Bioquímica II

TP Nº1: Fotosíntesis

Bioquímica II – Guía De Trabajos Prácticos Trabajo Práctico Nº 1: Fotosíntesis Universidad Nacional De Quilmes

Tabla de contenidos Objetivos Introducción Fotosíntesis Fraccionamiento subcelular Materiales Distribución del trabajo a realizar por cada grupo Procedimientos Aislamiento de cloroplastos Normalización de las soluciones de cloroplastos Cinética de la reacción de Hill Verificación de la integridad de los cloroplastos Efecto de los detergentes Anexo Esquema de siembra en policubeta de 96 pocillos

1 1 1 3 3 4 4 4 4 4 5 5 6 6

Objetivos Aislar cloroplastos de hojas de espinaca (fraccionamiento celular). Verificar que estén fotosintéticamente activos (reacción de Hill) e intactos (visualización al microscopio). Ensayar la acción de distintos tratamientos sobre su capacidad fotosintética (efecto de los detergentes).

Introducción Fotosíntesis Los cloroplastos están presentes en todas las células de las plantas verdes y algas eucarióticas. Se los puede considerar como centrales energéticas de la célula que utilizan la energía solar. En los cloroplastos, moléculas de pigmento que absorben la energía de la luz y la emplean para fabricar ATP y, en última instancia, para reducir dióxido de carbono y producir glúcidos tales como almidón y sacarosa. El proceso fotosintético en eucariotas y cianobacterias produce O2 como producto secundario de las reacciones de captación de la luz, por lo que en condiciones anaeróbicas, la fotosíntesis no se ve afectada. Estos orgánulos son de aproximadamente 5 µm y adoptan formas muy diversas. Tienen tres sistemas de membranas y contienen generalmente una elevada concentración de clorofila y en menor proporción otros pigmentos, que en conjunto pueden absorber la energía de la luz en la práctica totalidad del rango del espectro visible. Estas moléculas se localizan en las membranas más internas de los cloroplastos, que forman apilamientos de cisternas cerradas conocidos como tilacoides. Los organismos fotosintéticos atrapan la luz solar formando ATP y NADPH, que utilizan como fuente de energía para fabricar glúcidos y otros componentes orgánicos a partir de CO2 y H2O; de forma simultánea liberan O2 a la atmósfera. La ecuación global de la fotosíntesis describe una reacción de oxidación-reducción en la que el H2O cede electrones para la reducción del CO2 a glúcidos (CH2O):

CO2 + H2O ® CH2O + O2 Como el agua es un pobre dador de electrones (su potencial de reducción estándar es alto), este proceso requiere el aporte de energía en forma de luz para crear un buen dador de electrones. Entonces, los electrones fluyen a través de una serie de transportadores ligados a la membrana, al tiempo que se bombean protones a través de la membrana para crear un potencial

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electroquímico. Este potencial electroquímico es la fuerza motriz para la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi por un complejo ATP sintasa ligado a la membrana. Este proceso se denomina fotofosforilacion. Mediante ciertos experimentos se demostró que la síntesis de ATP está estrechamente acoplada a la cadena transportadora de electrones. Esta dependencia es explicada fácilmente por la teoría quimiosmótica. No obstante, ciertas condiciones y reactivos desacoplan la fosforilación del transporte electrónico. Entre estos desacoplantes químicos se encuentra el 2,4-dinitrofenol (DNP) que es un ácido débil con propiedades hidrofóbicas. Su hidrofobicidad le permite difundir fácilmente a través de las membranas y después de entrar en la matriz en forma protonada pueden liberar un protón (se disocian) disipando de este modo el gradiente de protones. Para los efectos del práctico, los cloroplastos en presencia del DNP, no se verán afectados. La captación de luz y el transporte electrónico seguiría funcionando aunque no haya producción de ATP. En cambio, en presencia de un inhibidor de alguno de los transportadores de electrones, el flujo a través de la cadena cesará y se evidenciará dicho efecto en los resultados del práctico. La fotosíntesis abarca dos procesos (ambos se realizan en los cloroplastos):  reacciones lumínicas: se absorbe energía luminosa por los pigmentos conservándola en forma de ATP y NADPH; simultáneamente se elimina O2  reacciones de fijación de carbono: se utiliza el ATP y NADPH para reducir el CO 2 formando glucosa y otros productos orgánicos. Robert Hill en 1937 descubrió que no si el aceptor de electrones era no biológico igual se desprendía oxígeno y se reducía ese aceptor según la siguiente ecuación:

2 A + 2H2O ®2 AH2 + O2 ECUACION DE HILL

En donde A es el aceptor de hidrógeno artificial. Uno de los aceptores no biológicos es el 2,6-diclorofenolindofenol (reactivo de Hill) que en su forma oxidada es azul y es incoloro en su forma reducida (AH2). Varios años más tarde, se encontró que el NADP + es el aceptor biológico de electrones en los cloroplastos. El proceso de captación y transferencia de la luz es el siguiente:  La luz excita una molécula antena (clorofila o pigmento accesorio), elevando un electrón a un nivel energético superior.  La molécula antena excitada pasa energía a una molécula de clorofila vecina (transferencia de energía por resonancia), excitándola.  Esta energía se transfiere a una clorofila del centro de reacción, excitándola.  La clorofila excitada del centro de reacción pasa un electrón a un aceptor electrónico primario.  El hueco electrónico en el centro de reacción se cubre con un electrón de un dador electrónico.  La absorción de un fotón ha producido una separación de carga en el centro de reacción. De esta forma la excitación por la luz produce una separación de carga e inicia una cadena de oxido-reducción. Esta cadena se divide en dos fotosistemas, cada uno con su propio tipo de centro de reacción fotoquímico y un conjunto de moléculas antena. Los dos fotosistemas tienen funciones distintas y complementarias. Es entre los fotosistemas II y I que tiene lugar el flujo electrónico impulsado por la luz, produciendo NADPH y un gradiente protónico transmembrana.

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Este esquema en Z muestra la ruta de transferencia de electrones desde el H2O al NADP+ en la fotosíntesis no cíclica. La posición de cada transportador electrónico sobre la escala vertical es un reflejo de su potencial de reducción estándar. Para elevar la energía de los electrones provenientes del agua al nivel de energía requerido para reducir al NADP +, cada electrón ha de ser elevado dos veces por los fotones absorbidos en los fotosistemas II y I. Durante la escisión del agua y durante la transferencia de electrones a través del complejo del citocromo bf, se transportan protones a través de la membrana tilacoide produciendo el gradiente de protones que es central para la formación de ATP. Fraccionamiento subcelular Según un método típico de fraccionamiento celular, se rompen las células mediante homogeneización suave en un medio con sacarosa 0,2 M para romper las membranas por presión osmótica. Los orgánulos tienen diferente tamaño y por lo tanto sedimentan a distintas velocidades durante la centrifugación. También tienen diferente densidad específica y flotan a distintos niveles en un gradiente de densidad. La centrifugación diferencial permite obtener un fraccionamiento inicial del contenido citoplásmatico, que puede purificarse con más precisión mediante una centrifugación isopícnica. En el sobrenadante se encuentran proteínas solubles. Centrifugación diferencial Condiciones de Centrifugación 1.000 g 10 min 20.000 g 20 min 80.000 g 60 min 150.000 g 180 min

Pellet células enteras, núcleos, membranas plasmáticas mitocondrias, lisosomas, peroxisomas microsomas, vesículas pequeñas ribosomas, virus, macromoléculas grandes

En la centrifugación isopícnica se llena un tubo de centrífuga con una disolución cuya densidad aumenta desde la superficie hasta el fondo. Para producir este gradiente de densidad se disuelve un soluto, por ejemplo la sacarosa, a diferentes concentraciones. Cuando se deposita una mezcla de orgánulos sobre este gradiente de densidad y se centrifuga el tubo a una alta velocidad, los orgánulos individuales sedimentan hasta que su densidad corresponde exactamente a la del gradiente. Entonces puede recogerse cada capa separadamente.

Materiales    

Buffer de homogeneización (BH10): Tris.HCl 30 mM (pH 7,4) MgCl2: 5 mM Sacarosa 10% p/v (292 mM) Gradiente: o BH20: BH10 pero con sacarosa 20% p/v o BH40: BH10 pero con sacarosa 40% p/v o BH60: BH10 pero con sacarosa 60% p/v

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  

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DCPIP: 0,1 mg/ml (3,2 mM) de 2,6-diclorofenol-indofenol en BH10 SDS: 1% p/v de dodecilsulfato sódico en BH10 y diluciones seriadas. Tritón X-100: 1% p/v de tritón X-100 en BH10 y diluciones seriadas.

