time PCR monitorea la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador del “amplicon” producido en cada ciclo de PCR (en tiempo real ).

Real-time PCR ventajas * no influenciado por amplificación no-especifica * amplificación puede ser monitoreada en tiempo real * no post-PCR procesamiento de productos (high throughput, low contamination risk)

* Ciclos ultra-rápidos (30 minutes to 2 hours) * Amplio rango mas de 1010* Requiere de 1000-veces menos RNA que los ensayos convencionales (3 picogram = one genome equivalent) •confirmación de amplificación especifica analizando las curva de “melting” * mas especifico, sensitiva y reproducible * no mucho mas caro que el PCR convencional (excepto equipamiento )

Real-time PCR desventajas * No es ideal para multiplex *Puesta a punto requiere de gran apoyo técnico y soporte * Equipamiento de alto costo *** *

Real-time Principios •basado en la detección y cuantificación con fluorescencia *

The five-fold dilution series seems to plateau at the same place even though the exponential phase clearly shows a difference between the points along the dilution series. This reinforces the fact that if measurements were taken at the plateau phase, the data would not truly represent the initial amounts of starting target material.

Real-Time Principios Tres metodos generales para los ensayos cuantitativos: 1. Hydrolysis probes (TaqMan, Beacons, Scorpions) 2. Hybridization probes (Light Cycler) 3. DNA-binding agents (SYBR Green)

(www)

Principles of Real-Time Quantitative PCR Techniques (a) SYBR Green I technique: SYBR Green I fluorescence is enormously increased upon binding to double-stranded DNA. During the extension phase, more and more SYBR Green I will bind to the PCR product, resulting in an increased fluorescence. Consequently, during each subsequent PCR cycle more fluorescence signal will be detected. (b) Hydrolysis probe technique: The hydrolysis probe is conjugated with a quencher fluorochrome, which absorbs the fluorescence of the reporter fluorochrome as long as the probe is intact. However, upon amplification of the target sequence, the hydrolysis probe is displaced and subsequently hydrolyzed by the Taq polymerase. This results in the separation of the reporter and quencher fluorochrome and consequently the fluorescence of the reporter fluorochrome becomes detectable. During each consecutive PCR cycle this fluorescence will further increase because of the progressive and exponential accumulation of free reporter fluorochromes. (c) Hybridization probes technique: In this technique one probe is labelled with a donor fluorochrome at the 3’ end and a second –adjacent- probe is labelled with an acceptor fluorochrome. When the two fluorochromes are in close vicinity (1–5 nucleotides apart), the emitted light of the donor fluorochrome will excite the acceptor fluorochrome (FRET). This results in the emission of fluorescence, which subsequently can be detected during the annealing phase and first part of the extension phase of the PCR reaction. After each subsequent PCR cycle more hybridization probes can anneal, resulting in higher fluorescence signals. Van der Velden, Leukemia 2003 (www)

SYBR Green

(1) At the beginning of amplification, the reaction mixture contains the denatured DNA, the primers, and the dye. The unbound dye molecules weakly fluoresce, producing a minimal background fluorescence signal which is subtracted during computer analysis. (2) After annealing of the primers, a few dye molecules can bind to the double strand. DNA binding results in a dramatic increase of the SYBR Green I molecules to emit light upon excitation. (3) During elongation, more and more dye molecules bind to the newly synthesized DNA. If the reaction is monitored continuously, an increase in fluorescence is viewed in real-time. Upon denaturation of the DNA for the next heating cycle, the dye molecules are released and the fluorescence signal falls. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking (NCBI Books) (www)

Cuando elegir SYBR Green * Ensayos que no requieren especificidad de sonda para detectar 1000 moléculas * General screening de transcriptos antes de diseñar un ensayo con sondas. * Cuando el PCR esta optimizado -no primer dimers or non-specific amplicons, e.g. from genomic DNA

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Panthera tigris

Especies con ámbitos hogar muy amplios. Cites I An extremely sensitive species-specific ARMs PCR test for the presence of tiger bone DNA Jon H. Wetton*, Carol S.F. Tsang, Chris A. Roney, Adrian C. Spriggs Forensic Science International 140 (2004) 139–145

Metodología Se extrajo DNA de ejemplares de Zoológicos de UK PCR-Secuenciación con primer universales del gen cit b PCR 1 ul of extract, 0.25 mM of each primer, 1 Taq Gold Buffer, 1.25 U Taq Gold and 200 mM dNTPs in 50 ml. Cycle parameters on a PE 9600 thermocycler were 95 for 20 min, then 35 cycles of 94 for 1 min, 50 for1 min and 72 for 1 min, followed by an extension at 72 for 10 min prior to a 4 hold. Fifty nanograms of the product was used for sequencing with BigDye

Citocromo b

Extracción de ADN de las píldoras de “Traditional Chinese Medicine” • • • • •

Las píldoras de TCM las trituraron en nitrógeno líquido antes de la extracción de ADN Hasta 1 g de TCM en polvo fue añadido a 2 Ml 0,5 EDTA M (pH 8,0), 200 Ml Proteinase K (10 mg/Ml) 10 Ml Entre 20y 50 Ml 1 DTT M e incubado por la noche en 37 C. La extracción con fenol/cloroformo y un lavado final con cloroformo fueron seguidos por desalting por un Centriprep 30 columna. Por último pasaje por una columna de QIAquick que utiliza protocolo de purificación de PCR del fabricante EDTA residual quitado y otros inhibidores.

Real Time-PCR • PCR que comprende 0.5 mM primer Tig117F 50TTTGGCTCCTTACTAGGGGTG-30 and Tig231R 50GGCATGTAGATATCGGATAATC-30, 3 mM MgCl2, 1 Light Cycler • Master SYBR Green mix 1ul del extracto de ADN extraído de TCM y agua esteril deionisada

Real Time-PCR • Después de que la desnaturalización inicial en 95 C por 2 min. • 40 ciclos de 95 C para 10s, 60 C para 10 s, 72 C para 10 s y 80 C para 2 s durante que la florescencia fue leída en 530 nm. • Un perfil final que se funde fue obtenido en el modo del paso entre 60–90 8C en 0,2 incrementos C

• Banco de referencia de félidos secuenciados

Conclusiones • Es posible utilizar marcadores moleculares en RT-PCR para emplear en taxonomía. • Se requiere de tener una banco de referencia para poder ajustar los protocolos de PCR para RT-PCR.