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Daboin Ingry Endodontopatógenos anaerobios gramnegativos presentes en las infecciones endodónticas primarias y efecto antimicrobiano del Biopure MTAD y la Doxiciclina sobre células planctónicas y biopelícula de Enterococcus faecalis Universidad de Los Andes-Facultad de Farmacia y Bioanálisis-Postgrado en Microbiología. 2010. p. 80 Venezuela Disponible en: http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=34308&type=ArchivoDocumento &view=pdf&docu=27416&col=5
¿Cómo citar?
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAO DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS POSTGRADO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA ANAERÓBICA "DR ROBERTO GABALDON"
Endodontopatógenos anaerobios gramnegativos presentes en las infecciones endodónticas primarias y efecto antimicrobiano del Biopure MTAD® y la Doxiciclina sobre células planctónicas y biopelícula de Enterococcus faecalis. lngry Daboín.
Tutora: Dra. Beatriz Nieves
Mérida, Noviembre, 201 O.
ÍNDICE DE CONTENIDO
Pág RESUMEN DEDICATORIA
¡¡
AGRADECIMIENTOS
¡¡¡
ÍNDICE DE FIGURAS
iv
ÍNDICE DE ESQUEMAS
V
ÍNDICE DE TABLAS
vi
iNTRODUCCIÓN
1
OBJETIVOS
4
ANTECEDENTES Patogenia Tratamiento MATERIALES Y MÉTODOS Población y Muestra Criterios de Inclusión Criterios de Exclusión
5 11 15 19 19 19 19
Recolección de las muestras
19 19
Cultivo de la muestra
19
Determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de las cepas
20
Estudio Microbiológico
de E. faecalis aisladas Determinación de la capacidad de formar biopelícula por
20
parte de las cepas aisladas
Cepas de E. faecalis aisladas
20
Cepas de bacterias anaerobias aisladas (P. intermedia, P.
21
gingivalis, P. endodontalis, F. nucleatum) Determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de las células planctónicas y organizadas en biopelícula de E.
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faecalis ante la doxiciclina y el Biopure MTAD.
Acción de la Doxiciclina sobre las células planctónicas
27
Acción del Biopure MTAD® sobre las células planctónicas
28
Acción de la Doxiciclina sobre las células de E. faecalis
28
organizadas en biopelícula Acción del Biopure MTAD® sobre las células de E. faecalis
29
organizadas en biopelícula.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
33
RESULTADOS
34
DISCUSIÓN
46
CONCLUSIONES
53
RECOMENDACIONES
54
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
55
ANEXOS
64
DEDICATORIA
A dios todo poderoso y al Dr. José Gregario Hernández por iluminar mi camino. A mi esposo Rolando por su apoyo, compresión, paciencia y estimulo para lograr esta meta. A mis Padres Charo y Conrado, por su apoyo incondicional, sabios consejos y su infinito amor. A mis abuelos mi hermana y tíos, por su confianza y estímulo.
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1
A ustedes dedico este logro.
¡¡
AGRADECIMIENTOS A dios todopoderoso. A Rolando mi esposo. A toda mi familia mis padres, abuelos, tíos y hermana. A la mi suegra y mis cuñados por su incondicional apoyo. A mi tutora Dra. Beatríz Nieves por todos los conocimientos impartidos y gran apoyo en todo el trayecto de mi preparación académica. A la Ilustre Universidad de Los Andes por brindarme el apoyo académico para el logro de esta meta. Al Laboratorio de Microbiología Anaeróbica Dr. Roberto Gabaldón. A las profesoras Kiralba Sánchez y Lorena Dávila por brindarme su valioso tiempo. Al profesor Bernardo Chatein, por su colaboración. Al personal de la cátedra de Endodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad de los Andes, en especial a la Profesora Rita Gutierrez. A personal del Módulo Odontológico Ernesto lsea Sanabria por su apoyo, en especial a Valentina, María Alejandra y Darcy. A la profesora Marlyn Berrios por su colaboración en el análisis estadístico. A todos los profesores del postgrado de Microbiología. A todo el personal que labora en el área de medios de cultivo, en especial a María Eugenia Nieves, Judith Araque, Zulay Araque Emma y Urbano. A Reynaldo personal del área de inmunología. A mis compañeras del postgrado en especial a Luisana, Poema, María Alejandra y Sorelis. ¡¡¡
INDICE ESQUEMAS Esquema N°
Pág
1
Toma de la muestra, cultivo e incubación.
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2
Identificación de las cepas aisladas
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3
Formación de biopelícula Enterococcus faeca/is
25
4
Formación de biopelícula P. gingivalis, P. endodontalis, P.
26
intermedia y F. nuc/eatum. ('
5
Determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de
31
las células planctónicas de E. faecalis aisladas ante la doxiciclina y el Biopure MTAD
6
Determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de las células organizadas en biopelícula de las cepas aisladas de E. faecalis ante la doxiciclina y el Biopure MTAD.
V
32
INDICE DE TABLAS Tabla N°
1
Pág
Géneros
de
patógenos
comúnmente
asociados
a
las
10
infecciones endodónticas
2
Distribución de los pacientes según la ocupación
37
3
Frecuencia de aislamiento de la combinación de E. faecalis
39
y de bacterias anaerobias aisladas de los conductos radiculares con cultivo positivo.
4
Relación entre aislamiento de bacterias y las características
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clínicas.
5
Susceptibilidad antimicrobiana de las células de E. faecalis en estado planctónico y organizadas en biopelícula ante doxiciclina y Biopure MTAD®.
vi
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INTRODUCCIÓN
Las infecciones producidas por microorganismos anaerobios gramnegativos son una de las causas más importantes que pueden afectar a la pulpa dental (López, 2004). Existen varios tipos de
infección endodóntica que se asocian, generalmente, a
diversas condiciones clínicas: Infección intrarradicular e Infección extrarradicular (Gomes y col., 2006; Siqueira, 2009). La infección intrarradicular es causada por los microorganismos colonizantes del sistema de conductos radicular. Esta infección, a su vez, puede ser subdividida en tres categorías, según el tiempo de establecimiento de los microorganismos dentro del conducto radicular: Infección primaria, Infección secundaria e Infección persistente (Siqueira, 2008). La composición de la microbiota endodóntica puede variar, dependiendo de los diversos tipos de infección y de las diversas formas de periodontitis apical. La delimitación de los tipos de infección endodóntica favorece la comprensión de los procesos patológicos que implican diversas condiciones clínicas y pueden ayudar a establecer medidas terapéuticas efectivas para cada condición (Siqueira, 2008). En el transcurrir de los años, diversos estudios han demostrado, que tanto la patosis pulpar, como la patosis periapical, se encuentran estrechamente vinculadas a la presencia de microorganismos (Sasone y col., 2008).
Estas infecciones están principalmente, Porphyromonas,
por
asociadas
anaerobios
Prevotella,
a una microbiota mezclada,
obligados
Treponema,
de
los
géneros
Peptostreptococcus
integrada
Fusobacterium,
y
especies
de
Campylobacter, también se encuentran algunos microorganismos facultativos, como
por ejemplo, especies de Streptococcus (Siqueira, 2007; Tomazinho, 2007; Gomez, 2007).
2
Las infecciones primarias del canal radicular son causadas por los microorganismos que colonizan el tejido pulpar necrótico. Sin embargo, las dificultades de cultivo de algunas de estas especies, han dificultado una mejor comprensión de la composición de la microbiota endodóntica, así como también, la posible asociación entre las especies específicas y los signos y los síntomas clínicos (Sasone y col., 2008). El desarrollo de una lesión periapical significa la presencia de bacterias en el sistema del canal radicular,
particularmente en su porción apical, donde puede existir una
biopelícula o una invasión de los túbulos dentinales, lo que plantea un desafío en el tratamiento (Na ir y col., 2005). La organización de las bacterias dentro de una biopelícula le confiere una gama de características fenotípicas que no son evidentes en sus contrapartes planctónicas y entre otras características, las hacen más resistentes a los antimicrobianos (Huang y col., 2008).
Enterococcus faecalis posee la capacidad de formar biopelículas entre especies del mismo género o con otros microorganismos, lo que lo hace ser más resistente a los protocolos de limpieza y conformación del sistema de conductos radiculares durante la terapia endodóntica (Duggan y col., 2007). La estrategia para combatir la infección del sistema de conductos radiculares, debe estar basada en el conocimiento de la microbiota presente, ya que el éxito de la terapia endodóntica depende del control de la infección. Si los microorganismos son resistentes a la terapia o a los mecanismos de defensa del hospedero y sobreviven ''
dentro del conducto, pueden comprometer la reparación periapical (Molander y col., 1998; Hancock y col., 2001 ).
La mayoría de las infecciones de origen endodóntico se tratan sin la necesidad de administrar antibióticos. Debido a la ausencia de circulación de sangre dentro de una pulpa necrótica e infectada, los antibióticos no pueden alcanzar y eliminar los microorganismos presentes en el sistema de conductos. De esta manera, la terapia antibiótica sistémica es ineficaz
en este tipo de infección; sin embargo, los
antibióticos pueden ayudar a impedir la propagación de la infección y el desarrollo de infecciones secundarias en pacientes inmunocomprometidos. Por lo tanto, los
3
antibióticos pueden ser una ayuda valiosa para la resolución de algunos casos de infección endodóntica (Siqueira, 2002).
El primer paso importante en la eliminación de los microorganismos en el conducto radicular, es la irrigación con soluciones bactericidas efectivas (Bystrom y Sundqvist, 1981 ). Con este propósito, se han utilizado diversas soluciones irrigantes, tales como,
hipoclorito
de
sodio,
clorhexidina,
derivados
del
yodo,
ácido
etilenendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico, agua oxigenada y Biopure MTAD®, el cual consiste en una mezcla de la tetraciclina (doxiciclina), un ácido (ácido cítrico), y un detergente (tween 80) (Haapasalo y col., 2005; Haapasalo, 2006; Portenier y col., 2006). La limpieza químico-mecánica es una estrategia de tratamiento, en la cual el agente irrigante posee una función antimicrobiana y de disolución de tejidos, para minimizar la cantidad de dentina infectada, remanente pulpar y eliminar el mayor número de microorganismos contenidos dentro del sistema de conducto radicular (Waltimo y col., 2004). Un papel importante de la irrigación del canal radicular es, por lo tanto, eliminar la biopelícula bacteriana residual de las superficies donde es imposible llegar con la instrumentación mecánica (Huang y col., 2008).
