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SERIE DIGITAL 10 / Ciencia y tecnología

Cuatro miradas sobre los virus

Cristina S. Borio y Betina I. Stephan / Mariana Capello / Javier A. Iserte / Solange A. B. Miele / Coordinador Mariano Nicolás Belaich

Bernal, 2012 SERIE DIGITAL / Ciencia y tecnología

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Ciencia y tecnología : cuatro miradas sobre los virus / adaptado por Mariano Belaich. - 1a ed. - Bernal : Universidad Nacional de Quilmes, 2012. E-Book. ISBN 978-987-558-239-2 1. Ingenieria Genética. 2. Virología. I. Belaich, Mariano, adapt. CDD 660.65

Universidad Nacional de Quilmes Rector Gustavo Eduardo Lugones Vicerrector Mario E. Lozano Serie Digital Directores Mariano N. Belaich, Departamento de Ciencia y Tecnología Margarita Pierini, Departamento de Ciencias Sociales 2012 ISBN 978-987-558-239-2 libro electrónico COORDINADOR Mariano Nicolás Belaich. Licenciado en Biotecnología. Doctor unq Mención Ciencias Básicas y Aplicadas. Docente e investigador unq en las asignaturas de Ingeniería Genética, Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular, Área de virosis de insectos.

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Índice

Introducción, por Mariano N. Belaich. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Emergencia viral: el caso del virus Junín, por Cristina S. Borio y Betina I. Stephan / Codirectores: Sandra E. Goñi y Mario E. Lozano. . . . . . . . . . . . . . . . 7 Uso de biotransformaciones para la obtención de precursores antivirales, por Mariana Capello / Director: Luis E. Iglesias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Los virus sanadores: el caso de los bacteriófagos, por Javier A. Iserte / Codirectores: Néstor G. Iglesias y Mario E. Lozano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 Virus con aplicaciones tecnológicas: el caso de los baculovirus, por Solange A. B. Miele / Codirectores: Marcela G. Pilloff , Mariano N. Belaich y P. Daniel Ghiringhelli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

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Introducción

La materia viva ha conquistado este planeta hace miles de millones de años. Si pudiéramos remontarnos a esos tiempos y transformarnos en espectadores privilegiados, seríamos testigos de los eventos extraordinarios que allí habrían sucedido: en un caliente océano primordial, ciertas moléculas logran multiplicarse copiándose a sí mismas, haciendo real el concepto de perpetuación. Luego los ácidos nucleicos, tal como los conocemos hoy en día, entablaron relaciones estrechas con proteínas, azúcares y lípidos conduciendo a la formación de las primeras células. Y esa concatenación de procesos químicos y físicos que, quizás por haber sido tan maravillosos y únicos aún no hemos podido reproducir completamente en un laboratorio, sería el gran comienzo de la vida. Poco a poco, esta particular materia fue haciéndose más compleja, además de diversificarse en inimaginables formas y dimensiones. ¿A partir de unas moléculas disueltas en agua caliente y en presencia de numerosas fuentes de energía nació la vida? Todo parecería indicar que sí. Pero quizás lo más llamativo es que de esas primeras poblaciones de células surgieran dinosaurios, ballenas, tigres, secuoyas, bacterias y hasta nosotros mismos. Lo interesante y revelador es que existe una unidad mínima que es la célula y que, a pesar de algunas diferencias, se estructura de manera similar en cada uno de los seres vivos que habitan la Tierra. Si bien la historia anterior tiene un amplio consenso entre los biólogos, lo que todavía genera controversias y largas discusiones científicas es posicionar y sugerir cuál ha sido el origen de los virus. ¿Qué son estas entidades? ¿Cuál es su naturaleza? ¿Qué los diferencia de los organismos? Muchas preguntas que han obsesionado a los primeros investigadores que hallaron a estas particulares criaturas, y que aún afecta el sueño de las nuevas generaciones de virólogos. Cuando nos detenemos a analizarlos, vemos que existen más tipos diferentes de virus que especies de organismos que habitan el planeta. Y que su diversidad morfológica es increíblemente asombrosa. Así, hay virus que poseen genomas de arn, mientras que otros contienen genotipos de adn. Algunos recubren al genoma con estructuras proteicas muy ordenadas y de formas geométricas diversas, tan perfectas que sorprenderían a más de uno, en tanto otros lo hacen con envolturas membranosas. Sin duda, todas son diferencias que sugieren orígenes distintos. Pero algo sí es común: los virus son parásitos de la vida y obligadamente necesitan de ella para multiplicarse.

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A la materia viva, debemos entenderla como a un sistema molecular complejo que intercambia materia y energía con el entorno, para sostenerse y multiplicarse consume insumos y energía que obtiene del mundo inerte (por ejemplo así lo hacen las plantas), o de otros organismos (el caso del ser humano). En cambio, los virus no producen ni almacenan energía, por lo que no pueden realizar trabajo por sí solos para sostenerse y multiplicarse. Así es que requieren de células adecuadas que les aporten todo lo necesario en la generación de progenie. De este modo, y como consecuencia de la acción parasitaria de los virus sobre sus hospedadores, se pueden alterar muchos de los procesos que sostienen la vida. Esto provocará que algunos organismos se enfermen y que otros directamente mueran. Los virus son una amenaza para la salud de los seres vivos y una de las peores pesadillas para los humanos. En numerosas ocasiones a lo largo de la historia, muchas epidemias virales han sido protagonistas directas de la destrucción o decadencia de civilizaciones enteras. Otras veces, han colaborado en el cambio sociohistórico. Por ejemplo, el virus de la viruela ayudó a los conquistadores españoles en la colonización de las Américas. O el vih (virus de la inmunodeficiencia adquirida) replanteó el ejercicio de la sexualidad a fines del siglo xx. La literatura, el cine y otras disciplinas artísticas han reproducido tales escenarios, o imaginado otros, donde el hombre se enfrentaba a situaciones límite a causa de la amenaza de estas criaturas invisibles y potencialmente mortales. Por estos motivos, desde que fueron descubiertos, los científicos han emprendido la titánica tarea de comprender cómo se forman y funcionan los virus, cómo protegernos de su acción e, incluso, cómo aprovecharlos tecnológicamente. En este volumen, la Serie Digital presenta cuatro textos sobre los virus, los cuales contienen cuatro miradas distintas sobre su estudio y aplicación. Cada uno de estos enfoques representa parte del trabajo de Tesis de Grado desarrollado por estudiantes de la Licenciatura en Biotecnología de la Universidad Nacional de Quilmes. En particular, contiene el estado del arte de cada disciplina temática que los introdujo en el apasionante mundo de la virología. En el primer capítulo de este volumen, Betina Stephan y Cristina Borio reflexionan sobre la emergencia viral, una realidad repetitiva en la historia, que involucra el cambio de hospedador de un virus con importantes consecuencias sanitarias. En particular, sus estudios se centraron en el virus Junín, un patógeno propio de la Argentina que provoca una terrible enfermedad en el hombre. El conocimiento de un virus y su patogenia es crucial como primera etapa para intentar desarrollar estrategias terapéuticas. De hecho, es necesario comprender los mecanismos de replicación de los genomas virales (todos muy particulares dada la diversidad de estas criaturas) para luego poder intentar bloquearlos, mediante el diseño y utilización de sustancias químicas adecuadas. Siguiendo esta línea, en el segundo capítulo, Mariana Capello nos introduce en los aspectos referidos a la síntesis de drogas antivirales, sobre todo describiendo

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la aplicación de la biotransformación de moléculas como procedimiento para la generación de estos fármacos. Pero, si bien es cierto que los principales esfuerzos del ser humano han estado dirigidos a comprender y atacar a los virus que nos amenazan, también se han diversificado los estudios científicos para intentar sacar provecho a partir de algunos de ellos. Dado que existen virus para todas las formas de vida que habitan el planeta, un patógeno que no nos utiliza como hospedadores puede ser fuente de increíbles aplicaciones. Así, en el tercer capítulo Javier Iserte nos narra cómo es posible utilizar a los virus que parasitan a las bacterias (bacteriófagos) como una interesante estrategia terapéutica para el tratamiento de infecciones en el ser humano. La fagoterapia es, tal vez, un camino posible que debamos transitar para dar respuesta y solución a muchas bacterias que presentan resistencias múltiples, producto de años de abuso en la administración de drogas antibióticas. Y finalmente en el último capítulo, Solange Miele nos introduce en las múltiples aplicaciones que poseen ciertos virus que infectan a los insectos, llamados baculovirus por su estructura en forma de bastón. La producción de factores terapéuticos y el control biológico de plagas agrícolas se constituyen como claros ejemplos de aproximaciones tecnológicas derivadas, de la explotación de estos patógenos que no nos eligen a nosotros como fuente de materia y energía. Y por lo tanto, en una cabal demostración de cómo es posible utilizar la diversidad natural en la producción de bienes y servicios. Por lo visto, los virus y sus estudios pueden ser abordados desde muchísimos aspectos y con diferentes fines. A veces serán una amenaza y nos esforzaremos en comprenderlos para poder enfrentarlos; pero en otras tantas oportunidades se transformarán en una solución y ayuda para sostener a nuestra civilización. Queridos lectores, estas criaturas que llamamos virus están dispersas por todos lados y pueden ser compañeros, amigos o enemigos de cada una de las formas de vida que habitan el planeta. Esperamos que esta publicación se transforme en un elemento o en un disparador que los ayude a comprender un poco más de qué trata la virología. Los cuatro ejemplos que aquí mostramos pueden ser solo la punta de un iceberg pero, sin duda, son una buena representación de esta diversa familia de criaturas. La virósfera está junto a nosotros. Conocerla, comprenderla y aprovecharla son y serán un desafío central para las ciencias de la vida durante este siglo. Mariano N. Belaich

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Emergencia viral: el caso del virus Junín Cristina S. Borio y Betina I. Stephan Codirección: Sandra E. Goñi y Mario E. Lozano

Están quemando los rastrojos de maíz, dijo el hombre señalando los incendios del campo que cubrían de un humo acre la ruta […] no habría pronunciado palabra desde que se subió al auto con sus bombachas batarazas y una boina negra ladeada sobre el ojo izquierdo. Es para espantar las ratas, agregó, traen la peste. El huésped, Edna Pozzi

Virus emergentes Desde hace milenios, el ser humano convive con patógenos que lo han enfermado y afectado, comprometiendo incluso su permanencia en el planeta. Estos agentes microbianos han evolucionado junto con nosotros en una relación de tipo predador-presa. Mientras que en nuestras poblaciones se seleccionaban complejos sistemas de defensa, estas entidades acumulaban cambios genéticos que les permitieron desarrollar fenotipos de evasión contra nuestras armas. Pero es preciso reconocer que no solo existen patógenos que conocemos desde hace siglos, sino que, de tanto en tanto, surgen nuevos microbios que descubren en nuestros cuerpos un ámbito adecuado para llevar a cabo su multiplicación. Un virus emergente se define como aquél que ha aparecido recientemente en una población, o que, rápidamente, está expandiendo su rango de hospedadores y con ello provocando una enfermedad (Flint et al., 2000). Podemos clasificar a los patógenos que producen enfermedades emergentes, potencialmente, en tres grupos: 1) los que han evolucionado recientemente, 2) los que llamamos agentes zoonóticos (patógenos que poseen un hospedador o reservorio animal desde el que se transmiten a los humanos), y 3) los que están presentes en grupos humanos aislados que, después del establecimiento de contactos que antes no existían entre dos poblaciones, logran propagarse. Existen numerosos ejemplos de patógenos emergentes (Tabla 1), entre los cuales se hallan los virus causantes de las zoonosis provocadas por arenavirus y bunyavirus, cuyos reservorios naturales se encuentran en especies particulares de roedores. La mayoría de las enfermedades emergentes se clasifican dentro de lo que denominamos zoonosis, y suelen ocurrir como consecuencia de cambios ecológicos que afectan la densidad de población del hospedador zoonótico, del vector de la enfermedad (si lo hubiera), o de los humanos. Por estas razones, la aparición de enfermedades emergentes puede ser producto de la actividad

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humana a lo largo y ancho de todo el planeta. La tasa de aparición de las zoonosis depende en gran medida de la ecología del animal reservorio. Se supone que, entre los factores que promueven este tipo de enfermedades, la actividad agropecuaria y los viajes en avión son los que tienen una mayor incidencia global. Por ejemplo, la actividad agropecuaria modifica profundamente el hábitat y, en consecuencia, la tasa de reproducción de diferentes especies animales; además, brinda un mecanismo muy eficiente de transmisión de patógenos, ya que permite un contacto muy estrecho entre el hombre y los vectores que transmiten una enfermedad. A su vez, la existencia de viajes tan rápidos como los que se realizan mediante vuelos aéreos posibilita que viajeros infectados, pero todavía asintomáticos, conquisten nuevos territorios para el patógeno, permitiendo una rápida diseminación de la enfermedad. El gran avance de la medicina y la biología nos hizo creer que con el suministro de nuevas drogas y vacunas era posible tener bajo control a todos los microorganismos. Sin embargo, vivimos en un mundo donde todas las criaturas intentan sobrevivir generando descendencia. Y lamentablemente, muchas veces, esas entidades usan nuestros cuerpos para lograr ese mandato natural. Tabla 1. Ejemplos de virus emergentes. Modificada de Morse (1993). Virus

Familia

Influenza

Orthomyxoviridae Cría integrada de aves acuáticas, cerdos y población móvil.

Dengue

Flaviviridae

Fiebre Amarilla

Flaviviridae

Junín

Arenaviridae

Machupo

Arenaviridae

Sin Nombre / Andes Bunyaviridae Fiebre del Valle de Rift

Bunyaviridae

Hantaan

Bunyaviridae

Ébola

Filoviridae

Marburg

Filoviridae

hiv

Retroviridae

Virus de la leucemia Retroviridae de células T humanas Viruela

Poxviridae

Parvovirus canino Virus de la gastroenteritis / Norwalk

Parvoviridae Calciviridae y otros

Factores de emergencia Densidades altas de población humana, presencia de estanques de agua. Densidades altas de población humana, presencia de estanques de agua, contactos selváticos. Aumento de la densidad de población de roedores sigmodontinos, y en consecuencia de su contacto con los humanos. Aplicación de técnicas de cultivo que lo provocan. Aumento de la densidad de población de roedores sigmodontinos, y en consecuencia de su contacto con los humanos. Aplicación de técnicas de cultivo que lo provocan. Aumento de la densidad de población de roedores sigmodontinos, y en consecuencia de su contacto con los humanos. Represas y riego. Aumento de la densidad de población de roedores muridos, y en consecuencia de su contacto con los humanos. Aplicación de técnicas de cultivo que lo provocan. Contactos selváticos con un hospedador aún desconocido, excesivamente rápida transmisión interhumana. Importación de monos en Europa y Estados Unidos. Transfusiones o tratamientos que requieren la administración parenteral de sueros, transmisión sexual, uso compartido de jeringas entre drogadictos. Transfusiones o tratamientos que requieren la administración parenteral de sueros, transmisión sexual, uso compartido de jeringas entre drogadictos. Emergente en América después de 1492, transmisión interhumana entre poblaciones previamente aisladas. Mutación espontánea en el virus felino de la panleucopenia. Nuevos métodos de detección en diarreas infecciosas.