Distribución del trabajo a realizar por cada grupo Todos los grupos deben obtener una suspensión de cloroplastos purificada. Todos los grupos deben realizar en ensayo de normalización. Un grupo realizará el ensayo correspondiente a la cinética de la reacción de Hill. Los restantes grupos realizarán los ensayos correspondientes a determinar el efecto de los detergentes sobre la actividad fotosintética.

Procedimientos Aislamiento de cloroplastos 1. Pesar 50 g de hojas de espinaca frescas y lavarlos con agua corriente. 2. Enjuagar con agua destilada, escurrir, secar, destroncar y trozar las hojas en pedazos medianos y colocarlos en el mortero. 3. Agregar 30 ml de BH10 frío y triturar bastante las hojas (agregar de a pequeñas cantidades). 4. Filtrar usando un embudo con un pedacito de algodón previamente humedecido con BH10. 5. Centrifugar el filtrado a 4°C durante 10 minutos a 5000 rpm. Para ello se utiliza la centrífuga clínica a 5000 rpm. 6. Descartar el sobrenadante con cuidado y resuspender el pellet de cloroplastos en 3 ml de BH10 y dejarlos en hielo. 7. Armar el gradiente de sacarosa en un tubo cónico de 50 ml agregando con pipeta 8 ml de las soluciones de sacarosa. El orden se debe respetar y el agregado debe realizarse lentamente sobre la pared del tubo (para no mezclar las capas). Primero se adiciona BH60, luego BH40 y por último BH20. 8. Cargar con cuidado 1,5 ml de la suspensión de cloroplastos en la parte superior del gradiente. 9. Centrifugar a 4°C durante 15 minutos a 5000 rpm. No utilizar el freno al cortar la centrifugación (desacelaración=0). 10. Los cloroplastos enteros quedarán en la interfase entre BH40 y BH60. Entonces, retirar los cloroplastos con una pipeta Pasteur y colocarlos en un tubo limpio en hielo. Normalización de las soluciones de cloroplastos Dado que entre una preparación y otra la cantidad de cloroplastos puede variar significativamente, será necesario determinar el volumen de suspensión que provoque una reacción colorimétrica en el tiempo deseado (15 minutos). Para ello se efectuará el siguiente ensayo: Tubo BH10 DCPIP Cloroplastos Vf

1 936 ul 64 l 1 ml

2 900 ul 100 ul 1 ml

3 898 ul 100 ul 2 l 1 ml

4 896 ul 100 ul 4 l 1 ml

5 892 ul 100 ul 8 l 1 ml

6 884 ul 100 ul 16 l 1 ml

7 868 ul 100 ul 32 l 1 ml

8 836 ul 100 ul 64 l 1 ml

Cinética de la reacción de Hill 1. Rotular 5 tubos de ensayo del 1 al 5. 2. Agregarle a cada tubo las siguientes soluciones: Tubo BH10 DCPIP Cloroplastos Vf

1 900 ul 1 ml

2 (1000-X) ul X ul 1 ml

3 900 ul 100 ul 1 ml

4

4 (900-X) ul 100 ul X ul 1 ml

5 (900-X) ul 100 ul X ul 1 ml

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Nota: el volumen de cloroplastos elegido luego de la normalización se restará del volumen de BH10. 3. Mezclar de inmediato y colocar los tubos del 1 al 4 a la luz, y el quinto en oscuridad. 4. Realizar un espectro de cada tubo (excepto el tubo cinco) en la región del visible (entre 400nm y 700nm) al tiempo inicial y del tubo cuatro cada 5 minutos, durante 20 minutos. Al finalizar, realizar un espectro del tubo guardado en oscuridad. Verificación de la integridad de los cloroplastos 1. Colocar en un tubo 1 ml de BH10, agregar 3 gotas de suspensión de cloroplastos y agitar suavemente. 2. Dejar a temperatura ambiente 5 minutos. 3. Colocar una gota sobre un portaobjetos y montar el cubreobjetos. 4. Observar al microscopio. 5. Observar todas las preparaciones de cloroplastos con los distintos detergentes. 6. Observar también trozos de las hojas lavadas directamente. Efecto de los detergentes 1. Preparar 6 tubos por duplicado con las siguientes soluciones.