Por lo anteriormente expuesto, el presente estudio tiene como objetivos, determinar \
'
el perfil microbiológico de las infecciones endodónticas primarias en pacientes que acudieron a la Facultad de Odontología de La Universidad de Los Andes, durante el periodo Abril-Julio 2009; por otra parte, determinar la capacidad de las bacterias anaerobias estrictas y facultativas aisladas de formar biopelícula, y determinar la eficacia del Biopure MTAD® y de la doxiciclina, ante células de E. faecalis en fase planctónica y organizadas en biopelícula.
OBJETIVOS
Determinar la frecuencia de bacterias anaerobias gramnegativas estrictas y cocos anaerobios facultativos presentes en las infecciones endodónticas primarias y determinar su relación con las características clínico-epidemiológicas de los pacientes.
Determinar la sensibilidad antimicrobiana de las cepas de E. faecalis aisladas ante algunos agentes antimicrobianos de uso convencional en Odontología.
Evaluar in vítro la capacidad de producir biopelículas por parte de las cepas de bacterias anaerobias y E. faeca/is aisladas en el estudio.
Evaluar in vitro la eficacia de la doxiciclina y del Biopure MTAD®, sobre células de E. faeca/ís en estado planctónico y organizadas en biopelícula.
ANTECEDENTES Infección Endodóntica
A pesar de la protección natural que posee la pulpa (esmalte, dentina, cemento y tejidos periapicales) (Figura 1), algunas bacterias pueden invadirla. Estas bacterias, normalmente, son fácilmente fagocitadas y eliminadas por los sistemas de defensa de los tejidos mesenquimáticos sanos, pero cuando la protección se interrumpe, la pulpa puede ser infectada.
Figura 1. Canino inferior. Relación dentina-pulpa-tejidos periapicales (Sores, Golberg, ,-)
2002).
La invasión de la pulpa puede tener lugar de varias formas. Comunicación directa de la cavidad oral con la pulpa (Figura. 2). A través de los túbulos dentina/es. A través de una cavidad de caries. A través de una bolsa gingival profunda. Por propagación de una infección periapical de un diente adyacente infectado. Por vía hematógena (anacoresis) (Liébana, 2002).
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Fig. 2 .Invasión de la pulpa a.- Comunicación directa de la cavidad oral con la pulpa,
b.-A través de los túbu/os dentina/es, c.- A través de una cavidad de caries, d.- A través de una bolsa gingival profunda, e.- Por propagación de una infección periapical de un diente adyacente infectado f.- Por vía hematógena (anacoresis).
Una vez ocurrida la invasión microbiana del tejido pulpar por las vías mencionadas, se establece la infección endodóntica (Siqueira, 2008). Estas infecciones se producen en el sistema de conductos radiculares y se considera que son la causa
principal de la periodontitis apical (Siqueira y Rocas, 2008). A
pesar de que en este tipo de infecciones se han encontrado asociados virus y hongos, las bacterias son los microorganismos más comunmente implicados en la patogenia de la periodontitis apical. Generalmente el proceso infeccioso endodóntico se produce, después de la necrosis de la pulpa, como resultado de una caries dental, un traumatismo o de procedimientos iatrogénicos. Una pulpa necrótica le proporciona a los microorganismos un ambiente húmedo, rico en nutrientes, con una.temperatura favorable y una tensión de oxígeno baja, lo cual protege a los microorganismos de
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los mecanismos de defensa del hospedero (Siqueira, 2009). Tales condiciones son altamente propicias para el establecimiento de una microbiota mixta, visiblemente dominada por especies de bacterias anaerobias, la mayoría de ellas, forman parte de la microbiota habitual de la cavidad oral. Por lo tanto, la infección endodóntica se
n
considera una infección endógena (Figdor y Sundqvist, 2007).
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1
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En las etapas avanzadas del proceso infeccioso, las bacterias se
organizan en
comunidades denominadas biopelículas adheridas a las paredes de los conductos
1
radiculares. De allí, la tendencia actual de incluir a la periodontitis apical en la categoría de enfermedades inducidas por biopelícula (Ozok y col., 2007). ¡
Para que un microorganismo sea considerado un patógeno endodóntico, debe
',
poseer ciertos requerimientos (Siqueira, 2002): ./ Debe estar presente en cantidades suficientes para iniciar y mantener la lesión periapical . ./ Poseer factores de patogenicidad que puedan expresarse durante el proceso infeccioso . ./ Debe localizarse espacialmente en el canal radicular para que sus factores de patogenicidad alcancen los tejidos periapicales . ./ El canal radicular debe permitir la sobrevivencia, el crecimiento de los microorganismos y provocar señales que estimulen la expresión de los genes de virulencia . ./ En el ambiente del canal radicular las relaciones antagónicas entre los microorganismos no deben darse o presentarse en baja proporción . ./ El hospedero debe defenderse inhibiendo la diseminación de la infección, este proceso puede resultar en daño del tejido periapical.
J
Cuando las bacterias invaden el tejido pulpar se inicia un proceso inflamatorio agudo, inespecífico, independientemente del agente agresor. El objetivo de esta respuesta es localizar y eliminar el antígeno, remover los tejidos degenerados y preparar el área injuriada para la reparación tisular. El proceso agudo es rápido, tarda de algunos minutos a dos o tres días y, dependiendo de la intensidad del agresor o
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antígeno, será eliminado y los tejidos reparados. En el caso contrario, los microorganismos colonizan el sistema de conductos y se instala una inflamación crónica con la participación adicional de células inmunocompetentes, como los linfocitos T y B, específicamente, avocados a la eliminación del agente agresor persistente (Rodrigues y col., 2004). Existen varios tipos de
infección endodóntica que se asocian, generalmente, a
diversas condiciones clínicas: La infección del conducto radicular es la causa primaria de enfermedad periapical aguda o crónica. Las infecciones intrarradiculares secundarias o persistentes causan lesiones periapicales secundarias o crónicas, que (
\
pueden dar lugar a síntomas persistentes, exudado, o falla del tratamiento endodóntico. La infección extraradicular se caracteriza por la invasión microbiana de los tejidos perirradiculares inflamados, ocurriendo después de la infección intraradicular;
se
puede presentar dependiente o independiente de la infección intraradicular. La composición de la microbiota varía dependiendo de los tipos de infección y lesión periapical (Siqueira, 2002; Gomes y col., 2006).
La infección primaria del canal radicular es causada por microorganismos colonizantes del tejido pulpar necrótico. La microbiota usualmente implicada cambia, dependiendo del tiempo de la infección y del tipo de enfermedad periapical. Mientras ¡\
que un alto rango de especies microbianas está asociada con lesiones periapicales crónicas, un grupo más reducido de especies está asociado con enfermedades periapicales sintomáticas, tales como periodontitis apical aguda y absceso periapical agudo (Siqueira y col., 2002; Gomes y col., 2006; Gomes y col., 2007). En líneas generales, las infecciones primarias son polimicrobianas, con predominio de
bacterias anaerobias. Las especies predominantes en estas infecciones
pertenecen, generalmente, a los géneros Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Treponema, Peptostreptococcus, Eubacterium, y Campylobacter.
Los estreptococos anaerobios facultativos o microaerófilos también se encuentran
9
comúnmente en infecciones primarias (Siqueira y col., 2002; Gomes y col., 2006; Gomes y col., 2007). La evidencia actual sugiere que algunas bacterias anaerobias gramnegativas están asociadas,
principalmente,
a la etiología de las
lesiones
perirradiculares
sintomáticas, incluyendo casos de absceso perirradicular agudo. Sin embargo, la misma especie comúnmente encontrada asociada con síntomas, también se ha observado en casos asintomáticos. Diversos factores pueden explicar estos resultados. Algunas cepas patógenas pueden diferir en la virulencia. Tales diferencias, pueden ser la explicación del por qué algunas especies se encuentran en ambos casos (Siqueira y col., 2005).
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Las infecciones intrarradiculares secundarias son causadas por microorganismos que no estaban presentes en la infección primaria y que han penetrado el sistema de conductos durante el tratamiento, entre las citas o después de la conclusión del tratamiento endodóntico, si estos microorganismos son capaces de sobrevivir y colonizar el conducto radicular, se establece una infección secundaria (Bogen y Slots, 1999; Siqueira y col., 2002).
En la infección persistente del conducto radicular se encuentran involucrados microorganismos
que
de
cierta
manera
resistieron
los
procedimientos
de
desinfección del conducto y estaban presentes durante la infección primaria o la infección secundaria. La microbiota asociada compuesta,
a infecciones persistentes está
generalmente, por una sola especie o por lo menos, por un número
más bajo de especies, en comparación con las infecciones primarias. Las bacterias gram-positivas son las predominantes. También se pueden encontrar hongos en una proporción perceptiblemente más alta que en infecciones primarias (Siqueira y col., 2002; Jonson y col., 2006; Tomazinho y Ávila-Campos, 2007; Siqueira y col., 2007).
Las infecciones secundarias y persistentes son en su mayoría, clínicamente indistinguibles, a excepción de los casos donde los síntomas de la infección se
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presenten en un diente previamente no infectado (típico ejemplo de infección secundaria).