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La fiebre hemorrágica argentina La fiebre hemorrágica argentina (fha), cuyo agente etiológico es el virus Junín, es una enfermedad emergente de tipo endémica, que se caracteriza por alteraciones cardiovasculares, hematológicas, inmunológicas, neurológicas y renales en los seres humanos, pudiendo provocar la muerte. El agente etiológico responsable de esta infección fue establecido en 1958, en forma independiente, por dos grupos de investigación (Parodi et al., 1958; Pirosky et al., 1959). Estos aislaron un agente viral a partir de sangre y órganos de pacientes obtenidos en el Hospital Regional de la ciudad de Junín, en la provincia de Buenos Aires. Esta circunstancia terminó dando el nombre con el cual conocemos a este patógeno viral. La fha se ha extendido progresivamente, y en la actualidad las provincias argentinas de Buenos Aires, Santa Fe, Córdoba y La Pampa son las que evidencian un mayor número de casos. Esta particularidad geográfica se debe a que el virus responsable se encuentra asociado a algunas especies de roedores campestres, los cuales son hospedadores y reservorios naturales. Estos animales eliminan el virus constantemente con la saliva y otras excreciones, contaminando en consecuencia el ambiente donde habitan y transmitiendo así el microbio a los demás miembros de su población. En tanto, el hombre toma contacto con el patógeno en forma accidental, ya sea por inhalación de partículas infectadas o a través de la piel o mucosas (Ruggiero et al., 1964a, b, c; Maiztegui, 1975; Weissenbacher et al., 1987). Por las razones anteriores, la fha se produce principalmente en personas que viven o trabajan en zonas rurales. En la mayoría de los casos, afecta a varones de entre 15 y 60 años de edad (el 80% aproximadamente), quienes por razones laborales poseen un mayor riesgo de exposición. Esta enfermedad ha tenido un impacto considerable en la salud y economía de la Argentina. Consecuentemente, se ha estimulado la investigación sobre la fha y su agente etiológico para controlar este problema sanitario. Ejemplo de esta empresa es el desarrollo de una vacuna por medio de la realización de un proyecto de colaboración entre el Ministerio de Salud Pública de la República Argentina y los laboratorios de usamriid (United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases) en Maryland, Estados Unidos. Para ello, se aislaron variantes del virus Junín (de la serie de cepas xj) con un grado creciente de atenuación de su virulencia (Barrera Oro y Eddy, 1982; McKee et al. 1984; Goñi et al., 2006). El miembro más atenuado de esta serie, la cepa Candid#1 (Cd#1), fue elegido para formular la vacuna (Figura 1).

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Figura 1. Genealogía de la cepa vacunal Candid#1. A partir de la cepa virulenta xj, que ha sido aislada de un paciente, se realizaron sucesivos pasajes en animales de laboratorio y cultivo celular, señalados en la parte lateral de las flechas.

La casuística de la fha ha mostrado variaciones considerables desde la primera epidemia sucedida en la década de 1950 (Figura 2). Sin embargo, es notable la disminución en el número de casos anuales que se produjo inmediatamente después del comienzo de la vacunación masiva en la zona endémica, lo que resalta la capacidad de Candid#1 para desencadenar la respuesta inmune protectora en los individuos tratados.

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Figura 2. Casuística de la fha. La ordenada de la izquierda indica el número de pacientes notificados con diagnóstico clínico compatible con fha, más aquellos que fueron confirmados por métodos serológicos o de aislamiento viral (desde 1967) o mediante ensayos de rt-pcr (desde 1992). La ordenada de la derecha permite inferir el número de personas vacunadas con la cepa Candid#1, desde el comienzo de la campaña de vacunación en el año 1991.

La familia Arenaviridae El agente responsable de la fha es un virus que pertenece a la familia Arenaviridae. Estos patógenos son virus que poseen genomas conformados por dos moléculas de arn, las cuales están envueltas en una membrana de naturaleza lipoproteica. Los arn genómicos se denominan s (por short, con un promedio de aproximadamente 3.500 nucleótidos de longitud) y l (por large, de aproximadamente 7.300 nucleótidos de longitud), cada uno contiene dos marcos de lectura abiertos, no superpuestos y de polaridad opuesta, que dieron origen a la denominación “ambisentido” (Auperin et al., 1984) (Figura 3).

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Figura 3. Estrategia de codificación de los Arenavirus. El esquema muestra los dos segmentos genómicos de un virus, detallando el nombre y la orientación de cada gen. RnC: Región no codificante; RIG: Región intergénica; GPC: Glicoproteínas.

Dentro de los viriones se hallan las cinco proteínas codificadas por el genoma viral: dos de ellas son glicoproteínas externas unidas a la membrana (g1 y g2, a las cuales debe sumarse el péptido señal de 58 aminoácidos), y las otras tres son la proteína de nucleocápside (n), un polipéptido de alto peso molecular (l) con actividad de arn polimerasa dependiente de arn, y la proteína z, que podría participar en la brotación de la partícula viral y en la regulación del ciclo replicativo. También, suelen encontrarse ribosomas derivados de las células infectadas. Esta particularidad, que puede ser observada mediante microscopía electrónica, le otorga a los viriones una apariencia granulada. Tal aspecto fue utilizado inicialmente para definir a estos patógenos como virus “arenosos” y de allí el nombre de la familia que los reúne. Los hospedadores principales de los arenavirus son generalmente roedores, mientras que los hospedadores secundarios o las especies afectadas pueden ser otros roedores o incluso, los seres humanos. Mediante el análisis de las diferencias antigénicas y la posterior comparación de secuencias, entre los miembros de la familia Arenaviridae, se ha postulado su división en dos grupos: arenavirus del Viejo Mundo, cuyos hospedadores son originarios de África y Europa; y arenavirus del Nuevo Mundo, todos ellos aislados en el continente americano (Tabla 2). El primer grupo incluye a los virus africanos Ippy (ippyv), Lassa (lasv), Mobala (mobv), Mopeia (mopv) y al virus de la coriomeningitis linfocitaria (lcmv) que posee distribución mundial. De ellos, solo lasv y lcmv provocan enfermedades en seres humanos. El grupo de arenavirus del Nuevo Mundo comprende a los virus Junín (junv), Amapari (amav), Flexal (flev), Guanarito (gtov), Latino (latv), Machupo (macv), Paraná (parv), Pichindé (picv), Tacaribe (tcrv), Tamiami (tamv), Sabia (sabv), Oliveros, Pampa, Pirital (pirv) y Whitewater Arroyo (wwav). De todos ellos, solo junv, macv, gtov y sabv han sido aislados a partir de seres humanos.

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Tabla 2. Lista de los integrantes de la familia Arenaviridae. En la columna Cat. A se describe la inclusión de los virus en la lista de patógenos Categoría A definida por el cdc (Centers for Disease Control and Prevention, de los Estados Unidos), cuyo nivel de bioseguridad es de 4. NR: no reportado; NW: Nuevo Mundo; OW: Viejo Mundo. a Los países están listados en base al aislamiento viral, no a los datos de serología. Tabla modificada de Charrel y De Lamballerie (2003). Distribucióna

Reservorio

junv

Linaje Evolutivo NW-B

Argentina

Machupo

macv

NW-B

Guanarito

gtov

Sabia

sabv

Lassa

lasv

OW

Coriomeningitis linfocitaria Mobala

lcmv

OW

mobv

OW

Mopeia

mopv

OW

Ippy

ippyv

OW

Flexal

flev

NW-A

República Centroafricana Brasil

Virus

Acrónimo

Junín

Cat. A

C. musculinus

Patogenicidad en humanos Sí

Bolivia

C. callosus, C.laucha

Sí

Si

NW-B

Venezuela

Z. brevicauda

Sí

Si

NW-B

Brasil

Desconocido

Sí

Si

Nigeria, Costa de Marfil, Guinea, Sierra Leona Todo el mundo

Mastomys sp.

Sí

Si

Mus musculus

Sí

No

Praomys sp.

NR

No

Mastomys natalensis

NR

No

Arvicanthus sp.

NR

No

Oryzomys spp.

Sí

No

República Centroafricana Mozambique

Si

Pichindé

picv

NW-A

Colombia

O. albigularis

NR

No

Paraná

parv

NW-A

Paraguay

O. buccinatus

NR

No

Allpahuayo

allv

NW-A

Perú

Oecomys bicolor

NR

No

Pirital

pirv

NW-A

Venezuela

Sigmodon alstoni

NR

No

Tacaribe

tcrv

NW-B

Trinidad

Sí

No

Cupixi

cpxv

NW-B

Brasil

Artibeus spp. (murciélago) O.capito

NR

No

Amapari

amav

NW-B

Brasil

NR

No

Oiveros

olvv

NW-C

Argentina

NR

No

Pampa

pamv

NW-C

Argentina

Bolomys sp.

NR

No

Latino

latv

NW-C

Bolivia

Calomys callosus

NR

No

Río Carcarañá

rcav

NW

Argentina

Bolomys sp.

NR

No

Withewater Arroyo

wwav

NW-Rec

Sudoeste de eua

Sí

No

O.capito-Neacomys guianae Bolomys obscurus

Tamiami

tamv

NW-Rec

Florida, eua

Neotoma albigula, N. mexicana, N. micropus, N. sinerea Sigmodon hispidus

NR

No

Bear Canyon

bcnv

NW-Rec

California, eua

Peromyscus sp.

NR

No

Kodoko

-

NW

Oeste de África

NR

No

Catarina

-

NW

Texas, eua

Mus Nannomys minutoides Neotoma micropus

NR

No

Pinhal

-

NW

San Pablo, Brasil

Calomys tener

NR

No

Dandenong

-

OW

-

-

Sí

No

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El virus Junín Como antes se indicó, el virus Junín es un miembro de la familia Arenaviridae que comparte las características propias de este conjunto de patógenos animales. El reservorio natural del junv es la laucha manchada (Calomys musculinus), aunque también ha sido aislado de la laucha chica (Calomys laucha), del ratón de pastizal pampeano (Akodon azarae), y del ratón colilargo menor (Oligorizomys flavescens) (Maiztegui, 1975; McCormick, 1990). Todos estos son roedores sigmodontinos, originarios de América. Sin embargo, el junv, ocasionalmente, también fue aislado del ratón común (Mus musculus), un animal originario del Viejo Mundo. Esta situación revela la capacidad de adaptación de los arenavirus, dado que este microbio se puso en contacto, a lo sumo, hace cinco siglos, con el roedor europeo. Esta característica tiene especial relevancia respecto a la epidemiología de la fha. En particular, porque aumenta el riesgo de que especies diferentes, con distintos nichos ecológicos, se conviertan en potenciales nuevos reservorios. En los roedores susceptibles, el virus cumple un ciclo que asegura su mantenimiento en la naturaleza. Es así que, por lo general, se encuentran títulos virales altos en casi todos los órganos y fluidos corporales, como la sangre y, particularmente, la saliva del animal. Los animales afectados presentan infecciones crónicas inaparentes, con eliminación persistente del virus al medio ambiente. Esto mostraría una relación ancestral, la cual ha permitido una convivencia que permite la supervivencia de ambas entidades biológicas. El junv posee un genoma segmentado conformado por los arn s y l. La molécula menor codifica la proteína n (factor mayoritario del virión) y el precursor de las glicoproteínas virales (gpc). Durante el ciclo infeccioso, la gpc producida es procesada por la maquinaria celular, para dar lugar a tres fragmentos que corresponden al péptido señal (ps) y a las glicoproteínas g1 y g2. Estos polipéptidos se ubican en la envoltura del virión y se asocian entre sí de manera no covalente, constituyendo unas espículas claviformes de 5-10 nm de longitud. El precursor gpc es un polipéptido que, en su forma no glicosilada, tendría aproximadamente 56 kDa. Para lcm, dentro de esta secuencia se establecieron tres regiones definidas: el péptido señal, desde el aminoácido 1 al 58, que permite el direccionamiento de la proteína al retículo endoplasmático rugoso; la glicoproteína g1, desde el aminoácido 59 al 247; y la glicoproteína g2, desde el aminoácido 248 al 485 (Buchmeier y Oldstone, 1979). El procesamiento proteolítico de este precursor se produce, de manera ordenada, en dos eventos independientes y mediados por dos enzimas celulares diferentes. En un primer paso, el ps es separado por acción de la peptidasa señal celular, antes de que el polipéptido abandone el retículo endoplasmático. El fragmento separado es miristoilado y permanece asociado de forma no covalente con las glicoproteínas virales (York et al., 2004). Esta asociación sería necesaria para el correcto direccionamiento del precursor hacia el aparato de Golgi (Agnihothram

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et al., 2006). El segundo clivaje ocurre entre el Golgi medio y el trans-Golgi, mediante la subtilasa ski-1/s1p, generando así las proteínas g1 y g2 (Burns y Buchmeier, 1993). La conformación de las glicoproteínas en el virión maduro estaría dada por un homopolímero de g1 unido no covalentemente a un homopolímero de g2, el cual se encuentra asociado al ps. La evidencia experimental revela que estas proteínas se asocian en forma de trímeros (Eschli et al., 2006). g1 es una proteína periférica, mientras que g2 posee tres regiones diferentes. En el extremo amino terminal se encuentra el dominio externo, de interacción con g1; en el centro de la proteína existe una región hidrofóbica de anclaje a membrana; y por último, en el extremo carboxilo terminal se encuentra el dominio interno que, aparentemente, interactúa con la proteína viral z (Figura 4). Figura 4. Interacción de las proteínas del virus Junín. El esquema representa la estructura de las membranas del virión según la evidencia experimental vigente. El trímero de g1 mira hacia el exterior, mientras que z, n y las moléculas de arn forman parte del interior del virus Junín.

El arn genómico mayor contiene el marco de lectura que codifica la proteína l (polipéptido con actividad de arn polimerasa dependiente de arn), responsable de la replicación del genoma viral. En el extremo 5’ de la misma molécula, se encuentra codificada la proteína z (inicialmente denominada p11), que posee un motivo de tipo zinc finger en el dominio central de la molécula, lo que le valió su nombre. Se ha propuesto que la proteína z tendría funciones regulatorias negativas de la replicación y transcripción (López et al., 2001; Cornu y De la Torre, 2002) y que, además, podría funcionar en los arenavirus como el equivalente de la proteína de matriz de los virus con genomas de arn simple de cadena y polaridad negativa (Perez et al., 2003).

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Es importante destacar que ambos segmentos genómicos poseen también componentes estructurales importantes en las zonas no codificantes. Por un lado, en la región intergénica (rig) se puede formar una estructura secundaria muy estable en forma de simple o doble horquilla, la cual actuaría como terminador de la transcripción (Romanowski et al., 1985; Ghiringhelli et al., 1991; Tortorici et al., 2001; Goñi et al., 2006). Por otro lado, los últimos 20 nucleótidos de los extremos 5’ y 3’ en ambos segmentos genómicos poseen secuencias complementarias (denominadas como región Arena), que pueden generar, al aparear entre sí, estructuras del tipo mango de sartén, lo que daría lugar a la conformación aparentemente circular revelada en las imágenes de microscopía electrónica.