BH10 DCPIP SDS Cloroplastos Vf

Efecto del SDS

Sin DCPIP

Sin det. ni clorop.

Sin det.

Sin clorop. (SDS 1%)

SDS 1%

SDS 0,1 %

SDS 0,01 %

SDS 0,001 %

900 ul 60 μl X ul 1 ml

900 ul 100 ul 1 ml

900 ul 100 ul X ul 1 ml

890 ul 100 ul 10 μl 1 ml

890 ul 100 ul 10 μl X ul 1 ml

890 ul 100 ul 10 μl X ul 1 ml

890 ul 100 ul 10 μl X ul 1 ml

890 ul 100 ul 10 μl X ul 1 ml

Sin DCPIP

Sin det. ni clorop.

Sin det.

900 ul 60 μl X ul 1 ml

900 ul 100 ul 1 ml

900 ul 100 ul X ul 1 ml

Efecto del Tritón

BH10 DCPIP Tritón X-100 Cloroplastos Vf

2. 3. 4. de

Sin clorop. Tritón X-100 Tritón X-100 Tritón X-100 Tritón X-100 (Tritón 1%) 1% 0,1 % 0,01 % 0,001 %

890 ul 100 ul 10 μl 1 ml

890 ul 100 ul 10 μl X ul 1 ml

890 ul 100 ul 10 μl X ul 1 ml

890 ul 100 ul 10 μl X ul 1 ml

890 ul 100 ul 10 μl X ul 1 ml

Mezclar suavemente sin hacer espuma. Incubar bajo luz natural 15 minutos. Realizar una tabla donde se indicará con un sistema de cruces, la presencia o ausencia reacción llevada a cabo en cada tubo. Símbolo Avance de reacción

++++

+++-

++--

+---

----

100 %

75 %

50 %

25 %

0%

5. Además, colocar 200 μl de cada una de las soluciones en un pocillo de la policubeta de 96 pocillos (ver Anexo y sembrar según esquema). 6. Leer la absorbancia a 610 nm en el lector correspondiente a las 15 minutos de reacción.

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Anexo Esquema de siembra en policubeta de 96 pocillos Mezclar suavemente cada uno de los tubos antes de tomar el volumen a sembrar en la placa. No olvidar sembrar 2 pocillos por grupo de buffer BH10 (Blanco).

1

2

A

Blanco

Sin DCPIP

B

Blanco

Sin DCPIP

C

Blanco

Sin DCPIP

D

Blanco

Sin DCPIP

E

Blanco

Sin DCPIP

F

Blanco

Sin DCPIP

G

Blanco

Sin DCPIP

H

Blanco

Sin DCPIP

A1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

A8

A9

A10

A11

A12

B1

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B11

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D1

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E1

E2

E3

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F1

F2

F3

F4

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F10

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G1

G2

G3

G4

G5

G6

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G10

G11

G12

H1

H2

H3

H4

H5

H6

H7

H8

H9

H10

H11

H12

3 Sin det. ni clorop. Sin det. ni clorop. Sin det. ni clorop. Sin det. ni clorop. Sin det. ni clorop. Sin det. ni clorop. Sin det. ni clorop. Sin det. ni clorop.

4 Sin det. Sin det. Sin det. Sin det. Sin det. Sin det. Sin det. Sin det.

5

6

7

8

9

Sin clorop. (SDS 1%) Sin clorop. (SDS 1%) Sin clorop. (Tritón 1%) Sin clorop. (Tritón 1%)

SDS 1% SDS 1% Tritón 1% Tritón 1%

SDS 0,1 % SDS 0,1 % Tritón 0,1 % Tritón 0,1 %

SDS 0,01 % SDS 0,01 % Tritón 0,01 % Tritón 0,01 %

SDS 0,001 % SDS 0,001 % Tritón 0,001 % Tritón 0,001 %

Grupo 1

Sin clorop. (SDS 1%) Sin clorop. (SDS 1%) Sin clorop. (Tritón 1%) Sin clorop. (Tritón 1%)

SDS 1% SDS 1% Tritón 1% Tritón 1%

SDS 0,1 % SDS 0,1 % Tritón 0,1 % Tritón 0,1 %

SDS 0,01 % SDS 0,01 % Tritón 0,01 % Tritón 0,01 %

SDS 0,001 % SDS 0,001 % Tritón 0,001 % Tritón 0,001 %

Grupo 2

6

10 11 12