Las infecciones extrarradiculares pueden ser también primarias, secundarias, o persistentes. La forma más común de infección extrarradicular es el absceso periapical agudo. La fuente de infección es, generalmente, la infección intrarradicular. Este tipo de infección no ocurre muy frecuentemente. Algunos estudios han atribuido como posible causa de estas infecciones, a los fracasos del tratamiento endodóntico. Los microorganismos que se asocian con las infecciones extrarradiculares son pocos y dentro
de
ellos,
se encuentran algunas especies
de
Actinomyces,
y
Propionibacterium propionícus (Siqueira y col., 2002; Siquiera y col., 2005; Noguchi y
col., 2005) En la tabla 1 se resume la etiología de los distintos tipos de infecciones endodóntica.
Tabla
1.
Géneros de patógenos comúnmente asociados a las infecciones
endodónticas Infección primaria
Infección secundaria y
Infección
persistente
Extrarradicular
Lesión periapical
Absceso periapical
crónica
agudo
Bacteroides
Porphyromonas
Enterococcus
Actinomyces
Treponema
Treponema
Actinomyces
Propionibacterium
Prevote/la
Fusubacterium
Streptococcus
Porphyromonas
Bacteroides
Gandida
Fusubacterium
Prevotella
Propionibacterium
Peptostreptococcus
Streptococcus
Staphylococcus
Streptococcus
Peptostreptococcus
Pseudomonas
Eubacterium Actinomyces Campy/obacter
(Machado y col., 2000; Siqueira y col., 2000; Xia y col., 2000; Ró9as y col., 2001; Siqueira y col., 2001; Jung, 2001).
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Patogenia
El establecimiento dentro de un sitio adecuado es esencial para la sobrevivencia de los microorganismos y la óptima actividad biológica dentro del ambiente. Muchos mecanismos protectores del hospedero contra la infección microbiana no están presentes en el ambiente del conducto radicular.
Aunque la adherencia a las superficies puede no ser un requisito esencial para la colonización, los microorganismos que poseen la capacidad de unirse al esmalte dental pueden tener una ventaja ecológica. La invasión de la pulpa ocurre después de la necrosis del tejido. Por esta razón, la necesidad de las bacterias de poseer factores de virulencia es mínima. Esto es demostrado por el hecho de que la mayoría de los microorganismos orales que invaden la pulpa necrótica son patógenos oportunistas (Salyers y col., 1994). La sobrevivencia en el tejido necrótico de la pulpa no es difícil inicialmente para los microorganismos invasores, debido a la disponibilidad de nutrientes y a que las defensas del hospedero son mínimas en este ambiente. A medida que transcurre el tiempo, las presiones selectivas operan en el entorno del conducto radicular y consisten, sobre todo, en la tensión de oxígeno, el potencial redox, el pH, la temperatura, y el tipo de nutrientes disponibles. Solamente las especies microbianas que pueden adaptarse a las condiciones ambientales del sistema de conductos, serán seleccionadas y establecidas. Posteriormente, las interacciones microbianas positivas o negativas influenciarán la última composición de la microbiota del conducto
radicular.
La
enfermedad
periapical
ocurrirá
después
que
los
microorganismos y sus productos metabólicos afecten los tejidos periapicales. La magnitud de la respuesta del hospedero será directamente proporcional a la virulencia y al número de las células microbianas presentes (Henderson y col., 1996).
El daño del tejido causado por las bacterias es mediado por mecanismos directos e indirectos. Los efectos nocivos directos se deben a sus productos, tales como
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enzimas (colagenasa, hialuronidasa, condroitinasa, fosfatasa ácida), exotoxinas y metabolitos (butirato, propionato, amonio, poliaminas, indol, compuestos sulfurados). Además, los componentes bacterianos, tales como ácido teicoico, peptidoglicano, fimbrias, proteínas de membrana externa, cápsula, y lipopolisacáridos, estimulan el desarrollo de las reacciones inmunes del hospedero, capaces de causar la destrucción severa de los tejidos (Salyers y col., 1994; Henderson y col., 1996; Nair, 1996). Por ejemplo, los macrófagos pueden ser activados por los componentes bacterianos y ser estimulados para liberar mediadores químicos, tales como citoquinas (interleuquina -115, factor de necrosis tumoral, interleuquina-6) y prostaglandinas, los cuáles están implicados en la inducción de la reabsorción del hueso, observada comúnmente en las enfermedades periapicales crónicas (Henderson y col., 1996; Nair, 1996). También se ha demostrado que el ADN bacteriano puede activar macrófagos y células dendríticas,
accionando la producción de citoquinas
promotoras de
inflamación. Otro ejemplo refiere, que el daño del tejido está asociado con absceso periapical agudo (Heeg y col., 1998). La formación de radicales libres derivados del oxígeno, tales como peróxido de hidrógeno y superóxido, junto con la liberación de enzimas lisosomales por los polimorfonucleares neutrófilos, tales como elastasa, colagenasa y gelatinasa, inducen la destrucción de la matriz extracelular y conducen a la formación de pus. Los efectos destructivos indirectos, parecen ser más significativos en el daño del tejido asociado a las lesiones periapicales agudas y crónicas (Siqueira, 2002).
Por otra parte, ha surgido mucho interés científico en el proceso de formación de las biopelículas, debido a que se reconoce que el proceso de su formación es un aspecto importante en la mayoría de las enfermedades bacterianas, incluyendo osteomielitis, caries dental y diversas infecciones, como aquellas relacionadas con equipos médicos, del oído medio, de implantes oculares y del pulmón en pacientes con fibrosis quística (Donlan y col., 2002).
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El proceso de regulación para la producción de las biopelículas es cíclico y dinámico, donde las condiciones externas van a producir alteraciones en la expresión de los genes requeridos para su formación. Este proceso de formación conlleva a la modificación del microambiente de sus propios habitantes, los cuales deben sufrir alteraciones genéticas adicionales durante el proceso, fomentando la maduración de la biopelícula (Jefferson, 2004)
La capacidad de formación de las biopelículas no parece estar restringida a algún grupo específico de microorganismos y en efecto, se considera que bajo condiciones ambientales adecuadas todos los microorganismos son capaces de formarlas (Lasa l'
y col., 2005). Estas organizaciones microbianas se pueden formar en una amplia variedad de superficies, incluyendo tejidos vivos, aparatos médicos, sistemas de tuberías de agua potable o sistemas acuáticos naturales (Donlan, 2002).
La formación de la biopelícula ocurre en seis fases (Svensater y Bergenholtz, 2004): 1-
Adhesión inicial del microorganismo a la superficie
2-
Colonización
3-
Ce-adhesión o ce-agregación
4-
Crecimiento
5-
Maduración
6-
Desprendimiento de algunos microorganismos
Durante el transcurso de cada una de estas fases, los microorganismos presentan una expresión de genes bien regulada.
Los patógenos han desarrollado mecanismos que les permiten sobrevivir en un ambiente inhóspito, facilitándoles escapar de la acción de las células de defensa y del sistema del complemento, evitando la destrucción por parte de los fagocitos, causando inmunosupresión e induciendo la proteólisis de los anticuerpos (Scheie y col., 2004; Svensater y Bergenholtz, 2004).
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El modo de crecimiento en biopelículas es una estrategia de sobrevivencia de los microorganismos a las condiciones ambientales adversas (Siqueira, 2001; Georg e y col., 2005). Sin embargo, en lo que concierne a las infecciones endodónticas, el concepto de la biopelícula microbiana ha ganado atención limitada a pesar de que es probable que tenga implicaciones clínicas importantes, especialmente desde el punto de vista del tratamiento (Svensater y Bergenholtz, 2004). Dichas agregaciones bacterianas se han observado sobre las paredes de los conductos, sugiriendo que los mecanismos de formación de las biopelículas pueden \.
existir dentro del espacio del conducto radicular infectado (Nair, 1987; Molven y col., 1991 ). En efecto, las biopelículas han sido experimentalmente producidas en el interior de conductos de dientes extraídos con mezclas de bacterias anaerobias o cultivos puros de E. faeca/is (Distel y col., 2002; Clegg y col., 2006). También han sido señaladas como la causa de periodontitis apical resistente al tratamiento (Tronstad y col., 1990; Noiri y col., 2002; Ferreira y col., 2004). La precondición para la formación de la biopelícula en el conducto radicular varía dependiendo de la causa de la destrucción de la pulpa. Una isquemia por trauma, que conlleva a una necrosis, es probable que tenga pre-requisitos totalmente diferentes para la fase de colonización que aquellas pulpas expuestas por caries (Svensater y Bergenholtz, 2004). En este último caso, la infección del espacio pulpar puede sobrepasar las defensas y causar pulpitis, necrosis pulpar, e incluso, progresar a una enfermedad periapical inflamatoria (Lave, 2004). La necrosis provee un ambiente favorable para la proliferación microbiana debido a la presencia de residuos orgánicos o nutrientes, que van a actuar como sustrato, promoviendo un hábitat selectivo para que los microorganismos crezcan en biopelículas sésiles (Leonardo y col., 2002; Nair y col., 2005). El tipo y concentración de nutrientes, pH y productos tóxicos del metabolismo celular van a influir en el establecimiento de estas microcolonias dentro del conducto radicular (Molven y col., 1991).
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La lesión inflamatoria apical puede proveer el vehículo fluido por el cual los organismos planctónicos puedan invadir, multiplicarse y comenzar la adhesión a las paredes del conducto. La cavidad oral es una fuente abundante de microorganismos que pueden colonizar el sistema de conductos radiculares después de la pérdida de la vitalidad pulpar, sin embargo, hay poco conocimiento sobre la formación de las biopelículas en las infecciones endodónticas (Svensater y Bergenholtz, 2004; Chavez, 2007).
Tratamiento ! '
Debido a que los microorganismos se han reconocido como el factor etiológico primario en el desarrollo de las lesiones periapicales, el propósito del tratamiento endodóntico es la eliminación de la infección del sistema de conductos radiculares y la prevención de la reinfección, sin embargo, bajo ciertas circunstancias, el tratamiento endodóntico puede fallar en el cumplimiento de su objetivo (Noiri y col., 2002; Haapasalo y col., 2005; Haapasalo, 2006).