Ciclo del virus Junín Como todo patógeno viral, el junv posee un ciclo de multiplicación con las etapas típicas para la generación de descendencia. Así, necesitará, en primer lugar, de un reconocimiento específico de células susceptibles para luego ingresar el genoma, transcribir y traducir los factores proteicos allí codificados. Posteriormente, replicarán los segmentos de arn, s y l, los cuales serán envueltos para conformar las partículas virales que finalmente podrán liberarse al medio. La proteína g1 es la más externa del virión, por lo que se asume que es la que interactúa con el receptor celular. Los arenavirus del Viejo Mundo y los del clado C del Nuevo Mundo comparten un mismo receptor, el alfa-distroglicano (Cao et al., 1998; Spiropoulou et al., 2002). En tanto, se describió que el receptor para gtov, junv y macv (clado B) sería de carácter proteico, o una entidad asociada a proteínas, identificándolo como el receptor 1 de transferrina (Rojek et al., 2006; Radoshitzky et al., 2007). De este modo, el ingreso de junv a la célula susceptible comenzaría por la unión de la proteína g1 al receptor celular específico, para, luego, ser endocitado en vesículas lisas. La membrana del virión se fusionaría a la membrana de la vesícula en un evento dependiente de la acidificación del interior del endosoma. De hecho, la modificación en el pH del ambiente induciría un cambio conformacional en la proteína g2, exponiendo, así, las regiones con actividad fusogénica. Se sabe que además de g2, el péptido señal estable sería necesario para que pueda ocurrir este proceso (York y Nunberg, 2006). Luego, y como producto de la fusión de las membranas, se liberaría la nucleocápside directamente al citoplasma celular. A partir de esta etapa, se daría comienzo a la síntesis de los arn mensajeros, utilizándose como moldes los segmentos genómicos virales, tarea en la que participaría la arn polimerasa dependiente del arn viral (proteína l). Así, después de la síntesis de todas las proteínas virales y de la replicación de los segmentos genómicos s y l, sucedería

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el empaquetamiento y la brotación de las partículas maduras a través de la membrana plasmática de la célula infectada (Figura 5). Figura 5. Ciclo viral. Se muestra un modelo del ciclo del virus Junín en una célula animal susceptible, detallándose los procesos que allí ocurren.

Perspectivas en el estudio de las emergencias virales Nuestra especie ha sido y continúa siendo presa de numerosos microbios que encuentran, en nuestros cuerpos, un ámbito adecuado para su reproducción. Es así, que, producto de este parasitismo, padecemos múltiples enfermedades, algunas de ellas tan graves que pueden ocasionarnos la muerte. Entre todos estos agentes, los virus sobresalen como entidades peligrosas por su dependencia obligada de la materia viviente. Algunos de ellos han evolucionado junto a nosotros desde hace milenios, mientras que otros han descubierto recientemente a nuestro organismo,

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como un lugar adecuado para lograr su multiplicación. Estos virus emergentes toman de sorpresa a los sistemas sanitarios humanos, dado que el conocimiento biológico que se tiene sobre ellos es menor respecto de aquellos patógenos que nos han acompañado desde hace siglos, con la consecuente menor disponibilidad de estrategias preventivas y terapéuticas. Como se ha mencionado, el avance del hombre sobre nuevos territorios, y la explotación de los recursos que allí se encuentran o producen, con la posible modificación de esos ambientes naturales, suelen ser disparadores de estos fenómenos de emergencia. En particular, el virus Junín cae dentro de este grupo de entidades que poseen un hospedador natural donde se reproducen, pero que también pueden infectar al ser humano. Si bien sus efectos económicos y sanitarios son de índole local, el estudio de este virus es importante, no solo para controlar su desarrollo en el área involucrada, sino también porque, a causa de los efectos de la globalización de bienes y personas, cualquier patógeno emergente debe ser considerado como una amenaza para toda la humanidad. En función de ello, numerosos grupos de investigación, nacionales e internacionales, han enfocado sus objetivos y esfuerzos en comprender cómo es el ciclo viral, cuáles son los marcadores genéticos asociados a la virulencia y la atenuación, y cuál es el rol de cada una de las proteínas virales. En tanto, otros se han centrado en el desarrollo de sistemas de diagnóstico, en el diseño de mejores estrategias de prevención, y en la evaluación de agentes terapéuticos antivirales que posibiliten una pronta recuperación de la enfermedad. Sin dudas, la emergencia viral se repetirá en la humanidad una y otra vez, ocasionando brotes, epidemias e incluso pandemias de enfermedades infecciosas nunca antes estudiadas. Ante este escenario, no cabe duda de que resulta trascendente la investigación y la caracterización del viroma animal (conjunto de virus que circulan en el reino animal), dado que, en cualquier momento, un patógeno que naturalmente infecta a un organismo particular (nuestras mascotas, los animales de granja, o los insectos urbanos, por ejemplo), puede terminar reproduciéndose en nuestras células y provocarnos una nueva enfermedad. Ante esta incertidumbre, la generación de conocimiento es nuestra mejor arma para dar batalla a cualquier desafío biológico que ponga en riesgo nuestra supervivencia en el planeta. Habitamos este mundo junto a miles de otras criaturas. Lograr que ninguna de ellas nos afecte es y será una tarea descomunal.

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Autoras Betina Inés Stephan: Licenciada en Biotecnología. Estudiante de Doctorado (unq, Conicet). Desempeña su trabajo de investigación en el área de la virología molecular (Laboratorio de Ingeniería genética y biología celular y molecular, área de virosis emergentes y zoonóticas). Docente de la Universidad Nacional de Quilmes (asignatura: Bioprocesos). Realizó el seminario de investigación en el año 2007. Cristina Silvia Borio: Licenciada en Biotecnología. Estudiante de Doctorado (unq, Conicet). Desempeña su trabajo de investigación en el área de la virología molecular (Laboratorio de Ingeniería genética y biología celular y molecular, área de virosis emergentes y zoonóticas). Docente de la Universidad Nacional de Quilmes (asignatura: Biología para enfermería). Realizó el seminario de investigación en el año 2008.

Codirectores Sandra Elizabeth Goñi: Licenciada en Biotecnología. Doctora de la Universidad Nacional de Quilmes, mención Ciencias básicas y aplicadas. Docente e investigadora de la unq (asignatura: Bioquímica ii, Laboratorio de Ingeniería genética y biología celular y molecular, área de virosis emergentes y zoonosis). Codirectora del seminario de investigación de Cristina S. Borio. Mario Enrique Lozano: Bioquímico. Doctor en Ciencias Bioquímicas de la Universidad Nacional de La Plata (unlp). Docente e investigador de la Universidad Nacional de Quilmes (asignatura: Bioquímica ii, Laboratorio de Ingeniería genética y biología celular y molecular, área de virosis emergentes y zoonosis). Vicerrector de la Universidad Nacional de Quilmes (2008-2012). Director de los seminarios de investigación y de la carrera de doctorado de Betina I. Stephan y Cristina S. Borio.

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Uso de biotransformaciones para la obtención de precursores antivirales Mariana Capello Dirección: Luis E. Iglesias

Puesto que yo soy imperfecto y necesito la tolerancia y la bondad de los demás, también he de tolerar los defectos del mundo hasta que pueda encontrar el secreto que me permita ponerles remedio. Mahatma Gandhi

Introducción La enfermedad ha sido siempre una sombra para la historia humana, tanto en circunstancias individuales como en catástrofes sanitarias de alto impacto en la historia de numerosos pueblos. En particular, las patologías infecciosas provocadas por bacterias o virus han diezmado naciones, arruinado economías y cambiado el curso de procesos históricos en más de una oportunidad. Y de hecho, aún hoy, luego de siglos de avances médicos, las enfermedades de origen viral se encuentran, luego del cáncer, entre las principales causas de muerte en los países industrializados. Sin olvidar infecciones virales de importancia, como la hepatitis B, el herpes y el papiloma, el impacto del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), provocado por el virus de inmunodeficiencia humana (vih), ha puesto de relieve la necesidad urgente de disponer de nuevos compuestos antivirales que permitan mantener en regla a estos patógenos (Rando y Nguyen-Ba, 2000). En comparación con los numerosos antibióticos desarrollados a lo largo de los últimos cincuenta años, los cuales han permitido controlar en buena medida a las bacterias patogénicas, existen, relativamente, pocos fármacos que presenten actividad antiviral. Esto es así debido a la naturaleza diferente de los virus, entidades biológicas que parasitan nuestras células para multiplicarse y que, en consecuencia, afectan nuestras funciones fisiológicas básicas produciendo muchas veces la muerte. Las bacterias son parientes muy lejanos del ser humano, en el árbol genealógico de la vida de este planeta, y, en base a ello, es más simple diseñar drogas que inhiban su crecimiento o que lo comprometan hasta afectar su capacidad vital. En cambio, distinguir entre las funciones virales y las propias de la célula parecía una tarea imposible hasta hace pocos años y, por consiguiente, el desarrollo de drogas antivirales resultó un emprendimiento más laborioso y lento.

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Los Antivirales Actualmente, la mayoría de los agentes antivirales conocidos son análogos de nucleósidos, los cuales interfieren en la síntesis de ácidos nucleicos, inhibiendo así la replicación del virus al comprometer la generación de nuevas moléculas genómicas para la progenie (Rando y Nguyen-Ba, 2000; Périgaud et al., 2000). Entre los más destacados en quimioterapia antiviral cabe citarse al azt (3’-azido-2’, 3’-didesoxitimidina) (Figura 1), y al ddI (2’, 3’-didesoxinosina), ambos utilizados como agentes anti-vih en el tratamiento del sida, así como también el aciclovir (9-(2-hidroxietoximetil) guanina), el cual es empleado como droga antiherpes. Otros análogos de nucleósidos que han demostrado experimentalmente actividad anti-vih son ddC (2’, 3’-didesoxicitidina), AzddG (3’-azido-2’, 3’-didesoxiguanosina), AzddDAP (3’-azido-2’, 3’-didesoxirribósido de -2, 6-diaminopurina), ddA (2’, 3’-didesoxiadenosina), carbovir (C-2’, 3’-didehidro-2’, 3’-didesoxiguanosina) y virazol (1-ribosil-1, 2, 4-triazol-3carboxamida) (Rando y Nguyen-Ba, 2000; De Clercq, 2002). También, existen derivados de nucleósidos que presentan actividad anticancerígena, dado que cumplen un mismo papel en la inhibición de la replicación genómica, aunque en este caso, de las células tumorales que han perdido el control de su ciclo de multiplicación (Bonnet y Robins, 1993). Estos antecedentes impulsaron investigaciones que centraron sus objetivos en la síntesis de análogos de nucleósidos, con el fin de encontrar nuevos agentes con potencial acción terapéutica para el control de los virus y del cáncer. Figura 1. 3’-azido-2’, 3’-didesoxitimidina (AZT)

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Dado que los nucleósidos son moléculas estructuralmente complejas y polifuncionales, con hidroxilos de reactividad similar, es difícil llevar a cabo, satisfactoriamente, reacciones selectivas mediante métodos químicos tradicionales (Greene y Wuts, 1999; Kadereit y Waldmann, 2001). A tal efecto se emplean los grupos protectores, pero la introducción y remoción de los mismos requiere diversos pasos y condiciones experimentales especiales, las cuales pueden afectar la estructura química de la molécula y constituir procesos largos que afectan de manera significativa el rendimiento, hechos desfavorables, considerando la necesaria síntesis a gran escala. Los alquilcarbonatos (ro-co-or’) se utilizan como grupos protectores de alcoholes, especialmente en polialcoholes tales como azúcares, mientras que los carbonatos cíclicos son muy eficientes en la protección de dioles y carbohidratos. Además, poseen numerosas aplicaciones en la industria, como lubricantes o aditivos. Los alquilcarbonatos se emplean en la química de polímeros para la obtención de policarbonatos y también en medicina, ya que poseen actividad como prodrogas (Parrish et al., 2000). En particular, la obtención regioselectiva de carbonatos derivados de nucleósidos presenta un interesante potencial, en función de su posible comportamiento como prodrogas de nucleósidos farmacológicamente activos, ya que el grupo carbonato confiere mayor lipofilicidad al nucleósido (Hammer, 1996). La remoción del grupo carbonato requiere condiciones básicas más fuertes que la hidrólisis de un éster, debido al efecto resonante del segundo oxígeno (Greene y Wuts, 1996; Parrish et al., 2000). Este hecho limita su aplicación como grupo protector de nucleósidos. Por lo tanto, es de utilidad encontrar un camino alternativo para remover estos compuestos en forma regioselectiva bajo condiciones suaves de reacción. En este escenario, el uso de las biotransformaciones, definidas como la reacción catalizada por enzimas sobre sustratos no naturales, y caracterizadas por su elevada selectividad, sus condiciones suaves de reacción y compatibilidad ambiental, surge como una prometedora opción de estudio y aplicación (Faber, 1997).

Ventajas de la utilización de un biocatalizador Las enzimas son muy eficientes. Las enzimas son macromoléculas biológicas de naturaleza proteica, que actúan como catalizadoras de reacciones químicas. De hecho, los procesos que son catalizados utilizando enzimas incrementan su velocidad en un factor de 108-1010. En general, los catalizadores químicos se emplean en concentraciones de 0,1-1%, mientras que los biocatalizadores se utilizan en relaciones de 10-3-10-4%. Por lo tanto, las enzimas muestran ser más eficientes por varios órdenes de magnitud respecto de los catalizadores

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químicos (Wong y Whitesides, 1994). Esta propiedad se debe a una disminución de la energía del estado de transición, ya que se forma un complejo entre el catalizador y el sustrato (Figura 2). Figura 2. Comparación de los diagramas de energía entre las reacciones catalizadas enzimáticamente y las no catalizadas.

Las enzimas son catalizadores muy selectivos. En una reacción de naturaleza selectiva aumentan los rendimientos y se agiliza la separación y purificación del producto. De este modo, disminuyen los tiempos y costos del proceso. Se dice que la reacción es quimioselectiva si, en sustratos que poseen grupos funcionales de reactividad química similar, existe una preferencia a reaccionar de un solo grupo de estos. En tanto, una reacción es regioselectiva cuando se producen mayoritariamente, uno o varios isómeros estructurales sobre todos los que se podrían formar. Por último, una reacción estereoselectiva tiene como productos uno o pocos de todos los estereoisómeros posibles. En función de estos conceptos, los procesos catalizados por enzimas suelen ser quimioselectivos, regioselectivos o estereoselectivos (Faber, 1997). Son catalizadores ambientalmente compatibles. A diferencia de los catalizadores químicos, las enzimas, al ser productos naturales, son totalmente biodegradables, amén que su uso no implica riesgos de contaminación alguno ni generación de residuos tóxicos. Las enzimas actúan bajo condiciones suaves de reacción. Las enzimas son capaces de actuar a temperaturas de entre 20 y 60 ºC. Además, son estables en medios con un pH cercano a la neutralidad (en general entre 5-8). De este modo, su utilización disminuye la aparición de productos secundarios debido

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a descomposiciones, isomerizaciones o racemizaciones que suelen ocurrir en condiciones más extremas de pH, temperatura y presión típicas de procesos puramente químicos. Por otra parte, utilizar condiciones suaves de reacción disminuye los costos en los procesos de escalado, asunto crucial en vistas de la viabilidad económica de la producción a niveles industriales (Faber, 1997). Catalizan una gran cantidad de reacciones. Gran cantidad de enzimas pueden utilizarse para catalizar tanto una reacción como la inversa, tales como las oxidorreductasas y las hidrolasas, lo cual genera una gran versatilidad de aplicación. Reconocen como sustratos a moléculas de estructura muy variada. Las enzimas tienen una amplia tolerancia a sustratos no naturales de estructuras muy diversas, lo cual permite utilizarlas en diferentes procesos de producción sin la necesidad de realizar cambios significativos en las condiciones de reacción o en la naturaleza molecular de las mismas (Faber, 1997). Pueden actuar en medios distintos a los naturales. Una particular capacidad de las enzimas es su tolerancia a diferentes entornos ambientales. De acuerdo a ello, muchas poseen actividad en solventes orgánicos, lo cual puede ser una ventaja en función de la naturaleza química de los sustratos o productos implicados (Wong y Whitesides, 1994). Si bien las biotransformaciones poseen muchas ventajas, varias de las cuales han sido citadas previamente, también es oportuno mencionar ciertas desventajas. Por ejemplo, las enzimas provistas por la naturaleza solo se encuentran en una forma enantiomérica, de este modo, para sintetizar el otro enantiómero de un producto dado es necesario emplear métodos químicos complementarios. Por otra parte, las enzimas pueden sufrir inhibiciones por sustrato o producto, disminuyendo así la eficiencia del proceso. Además, no es posible trabajar a temperaturas o pH muy extremos, ciertas veces necesarios, ya que suelen inactivarse o comprometer seriamente su actividad. Sin embargo, y a pesar de los cuestionamientos anteriores, las enzimas pueden ser inmovilizadas en diferentes matrices. Esta característica proporciona estabilidad y permite el reuso con el fin de escalar estas reacciones. Así, en vista de las ventajas y desventajas, las biotransformaciones basadas en enzimas presentan un presente interesante y un futuro aún más prometedor.

