Biología Molecular y Filogenia en Micología

Biól. Nicolás Pastor

Micología 2014

¿Por qué usar herramientas moleculares? Sistemática - Delimitación de especies → Concepto filogenético de especie → Diagnosis inequívoca(?) de especies - Resolución de conflictos taxonómicos

¿Por qué usar herramientas moleculares? Sistemática - Delimitación de especies → Concepto filogenético de especie → Diagnosis inequívoca(?) de especies - Resolución de conflictos taxonómicos

Evolución - Estudios de co-evolución - Evolución de caracteres morfológicos

¿Por qué usar herramientas moleculares? Sistemática - Delimitación de especies → Concepto filogenético de especie → Diagnosis inequívoca(?) de especies - Resolución de conflictos taxonómicos

Evolución - Estudios de co-evolución - Evolución de caracteres morfológicos

Ecología - Independencia de basidiomas y ascomas - Cambios en la composición espacial y temporal de las comunidades

PREGUNTA

Flujo de trabajo EXTRACTO DE ADN AMPLICON

MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS

BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN

ANÁLISIS FILOGENÉTICO

ARBOL FILOGENÉTICO

Flujo de trabajo

PREGUNTA

EXTRACTO DE ADN MATERIAL BIOLÓGICO

LAB. HUMEDO

ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS

BASE DE DATOS

BIOINFORMATICA ANÁLISIS FILOGENÉTICO

AMPLICON

SECUENCIA DE ADN

ARBOL FILOGENÉTICO

Pregunta y selección del material biológico

- Morfología muestra algunos caracteres afines a algún género conocido, pero... No se lo puede identificar mediante las claves existentes, ni es similar a nada publicado (al menos de lo que se conoce!!)

Pregunta y selección del material biológico

¿Encontré una nueva especie? Si así es, ¿cómo está relacionada con el resto de las especies más cercanas del género?

¿Cuál es su posición filogenética en el género?

Flujo de trabajo

PREGUNTA

EXTRACTO DE ADN AMPLICON

MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS

BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN

ANÁLISIS FILOGENÉTICO

ARBOL FILOGENÉTICO

Extracción de ADN Kit Comercial

Protocolo tradicional

- Disgregación mecánica del tejido - Lísis celular (mecánica y química) - Secuestro de ADN y precipitación de otros contenidos celulares (proteínas, lípidos, etc) - Precipitación de ADN - Lavado y resuspensión de ADN

ADN genómico

Flujo de trabajo

PREGUNTA

EXTRACTO DE ADN AMPLICON

MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS

BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN

ANÁLISIS FILOGENÉTICO

ARBOL FILOGENÉTICO

Amplificación y secuenciación de ADN

http://www.fitolab.com.mx/pcr2.html

Amplificación y secuenciación de ADN - ¿Con cuántos marcadores voy a trabajar? → loci independientes (no ligados)

- ¿Que nivel taxonómico quiero resolver? → tasas de evolución de ADN

- ¿Qué hay disponible en las bases de datos? → meramente pragmático!!!

Amplificación y secuenciación de ADN Marcadores más utilizados → No-codificantes (intrones, DNAr) - ITS = espaciador interno de la transcripción - LSU/25S = subunidad ribosomal mayor - SSU/18S = subunidad ribosomal menor → Codificantes (expresan proteínas) - rpb1/rpb2 = RNA polimerasa subunidad I ó II - atp6 = subunidad 6 ATPasa mitocondrial - tef1 = factor de enlongación 1-α - β-tubulina = subunidad beta de Tubulina

Amplificación y secuenciación de ADN Cebadores: específicos y no específicos

Bellemain et al.(2010). BMC Microbiology.10: 189-198

www.clarku.edu/faculty/dhibbett/

Amplificación y secuenciación de ADN

www.macrogen.com/eng/

Flujo de trabajo

PREGUNTA

EXTRACTO DE ADN AMPLICON

MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS

BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN

ANÁLISIS FILOGENÉTICO

ARBOL FILOGENÉTICO

Minería de datos - Búsqueda de secuencias por similitud B asic L ocal A lignment S earch T ool

Busca en una BD determinada, las secuencias similares a la que uno provee.

Altschul etl al. 1990. J Mol Biol. 215(3): 403-410.

- ¿Por qué buscamos secuencias similares?

Similitud

Homología

Minería de datos - Bases de datos más utilizadas en Micología GenBank

www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

BD general (todo tipo de secuencias, todo tipo de organismos)

. : M AA R J A M : . maarjam.botany.ut.ee/ www.unite.ut.ee/

BD específica de secuencias de ITS de hongos

BD específica para Glomeromycota. Varios marcadores

Flujo de trabajo

PREGUNTA

EXTRACTO DE ADN AMPLICON

MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS

BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN

ANÁLISIS FILOGENÉTICO

ARBOL FILOGENÉTICO

Alineamiento Múltiple de Secuencias (MSA) s1:EN LA RAMA NOS CANTA LA RANA [22 letras] s2:LA RANA NO CANTA EN LA CAMA [21 letras]

ENLARAMANOSCANTALARANA LARANANOCANTAENLACAMA* * *

3/22 = 0,1363

14% similitud

ENLARAMANOSCANTA--LARANA 16/22 = 0,7272 --LARANANO-CANTAENLACAMA 73% similitud **** *** ***** ** * * insercion/deleción

mutación puntual

Alineamiento Múltiple de Secuencias (MSA)

- Existen programas para realizar MSA de manera automática, basados en diferentes algoritmos: → Clustal (W, IX, Ω) → MUSCLE → T-Coffee → MAFFT

Flujo de trabajo

PREGUNTA

EXTRACTO DE ADN AMPLICON

MATERIAL BIOLÓGICO ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS

BASE DE DATOS SECUENCIA DE ADN

ANÁLISIS FILOGENÉTICO

ARBOL FILOGENÉTICO

Análisis filogenético - ¿Puedo hacer filogenía sin biología molecular?

C A

Esporas

B

D

Hábito Hipógeo [0] / Epígeo [1] Esporas Negra [a] / Blanca [b] / Rosa [c] Ornamentaciónes Verrugas [a] / Sin [b] / Espinas [c] Color basidioma Azul [0] / Rojo [1]

A verrugas negra hipogeo azul

B sin

Habito

Esp

Orna

Color

A

0

a

a

0

B

0

a

b

0

C

1

b

c

1

D

1

c

c

1

C blanca

D rosa espinas epigeo rojo

Análisis filogenético Entonces... ¿Por qué utilizar caracteres moleculares?

Análisis filogenético - Enorme disponibilidad de caracteres → Cada sitio de las secuencia es un carácter distinto → Elección objetiva del carácter y sus estados - Tasas de evolución conocidas → Modelos de evolución de ADN → Relojes moleculares

Análisis filogenético - Métodos basados en matriz de distancias → Neighbor-joining → Mínimos cuadrados ¡¡¡ NO ES → UPGMA FILOGENIA !!! - Método de Máxima Parsimonia - Métodos Probabilísiticos → Máxima Verosimilitud → Inferencia Bayesiana

DISCUTIDO

MODELOS DE SUBSTITUCION DE ADN