Existen factores locales y sistémicos que contribuyen al fracaso del tratamiento endodóntico (Nair y col., 1990). No obstante, el factor decisivo que afecta el resultado del tratamiento de conducto a largo plazo, es la persistencia de microorganismos dentro del sistema de conductos radiculares, lo que representa un riesgo latente para que el tratamiento fracase y se perpetúe la inflamación perirradicular (Siqueira, 2001; Siqueira y Lopes, 2001; Friedman y col., 2003; Farzaneh y col., 2004).
Las posibilidades de aumentar un resultado favorable con el tratamiento de conductos son altas, si se consigue que la infección sea erradicada efectivamente antes de que el sistema de conductos radiculares sea obturado, en caso contrario, los microorganismos se mantendrán viables en el conducto, existiendo un riesgo constante de que la inflamación periapical sea perpetuada (Siqueira, 2001 ). La biopelícula proporciona resistencia a sus habitantes, por ejemplo, los patógenos
16
viviendo en estos agregados microbianos, resisten las fuerzas físicas, así como también a las producidas por el flujo de sangre o por la acción de limpieza de la saliva. De igual manera, pueden soportar privaciones de nutrientes, cambios de pH y radicales de oxígeno, mejor que los organismos planctónicos; además de resistir a la fagocitosis; incluso, estos fagocitos que intentan atacar, pueden causar más daño sobre los tejidos circundantes que a la biopelícula como tal (Costerton, 1987; Jefferson, 2004).
Sin embargo, el principal problema con la biopelícula es su conocida resistencia a los antimicrobianos.
La
resistencia se define como la habilidad
que tiene un
microorganismo de crecer en presencia de un nivel elevado de antimicrobiano, incluyendo en este término, a los antibióticos y los desinfectantes (Gilbert y col., 1997; Donlan, 2002). En este sentido, se ha señalado que la concentración necesaria de un agente antimicrobiano para matar a microorganismos planctónicos, debe ser aumentada de 1O a 1000 veces para tener la misma eficacia sobre los microorganismos dentro de la biopelícula (Mah, 2001).
Estas organizaciones microbianas proveen un nicho ideal para el intercambio de ADN extracromosomal (plásmidos), facilitándose así, el paso de determinantes de la resistencia antibiótica, agravando aún más la situación. El mecanismo utilizado para la transferencia de plásmidos es la conjugación, la cual ocurre en una frecuencia mucho mayor entre células creciendo en biopelículas que entre células planctónicas, debido a la gran cercanía entre las células (Svensater y Bergenholtz, 2004).
La característica que mejor distingue las infecciones crónicas relacionadas con biopelículas, es su respuesta a los tratamientos antibióticos. Mientras que las infecciones agudas pueden ser eliminadas tras un breve tratamiento antibiótico, las infecciones por biopelículas,
normalmente no consiguen
ser completamente
eliminadas y producen episodios recurrentes, siendo menos susceptibles a los antimicrobianos y más resistentes a los mecanismos de defensa (Scheie y col., 2004; Lasa y col., 2005).
17
Por otra parte, la microbiota del conducto radicular encontrada en dientes no tratados, difiere de aquella encontrada después del fracaso del tratamiento, teniendo repercusión en la tasa de éxito encontrada para ambos casos (Friedman y col., 2003; Farzaneh y col., 2004) Las pulpas necróticas presentan una microbiota polimicrobiana, caracterizada por una amplia variedad de combinaciones bacterianas, promediando entre cuatro a siete especies por conducto, con predominio de bacterias anaerobias, en iguales proporciones de bacterias grampositivas y gramnegativas (Sundqvist, 1976, Seasone
y col., 2008).
En contraste,
la microbiota detectada en dientes previamente tratados con
periodontitis apical crónica, comprende una o dos especies, con predominio de microorganismos
grampositivos
como
E.
faecalis,
Actinomyces
spp.
y
Propionibacterium spp., en aproximadamente iguales proporciones de facultativos y anaerobios estrictos. También se ha descrito la presencia de especies fúngicas como Gandida spp (Siqueira, 2007; Tomazinho, 2007; Gomes, 2007). Esta discrepancia en la composición de la microbiota puede ser el resultado a su vez de las diferencias en la presión selectiva que existe en pulpas necróticas infectadas contra la que existe en conductos previamente tratados, además, se considera que las bacterias anaerobias facultativas son consideradas más difíciles de eliminar del conducto infectado debido a que son menos susceptibles a los antimicrobianos que los anaerobios obligados (Hancock y col., 2001; Chavez, 2004 ).
Si bien es importante conocer la composición microbiana del conducto, en vista de su repercusión sobre el éxito del tratamiento, las muestras microbiológicas usualmente solo permiten el aislamiento de microorganismos en el conducto principal, siendo improbable la toma de muestras más allá del punto final de la preparación y obturación, conductos laterales, ramificaciones apicales, istmos y túbulos dentinarios. Los microorganismos pueden encontrarse en estas zonas inaccesibles formando
18
biopelículas, lo que puede conllevar a la persistencia o desarrollo de la periodontitis apical (Wu y col., 2006).
El primer paso importante en la eliminación de los microorganismos en el conducto radicular es la irrigación con soluciones bactericidas efectivas (Bríto y col., 2009). Para este propósito, se han utilizado diversas soluciones irrigantes, tales como hipoclorito
de
sodio,
clorhexidina,
derivados
del
yodo,
ácido
etilenendiaminotetraacetico (EDTA), ácido cítrico, agua oxigenada y Biopure MTAD® (Haapasalo y col., 2005; Haapasalo, 2006; Portenier y col., 2006). La limpieza químico-mecánica es una estrategia de tratamiento en la cual el agente (
\
irrigante posee una función antimicrobiana y de disolución de tejidos, para minimizar la cantidad de dentina infectada, remanente pulpar y eliminar el mayor número de microorganismos contenidos dentro del sistema de conducto radicular (Waltimo y col., 2004).
Los microorganismos dentro de las biopelículas responden de manera diferente, dependiendo de su fase de crecimiento, la dosis y la frecuencia de exposición al agente antimícrobíano (Spratt y col., 2001; Duggan y col., 2007). Es importante el uso de un agente, que no solo tenga la cualidad de eliminar los microorganismos viables, sino también, que sea capaz de eliminar físicamente la biopelícula y por lo tanto, eliminar a las bacterias y sus componentes antígénicos como los lípopolisacáridos, peptidoglicanos y ácido lipoteicoico, que a pesar de que no este viable, el microorganismo puede desencadenar y perpetuar un proceso inflamatorio por inducir la liberación de mediadores de la inflamación (Tronstad y col., 1990). Incluso, la presencia de biopelículas remanentes no viables, pueden comprometer la obturación tridimensional del conducto, sobre todo, sí se va a usar un material de obturación a base de resina, ya que la bíopelícula va a interferir con la adhesión a las paredes del conducto (Ciegg y col., 2006).
MATERIALES Y MÉTODOS Población y Muestra: Estuvo representada por los pacientes adultos que acudieron a la Cátedra de Endodoncia de la Facultad de Odontología de La Universidad de Los Andes, en el periodo comprendido entre marzo y julio del año 2009. Se estudiaron 32 pacientes con diagnóstico de infección endodóntica primaria. Los datos clínicoepidemiológicos se recolectaron a través de la aplicación de una encuesta a cada paciente con diagnóstico de infección endodóntica primaria, que autorizó por escrito su voluntad de participar en el estudio. Criterios de Inclusión: Se estudiaron los pacientes con diagnóstico de infección endodóntica primaria, sin enfermedad periodontal. Criterios de Exclusión: Se excluyeron del estudio todos los pacientes que recibieron tratamiento antibiótico durante los últimos 3 meses, y también, los que presentaban alguna enfermedad sistémica.
Estudio Microbiológico
Recolección de las muestras A cada diente seleccionado se le realizó aislamiento absoluto con goma dique, la zona circundante del diente se limpió con peróxido de hidrógeno al 30%. Después del acceso coronal, el diente se irrigó con solución salina al 0,9% y la muestra se tomó insertando en el conducto radicular 4 puntas de papel estéril durante 60 segundos. Las puntas se colocaron en 3 mi de medio de transporte RTF (Reduced Transport Fluid), propuesto por Syed y Loesche (1972), las muestras se procesaron dentro de las 4 horas siguientes de haber sido colectadas.
Cultivo de la muestra Las muestras colocadas en el medio de transporte RTF se mezclaron vigorosamente en agitador mecánico y se sembraron en placas agar base sangre (HIMEDIA, India)
20 al 5% y agar bilis esculina (HIMEDIA, India) y se incubaron a 37°C durante 48 horas en microaerofilia. También se inocularon placas de agar sangre base Schaedler selectivo (HIMEDIA, India) (ácido nalidíxico 1Omg/L y ácido nalidíxico 1Omg/Lvancomicina 2,5mg/L) y no selectivo. Dichas placas se incubaron durante 5 a ?días a 37°C en condiciones anaeróbicas utilizando sobres generadores de COz e Hz (Anaerocult® A, Merck, Alemania). Las colonias presuntivas de Enterococcus se subcultivaron en agar infusión cerebro corazón (BHI) (HIMEDIA, India) y se identificaron mediante las pruebas convencionales descritas por Murray y col. (2007), y la Galería STREPTO-SYSTEM 9R (Liofilchem, Italia), siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Las colonias presuntivas de bacterias anaerobias se sub-cultivaron en \.1
agar sangre base Columbia (HIMEDIA, India). La identificación de estas bacterias se realizó mediante la galería RAPID ID 32A (BioMérieux, Francia), siguiendo las instrucciones de la casa comercial (Esquema 1 y 2).
Determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de las cepas de E. faecalis aisladas. A las cepas de E. faecalis aisladas se les realizaron pruebas de susceptibilidad antimicrobiana ante varios agentes antimicrobianos: Eritromicina 15¡.Jg, Vancomicina 30¡.Jg, Doxiciclina 30¡.Jg, Ciprofloxacina 5¡.Jg (BBL, USA) Ampicilina 10¡.Jg, Tetraciclina 30 ¡.Jg (Liofilchem, Italia), por el método de difusión del disco en agar Müeller Hinton (Kirby Bauer) siguiendo las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards lnstitute (CLSI, 2009).