Fuente y clasificación de los biocatalizadores La mayor parte de las enzimas utilizadas para las biotransformaciones se emplean en su forma cruda. De acuerdo a ello, las preparaciones contienen 1-30% de enzima, mientras que el resto se forma con carbohidratos, lípidos, sales o proteínas del medio del cual han sido aisladas (Wong y Whitesides, 1994). Si bien esto parecería ser un problema, es muy común encontrar que

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las preparaciones enzimáticas crudas tengan más actividad que las mismas enzimas purificadas. Este último hecho se debería a que, en el crudo, las enzimas se encuentran más estabilizadas y en un entorno más cercano al natural (Anthonsen, 2000). Las enzimas se clasifican, según la iubmb (Enzyme Commission, International Union of Biochemistry and Molecular Biology), de acuerdo al tipo de reacción catalizada, en: oxidorreductasas, transferasas, liasas, hidrolasas, isomerasas y ligasas (Tabla 1). Las enzimas más utilizadas en el área de las biotransformaciones son las hidrolasas (65%). En segundo lugar, las más empleadas son las oxidorreductasas (25%). Tanto las transferasas como las liasas tienen una utilidad del 5%. En tanto, las isomerasas y las ligasas son las menos utilizadas para la catálisis enzimática (1%). Tabla 1. Clasificación de las enzimas Categoría Oxidorreductasas

Transferasas

Hidrolasas

Liasas Isomerasas

Ejemplos de reacción catalizada

Ejemplos

Reacciones redox (oxidación y reducción), oxigenación de C-H, C-C, C=C. Deshidrogenasas, Reacción de Baeyer-Villiger. Hidroxilaciones y oxigenasas epoxidaciones. Transferencia de fragmentos activados a moléculas receptoras (azúcares, aldehídos, Transaminasas cetonas, acilos, fosforilos o metilos). Hidrólisis y formación de ésteres, amidas, Lipasas, esterasas, lactamas, lactonas, péptidos, enlaces acilasas, proteasas, glicosídicos. fosfolipasas, Hidrólisis de epóxidos y nitrilos. glicosidasas Reacciones de adición y eliminación de pequeñas moléculas a dobles enlaces (C=C, Aldolasas, fumarasa C=O, C=N). Reacciones de epimerización. Rearreglos Fructosa-glucosa intramoleculares. isomerasa Racemizaciones.

Utilización de células enteras o enzimas aisladas En una biotransformación se pueden utilizar microorganismos o enzimas aisladas que, además, pueden estar libres o inmovilizados (Tabla 2). La elección del biocatalizador depende de su costo, del tipo de reacción, de la necesidad de reciclar los cofactores y de la escala en la cual la biotransformación se lleve a cabo (Wong y Whitesides, 1994).

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Muchas reacciones enzimáticas, en particular las oxidaciones y las reducciones, requieren el uso de cofactores; son los más utilizados el atp (Adenosina trifosfato), nad (Dinucleótido de nicotinamida y adenina), nadp (Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato) y las flavinas fmn (mononucleótido de flavina) y fad (dinucleótido de flavina-adenina). Estas moléculas suelen ser muy inestables y caras para ser utilizados como reactivos estequiométricos, por lo que es necesario reciclarlos. Así, en una segunda reacción acoplada, los cofactores pueden ser regenerados, empleándose de este modo solo en pequeñas cantidades catalíticas. Es importante notar que esta necesidad de reciclar cofactores desaparece si se emplean células enteras, dado que, en tales situaciones, el microorganismo, solo a través del aporte de una fuente de carbohidratos y nitrógeno, brinda tanto sus cofactores como las enzimas necesarias para llevar a cabo la reacción deseada (Roberts, 1995). Por otro lado, si se utilizan células, estas no deben estar necesariamente vivas; solo deben estar activas. Cabe señalar que el uso de células enteras involucra dificultades asociadas al cultivo y crecimiento de microorganismos. En contraposición a las reacciones catalizadas con enzimas crudas o aisladas, la productividad de las biotransformaciones llevadas a cabo con microorganismos es menor debido a que estos aceptan bajas concentraciones de sustratos. En cambio, el empleo de enzimas aisladas produce incrementos notorios de la productividad, ya que existe una mayor tolerancia a concentraciones superiores de los sustratos. Además, la utilización de las enzimas aisladas puede ser ventajosa en cuanto a costos, dado que en general no necesitan estar estrictamente puras (Wong y Whitesides, 1994). Tabla 2. Ventajas y desventajas del uso de enzimas aisladas o células enteras Modalidad

En todas sus formas Enzimas aisladas

Disueltas en agua Suspendidas en solvente orgánico Inmovilizadas

En todas sus formas Células enteras Quiescentes Inmovilizadas

Ventajas Simple manejo. Mayor productividad. Alta actividad enzimática. Solubilidad de sustratos. Fácil recuperación de la enzima. Fácil recuperación de la enzima y del producto. No hay necesidad de reciclar cofactores. Económicas. Uso sencillo, pocos productos secundarios. Reusabilidad.

Desventajas Necesidad de reciclar cofactores, si es el caso. Sustratos insolubles, necesidad de extracciones. Actividad enzimática reducida. Pérdida de la actividad en la inmovilización. Equipamiento caro, parte experimental tediosa, baja productividad, baja tolerancia a solventes orgánicos. Actividades menores. Actividades menores.

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Diferencia entre las fermentaciones y las biotransformaciones Una de las principales diferencias que existe entre las fermentaciones y las biotransformaciones es que, en las primeras, se utiliza a los microorganismos en su ambiente natural, necesariamente vivos y actuando sobre sus sustratos naturales, mientras que en las biotransformaciones se utilizan sustratos no naturales para las células, y además estas no se encuentran metabólicamente activas sino en estado quiescente (Wong y Whitesides, 1994). Por otra parte, las fermentaciones son procesos en los cuales están involucradas muchas reacciones bioquímicas del metabolismo para la síntesis de novo de un determinado compuesto, mientras que en la biocatálisis se utilizan unas pocas reacciones metabólicas (Tabla 3). Además, en una biotransformación, la cantidad de productos secundarios que se forman es mucho menor que en una fermentación, ya que en esta última se encuentran más enzimas activas (Faber, 1997). Tabla 3. Diferencias entre una fermentación y una biotransformación Microorganismo

Biotransformación Células quiescentes

Tipo de reacción

Proceso de una etapa. Reacción catalizada

Número de enzimas activas Material de partida Productos Aislamiento de productos Productos secundarios

Una o pocas Sustrato no natural Naturales/no naturales Simple Pocos o ninguno

Fermentación Células en crecimiento Proceso vital para las células empleadas llevado a cabo en varias etapas. Muchas Fuente de C y N Solo naturales Tedioso Muchos

Utilización de solventes orgánicos El prejuicio asociado a la utilización de agua como único medio natural y óptimo para llevar a cabo las reacciones catalizadas por enzimas limitó la aplicación de ellas en la síntesis orgánica. Como es sabido, el empleo de solventes orgánicos con baja actividad de agua es ampliamente utilizado para llevar a cabo reacciones de síntesis química, muchas de las cuales deben realizarse en ausencia total de agua (Wong y Whitesides, 1994). Ante este escenario, es importante considerar la estabilidad de las enzimas en ciertos solventes orgánicos dependiendo de la hidrofobicidad de los mismos, y derribar, en consecuencia, el prejuicio de que no pueden ser empleadas en medios diferentes a los estrictamente acuosos. De hecho, las enzimas suelen ser

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más estables en solventes de naturaleza no polar, donde quedan suspendidas, que en aquellos hidrofílicos donde se pueden solubilizar. Por otra parte, es más sencillo separar, del medio de reacción las enzimas que se mantienen en suspensión, simplificándose el proceso de aislamiento y purificación de los productos al aprovechar su solubilidad en estos solventes. En particular, estos solventes se utilizan con las enzimas hidrolíticas para evitar la competencia de la hidrólisis en las reacciones de síntesis y disolver numerosos sustratos hidrofóbicos. Así, es importante resaltar la versatilidad de las enzimas para su uso como catalizador en reacciones químicas que requieren condiciones de solvente no polar. En estas situaciones, para que las enzimas mantengan su conformación activa en medios orgánicos, es necesario simplemente que estén rodeadas de una pequeña capa de agua.

Enzimas hidrolíticas Las enzimas hidrolíticas son las más usadas en la síntesis orgánica debido a que presentan ventajas sobre las otras (Faber, 1997): • Catalizan una gran variedad de reacciones de hidrólisis de uniones amida, éster y peptídica. • Catalizan reacciones de síntesis (formación de uniones amida, éster, peptídica), al trabajar en medios orgánicos de baja actividad de agua invirtiendo su actividad hidrolítica natural. • Permiten obtener reacciones con notable regio y estereoselectividad, difícil de obtener por métodos químicos tradicionales. • No necesitan cofactores, por lo que pueden utilizarse en forma aislada. • Son económicamente accesibles, además, si están inmovilizadas pueden reciclarse fácilmente disminuyendo aun más los costos. Son comerciales, por lo que se facilita el acceso a este tipo de biocatalizadores. • No es necesario purificarlas, por el contrario, presentan mayor actividad crudas. • Algunas de ellas son extracelulares, por lo que el proceso de aislamiento se simplifica. De acuerdo a su función particular, las enzimas hidrolíticas pueden clasificarse de acuerdo al tipo de unión que hidrolizan (Wong y Whitesides, 1994). Dentro de este grupo, se encuentran las amidasas, las proteasas, las epóxido-hidrolasas, las esterasas, las lipasas, las glicosidasas y las dehalogenasas (Tabla 4).

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Tabla 4. Clasificación de las enzimas hidrolíticas Enzima hidrolítica Lipasas, esterasas Proteasas Amidasas, acilasas, nitrilasas Epóxido-hidrolasas Glicosidasas Dehalogenasas

Unión hidrolizada Éster Peptídica (amida) Otras amidas, nitrilos Éter (epóxido) Glicosídica Enlaces haluros (C-X)

X: Halógeno

A continuación, se hará una breve referencia sobre algunos de los tipos de enzimas antes mencionados. Amidasas

En general, estas enzimas catalizan la hidrólisis del grupo amida. Poseen una tolerancia a sustratos bastante limitada ya que reconocen amidas que no forman parte de uniones peptídicas. Un ejemplo es la penicilina amidasa. Proteasas

Hidrolizan y en algunos casos sintetizan enlaces peptídicos. Reconocen más sustratos que las amidasas. Algunos ejemplos de estas enzimas son: quimiotripsina, termolisina y subtilisina. Esta última posee un mecanismo de acción similar al de las lipasas y esterasas y no cataliza la formación de péptidos. Lipasas y esterasas

Actualmente, las biotransformaciones tomaron un lugar muy importante en los procesos de síntesis orgánica. En particular, las serina-hidrolasas se utilizan ampliamente para transformaciones del tipo regio-, quimio- y enantioselectivas. La familia de las serina-hidrolasas, que incluye a lipasas, esterasas y ciertas proteasas, tiene un mecanismo catalítico en común. Posee, en su sitio activo, tres aminoácidos responsables de la actividad: serina, histidina y ácido aspártico (o glutámico), los cuales forman una triada catalítica (Figura 3). Si analizamos el sitio activo, es posible notar que el pKa de la serina disminuye debido a un rearreglo del ácido aspártico y la histidina allí presentes, generando en consecuencia un nucleófilo. Este nucleófilo (hidroxilo de la serina del sitio activo de la enzima) ataca al carbonilo (c=o) del sustrato. De este modo, el sustrato queda unido covalentemente y de manera transitoria a la

Los sustratos poseen una reactividad química similar.

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enzima (intermediario acil-enzima). Luego, un nucleófilo ataca al intermediario, regenerando la enzima y originando el producto (Wong y Whitesides, 1994). Figura 3. Mecanismo de las serina-hidrolasas

En particular, las lipasas catalizan tanto reacciones de hidrólisis como una amplia variedad de acilaciones, incluyendo las alcoxicarbonilaciones, muy importantes en la

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química de grupos protectores de compuestos polihidroxilados (García-Alles y Gotor, 1999). En cambio, las esterasas catalizan las hidrólisis de ésteres pero no su síntesis. Las lipasas poseen muchas ventajas y forman parte de aproximadamente el 35% de las biotransformaciones publicadas. Del análisis de sus propiedades puede describirse que son enzimas extracelulares, las cuales aceptan estructuras muy variadas como sustratos no naturales y en muchas ocasiones tienen una mayor actividad crudas que en su estado purificado. Respecto de su función, catalizan la formación e hidrólisis de ésteres y, además, la formación de amidas. En general, los sustratos de las lipasas son ésteres que presentan el resto alcohólico estructuralmente complejo, mientras que los de las esterasas son ésteres con el grupo acilo complejo. Una característica que distingue a las lipasas de otras enzimas hidrolíticas es su estabilidad y actividad en medios orgánicos. En estos entornos, las lipasas revierten su natural actividad hidrolítica para catalizar regio- y estereoselectivamente reacciones de esterificación, transesterificación y aminólisis, entre otras (Schmid y Verger, 1998; Kanerva, 1996). Esto se debe a que poseen un mecanismo de activación interfasial in vivo: la enzima se activa en la interfase entre la fase acuosa y la fase orgánica. De hecho, las lipasas poseen una tapadera que se abre en presencia de una interfase, por lo tanto en ausencia de la misma se encuentran inactivas. A diferencia de las lipasas, que comienzan a tener actividad cuando la concentración de sustratos es igual a la concentración micelar crítica, la actividad de las esterasas es de tipo Michaelis-Menten, tolerando menos del 10-20% de solventes orgánicos miscibles con agua (Figura 4). Figura 4. Aspectos cinéticos de las lipasas y las esterasas

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Diversos factores de índole práctica hacen que las lipasas posean interesantes perspectivas de aplicación como catalizadores en procesos de interés tecnológico e industrial, tales como modificación de grasas, producción de esencias y resolución de fármacos, lo que muestra el potencial de las biotransformaciones en las que participan estas enzimas (Sheldon, 1996, Schmid y Verger, 1998). En la Tabla 5 se muestran algunas de las lipasas y esterasas más utilizadas. Tabla 5. Ejemplos de lipasas y esterasas más utilizadas Lipasas

Esterasas

Abreviatura

Nombre

Abreviatura

Nombre

ppl

Lipasa de páncreas porcino

ple

Esterasa de hígado de cerdo

cal b

Lipasa B de Candida antarctica

hle

Esterasa de hígado de caballo

crl

Lipasa de Candida rugosa

ace

Acetilcolinesterasa

wgl

Lipasa de germen de trigo

Lipasas de Candida antarctica (cal) El hongo Candida antarctica produce dos isoformas de lipasas: a y b. De ellas la más utilizada es la isoforma b, ya que posee una mayor tolerancia a sustratos. Por un lado, cal b no posee activación interfasial, por esto se dice que comparte algunas características con las esterasas (Faber, 1997; Kirk y Christensen, 2002). Por otro lado cal a es más termoestable que cal b, dado que su temperatura óptima es de 90 ºC (Tabla 6). cal b se encuentra, comercialmente, en forma inmovilizada absorbida sobre una resina acrílica macroporosa, pudiendo soportar temperaturas relativamente altas y actuar en solventes orgánicos en la síntesis e hidrólisis de diversos compuestos. Es importante resaltar que la inmovilización le otorga mayor estabilidad, fácil remoción del medio de reacción y posibilita su reuso. También, permite estudiar un amplio rango de condiciones experimentales sin afectar la actividad de la enzima. En particular, su selectividad puede aumentarse adicionando cosolventes miscibles con agua a la mezcla de reacción. Presenta además, una alta regio- y enantioselectividad y por consiguiente, es utilizada para resolver aminas y alcoholes racémicos y para preparar compuestos ópticamente activos a partir de compuestos meso. cal b está más estudiada y caracterizada que la isoforma a. Esta última no presenta estereoselectividad, pero es la única capaz de hidrolizar ésteres impedidos estéricamente. cal a tiene utilidad tanto en la industria textil como en la papelera, y también se utiliza en la hidrólisis de ácidos grasos de muy alto punto de ebullición, glicéridos y ésteres.