Determinación de la capacidad de formar biopelícula por parte de las cepas aisladas
Cepas de E. faecalis Las cepas de E. faecalís aisladas se cultivaron por separado en caldo Tripticasa soya (TSB) (BBL, USA), durante 18 horas, una vez transcurrido este tiempo se preparó una suspensión de cada cepa estandarizada al patrón 0,5 de McFarland (1 x1 06
21
UFC). La suspensión (200 ~1) se agregó en cada pozo de una placa de poliestireno de 96 pozos. En 3 pozos solo se agregó TSB (control negativo). La placa se incubó durante 24 horas 3rC, luego se procedió a lavar cada pozo con solución salina fosfato estéril, se dejó secar al aire y se tiñó con cristal violeta al 0,01% durante 30 minutos, y se lavó nuevamente. Se examinó visualmente
la
presencia de un anillo violeta en el pozo. Luego se añadió etanol al 95% y
se
cuantificó la cantidad de biopelícula formada mediante la medición de la densidad óptica a 490 nm del cristal violeta disuelto en el alcohol, en un lector de ELISA (Microplate Manager Bio-Rad Laboratories, lnc. Modelo 550). El ensayo se realizó por triplicado en tres oportunidades diferentes (Passerini y col., 2009) (Esquema 3). El punto corte se definió como tres desviaciones estándar por encima de la media de la DO del control.
Cepas de bacterias anaerobias
(P. intermedia, P. gingivalis, P. endodontalis, F.
nucletum). Las cepas de P. intermedia, P. gingivalis, P. endodontalis, F. nucletum aisladas en el estudio se cultivaron por separado en placas de agar sangre base Schaedler, durante 5 días a 37° en condiciones de anaerobiosis. Luego se preparó una suspensión de cada cepa estandarizada al patrón 0,5 de McFarland en caldo Schaedler (1x10 6 UFC). La suspensión (200 ~1) se agregó en cada pozo de una placa de poliestireno de 96 pozos. En 3 pozos solo se agregó caldo Schadler (control negativo). La placa se incubó durante durante 48 horas a 37°C, en condiciones de anaerobiosis, luego se procedió a lavar cada pozo con agua destilada estéril, se dejó secar al aire y se tiñó con safranina al 0,25% durante 30 minutos, se lavó nuevamente. Se examinó visualmente la presencia de un anillo rosado en el pozo. Luego se añadió etanol al 95% y se cuantificó la cantidad de biopelícula formada mediante la medición de la densidad óptica a 490 nm de la safranina disuelta en el alcohol, en un lector de ELISA (Microplate Manager Bio-Rad Laboratories, lnc. Modelo 550). El ensayo se realizó por triplicado en tres oportunidades diferentes.
22
Con cada grupo de bacterias se probaron los dos colorantes (cristal violeta y safranina), resultando cristal violeta más adecuado para la visualización de la biopelícula de E. faecalis y safranina para las bacterias anaerobias (Davey y Duncan, 2006).
El punto corte se definió como tres desviaciones estándar por encima de la media de la DO del control.
23
4horu
60scg.
-70"C
ASCH l.
~
1
e:=:> e::=>
ASCH 107
ASCH 108 ASS%
ABE
ASCH
AS5%
ASCH107
ABE
ASCH108
5-7 días 37oC
Esquema 1. Toma de la muestra, cultivo e incubación.
24
Bacterias anaerobia!!
--
II'Ú ¿,.;. - -
ASC
E.faecalis BHI
l
,
1 1
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r
('·
Esquema 2. Identificación de las cepas aisladas.
25
L
C..Wo de 11 horas en TSB -
~
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--
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J
M';
1 Estandarizado a1x 1f UR:
200fd
J 1, '
Secuanlicó la cantidad de biapelícula Midiendo la densidad óptica a490 nm del
TSBsin incaar como control
Cris1al violeta diSueiiD en alcohol con un ledory visualmente
1
1
1 1
~~.s~-==---=---=a---=mm=-mm~)
24horas 37'C
Se lavó con PBS yse tiñó con cristal violeta 0,01 % 1 30min. ·
\
[ ZJ
Esquema 3. Formación de biopelícula Enterococcus faecalis (Passerini y col., 2009)
26
[PB3agor-:r-~~J 1 Estandarizado a 1x1D' UFC 200~, en caldo Schaedler.
1
Se cuantificó la cantidad de biopelícaA 11iciendo la densidad óptica a 490 111 de la sat'ranlna disuelta en aleollol, COIIIIIIec:tór y Yisuallllelde
caldo Schaecller sin J inoeular COIIO control .
1 41 horas 3.,-c (anaerobiosis)
1 Se lavó con agua destilada, se dejó secar al aire y tiñó con satanina 0¡2:5% 3D nin.
1 se laVó yse aftacló etanol a1 m
Esquema 4. Formación de biopelícula P. gingivalis, P. endodontalis, P.
intermedia y F. nuc/eatum (Davey y Duncan, 2006).
27 Determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de las células planctónicas
y organizadas en biopelícula de E. faecalis
ante la doxiciclina y el Biopure
MTAD.
En este ensayo se utilizaron las 4 cepas de E. faecalis aisladas en el estudio, 1 cepa de E. faecalis de origen vaginal y 2 cepas ATCC (E faecalis ATCC 29212 y Staphy/ococcus aureus ATCC 25923) como controles.
Acción de la Doxiciclina sobre las células planctónicas. Se probaron concentraciones de clorhidrato monohidratado de doxiciclina (Lab. Valmorca Mérida, Venezuela) entre 1 ¡.Jg/ml, y 64 ¡.Jg/ml (CLSI, 2009). Las cepas se cultivaron en agar BHI (HIMEDIA, India) y se incubaron a 37°C durante 18 horas en condiciones de aerobiosis. Posteriormente, se prepararon los inóculos en caldo Müeller Hinton ajustados al patrón 0,5 de McFarland. Se usaron placas de poliestireno de 96 pozos, en cada pozo se colocaron 50 !JI de cada dilución del antibiótico y luego se agregaron 50
1-11
del inóculo. Se utilizó un
control negativo de cada dilución (caldo MH +antibiótico) y un control positivo de cada cepa (Inoculo + caldo MH). Las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C en condiciones de aerobiosis, envueltas en papel parafilm. Luego de transcurridas las 24 horas, se observó a simple vista la presencia de desarrollo bacteriano en cada uno de los pozos. También se midió la absorbancia en un lector de ELISA (Microplate Manager Bio-Rad Laboratories, lnc. Modelo 550), a una longitud de onda de 655 nm. Para comprobar el crecimiento bacteriano o la ausencia del mismo en cada uno de los pozos, se tomó una asada y de cada pozo y se cultivo en agar sangre y agar bilis esculina a 37°C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis (Passerini y col., 2009) (Esquema 5).
28 Acción del Biopure MTAD® sobre las células planctónicas. Se probaron concentraciones de Biopure MTAD® (DENTSPLAY Tulsa Dental) dobles entre 1 1-Jg/ml, y 128 1-Jg/ml. Las cepas se cultivaron en agar BHI (HIMEDIA, India) y se incubaron a 37°C durante 18 horas en condiciones de aerobiosis. Posteriormente, se prepararon los inóculos en caldo Müeller Hinton, ajustados al patrón 0,5 de McFarland. Se usaron placas de poliestireno de 96 pozos, en cada pozo se colocaron 50 !JI de cada dilución del antibiótico y luego se agregaron 50 !JI del inóculo. Se utilizó un control negativo de cada dilución (caldo MH + antibiótico) y un control positivo de cada cepa (lnóculo + caldo MH). Las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis, envueltas en papel parafilm. Luego de transcurridas las 24 horas, se observó a simple vista la presencia de desarrollo bacteriano en cada uno de los pozos. También se midió la absorbancia en un lector de ELISA (Microplate Manager Bio-Rad Laboratories, lnc. Modelo 550), a una longitud de onda de 655 nm. Para comprobar el crecimiento
bacteriano o la
ausencia del mismo en cada uno de los pozos, se tomó una asada de cada pozo y se cultivo en agar sangre y agar bilis esculina a 37°C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis (Passerini y col., 2009) (Esquema 5).
Acción de la Doxiciclina sobre las células de E. faecalis organizadas en biopelícula. Se probaron concentraciones de clorhidrato monohidratado de doxiciclina (Lab. ';
Valmorca Mérida, Venezuela) dobles entre 1 1-Jg/ml, y 64 1-Jg/ml (CLSI, 2009). Las cepas se cultivaron en agar BHI y se incubaron a 37°C durante 18 horas en condiciones de aerobiosis. Posteriormente, se prepararon los inóculos en caldo Müeller Hinton, ajustados al 0,5 del patrón de McFarland. Se usaron placas de poliestireno de 96 pozos, en cada pozo se colocaron 75 ¡..¡1 del inóculo. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis, envueltas en papel parafilm. Se observó a simple vista la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano. Luego se descartó el medio de cultivo y bajo estrictas condiciones de asepsia se lavaron
29 cada uno de los pozos con solución salina fosfato estéril y se agregaron 1001-11 de cada concentración del antibiótico, se incubó nuevamente a 37°C durante 18 horas. Luego de transcurridas las 18 horas, se observó a simple vista la viabilidad de las biopelículas de acuerdo a la presencia de desarrollo bacteriano en cada uno de los pozos. También se midió la absorbancia en un lector de ELISA (Microplate Manager Bio-Rad Laboratories, lnc. Modelo 550) a una longitud de onda de 655 nm (Esquema 6.)