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Tabla 6. Comparación de las dos isoformas de lipasa de Candida antárctica Peso molecular (kDa) Punto isoeléctrico pH óptimo Estabilidad de pH Activación interfasial Dependencia de metales Temperatura máxima

CAL A

CAL B

45 7.5 7 6-9 Sí, baja Sí, calcio 90ºC

3.3 6.0 7 7-10 No No 50-60ºC

En el ejemplo que se muestra a continuación (Esquema 1, García et al., 1992) se resuelve una mezcla racémica mediante una reacción de aminólisis empleando cal b como biocatalizador, obteniéndose un rendimiento de 45% y un 99% de e.e. (exceso enantiomérico). Esquema 1. Ejemplo de una resolución empleando cal b

Esta enzima también es muy utilizada en resoluciones cinéticas enantioselectivas de aminas, como es el caso del ejemplo mostrado a continuación (Esquema 2, Iglesias et al., 1997). Esquema 2. Ejemplo de una reacción de aminólisis

Esterasa de hígado de cerdo La esterasa de hígado de cerdo (ple) pertenece al tipo de las serina-hidrolasas y es estructuralmente compleja (Faber, 1997). Dado que esta enzima es hasta el presente la esterasa más versátil y no necesita purificación, es de gran utilidad en biocatálisis, especialmente para catalizar reacciones preparativas ya que es muy eficiente y económica. Presenta una actividad del tipo michaeliana, en donde

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la actividad enzimática aumenta al incrementarse la concentración de sustrato, hasta el punto de llegar a saturación. ple puede catalizar la hidrólisis de acetatos de alcoholes primarios y de carboxilatos de metilo o etilo, bajo condiciones de reacción muy suaves. Se utiliza para la hidrólisis de compuestos meso y en la resolución de ésteres racémicos cíclicos y alifáticos. Por otro lado, acepta una gran variedad de sustratos, como por ejemplo las lactonas y los diésteres (Wong y Whitesides, 1994). Ejemplo de reacciones regioselectivas (Abril, 1989)

Ejemplo de asimetrización (Person, 1999)

Ejemplo de hidrólisis suave (Pfenninger, 1986)

En cuanto a la selectividad, es posible aumentarla adicionando solventes miscibles con agua tales como el metanol, el terbutanol, la acetona, el dioxano, el acetonitrilo, la dimetilformamida o el dimetilsulfóxido. La proporción de estos solventes en la mezcla de reacción puede variar en 10-20% del total del volumen. En particular, el agregado de alcoholes de bajo peso molecular, o dimetilsulfóxido, es la estrategia más utilizada para incrementar la selectividad de ple (Faber, 1997).

Lipasa pancreática porcina (ppl) En general, los crudos donde se encuentra la lipasa pancreática porcina contienen otras enzimas hidrolíticas, como la quimiotripsina. Este crudo puede

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catalizar reacciones con muy alta regio y quimioselectividad. En particular, es muy selectiva para ésteres de alcoholes primarios (Esquema 3). Además, se puede utilizar esta enzima en un medio de naturaleza orgánica para obtener, por ejemplo, lactonas ópticamente activas o poliésteres. En tanto, en un medio acuoso se la utiliza para remover grupos acilos en la síntesis de carbohidratos (Wong y Whitesides, 1994). Esquema 3. Ejemplo del empleo de ppl en síntesis orgánica (Bestmann y Philipp, 1991)

También, es posible utilizar ppl para preparar dioles ópticamente activos a partir de la hidrólisis de carbonatos cíclicos, donde uno de los aspectos más interesantes es la estereoselectividad de esta reacción (Esquema 4). De hecho, los carbonatos cíclicos ópticamente activos son precursores importantes para la producción de productos naturales como el taxol (Matsumoto et al., 1996). Esquema 4. Resolución mediante la hidrólisis enzimática de un carbonato cíclico

Antecedentes sobre reacciones regioselectivas enzimáticas de nucleósidos Tal como se mencionó anteriormente, en la modificación química de nucleósidos, las reacciones regioselectivas que transcurren bajo condiciones suaves de reacción resultan de suma importancia. Si bien existen métodos químicos para acilar regioselectivamente a los nucleósidos, la acilación enzimática ofrece mejores rendimientos, regioselectividad e involucra menor cantidad de pasos (Wong y Whitesides, 1994).

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En lo que se refiere a derivados alcoxicarbonatados de nucleósidos, la síntesis tradicional de carbonatos en la posición 3’, importante en la preparación de oligonucleótidos y otros derivados, requiere la protección del alcohol de la posición 5’ y el uso de un agente de alcoxicarbonilación como es el pirocarbonato de dietilo, EtO-(CO)-O-(CO)-OEt. Sin embargo, la alcoxicarbonilación enzimática regioselectiva, de los grupos hidroxilos de diferentes nucleósidos, se lleva a cabo directamente mediante el uso de lipasas y un agente de alcoxicarbonilación. Por ejemplo, la alcoxicarbonilación de desoxinucleósidos en 3’ se produjo con un 64-82% de rendimiento empleando la lipasa de Pseudomonas sp. (psl), y carbonatos de oxima (Morís y Gotor, 1992; García-Alles et al., 1993; GarcíaAlles y Gotor, 1995). Utilizando cal b, la reacción fue selectiva para la posición 5’ de la ribosa o desoxirribosa, obteniéndose así el producto con un rendimiento de 45-68% (Esquema 5). Es importante notar que estas reacciones no podrían llevarse a cabo en ausencia de la enzima, aun bajo condiciones más fuertes de reacción (Morís y Gotor, 1993). En estos ejemplos, es posible observar que, variando el biocatalizador, pueden obtenerse diferentes resultados en cuanto a regioselectividad de la reacción de alcoxicarbonilación.

Esquema 5. Protección enzimática de nucleósidos empleando cal b y psl

Base: uracilo, timina, adenina, R= alquilo, vinilo, alilo.

Conclusiones Los virus son entidades biológicas parásitas de la vida. Por esa necesidad y dependencia, se transforman en una amenaza que debe ser enfrentada con diferentes estrategias. De acuerdo a lo descripto, los compuestos antivirales (principalmente nucleósidos modificados) actúan afectando la capacidad de replicación de los genomas virales, atentando así contra su supervivencia. Su diseño y evaluación es una tarea compleja dadas las sutiles modificaciones químicas que deben efectuarse para ensayar la acción de estas moléculas. En este escenario, todo enfoque metodológico que colabore en el desarrollo de nuevas moléculas es un gran aporte para el ser humano. Es así como las transformaciones mediadas por enzimas se presentan como una alternativa que debe ser explotada para optimizar el desarrollo de antivirales.

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Autora Mariana Capello: Licenciada en Biotecnología. Se desempeña actualmente en la industria biotecnológica. Docente de la Universidad Nacional de Quilmes (asignaturas: Química orgánica, Química de los alimentos). Realizó el seminario de investigación en el año 2005.

Director Luis Emilio Iglesias: Licenciado en Ciencias Químicas (uba). Doctor en Ciencias Químicas (uba). Docente-investigador de la Universidad Nacional de Quilmes (asignaturas: Química orgánica I y II; Laboratorio de biotransformaciones). Director del seminario de investigación de Mariana Capello.

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Los virus sanadores: el caso de los bacteriófagos Javier A. Iserte Codirectores: Néstor G. Iglesias y Mario E. Lozano

[…] dans un flash j’ai compris: ce qui cause mes taches était en fait un microbe invisible, un virus filterable, mais un virus parasite sur des bactéries.  D’Herelle (1917)

Los bacteriófagos, o más sencillamente fagos, son virus cuyo hospedador corresponde a un microorganismo del dominio Bacteria. Existen numerosos miembros descriptos, y de hecho se cree que son el grupo con mayor cantidad de representantes en el planeta. Por ejemplo, estudios de rastreo en aguas oceánicas mostraron que hay aproximadamente 106 partículas virales por mililitro (Wommack et al., 2000), mientras que en algunos estuarios se encontraron hasta 108 partículas por mililitro (Goyal et al., 1987). De esta manera, es probable que pueda infectarse hasta el 70% de los procariotas marinos (Prescott et al., 1999). Por ello, se considera que los fagos podrían tener una gran importancia ecológica, interviniendo en el recambio bacteriano marítimo y en parte del ciclo del carbono y de otros elementos esenciales para la vida. También, es destacable el papel que jugarían en la evolución, ya que suelen participar en el intercambio de genes entre distintas especies de bacterias, mediante eventos de transducción, o directamente por lisis y transformación de fragmentos de los genomas liberados. Pero quizás, lo más interesante, sea su potencial actividad como agentes terapéuticos humanos. Un virus que no nos infecta y que, sin embargo, puede salvarnos.

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Características generales de los bacteriófagos y clasificación Una de las primeras evidencias sobre la existencia de bacteriófagos se remonta a la capacidad que presentaron unos filtrados, recuperados del agua del río Ganges, en la India, en lisar bacterias que crecían en condiciones de laboratorio. Esta propiedad fue observada por la aparición de pequeñas zonas circulares translúcidas, en medio de una pátina de bacterias cultivadas sobre medio sólido (D’Herelle, 1917; Summers, 1999). Debido a ello, estos primeros virus encontrados fueron denominados virus líticos. El ciclo replicativo de los mismos comienza por la unión, la adsorción y luego la penetración en la célula bacteriana. Inmediatamente, los fagos toman el control del metabolismo celular y dirigen casi todos los recursos celulares: en primer lugar, para la síntesis de sus ácidos nucleicos; y luego, para generar sus proteínas estructurales. Finalmente, se realiza el ensamblaje de las nuevas partículas y la liberación masiva de todas ellas, deshaciendo la membrana y la pared celular. Un dato interesante a resaltar es que la velocidad de replicación de los virus procariotas es superior a la de los virus eucariotas (Prescott, 1999), en correlación con la mayor velocidad de multiplicación que poseen las células bacterianas, respecto de sus pares eucariotas.

Algunos años después de las primeras descripciones, se reportó que en algunas cepas bacterianas infectadas no se evidenciaba lisis. A pesar de ello, era posible observar una liberación permanente de virus. Este fenómeno fue inicialmente atribuido a la presencia de partículas virales adheridas a la superficie celular, que

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se liberaban mecánicamente. Un poco más tarde, se lo relacionó con un nuevo tipo de fagos que poseían un mecanismo de replicación distinto, denominados por estas características lisógenos o temperados. En su ciclo replicativo, estos virus generaban una estructura genómica, derivada de la infección permanente dentro de la célula bacteriana, a la que se denominó profago. Inicialmente, los fagos líticos o virulentos se clasificaron en tres grupos, de acuerdo al contenido de sus ácidos nucleicos. El primero de estos comprende a aquellos que contienen un genoma compuesto por una gran molécula de adn de cadena doble, de entre 30 y 130 kpb de longitud, como los clásicos fagos t de Escherichia coli. El segundo grupo incluye a aquellos virus cuyo genoma está compuesto por una molécula de adn pequeña, de una longitud menor a los 10 kpb. Entre ellos, es posible encontrar algunos representantes con forma isométrica y otros del tipo filamentoso. El último grupo, con un menor número de miembros conocidos, incluye a los fagos con genoma de arn y de tamaño pequeño (4 kb en promedio) (Bradley, 1967). En tanto, el genoma de los fagos temperados está compuesto por una molécula de adn de cadena doble de gran tamaño (más de 20 kpb). Esto se debe, probablemente, a la gran cantidad de genes necesarios para la regulación del establecimiento y liberación del estado de lisogenia, proceso del cual se conocen tres estrategias diferentes. Una de ellas está representada en el ciclo vital del fago λ de Escherichia coli, cuyo genoma se integra al adn bacteriano en uno o unos pocos sitios predilectos. La segunda estrategia es la que se puede encontrar en el fago Mu-1, de la misma bacteria, el cual se integra al azar en el genoma hospedador. Y la tercera es la utilizada por el fago P1, el cual se mantiene dentro de la célula como un elemento extra cromosómico, como si fuera un plásmido. De hecho, se ha observado que algunos fagos pueden mantenerse tanto en la forma de plásmido, como insertados dentro del genoma (Campbell et al., 2001). Si transferimos el foco de atención al hospedador, veremos que las bacterias han desarrollado mecanismos para protegerse de la infección por fagos. Por ejemplo, los sistemas de modificación y restricción de ácidos nucleicos tienen como función principal destruir cualquier molécula de adn foránea como, por ejemplo, el genoma de ciertos virus. Para superar este inconveniente, los bacteriófagos han seleccionado sistemas que modifican químicamente las bases nitrogenadas de su genoma haciéndolo insensible a las enzimas de restricción de las bacterias. Así, en el caso del bacteriófago t4 de E. coli, la citosina se convierte en 5-hidroximetilcitosina, la cual además sufre una modificación adicional uniendo residuos de glucosa. Otros fagos suelen modificar residuos de adenosina, siendo las modificaciones más comunes las metilaciones y glicosilaciones. La clasificación más moderna de los fagos incluye, además de las características de los ácidos nucleicos antes mencionadas, su morfología. En este sentido, en el año 1967 (Bradley, 1967), se definieron seis grupos principales de bacteriófagos nombrados con letras mayúsculas de la A hasta la F. Con el tiempo, se fueron incorporando más integrantes, por lo tanto, esta división necesitó ser ampliada.