Para comprobar el crecimiento bacteriano o la ausencia del mismo en cada uno de los pozos, se tomó una asada de cada pozo y se cultivó en agar sangre y agar bilis esculina a 37°C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis (Passerini y col., 2009). 1
Acción del Biopure MTAD® sobre las células de E. faecalis organizadas en biopelícula. Se probaron concentraciones de Biopure MTAD® (DENTSPLAY Tulsa Dental) entre 1 ¡Jg/ml, y 128 ¡Jg/ml. Las cepas se cultivaron en agar BHI y se incubaron a 37°C durante 18 horas en condiciones de aerobiosis. Posteriormente, se prepararon los inóculos en caldo Müeller Hinton, ajustados al patrón 0,5 de McFarland. Se usaron placas de poliestireno de 96 pozos, en cada pozo se colocaron 75 !JI del inóculo. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis, envueltas en papel parafilm. Se observó a simple vista la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano. Luego se descartó el medio de cultivo y bajo estrictas condiciones de asepsia se lavaron cada uno de los pozos con solución salina fosfato estéril y se agregaron 100¡JI de cada concentración del irrigante y se incubó nuevamente a 37°C durante 18 horas. Luego de transcurridas las 18 horas, se observó visualmente la viabilidad de las biopelículas de acuerdo a la presencia de desarrollo bacteriano en cada uno de los pozos. También se midió la absorbancia en un lector de ELISA (Microplate Manager Bio-Rad Laboratories, lnc. Modelo 550) a una longitud de onda de 655 nm.
30
Para comprobar el crecimiento bacteriano o la ausencia del mismo en cada uno de los pozos, se tomó una asada de cada pozo y se cultivo en agar sangre y agar bilis esculina a 37°C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis (Passerini y col., 2009) (Esquema 6). La formación de biopelícula por las bacterias anaerobias y E. faecalis, se realizó por triplicado en tres oportunidades diferentes. Los resultados de cada prueba se compararon para determinar la reproducibilidad ínter-ensayo. Para comparar los resultados de la concentración inhibitoria mínima se calculó el respectivo valor de CIM so de cada antimicrobiano.
31
BID
0,5 Mcfar1and
1 caldo+ antimicrobiano caldo+ inóculo 50~1 caldo + antimicrobiano 50Jll inóculo
24horas 37"C
655nm
AS 5%
ABE
Esquema 5. Determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de las células planctónicas de E. faecalis ante la doxiciclina y el Biopure MTAD (Passerini y col., 2009).
32
AS 5%
ABE
BHI
24 horns 37DC
!. ... 0,5 Mcfarland
1 Se lavó con solución salina fosfato estéril 75pl inóculo 24ho!as3PC
Esquema 6. Determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de las células organizadas en biopelícula de E. faecalis ante la doxiciclina y el Biopure MTAD (Passerini y col., 2009).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el procesamiento y análisis de los datos se utilizó estadística descriptiva. Los resultados fueron analizados mediante la aplicación de la prueba Chi cuadrado o prueba de independencia, donde p s; 0,05 se consideró con significancia estadística. Para analizar las diferencias existentes entre Biopure MTAD®, y la Doxiciclina se utilizó el Test de Student, donde p s; 0,05 se consideró con significancia estadística.
\•
RESULTADOS
Se estudiaron un total de 32 pacientes con infección endodóntica primaria que cumplieron con los criterios de inclusión antes señalados, a quienes se les tomaron las muestras de los canales radiculares infectados, de los cuales, el53,13% (17/32) eran del género femenino con un promedio de edad de 18,71 (18-56) y 46,88% (15/32) pertenecían al género masculino con un promedio de edad de 26,07 (15-45). De acuerdo al nivel de instrucción, la muestra poblacional se categorizó en 4 grupos: primaria 9,38%, (3/32) básica 9,38% (3/32), diversificada 50% (16/32) y universitaria 31,25% (1 0/32) (Figura 3). La mayoría de los pacientes eran estudiantes 34,38% (11/32), 25% (8/32) comerciantes, 18,77% (6/32) profesionales (Tabla 2).
De las 32 muestras de conductos radiculares procesadas, solo hubo desarrollo bacteriano en 18 (56,25%) (Figura 4). En el 77,80% (14/18) de las muestras se aislaron bacterias anaerobias, con predominio de P. endodontalis como única especie o en combinación con otros anaerobios o E. faecalis. En 22,22% (4/18) de las muestras positivas hubo desarrollo de E. faecalis en combinación con bacterias anaerobias (Figura 4). E. faecalis se aisló en 75% (3/4) en combinación con P. endodontalis, en 25% (1/4)
combinado con P. intermedia (Tabla 3) . .,. ~
Se aisló un total de 29 especies, de las cuales, 71,37% (12/29) pertenecian a P. endodontalis, 17,24% (5/29) a P. intermedia, 17,24% (5/29) a P. gingivalis, 10,34%
(3/29) a F. nuc/eatum, 13,74% (4/29) a E. faecalis (Figura 5). El presente trabajo reveló que la infección por E. faecalis y bacterias anaerobias estuvo asociada con lesiones perirradiculares, dolor dental y ausencia de vitalidad pulpar, sin embargo, no hubo relación estadísticamente significativa entre el aislamiento positivo y las características clínicas estudiadas (Tabla 4).
35 En relación al resultado de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana realizadas a las cepas de E. faecalis aisladas, se encontró que la mayoría de las cepas (75%) fue ~-lactámicos,
sensible a los
50% resistentes a las quinolonas y a los macrólidos,
100% presentaron resistencia intermedia a la doxiciclina, y 50% a la tetraciclina, 75% fue sensible a vancomicina (Figura 6).
El 100% (5/5) de las cepas estudiadas de E. faecalis evidenciaron la capacidad de formar biopelícula (Figura 7). En cuanto a las cepas de bacterias anaerobias, se observó la capacidad de formar biopelícula en el 66,66% (8/12) de las cepas estudiadas (Figura 8), siendo las cepas de P. endodontalis las que evidenciaron en mayor porcentaje (75%) dicha característica.
Con respecto a la susceptibilidad antimicrobiana de las cepas de E. faecalis, ante Doxiciclina y Biopure MTAD®, se observó que las células en fase planctónica fueron más sensibles que las organizadas en biopelícula ante los 2 agentes ensayados. La
CIM 50 de
doxiciclina
y Biopure
MTAD® fue
de
16~g/ml
y
8~g/ml,
respectivamente ante las células planctónicas, mientras que ante las células organizadas en biopelícula, la CIM 50 doxiciclina y Biopure MTAD® fue de y
16-32~g/ml,
32-64~g/ml,
respectivamente (Tabla 5).
El Biopure MTAD® fue más efectivo que la doxiciclina tanto para eliminar las células de E. faecalis en su fase planctónica, como sobre las células organizadas en biopelícula, aunque sin una diferencia estadísticamente significativa (Tabla 5).
No se encontró reproducibilidad de los resultados de las pruebas sensibilidad antimicrobiana expresados en la medición de la densidad óptica (DO verificar el desarrollo o no de E. iaecalis durante la prueba.
655
nm) para
36
B Primaria
s
Basica Diversificada
B Universitario
\.'
Figura 3. Distribución de la muestra poblacional según el grado de instrucción.
37
Tabla 2. Distribución de los pacientes según la ocupación.
1
Ocupación
'
-'
(%)
Abogado
1
3,13
Arquitecto
1
3,13
Ingeniero
1
3,13
Contador Público
1
3,13
Docente
2
6,25
Labores del Hogar
4
12.5
Comerciante
8
25,0
Estudiante
11
34,38
Otras
3
9,38
Total
32
100,0
38
s
43,75%
Anaerobios
liil Anaerobios
+ E. faecalis
77,77%
Negativo
56,25%
''
Figura 4. Resultado del cultivo de la muestra de los conductos radiculares con infección endodóntica primaria.
39
Tabla 3. Frecuencia de aislamiento de la combinación de E. faecalis y de bacterias anaerobias aisladas de los conductos radiculares.
Especies aisladas
no pacientes
(%)
Enterococcus faecalis + Prevotel/a intermedia
1
5,56
Enterococcus faeca/is + Porphyromonas endodontalis
3
16,66
P. endodontalis
5
27,77
P. intermedia
1
5,56
P. gingivalis
2
11 '11
F. nuc/eatum
1
5,56
P. endodontalis + P. intermedia+ F. nuc/eatum
1
5,56
P. endodontalis + P. gingiva/is
2
11 '11
P. endodontalis + P. intermedia
1
5,56
P. endodontalis +P. gingivalis + F. nuc/eatum
1
5,56
Total
18
100
40
60
.. ta
> so ta
"!
.!! 40 (.)
eQ)
:S (.) Q)
... u.
30
20
Figura 5. Especies bacterianas aisladas de los pacientes con infecciones endodónticas primarias.
41
Tabla 4. Relación entre el aislamiento de bacterias y las características clínicas de los pacientes con infecciones endodónticas primarias. Características Clínicas Si
DOLOR DENTAL
(%)
n
Total
No n
(%)
(%)
n
Aislamiento de bacterias Si
11,00
34,38
7,00
21,88
18,00
56,25
No
5,00
15,63
9,00
28,13
14,00
43,75
16,00
50,00
16,00
50,00
32,00
100,00
Total VITALIDAD PULPAR
Si
(%)
n
Total
No n
(%)
(%)
n
Aislamiento de bacterias Si
6,00
18,75
12,00
37,50
18,00
56,25
No
7,00
21,88
7,00
21,88
14,00
43,75
13,00
40,66
19,00
59,37
32,00
100,00
Total
\
'
PROCESO PERIAPICAL
Si n
Total
No
(%)
n
(%)
n
(%)
Aislamiento de bacterias Si
16,00
50,00
2,00
6,25
18,00
56,25
No
9,00
28,13
5,00
15,63
14,00
43,75
25,00
78,13
7,00
21,88
32,00
100,00
Total
42
100 90 80 -
70
"'C
60
'te.
Rl
:2
:e ·.¡:;
50
~
40
a.
S
"'
DR
::l
"' 30 20
10
o Eritromicina Ciprofloxacina Vancomicina
Ampicilina
Tetraciclina
Doxiciclina
Agente antimicrobiano
Figura 6. Susceptibilidad antimicrobiana de las cepas de Enterococcus faeca/is aisladas.
43
E e
o "'..,.
oo
-
0,1
E. feacalis 04
0,09
1511 E. feacalis 20
0,08
E. feacalis 30 0,07 E. feacalis SV
ns
:;
·-c. u (jj
o
:a
Ea E. feacalis 24
0,06
- Cont rol negativo
0,05
cu
0,04
e
0,03
"C
·o
·u ns
...
E o
0,02 0,01
o
Figura 7. Actividad formadora de biopelícula de las cepas de E. faecalis aisladas de infecciones endodónticas primarias. Después de 24 horas de cultivo se evaluó la masa de la biopelícula organizada mediante la tinción con cristal violeta.
El error en las barras indica la desviación estándar. Después de 24 horas de cultivo se evaluó la masa de la biopelícula organizada mediante la tinción con safranina. El error en las barras indica la desviación estándar. El punto corte se defin ió como tres desviaciones estándar por encima de la media de la DOc.
SV: cepa aislada de secreción vaginal.
44
0,1 0,09
·-
E e:
0,08
¡
B P. endodontalis 1. 7 El P. intermedia 1.17
P. intermedia 5.3 B P. gingivalis 15.5 B P. endodontalis 16.2
o
e
en
oe""
0,07
ni
0,06
"S u
P. intermedia 17.2 P. endodontalis 17.4 P. gingivalis 19.1
,_
F. nuc/eatum 19.3
Qj
a. 0,05
o
:a QJ
"'CC
s 0,04
e:
•O
·o ni
P. intermedia 24.2
0,03
P. endodontalis 28.7 P. endodontalis 30.1 Control negativo
E ...
o .....
0,02 0,01
o \, .
Figura 8. Actividad formadora de biopelícula de las cepas de bacterias anaerobias aisladas de infecciones endodónticas primarias. Después de 24 horas de cultivo se evaluó la masa de la biopelícula organizada mediante la tinción con safranina. El error en las barras indica la desviación estándar. El punto corte se definió como tres desviaciones estándar por encima de la media de la DOc.
45
Tabla 5. Susceptibilidad antimicrobiana de las células de E. faecalis en estado planctónico y organizadas en biopelícula ante doxiciclina y Biopure MTAD®.
Cepas Células planctónicas
Biopelícula
Doxiclcllna-
Biopure MTAD®
ooxlcicliria
Biopure MTAD®
CIM IJg/ml
CIM IJg/ml
CIM ~o~g/ml
CIM IJg/ml
E. faecalis ATCC 29212
4
4
4
4
S. aureus ATCC 25923
2
2
4
2
E. faecalis 04
8
4
32
16
E. faeca/is 20
16
8
64
32
E. faeca/is 24
16
8
32
16
E. faecalis 30
16
8
64
16
E. faecalis SV
4
4
8
8
16
8
32-64
16-32
CIMsoiJg/ml
Punto corte doxiciclina
SS4 1= 8
R i:: 16 (CLSI, 2009)
DISCUSIÓN Las bacterias presentes en los conductos radiculares infectados comprenden un número restringido de especies, comparadas con el total de la microbiota bucal. Las bacterias anaerobias y E. faeca/is constituyen un pequeño porcentaje de esas especies microbianas (Moore y col., 1994). En el presente estudio se determinó el papel de las bacterias anaerobias gramnegativas y
E.
faecalis como agentes etiológicos de las infecciones
endodónticas primarias en los pacientes que acudieron a la Facultad de Odontología de La Universidad de Los Andes. Se encontró desarrollo bacteriano en el 56,25% \;
(18/32) de los conductos analizados. En el presente trabajo, E. faecalis se aisló en combinación con bacterias anaerobias en un 22,22%, asociado con infecciones endodónticas primarias. Resultados similares obtuvieron Gomes y col. (2006), quienes
aislaron E. faecalis en 24%. Otros autores también han reportado su
asociación con una gran variedad de bacterias aerobias y anaerobias involucradas en distintas infecciones endodónticas (Reynaud y col., 2007; Salah y col., 2008). El canal radicular infectado no tratado, es un ambiente que provee microorganismos con requerimientos nutricionales diversos que pueden variar en el tiempo. Los nutrientes disponibles son péptidos, principalmente, y amino ácidos, los cuales favorecen las especies proteolíticas como los anaerobios ('
(Figdor y Sundqvist.,
2007). Mientras que el crecimiento de bacterias facultativas, particularmente E. faecalis, es más frecuente en infecciones endodónticas secundarias (Gomes y col.,
2006). En estos casos, E. faecalis pudo haber estado presente en las pulpas necróticas y haber sobrevivido a los procedimientos mecánicos y a los medicamentos intracanal, los cuales originan cambios ecológicos en el canal radicular (Gomes y col., 2003). Siqueira y Rocas (2005), recopilaron una serie de datos en los cuales se evaluó la microbiota presente en infecciones endodónticas primarias, tomando en cuenta la sintomatología
presente.
Especies
de
microorganismos
anaerobios
(como
47
Pseudoramibacter a/actolyticus, P. endodontalis, Treponema dentíco/a, Dialister pneumosintes, Filifactor alocis, Tannerel/a forsythia), entre otros, fueron los que se
encontraron en mayor porcentaje en las infecciones endodónticas primarias. Cepas de E. faecalis también fueron observadas en dichos estudios. Los porcentajes de prevalencia variaron desde 5% en infecciones endodónticas asociadas con lesiones perirradiculares asintomáticas hasta un 30%, aproximadamente, en infecciones endodónticas asociadas con periodontitis apical aguda. En general, E. faeca/is estuvo presente en 18% (9/50) de los casos con infección endodóntica primaria (Rocas y col., 2007). En el presente trabajo se detectó E. faecalis más frecuentemente de pacientes con infecciones endodónticas primarias,
sintomáticos, no profesionales y que presentaban lesión perirradicular, aunque sin significancia estadística. Por otra parte, Rocas y col. (2007), utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para la detección de E. faecalis en infecciones endodónticas primarias, lo encontraron
asociado
33%
(7/21)
con
lesiones
perirradiculares
crónicas
asintomáticas, en 10% (1/1 O) con periodontitis apical aguda y en 5% (1/19) con abscesos perirradiculares agudos. Las combinaciones bacterianas en los canales radiculares pueden ser más patógenas que las cepas individuales, por lo que es importante determinar el papel de las bacterias en el desarrollo de signos y síntomas clínicos, así como la asociación de cada microorganismo con cada uno de los otros (Fouad y col., 2002). En el presente trabajo, los bacilos gramnegativos anaerobios se aislaron más frecuentemente de pacientes con proceso periapical sintomáticos(50%) (Tabla 4), pero sin una relación estadísticamente significativa. Siqueira y col. (2002), Seasone y col. (2008) y Jacinto y col. (2008), también sugieren que bacterias anaerobias como F. nucleatum están presentes en casos sintomáticos.
La presencia de bacilos gramnegativos anaerobios pigmentados en infecciones endodónticas sugiere algún papel de estas bacterias en la etiología y perpetuación
48
de la infección perirradicular. En el presente trabajo, tanto Porphyromonas spp. como Prevotel/a spp. y Fusobacterium spp se encontraron asociados, predominando la
asociación P. endodontalis con otros anaerobios. En cinco casos, aparentemente P. endodontalis se aisló como única especie endodontopatógena, probablemente otras
bacterias no se desarrollaron por ser más exigentes o por ser no cultivables. P. endodonta/is ha sido casi exclusivamente asociada a infecciones endodónticas y su
patogenicidad parece dependiente de la presencia de otras especies, como lo han reportado otros autores, quienes señalan que la participación en infecciones mezcladas,
con
el
sinergismo
consecuente,
es
un
requerimiento
para
la
patogenicidad de Porphyromonas spp. y Prevotella spp. (Tomazinho y Avila, 2007). ',
Por otra parte, Gomes y col. (2004), aislaron 70% de bacterias anaerobias en dientes con infección endodóntica primaria, sin embargo, dichos autores encuentran a P. intermedia como especie predominante. En el presente estudio P. endodontalis fue la
especie aislada con mayor frecuencia, las diferencias en los resultados puede deberse a características de las distintas regiones geográficas estudiadas, tal como lo señala Siqueira y col. (2008). Asi mismo, Seol y col. (2006) en un estudio realizado en Corea, para detectar bacterias anaerobias pigmentadas de negro en infecciones endodónticas, identificaron P. intermedia en 10%, y P. gingivalis en 5%. Mientras que Siqueira y col. (2005) compararon la prevalencia de 7 patógenos endodónticos en muestras de
infecciones endodónticas primarias tomadas
en
dos
regiones
geográficas diferentes (Río de Janeiro-Brasil y Seui-Corea del Sur) utilizando Nested PCR, las especies más prevalentes detectadas en Brasil fueron P. endodontalis 79%, Treponema
dentico/a
79%,
Dialister pneumosintes 76%.
Las especies más
preva lentes encontradas en Corea fueron F. nucleatum 38%, Tannerella forsythia 26%, Treponema maltophilum 24%. Gomes y col. (2005) y Tomazinho y Siqueira (2007), investigaron la presencia de cuatro bacterias anaerobias pigmentadas de negro (P. gingivalis, P. endodontalis, P. intermedia y Prevotella nigrescens) en infecciones endodónticas y detectaron a P. gingivalis como especie más frecuente, 43,3% y 38%, respectivamente.