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Así, varios grupos se subdividieron, agregándosele un número luego de la letra identificatoria; por ejemplo, el grupo A se dividió en A1 y A2. Actualmente se cuenta un total de 21 tipos morfológicos diferentes (Ackermann et al., 1987a), agrupados dentro de 13 familias (Ackermann et al., 1987b) y 140 géneros. Teniendo en cuenta las características morfológicas, podemos dividirlos en cuatro grupos principales: fagos con cola (que ahora conforman el orden Caudovirales (Ackermann et al., 1999), pleomórficos, cúbicos o con simetría helicoidal. De todos ellos, muy pocos poseen envoltura. Desde 1959 hasta la fecha, se han descripto más de 5.100 fagos, de entre los cuales más del 96% son virus con cola. Pero, dada la abundancia de los mismos en la naturaleza, se describen cerca de 150 nuevos fagos cada año (Ackermann, 2001). Esquema 1. Clasificación de los bacteriófagos por familia y morfotipo

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El descubrimiento de los fagos La historia del descubrimiento de los bacteriófagos ha sido un tema de largos debates. Ernest Hankin, un bacteriólogo británico que estudiaba una de las epidemias de cólera en la India, reportó, en 1896, la presencia de una evidente actividad antibacteriana contra Vibrio cholerae (agente causal de la enfermedad) presente en las aguas de los ríos Ganges y Jumna. Hankin sugirió que una sustancia no identificada, la cual pasaba a través de finos filtros de porcelana y era lábil al calor, era la responsable de este fenómeno y de la limitación de la expansión de la epidemia del cólera en la India (Hankin, 1896). Dos años después, el bacteriólogo ruso Nikolás Fiodorovich Gamaleya observó un fenómeno equivalente mientras trabajaba con Bacillus subtilis (Samsygina et al., 1984) y, más adelante, otros investigadores realizaron observaciones similares (Van Helvoort, 1992). Sin embargo, en ninguno de estos trabajos se enriqueció la escueta definición inicial de Hankin. Recién dos décadas más tarde Frederick Twort, un bacteriólogo entrenado en Inglaterra, sugirió que, entre otras posibilidades, el causante de la destrucción de las bacterias podía ser un virus (Twort, 1915). Sin embargo, por varias razones, que incluyeron dificultades financieras (Summers, 1999; Twort, 1915), Twort decidió no continuar con sus estudios. Poco tiempo después, los bacteriófagos fueron oficialmente descubiertos por Felix d’Herelle, un microbiólogo francocanadiense que trabajaba en el Instituto Pasteur de París (D’Herelle, 1917). Así, el descubrimiento (o redescubrimiento) de los bacteriófagos por parte de D’Herelle se asoció con un brote de disentería hemorrágica severa, que aconteció entre las tropas francesas localizadas en Maisons-Laffitte (en las afueras de París), en los meses de julio y agosto del año 1915. Sin embargo, aparentemente, D’Herelle había observado por primera vez el fenómeno de los bacteriófagos en 1910, mientras estudiaba estrategias microbiológicas para controlar un brote de langostas en México. Durante la epidemia de 1915, varios soldados fueron hospitalizados y D’Herelle fue asignado para conducir la investigación del brote. Durante estos estudios, obtuvo filtrados libres de bacterias de las muestras fecales de sus pacientes, que luego mezcló e incubó con diferentes cepas de Shigella aisladas durante el mismo brote. Una porción de las mezclas fue inoculada en animales experimentales (como parte de los estudios de D’Herelle sobre el desarrollo de una vacuna contra la disentería bacteriana), y otra fracción fue esparcida sobre medios de cultivo sólidos para observar el crecimiento de las bacterias. Así, en los cultivos, D’Herelle descubrió la presencia de pequeñas áreas claras a las cuales inicialmente llamó taches, luego taches vierges y, más tarde, placas (Summers, 1999). Estos resultados fueron presentados durante el encuentro de la Academia de Ciencias francesa en septiembre de 1917 y publicados en las actas del mismo Congreso (D’Herelle, 1917). A diferencia de Hankin y Twort, D’Herelle tenía pocas dudas acerca de la naturaleza del fenómeno, por lo cual propuso que el agente causal debía ser

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un virus capaz de parasitar a las bacterias. El nombre “bacteriófago” fue también propuesto por D’Herelle, quien, de acuerdo a sus memorias (Sulakvelidze et al., 2001), decidió el nombre en conjunto con su esposa Marie, el 18 de octubre de 1916, el día anterior al cumpleaños de su hija menor (D’Herelle, aparentemente, aisló los primeros bacteriófagos en el verano parisino de 1916, aproximadamente un año después del brote de disentería de Maisons-Laffitte). La denominación se formó a partir de los vocablos “bacteria” y “fagos” (comer o devorar en griego) e implica a las entidades biológicas que “comen” o “devoran” bacterias, un concepto que define, con bastante precisión, el fenómeno que se establece entre los virus y sus hospedadores, cualesquiera sean estos. D’Herelle, quien se consideró el descubridor de los bacteriófagos, fue consciente del descubrimiento previo de Twort (Bordet, 1921; Twort, 1915) aunque sostuvo siempre que, el fenómeno descrito por este, era diferente al suyo. Además, y en claro contraste con Twort, D’Herelle continuó activamente sus estudios y promovió la idea de que eran virus activos y no solo enzimas, como pensaban otros de sus colegas investigadores. Cuando la disputa se fue zanjando, muchos científicos aceptaron el descubrimiento independiente de los bacteriófagos y simplemente lo denominaron el “fenómeno Twort-D’Herelle” y con el transcurso de los años, el “fenómeno bacteriófago”.

Comienzos de la fagoterapia Poco tiempo después de su hallazgo, los fagos comenzaron a utilizarse como agentes antibacterianos. El primer trabajo publicado no fue realizado por su descubridor D’Herelle, quien luego trabajara copiosamente en el tema, sino por Bruynoghe y Maisin en 1921 (Bruynoghe et al., 1921). Su artículo titulado “Essais de therapeutique au moyem du bactériophage” fue el inicio de una larga lista de reportes. En tanto, la compañía L´Orèal de París fue la primera en comercializar preparaciones de fagos contra varias infecciones bacterianas, utilizando “semillas” producidas en el laboratorio de D’Herelle. Estas preparaciones fueron denominadas Bacté-coli-phage, Bacté-rhino-phage, Bacté-intesti-phage, Bacté-pyophage y Bacté-staphy-phage. También, los fagos terapéuticos fueron producidos en Estados Unidos. En la década de 1940, la compañía Eli Lilly lanzó comercialmente siete productos con fagos para su aplicación en humanos, los cuales incluían preparaciones contra estafilococos, estreptococos, E. coli, y otros patógenos bacterianos. Sin embargo, la eficacia comercial del producto estaba en duda y con el surgimiento posterior de los antibióticos, drogas económicas de fácil producción en escala industrial, la venta de fagos terapéuticos se detuvo en el mundo occidental. A pesar de ello, los fagos continuaron utilizándose (combinados junto con los antibióticos) en Europa del este y en la antigua Unión Soviética. De hecho, muchas instituciones de estos países estuvieron activamente involucradas en la investigación y producción de bacteriófagos

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con fines terapéuticos, durante gran parte del siglo xx. Las actividades más importantes se llevaron a cabo en el Instituto Eliava de Bacteriófagos, Microbiología y Virología de la Academia de Ciencias Georgiana, en la ciudad de Tbilisi (Georgia), y en el Instituto de Inmunología y Terapia Experimental Hirszfeld de la academia polaca de ciencias, ubicado en la ciudad de Wroclaw. En particular, el Instituto Eliava fue fundado en el año 1923 por Giorgi Eliava junto con Félix d’Herelle. Un tiempo después, en 1937, Eliava fue arrestado y ejecutado por Stalin. En forma previa a este hecho, cuando su amigo fue declarado enemigo público del Estado soviético, D’Herelle regresó a París imaginando el destino que le esperaba. La tarea científica que realizaron durante esos años, previos a la Segunda Guerra Mundial, fue colosal. De hecho, el Instituto llegó a emplear a más de 1.000 investigadores y produjo preparaciones de fagos contra una docena de bacterias patógenas que incluyeron estafilococos, Pseudomonas, Proteus, y muchos otros patógenos entéricos. Luego, durante el estallido del conflicto bélico más importante del siglo xx, este gran trabajo se transformó en botín de guerra. Así, durante la ocupación nazi de Francia, D’Herelle rechazó ofrecer su experiencia en fagoterapia a los alemanes, quienes pretendían obtener la colección de fagos del Instituto Eliava que estaba abasteciendo al ejército ruso. Su negativa a la colaboración le significó pasar en prisión los años que duró la ocupación. Quizás este evento bélico que ha sido dramático para la humanidad, marcando un antes y un después en muchos aspectos sociales, políticos y culturales, también condenó a poco más que el olvido a las investigaciones en fagoterapia. En la actualidad, el Instituto Eliava se conserva en un estado muy deteriorado y sin recursos suficientes, pero continúa con su investigación en fagoterapia. En tanto, el Instituto Hirszfeld, fundado en 1952, se involucró en esta disciplina activamente a partir del año 1957, cuando se utilizaron fagos terapéuticos para tratar infecciones con Shigella.

Entrada al G. Eliave Bacteriophage, Virology and Microbiology Institute. Tomada de .

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Tomado de .

La fagoterapia en la actualidad El advenimiento de los antibióticos, percibidos socialmente como curas mágicas contra las infecciones bacterianas dada la inmediatez de sus efectos, fue el principal causante de que los fagos fueran desechados como alternativa terapéutica. Sin embargo, en la actualidad, con el surgimiento de bacterias que evidencian múltiples resistencias a los antibióticos (seleccionadas por el abuso de estas drogas cuando en ocasiones su aplicación es innecesaria), los bacteriófagos han entrado de nuevo al juego y muchos científicos los ven como una herramienta complementaria y útil. Así, las publicaciones de principios del siglo xx que habían sido dejadas de lado, se están retomando para su uso actual. A pesar de ello, hay muchas discrepancias acerca de los resultados obtenidos en esos tiempos. En cierta medida esto se debe a que, en aquella época, no se habían normalizado aún las metodologías de validación de los experimentos como sí sucede hoy. Para dar un ejemplo, a D’Herelle se le atribuye el error

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de no incluir controles de doble-ciego con placebos, en sus experimentos realizados en humanos y en gallinas, cuando intentó comprobar la eficacia de sus preparados (Van Helvoort, 1992). De cualquier modo, los resultados obtenidos en diferentes ensayos son muy alentadores. Recientemente, en el Instituto Hirszfeld de Polonia fueron tratados, con preparaciones de fagos, 1.307 pacientes con infecciones bacterianas causadas por cepas con resistencias múltiples a los antibióticos. La terapia fue altamente efectiva con una recuperación total que fue observada en 1.123 casos (85,9%), mientras que en 134 pacientes (10,9%) se observó una efectividad transitoria, y solo en 50 (3,8%) el tratamiento fue ineficiente (Slopek et al., 1983a; 1983b; 1985a; 1985b; 1985c; 1987). En occidente, los primeros nuevos trabajos, acerca del uso de fagos terapéuticos, fueron publicados por H. Williams Smith, en Gran Bretaña, en la década de 1980 (Smith 1982a; 1982b; 1987a; 1987b). Así, sus resultados demostraron fehacientemente la utilidad de la fagoterapia en modelos animales. Por ejemplo, en ratas inoculadas con una dosis letal de E. coli, una sola inyección de fagos fue más efectiva que múltiples aplicaciones de antibióticos. Este trabajo fue revisado con éxito, en 1996, por Bruce R. Levin y James. J. Bull, quienes utilizaron modelos matemáticos muy estrictos para estudiar la cantidad de fagos y bacterias en los animales en estudio (Levin et al., 1996).

El gráfico indica el número de artículos científicos publicados en revistas internacionales con referato en temas de fagoterapia. Los datos del año 2011 se corresponden con el primer cuatrimestre. Tomado de .

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Ventajas y desventajas de la fagoterapia Gran parte de la responsabilidad de la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos se debe a una incorrecta aplicación de esa terapia, fundamentalmente debido a tratamientos incompletos o al abuso en la utilización de los medicamentos en situaciones innecesarias. En el caso de la utilización de fagos, la resistencia también podría ser un escenario temido. En general, se encuentra que en una de cada 106 divisiones bacterianas aparece un individuo resistente a un antibiótico determinado (Carlton, 1999) o a una familia de antibióticos, dependiendo de la mutación involucrada. En cambio, para un bacteriófago se encuentra que aparecen bacterias resistentes cada 107 divisiones. Este número, a pesar de ser más conveniente en cuanto a probabilidades, no implica una mejora sustancial. Por ello, algunos autores recomiendan una co-terapia antibiótico-fago. Según los cálculos, en estas estrategias, la aparición de una bacteria resistente debería ser de 1 cada 1013 (106 × 107) divisiones. Por lo visto, un evento muy poco probable. Otro aspecto a considerar es el rango de hospedador, entendiéndolo como el número de especies bacterianas susceptibles a la infección por un fago particular. Por ejemplo, los antibióticos presentan un rango de bacterias sensibles bastante amplio. Así, la utilización de un determinado tipo de droga tiene la ventaja de poder eliminar a muchas cepas de la misma especie que pueden co-infectar a un individuo. Pero al mismo tiempo, se presenta la desventaja de que el uso del antibiótico puede alterar la flora microbiana normal del paciente, la cual tiene un efecto protector contra muchos patógenos. Sin esta flora, un individuo es generalmente más sensible a nuevas infecciones. En contraposición, los fagos son mucho más específicos e incluso pueden diferenciar entre cepas de la misma especie bacteriana, afectando a unas sin perjudicar a otras. Por ello, la terapia con fagos presentaría ventajas y desventajas respecto a la realizada con antibióticos. En particular, el escaso rango de hospedador que poseen algunos fagos puede convertir a la fagoterapia en ineficiente, obligando a la formulación de preparados multivalentes o cócteles de fagos. Aun así, algunas veces es casi imposible abarcar todo el rango de variantes dentro de una misma especie bacteriana, recomendándose verificar la sensibilidad de las cepas a eliminar contra un panel de fagos in vitro, antes de aplicar una terapia. Pero, por otro lado, también es oportuno destacar que la alta especificidad de estos virus es ventajosa, desde el punto de vista de que la flora normal del paciente no se vería comprometida. Además, un dato que no es menor y que marca una diferencia importante entre los bacteriófagos y los antibióticos es la capacidad de multiplicación que poseen los primeros. Esto permite que se produzca una acción del fago localizada y extremadamente rápida, sin necesidad de múltiples aplicaciones. Y que luego, cuando la bacteria susceptible sea eliminada, el bacteriófago no tendrá manera de multiplicarse y tenderá a desaparecer, siendo descartado a través del sistema

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reticuloendotelial (Geier et al., 1973). Por ello se dice que la terapia con fagos es autolimitante. Sin embargo, hay quienes opinan que su rápida eliminación podría ser desventajosa al no haber tiempo suficiente para actuar de manera eficiente. Para disminuir este efecto, se han desarrollado estrategias que permiten aumentar el tiempo de retención del fago dentro de los organismos. Por ejemplo, algunos procedimientos están basados en la selección de fagos persistentes, los cuales se obtienen mediante pasajes seriales en animales y por la recolección de los mismos a tiempos cada vez más tardíos (Merril et al., 1996). Así, se ha comprobado que estos virus persistentes son más eficaces que los originales. Es de destacar, considerando la variada diversidad de los fagos, que no suele recomendarse aplicar los virus lisogénicos en fagoterapia. Primero, debido a que estos no lisan rápidamente a las bacterias, provocando que la terapia pierda eficacia. Segundo y no menos importante, muchos de estos fagos suelen integrarse al genoma bacteriano, aumentando así la posibilidad de transferencia de genes. Esto puede suceder porque, en algún momento del ciclo vital, el sistema de regulación que mantiene integrado al adn del fago se pierde, en general cuando la bacteria entra en estrés biológico, provocando que el profago se escinda del genoma y reanude el ciclo lítico. En estas circunstancias, cuando el adn del virus se libera, puede tomar “por error” material genético de la bacteria, llevarlo consigo y potencialmente transmitirlo a su próximo hospedador. Este proceso se llama transducción y es una de las formas más importantes de transferencia horizontal de genes entre bacterias. En cualquier caso, desde el punto de vista de la aplicación de un sistema terapéutico integrado, es absolutamente nocivo que aumente la posibilidad de transferencia de secuencias entre bacterias, en particular si estas son genes de resistencia a los tratamientos. Respecto a la respuesta del paciente infectado por bacterias y tratado con fagos, existen trabajos en los cuales se muestra que el sistema inmune desarrolla anticuerpos neutralizantes contra estos virus. Su aparición se observa unas pocas semanas después de la terapia, lo cual tendría poco efecto en la mayoría de los casos, ya que la terapia con fagos tiende a ser corta. Sin embargo, en algunas infecciones crónicas o en casos de reinfección, los anticuerpos generados por el paciente se transforman en un problema a enfrentar. Las alternativas planteadas para estas situaciones son, o bien aumentar el número de bacteriófagos inoculados a fin de secuestrar todos los anticuerpos generados, o bien cambiar el bacteriófago por otro distinto que posea la misma especificidad. En los primeros ensayos de fagoterapia, todos ellos en la era preantibiótica, la pureza de los preparados fue un problema importante. Originalmente las formulaciones estaban compuestas por lisados bacterianos, los cuales solían incluir toxinas bacterianas y restos celulares que podían causar un shock tóxico. Además, no siempre los preparados estaban libres de microorganismos o, cuando se esterilizaban, los métodos empleados para hacerlo inactivaban a los bacteriófagos. Hoy en día, la tecnología disponible permite que esto no

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sea un problema. Por ejemplo, la centrifugación a alta velocidad y el filtrado por membranas de 0,22 µm son soluciones relativamente sencillas para estos inconvenientes. Dada la importancia sanitaria que podrían tener estas estrategias terapéuticas, todos los estudios clínicos realizados con bacteriófagos se concentraron en estudiar la seguridad de su aplicación, demostrando, en consecuencia, que estos virus son totalmente inocuos para el ser humano. En distintas terapias, los bacteriófagos fueron administrados por diferentes vías: oral (contenidos en tabletas, líquido o aerosoles), intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, o externamente (cremas para la piel, gotas para los ojos, entre otros). En ningún caso se han reportado efectos secundarios notables. Además, los fagos son extremamente comunes en cualquier ambiente y medio natural, lo cual sugiere que todos hemos estado expuestos a ellos una y otra vez.

Conclusiones Desde que sabemos que los virus son entidades biológicas que abundan en este planeta y que, a su vez, parasitan a los organismos, pudiendo incluso matarlos (con nuestra especie incluida), poco bueno se ha escrito sobre ellos. De hecho, hablar de virus supone y predice una enfermedad, escenario poco placentero para cualquier persona. Sin embargo, si pensamos que existen virus que infectan a cada uno de los organismos que habitan este planeta, y si contabilizamos que algunos de esos organismos (bacterias, hongos, parásitos) también invaden nuestros cuerpos para lograr su multiplicación, no es descabellado imaginar que un virus pueda llegar a transformarse en una terapia. Este es el caso de los bacteriófagos, virus que infectan y matan bacterias, muchas de ellas agentes patogénicos para el ser humano. Los virus pueden ser nuestros predadores, pero también, un arma para defendernos. La manipulación deliberada de las relaciones biológicas que existen en la naturaleza puede ser una herramienta vital para nuestra salud. Aunque parezca contradictorio, un veneno a veces puede ser también un antídoto. Todo depende de quién lo bebe y en qué circunstancias. A no temer, entonces, si en un futuro nos recetan una suspensión de bacteriófagos como remedio para curar una enfermedad producida por bacterias. Una infección para curar a otra infección. Extraño, pero sin dudas eficaz.

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Autor Javier Alonso Iserte: Licenciado en Biotecnología. Estudiante de Doctorado (unq-conicetanpcyt). Desempeña su trabajo de investigación en el área de la virología molecular (Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular, área de virosis emergentes y zoonosis). Docente unq (asignatura: Bioquímica ii). Realizó el seminario de investigación en el año 2003.

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Codirectores Néstor Gabriel Iglesias: Licenciado en Biotecnología. Doctor por la Universidad Nacional de Quilmes, mención Ciencias básicas y aplicadas. Investigador en el Instituto Leloir en virología molecular. Codirector del seminario de investigación de Javier A. Iserte. Mario Enrique Lozano: Bioquímico. Doctor en Ciencias Bioquímicas de la unlp (Universidad Nacional de La Plata). Docente-investigador unq (asignatura: Bioquímica ii; Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular, área de virosis emergentes y zoonosis). Vicerrector de la Universidad Nacional de Quilmes (2008-2012). Director del seminario de investigación y de la carrera de doctorado de Javier A. Iserte.

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Virus con aplicaciones tecnológicas: el caso de los baculovirus Solange A. B. Miele Codirectores: Marcela G. Pilloff, Mariano N. Belaich y P. Daniel Ghiringhelli

[…] he aquí mañana yo traeré la langosta a tu territorio; y cubrirá la superficie de la tierra, de modo que ésta no pueda verse. Devorará el resto de lo que ha escapado, lo que os ha quedado del granizo. Devorará también todos los árboles que crecen en el campo. Antiguo Testamento

Los virus son entidades biológicas que han convivido con los organismos, probablemente, desde los orígenes de la vida en este planeta. Como nos sucede a nosotros, los humanos, el resto de las especies también hospeda a estas particulares criaturas, se enferma por su colonización e incluso, padece la muerte a causa de su multiplicación parasitaria. Aunque parezca intrascendente, el estudio de los virus que infectan a bacterias, plantas, insectos u otros animales, resulta de interés para el hombre, no solo porque implica incrementar el conocimiento sobre la naturaleza, sino también porque estas entidades, que no son un peligro para nuestra salud, pueden impactar sobre nuestras fuentes de alimentos, o terminar transformándose en sofisticadas herramientas, útiles en cuestiones sanitarias y en la producción de bienes y servicios. Entre los múltiples virus que no nos infectan se encuentran los baculovirus, patógenos de insectos que han sido estudiados por el hombre debido a sus diferentes potencialidades en aspectos tan disímiles como lo son la agricultura, la industria biotecnológica y la medicina.

Los baculovirus: características principales Las enfermedades causadas por patógenos virales en invertebrados han sido muy examinadas. De hecho, existen reportes de cientos de virus que afectan a diferentes especies de estos animales. Dentro de su enorme diversidad, la familia Baculoviridae es una de las más numerosas y estudiadas porque presenta aptitudes interesantes para diferentes aplicaciones humanas. Este potencial fue reconocido durante la década de 1940, cuando una infección natural afectó notablemente a poblaciones de Gilpinia (Diprion) hercyniae en Canadá (Cameron, 1973). Este insecto, originario de Europa, había causado estragos en plantaciones de Picea spp.,

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en América del Norte, hasta que las autoridades agrarias importaron un conjunto de parasitoides para controlar a la plaga. Ingresaron también, sin saberlo, a un baculovirus. Al poco tiempo, este patógeno se diseminó sobre más de tres millones de hectáreas sin ninguna intervención humana, diezmando como consecuencia a las poblaciones de la plaga (Balch y Bird, 1944; Bird y Elgree, 1957). Los baculovirus constituyen una familia de patógenos virales que infecta a artrópodos y, en particular, a insectos de los órdenes Lepidoptera, Hymenoptera y Diptera. Junto a las familias Asfaviridae, Herpesviridae, Iridoviridae, Polydnaviridae, Mimivirus, Phycodnaviridae, Nimaviridae, Adenoviridae y Poxviridae, la familia Baculoviridae forma parte del grupo de los llamados virus con grandes genomas de adn doble cadena (Gao y Qi, 2007). Los genomas baculovirales descriptos hasta el momento, muy diversos en tamaño, indican la existencia de entre 90 y 180 marcos de lectura diferentes (Jehle et al., 2006a; Miele et al., 2011). Sin embargo, solo un grupo de ellos comprende un conjunto de genes ortólogos. Este hecho revelaría eventos frecuentes de inserciones y deleciones a lo largo de la historia evolutiva de esta familia de patógenos, lo que pone de manifiesto la existencia de genes cruciales para el ciclo viral, que son compartidos por todos los miembros conocidos. Otros genes, presentes solo en algunos miembros, aportarían ventajas adaptativas, probablemente, no esenciales. Considerando esto, se ha hipotetizado que la evolución de los virus que contienen genomas de adn doble cadena estaría fuertemente condicionada por mutaciones estructurales significativas, como la captura génica de secuencias del hospedador o de otros representantes virales, las recombinaciones homólogas con secuencias de virus relacionados, las deleciones de regiones genómicas virales, o los eventos de duplicación y patrones de coevolución con el hospedador (Shackelton y Holmes, 2004; Herniou et al., 2004; Jhele et al., 2006a). Las moléculas genómicas se encuentran altamente condensadas y asociadas a proteínas, ya que están contenidas dentro de nucleocápsides con morfología baciliforme, que dan el nombre a la familia viral. Estas estructuras son vainas polares de naturaleza proteica y forma cilíndrica, con un diámetro promedio de entre 40 y 70 nm, mientras que la longitud está comprendida entre 250 y 400 nm (Federici, 1986; Tanada y Hess, 1991; Boucias y Pendland, 1998).

Características morfológicas de los baculovirus Los miembros de la familia Baculoviridae se caracterizan por presentar dos fenotipos distintos a lo largo del proceso infectivo (Figura 1). Dichas estructuras diferenciales, sin embargo, poseen el mismo genotipo y su generación es dependiente de la temporalidad de la infección. Así, podemos reconocer a las formas tempranas, conocidas con el nombre de formas brotantes o bv (Budded Virus), y a las formas tardías, denominadas cuerpos de oclusión u ob (Occlussion Body), que contienen a los odv (Oclussion Derived Virus).

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Figura 1. Fenotipos de los baculovirus

En el esquema se muestran los dos fenotipos que presenta el baculovirus durante su ciclo viral, en hipotéticos cortes transversales. Con flechas rojas se indican algunos factores proteicos propios de los bvs; con flechas verdes algunos factores proteicos compartidos; con violeta se indica el genoma viral común; y con flechas azules se señalan algunos factores proteicos propios de los odv. El tegumento hace referencia a la región comprendida entre las nucleocápsides y la envoltura. La distribución de la proteína p74, de las indicadas como Proteínas de membrana y de gp41en el fenotipo odv es especulativa y no está basada en evidencias científicas. Las líneas que envuelven a las nucleocápsides representan a las bicapas lipídicas, y el color diferente de las mismas en ambos fenotipos hace alusión a su origen diferencial, y por ende, a una composición lipídica distinta.

En estadios tempranos de la infección, a alrededor de las 12 horas de iniciado el ciclo en una célula, se producen viriones del fenotipo bv. Esta estructura contiene una única nucleocápside envuelta en una bicapa lipídica, derivada de la membrana plasmática de la célula infectada. El análisis del proteoma de la envoltura del bv demuestra que la glicoproteína gp64, o su homólogo funcional conocido como Proteína f (ambas también denominadas proteínas env), constituye el componente principal. En cuanto a la distribución de estos polipéptidos, diferentes estudios mostraron que las proteínas env se concentran en uno de los extremos del virión, formando así una estructura característica en forma de espiga (Volkman, 1986; Blissard y Rohrmann, 1990; Braunagel y Summers, 1994; Westenberg et al., 2002 y 2004).

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Por otro lado, en las fases tardías del ciclo viral se producen grandes cantidades de poliedrina o granulina, según el género del virus, las cuales son proteínas insolubles de alrededor de 30 kDa (con la excepción de la poliedrina del virus Cuninpv). Estos polipéptidos, al cristalizar, forman la matriz, o cuerpo de oclusión (ob), típica de los representantes de este virus, ya sea con forma de poliedro irregular (para la poliedrina) o de gránulo (para la granulina). Durante su morfogénesis, quedan incluidos uno o varios odv en las partículas cristalinas protectoras. Estas están constituidas por una o varias nucleocápsides, envueltas por un recubrimiento lipoproteico que se origina a partir de la membrana nuclear interna (Braunagel y Summers, 1994). La observación de los cuerpos de oclusión, mediante microscopias electrónicas, revela esta particular composición (Figura 2). Figura 2. Fenotipos baculovirales tardíos

Células Sf21 infectadas con acmnpv. Se muestra una microscopía óptica donde pueden observarse células conteniendo cuerpos de oclusión u ob. También se muestra mediante una microscopia electrónica de transmisión el interior de esta estructura, la cual contiene a los odv.

A alrededor de las 24 horas postinfección ya comienzan a observarse ob en el núcleo celular infectado, liberándose del mismo a las 48 horas, por la acción lítica de proteínas virales. Mediante esta estrategia, el virus se asegura una alta resistencia al ataque del agua, de agentes químicos, y de fenómenos físicos como la deshidratación, las radiaciones o los cambios bruscos de temperatura (Benz, 1986; Jackes, 1985). Sin embargo, la estructura rígida y cristalina, antes descripta, es soluble en condiciones básicas, como las que se encuentran en el lumen intestinal de los insectos.

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Clasificación Como ya se ha mencionado, los baculovirus deben su nombre a la morfología de sus cápsides (baculum = bastón). En los primeros tiempos, las características morfológicas de los cuerpos de oclusión y su ubicación en la célula infectada permitieron agruparlos en dos géneros: virus de la poliedrosis nuclear (npv), que presenta cuerpos de oclusión en forma de poliedros en el núcleo de las células infectadas; y virus de la granulosis (gv), que presenta inclusiones elipsoidales en el citoplasma celular. Dado que, inicialmente, se suponía que los baculovirus tenían un rango de hospedador limitado a una especie, la nomenclatura original utilizaba el nombre científico (con su código binomial) en la denominación (Gröner, 1986). Por ejemplo, al virus aislado a partir del lepidóptero Autographa californica se lo denominó acmnpv, donde las primeras dos letras hacen referencia al insecto y las últimas cuatro al género nucleopoliedrovirus de variedad múltiple. Actualmente, se sabe, sin embargo, que si bien los rangos de infección son estrechos respecto a los hospedadores, no siempre se limitan a una especie. Sin dudas, esta situación puede confundir y llevar a equivocaciones en el establecimiento de la taxonomía y clasificación. De hecho, se han aislado baculovirus a los que se los denominó según esta norma, y luego resultaron variedades genotípicas muy similares a otros virus ya descriptos. En la actualidad, gracias a la disposición de una mayor cantidad de información biológica y de secuencias genómicas, los baculovirus son clasificados en cuatro géneros: alfabaculovirus, betabaculovirus, gamabaculovirus y deltabaculovirus. (Jhele et al., 2006b; Rohrmann, 2008; Miele et al., 2011). En función de esta nueva clasificación, se describen algunas características comunes:

Alfabaculovirus Incluiría a los nucleopoliedrovirus (npv) que infectan lepidópteros, el contenido de nucleocápsides puede ser simple (snpv) o múltiple (mnpv). Este género se subdivide en dos clados, uno denominado Grupo i, y el otro Grupo ii (los primeros poseen proteína gp64 en la envoltura del bv, mientras que los segundos tienen solo la proteína f ). Todos los miembros producen bv y odv, siendo el tamaño promedio de ob de 0,4-3 μm y el tamaño del genoma entre 100 y 180 kpb. La especie tipo sería acmnpv.