49 Algunos autores reportan a Fusobacterium spp. más frecuentemente asociado a infecciones primarias que a infecciones secundarias persistentes (Gomes y col.,2004; Jacinto y col., 2008). En el presente trabajo, F. nucleatum se encontró asociado a otras bacterias anaerobias como P. gingivalis y P. intermedia. Estas especies anaerobias pigmentadas tienen una capacidad proteolítica y generan nutrientes que pueden ser utilizados por una variedad de otras especies, incluida F. nucleatum (Saito y col., 2008)
Por otra parte, la capacidad de F. nucleatum de ce-agregar con otras bacterias sugiere que actúa como un puente microbiano entre los colonizadores tempranos y tardíos y promueve los cambios físico-químicos, permitiendo a los patógenos establecerse y proliferar (Díaz y col., 2002). Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, evidenciaron que el 50% de las cepas E. faeca/is estudiadas fueron resistentes a la eritromicina y a la ciprofloxacina, el 25% fue resistente a la ampicilina y a la tetraciclina, el 100% presentó resistencia intermedia a la doxiciclina. Estos resultados difieren de los reportados por Pinheiro y col. (2004), quienes encontraron 71,5% de resistencia a eritromicina, 19,1% a la ciprofloxacina, 100%
de susceptibilidad a la ampicilina, 14,7% de resistencia a
tetraciclina y a doxiciclina. En otro estudio, Salah y col. (2008) reportaron E. faeca/is susceptible a ampicilina, cloranfenicol, vancomicina, ciprofloxacina, y teicoplanina, pero mucho menos susceptible a eritromicina. Estas diferencias en los patrones de resistencia pueden deberse a las áreas geográficas estudiadas, al origen de las infecciones y al tiempo transcurrido entre un estudio y el otro, a medida que pasa el tiempo se ha evidenciado un aumento en la resistencia (Pinheiro y col., 2004), sin embargo, se requiere de otros estudios con un número mayor de cepas para corroborar los resultados. El género Enterococcus constituye un pequeño porcentaje de las especies microbianas aisladas de los conductos radiculares con pulpa necrótica, sin embargo, se aislan frecuentemente de dientes con tratamiento endodóntico fracasado (Gomes y col., 2006).
50
Numerosas investigaciones afirman la capacidad de E.
faecalis de formar
biopelículas, de esta manera puede sobrevivir a ciertas condiciones en el interior del conducto radicular tanto a la acción de medicaciones como a diversos protocolos de irrigación. Uno de ellos es el trabajo
realiz~do
por George y col. (2005), quienes
evaluaron la influencia de distintas condiciones ambientales y nutricionales en las características de las biopelículas formadas por E. faecalis en el conducto radicular y su penetración en los túbulos dentinales. Las condiciones ambientales estudiadas fueron medios ambientes aerobios y anaerobios ricos y pobres en nutrientes. En la presente investigación todas las cepas de E. faecalis estudiadas tenían la capacidad de producir biopelícula. Las especies anaerobias pigmentadas aisladas en el presente trabajo (P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia), también mostraron capacidad de formar biopelícula en un 66,66% (8/12). Estas especies son anaerobios exigentes que requieren suplementos adicionales para crecer y probablemente necesitan la colonización y activación metabólica de otros organismos, como F. nucleatum, para poder establecerse dentro de la biopelícula. P. gingivalis tiene el potencial para modular la interacción con la superficie de otras células, mediante la expresión diferencial de la cápsula y e.s posible, que la expresión del polisacárido capsular, adhesinas y fimbrias sean reguladas en concordancia (Davey y Duncan, 2006). Estos factores de virulencia promueven la ce-agregación y/o adhesión bacteriana a los tejidos del hospedero para formar biopelícula (Siqueira y col., 2008). F. nucleatum co-adhiere para formar flóculos bacterianos y forma una biopelícula homogénea, ambos procesos parecen estar asociados a un aumento de la hidrofobicidad, asociado a su vez, con un cambio en la carga superficial de la bacteria (Zilm y Rogers, 2007). En este sentido, Saito y col. (2008), sugieren que P. gingivalis excreta una molécula que estimula la formación de biopelícula por F. nucleatum, y que ese efecto sinergístico es un factor importante en las infecciones apicales polimicrobianas del diente.
51
La evidencia científica sugiere que la organización de los microorganismos en biopelícula los hace menos susceptibles a los agentes antimicrobianos que su contraparte en estado planctónico, esta ha sido una de las maneras tradicionales para probar la eficacia de las sustancias antimicrobianas in vitro (Chávez, 2007). En el presente trabajo, se usó el modelo biopelícula para investigar el efecto antimicrobiano del Biopure MTAD® en comparación con la doxiciclina sola. Aunque la formación de biopelícula en los canales radiculares es limitada, se sabe que la biopelícula puede estar presente en las paredes del conducto radicular y también sobre la superficie radicular externa de la porción apical del diente con infección (Svensater y Bergenholtz, 2004). En el presente estudio se encontró que la mayoría de las células en estado planctónico expuestas a la doxiciclina y al Biopure MTAD®, fueron ligeramente más sensibles que las células organizadas en biopelícula. Kho y Baumgartner (2006) evaluaron y compararon la acción antimicrobiana de la irrigación con NaOCI al 1,3% y Biopure MTAD® y de NaOCI al 5,25% y EDTA en los 5mm apicales de dientes infectados con E. faecalis. El tiempo de irrigación final para ambos grupos fue de 2 minutos. En sus resultados no obtuvieron diferencias significativas cuando utilizaron los dos tipos de irrigación final. A pesar de que los irrigantes pueden penetrar dentro de los túbulos dentinarios, no significa que la concentración de dichos irrigantes sea suficiente para eliminar todo tipo de microorganismo presente, y que la preparación biomecánica, por sí sola, sea capaz de erradicar al 100% la microbiota existente. Por su parte, Shabahang y Torabinejad (2003) y Torabinejad y col (2003) utilizando la misma metodología del estudio anterior encontraron que ninguna de las 15 muestras provenientes del grupo donde la irrigación final se hizo con Biopure MTAD® mostró crecimiento bacteriano luego de una semana. Los autores atribuyen estos resultados a la porción de doxiciclina presente en el Biopure MTAD®, entre cuyas propiedades están la actividad anticolagenasa, su bajo pH, su capacidad de adherirse a la dentina y su capacidad de ser liberada con el tiempo. Por otra parte, parece ser que la presencia del detergente (Tween 80) en el Biopure MTAD®,
52
incrementa la profundidad de penetración de este material en los túbulos dentinales al disminuir la tensión superficial (Mohammadi, 2008). Con relación a las propiedades que presenta cada uno de los componentes del Biopure MTAD®, Krause y col. (2007) evaluaron el efecto antimicrobiano que presenta el Biopure MTAD® y dos de sus componentes por separado, la doxiciclina y el ácido cítrico, sobre E. faecalis. Utilizaron dos modelos de estudio in vitro, un modelo de diente bovino y un modelo de zonas de inhibición. Las muestras fueron irrigadas con 601-JL durante un tiempo de 1O minutos. En ambos modelos de evaluación, la doxiciclina fue el irrigante que mostró mayor efecto antimicrobiano sobre E. faecalis en comparación con el ácido cítrico y el Biopure MTAD®. También acotan que la concentración de doxiciclina utilizada en el estudio fue al 10%, una concentración mayor que la que se encuentra presente en el Biopure MTAD® que es al 3%. En el presente trabajo, la actividad antimicrobiana del Biopure MTAD® fue el doble que la observada con doxiciclina sola ante las cepas de E. faecalis, tanto en su estado planctónico (CIM 50 Dox= 16¡..Jg/ml) (CIM 50 Biopure MTAD® 8¡..J/gml) como en las organizadas en biopelícula (CIM 50 , Dox= 32-64¡..Jg/ml) (CIM5o Biopure MTAD® 16321-J/gml). Así mismo lo afirman Portenier y col. (2006), Davis y col. (2007) y Shabahany y col. (2008), quienes compararon la acción antimicrobiana del Biopure MTAD® con la clorhexidina al 2% sobre E. faeca/is, resultando más efectivo el Biopure MTAD® en un período de 5 minutos. Davis y col (2007) señalan que en su estudio no se evaluó la propiedad de sustantividad de la clorhexidina, sólo su habilidad de inhibir el crecimiento del microorganismo. Por tal razón, quizás clínicamente, la clorhexidina pudiera presentar mayor espectro antimicrobiano. En resumen, el presente estudio mostró que el Biopure MTAD® tuvo una actividad antimicrobiana mayor que la doxiciclina sobre las células de E. faecalis organizadas en biopelícula, aunque es importante destacar que el Biopure MTAD® todavía no se encuentra disponible en Venezuela.
CONCLUSIONES
De las 32 muestras de conductos radiculares procesadas, hubo desarrollo bacteriano en 18 (56,25%). En el 100% de dichas muestras se aislaron bacterias anaerobias, en un. 50% (9/18) se aislaron algunas especies como único endodontopatógeno anaerobio predominante, en el 22,22% (4/18) combinación de anaerobios con E. faecalis y en el 27,77% (5/18) combinación de varias especies anaerobias. P. endodontalis fue la especie más frecuentemente aislada de los pacientes con
infecciones endodónticas primarias 72,27% (13/18). Las bacterias anaerobias se aislaron en mayor proporción que E. faecalis. No se encontró diferencia estadísticamente significativa entre el aislamiento de las especies endodontopatógenas estudiadas y las características de los pacientes. Las cepas aisladas de E. faecalis presentaron resistencia intermedia a la doxiciclina, antimicrobiano utilizado frecuentemente en el tratamiento vía oral de infecciones de este tipo y también como componente de irrigantes de conductos radiculares. Todas las cepas de E. faecalis estudiadas, así como el 66,66% de las cepas de bacterias anaerobias, evidenciaron la capacidad de formar biopelícula. Se observó mayor actividad antimicrobiana del Biopure MTAD® en comparación con la doxiciclina tanto sobre las células de E. faecalis en estado planctónico como sobre las células organizadas en biopelícula, aunque sin diferencias estadísticas significativas.
RECOMENDACIONES Continuar el estudio con mayor número de pacientes. Determinar la eficacia del Biopure MTAD® in vivo. Determinar la susceptibilidad antimicrobiana de las cepas de bacterias anaerobias. Determinar la presencia de otros endodontopatógenos mediante PCR.
\..'
e
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