Betabaculovirus Incluiría a los granulovirus (gv) que infectan lepidópteros. Todos los miembros producen bv y odv, siendo el tamaño promedio de ob de 300-500 x 130-250 nm y el tamaño del genoma entre 100 y 180 kpb. La especie tipo sería cpgv.

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Gamabaculovirus Incluiría a los nucleopoliedrovirus (npv) que infectan himenópteros (nelenpv, nesenpv y neabnpv). Presentan ob de alrededor de 0,4-1,1 μm con nucleocápsides simples en sus viriones (snpv). Los genomas serían de alrededor de 90 kpb y no presentarían proteínas ortólogas a f o gp64, ni tampoco la presencia del fenotipo brotante. La especie tipo sería nelenpv.

Deltabaculovirus Incluiría a los nucleopoliedrovirus (npv) que infectan dípteros, siendo el único descripto, hasta el momento, cuninpv. Estos virus presentarían los dos fenotipos, bv y odv. Al nivel estructural, cuninpv presenta un ob globular de alrededor de 400 nm de diámetro, formado por una proteína no homóloga a la poliedrina o granulina de los otros géneros. La especie tipo sería cuninpv. Este agrupamiento concuerda con lo observado en estudios filogenéticos basados en las secuencias core genes (genes conservados por todos los miembros conocidos) (Figura 3).

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Figura 3. Filogenia baculoviral

Para construir este cladograma, se utilizaron las secuencias aminoacídicas de los 31 genes compartidos identificados en la familia Baculoviridae. En el mismo se muestran gráficamente las relaciones evolutivas entre los miembros. También se indica la distribución en los linajes y géneros aceptados. Los gamabaculovirus y deltabaculovirus están referenciados con letras griegas. Adaptado de Miele et al., (2011).

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Ciclo viral Como cualquier entidad viral, los baculovirus requieren de células para soportar su multiplicación (Figura 4). El ciclo viral puede ser dividido en tres etapas principales: • Ingestión de los cuerpos de inclusión e inicio de la infección en las células intestinales (infección primaria). • Dispersión de la enfermedad dentro del insecto mediada por las formas brotantes o bvs (infección secundaria). • La muerte y liberación de los nuevos cuerpos de inclusión (ob, que contienen los odvs). Figura 4. Ciclo viral en una célula

En el gráfico se muestran los principales procesos que suceden durante un ciclo viral dentro de una célula. A las seis horas postinfección aparece el estroma virogénico. Este luego se agranda, como así también el núcleo, apareciendo a las 12 horas la primera producción de bv. A partir de aquí, las nucleocápsides en el núcleo se rodean de membrana interna nuclear, dando lugar a los odvs. Finalmente, a las 24 horas, los odv ya se encuentran cubiertos por una matriz proteica, generándose los ob, los cuales, a las 48 horas de iniciada la infección, son liberados por una lisis celular. Adaptada de Slack y Arif (2007).

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El inicio más común de una infección por baculovirus (infección primaria) se produce con la ingesta de alimentos contaminados con cuerpos de inoclusión. Una vez dentro del lumen intestinal, las condiciones altamente básicas que allí imperan (pH 9,5-11) y la acción de proteasas alcalinas conducen a la hidrólisis de la proteína mayoritaria de los ob (Adams y McClintock, 1991; Terra y Ferreira, 1994). Luego, los viriones liberados (odv) atraviesan la membrana peritrófica del intestino. Esta estructura se encuentra formada por una red de proteínas y quitina que genera un tubo protector a lo largo de todo el intestino medio del insecto, y lo protege del contacto directo con las partículas de alimento o de cualquier agente patogénico que ingrese por vía entérica. A partir de aquí, existen varias hipótesis, validadas con evidencia experimental, sobre cómo progresa la enfermedad. Por un lado, estaría presente el efecto de ciertas proteínas del tipo metaloproteasas, denominadas vef (Virus Enhancing Factors), las cuales actuarían afectando la integridad de la membrana peritrófica y aumentando, en consecuencia, su permeabilidad (Wang y Granados, 1998; Peng et al., 1999; Li et al., 2003; Slavicek y Popham, 2005). Por otro lado, los viriones podrían alcanzar las microvellosidades intestinales durante el proceso de muda del insecto ya que, allí, la membrana peritrófica es liberada durante la ecdisis y, por ende, dejaría de ser una barrera para la infección (Washburn et al., 1995). Luego de salvar las barreras físicas, los viriones se unen, por fusión de membranas, a los extremos apicales de las microvellosidades de las células columnares del intestino medio, las cuales están encargadas de secretar enzimas digestivas y absorber nutrientes (Adams y McClintock, 1991; Horton y Burand, 1993; Haas-Stapleton et al., 2004). Existen proteínas estructurales virales, específicas para dicha función, cuya ausencia produce un fenotipo no infectivo. Este conjunto de polipéptidos se denominan factores de infección per os, o en inglés, Per os Infectivity Factors (pif ) (Kikhno et al., 2002; Pijlman et al., 2003; Zhou et al., 2005; Zhang et al., 2005; Fang et al., 2006). Finalizado el proceso de fusión, las nucleocápsides ingresan en el citoplasma celular dirigiéndose hacia el núcleo, donde se desnudan y liberan el adn a través de los poros nucleares. El núcleo se hipertrofia, lo que afecta la posición y el tamaño de los nucléolos. A partir de aquí, comienza la transcripción de los primeros genes, o genes inmediatamente tempranos, por acción de la arn polimerasa ii del insecto, produciéndose una cascada regulatoria de expresión génica. Esto conduce a la replicación del adn viral y a la posterior encapsidación y brotación de la célula, formándose así la primera progenie viral de bv. Esta descendencia inicial, que atraviesa la lámina basal de las células intestinales, será la encargada de diseminar el virus por el cuerpo del insecto (infección secundaria) afectando a células más activas y, por lo tanto, más conducentes para el éxito de la multiplicación viral. La lámina basal es una estructura de naturaleza proteica que constituye otra barrera física para la diseminación del virus. Es posible que las proteasas

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producidas por las células columnares del epitelio del intestino medio (estimuladas por la infección primaria), o la acción de factores virales tales como v-cath (Viral cathepsine o catepsina), los cuales pueden ser purificados conjuntamente con el fenotipo bv, colaboren en xxxxx dicho obstáculo. De modo comparativo, en los mamíferos, muchas células tumorales, productoras de metástasis, generan catepsinas sobre su superficie para degradar la matriz extracelular y así invadir y colonizar nuevos tejidos (Nomura y Katunuma, 2005). Los bv, derivados de las células epiteliales, infectan células traqueolares, mediante endocitosis, por la acción de las proteínas fusogénicas gp64 o f produciendo una nueva progenie viral que continuará la infección en los tejidos del hemocele. Una vez allí, los bv serán dispersados al infectar a los hemocitos. Estas son células del sistema circulatorio responsables de la generación de una respuesta inmune hacia los patógenos. En consecuencia, durante esta etapa del ciclo, se compromete seriamente la capacidad de defensa del individuo afectado. Diseminada la infección, se produce una abundante generación de progenie viral en el cuerpo graso (Dean et al., 1985). Esta estructura, que actúa como el hígado del insecto, es un órgano amorfo localizado a lo largo de todo el animal y es el responsable del metabolismo y almacenamiento de azúcares y lípidos, como así también de la producción de vitelogenina (proteína mayoritaria del huevo). Como es sabido, los virus son entidades biológicas que se diferencian de los organismos por su incapacidad de almacenar y producir energía, aunque la requieran para asegurar su supervivencia. Por eso no es extraño que las células más ricas en energía se transformen en el principal productor de progenie viral en el insecto infectado. Dado que los distintos baculovirus presentan diferentes tropismos celulares, el patrón de la infección es dependiente del patógeno y del hospedador en cuestión. Los más promiscuos son los npv que infectan lepidópteros, puesto que la infección comienza en el intestino medio y luego se disemina a la matriz traqueal y los hemocitos, al tejido adiposo, a la epidermis, al tejido muscular, glandular, reproductivo y nervioso. Los npv que infectan himenópteros y dípteros concentran su tropismo en el intestino medio, pudiéndose extender, en algunos casos, a los hemocitos. En tanto, los gv presentan alta variabilidad en los tejidos que infectan aunque, generalmente, no suelen extenderse hasta el tejido muscular y el nervioso (Sciocco-Cap et al., 2001). Durante el proceso de la infección secundaria se producen los viriones ocluidos, los cuales se acumulan en las células o se liberan por efecto de la ruptura de las membranas celulares. Finalmente, debido al avance de la infección, el insecto muere. En el caso particular de las infecciones poliorganotróficas, en las cuales se afecta la epidermis, como sucede con los npv, se produce la lisis del tegumento y la liberación de los ob al ambiente. Estos procesos de licuefacción tisular y ruptura de la cutícula son facilitados por la interacción sinérgica entre la proteasa viral catepsina o v-cath y la quitinasa

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viral o chia (Ohkawa et al., 1994; Slack et al., 1995; Hawtin et al., 1997). De este modo, se produce la contaminación de la superficie de las hojas y se asegura la posibilidad de nuevas infecciones sobre larvas que se alimentan de las mismas.

Baculovirus y su aplicación bioinsecticida El término control biológico se refiere, por un lado, al fenómeno natural que consiste en la regulación del número de plantas y animales por medio de enemigos naturales (parásitos, predadores y patógenos); y, por otro, al control aplicado de plagas, técnica que incluye la manipulación de agentes naturales para reducir las pérdidas en agricultura, forestación o productos comerciales derivados. Entre los enemigos naturales, se puede nombrar a los insectos predadores o entomófagos, a los parasitoides y a patógenos causantes de enfermedades, también conocidos como entomopatógenos, entre los que se incluyen bacterias, hongos y virus como los baculovirus. Dadas las características de estas estrategias, el control biológico está libre de los efectos secundarios indeseables, asociados a los insecticidas de amplio espectro, y es, además, uno de los métodos de mejor relación entre costo y efectividad. Sin embargo, es preciso que las estrategias basadas en su uso sean diseñadas y aplicadas por especialistas, bajo estrictos principios establecidos, para que el control biológico sea seguro y no tenga efectos adversos sobre el ecosistema intervenido (Van der Bosch et al., 1982). Si bien, desde hace siglos se conocían enfermedades en insectos que afectaban y controlaban plagas de modo natural, sin ningún tipo de intervención humana, el concepto de insecticida microbiano se reconoció por primera vez en el año 1879, cuando el ucraniano Elie Metchnikoff aplicó el hongo Metarhizium anisopliae para el control de un curculiónido plaga del trigo (Zimmermann el al., 1995). Posteriormente, dicho conocimiento fue puesto en práctica por Isaac Krassilstchik en pruebas de campo, durante el año 1888. Es posible que la aplicación de insecticidas biológicos no sea suficiente para la erradicación o control definitivo de una plaga pero, al menos, puede servir para disminuir el uso de los insecticidas químicos. Así, es posible atemperar los efectos adversos que tienen sobre los agroecosistemas involucrados, al combinarlos con estrategias naturales que no interfieren significativamente sobre el resto del ambiente intervenido. Los baculovirus son excelentes entomopatógenos, útiles para el control de plagas agrícolas, como lo destacan numerosas aplicaciones exitosas (Tabla 1).

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Tabla I. Ejemplos de baculovirus aplicados como bioinsecticidas Entes biológicos implicados Cultivo

Insecto plaga

Lugar de aplicación Baculovirus

País/Continente

Soja

Anticarsia gemmatalis

agmnpvMNPV

Brasil

Algodón Tabaco Leguminosas Verduras

Helicoverpa spp Heliothis spp

hzsnpv hearnpv

Estados Unidos Europa

Algodón

Spodoptera littoralis

spltmnpv

Egipto

Plantas ornamentales Tomate Pimiento Girasol

Spodoptera exigua

semnpv

Holanda Estados Unidos Guatemala

Manzanos Perales Nogales

Cydia pomonella

cpgv

Árboles latifoliados

Lymantria dispar

ldmnpv

Abetos

Orgyia pseudotsugata

opmnpv

Pináceas

Neodiprion sertifer

nsenpv

Pináceas

Neodiprion lecontei

nelenpv

Granos y frutos secos almacenados

Plodia interpunctella

pigv

Estados Unidos Europa Chile Argentina Estados Unidos Canadá Europa Estados Unidos Canadá Estados Unidos Canadá Europa Estados Unidos Canadá Estados Unidos

Referencias Moscardi, 1989, 1995, 1999; Oliveira et al., 2006. embrapa Ignoffo y Couch, 1981; Hüber, 1986; Lacey y Goettel, 1995; Cherry et al., 2000. Carey y Harrap, 1980; McKinley et al., 1989; Jones et al., 1993 y 1994. Smits y Vlak, 1994; Cunningham, 1995; Estrada Hurtarte, 1996; Moscardi, 1999. Falcon et al., 1968; Hüber, 1986; Lipa, 1998. Webb et al., 1999. Thompson y Maksymiuk, 1978; Cunningham, 1998; Martignoni, 1999. Cunningham, 1998. Cunningham, 1998. Cunningham, 1998.

En la tabla se listan algunos virus utilizados como agentes de control biológico, indicándose las plagas y cultivos agrícolas involucrados. En la columna País/Continente se indica el lugar donde se realizó la aplicación en campo y su correspondiente referencia.

Estas entidades biológicas, al infectar y matar de manera específica a numerosos insectos, se transforman en armas naturales para su control poblacional. Debido a estas características, y a la posibilidad de producir baculovirus a niveles industriales, la aplicación bioinsecticida es protagonista de las posibles tecnologías derivadas del estudio y manipulación de esta familia de patógenos.

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Los baculovirus y su aplicación como plataforma para la expresión de proteínas La producción de proteínas en contextos heterólogos es ampliamente abordada por la biotecnología actual. Esto es así porque pueden servir como fármacos, como vacunas, o formar parte de un sistema de diagnóstico. También, ciertas veces, son una piedra fundamental en procesos industriales de índole productiva (Inceoglu et al., 2006). Cualquiera de los sistemas disponibles consta de una plataforma de ácidos nucleicos con capacidad de replicación (plásmidos, genomas virales), y con un organismo capaz de multiplicar a dicha construcción, además de poder leer el mensaje y, así, expresar la proteína de interés. En este contexto, los baculovirus se presentan como una muy buena alternativa. Entre sus ventajas, se cuenta que existen numerosas líneas celulares de insectos en donde poder propagarlos y que, al infectar a hospedadores eucariotas, las proteínas que se producen pueden poseer alguna de las modificaciones postraduccionales útiles para su correcta utilización (Aucoin et al., 2010; Van Oers, 2011). Además, deben destacarse, los altos niveles de producción que se logra alcanzar dado que, en general, se utilizan las secuencias promotoras del gen que codifica a la proteína mayoritaria del ob. En virtud de lo anterior, se han modificado genomas baculovirales para adaptarlos a la expresión de proteínas heterólogas. Quizás, el nucleopoliedrovirus de Autographa californica (acmnpv) sea el miembro más adaptado de esta familia y del cual existen mayor cantidad de sistemas comerciales. En general, se utilizan células de insectos en cultivos in vitro, como medio orgánico para la producción de las proteínas de interés (codificadas en el genoma de un baculovirus que ha sido genéticamente modificado) (Farrella et al., 2005; Haines et al., 2008). Aunque también se han evaluado producciones en larvas, abaratando los costos de mantenimiento y logrando excelentes rendimientos (Liu et al., 2007; Kato et al., 2010).

Baculovirus y el delivery específico a células de mamíferos La terapia génica es una aplicación que consiste en el suministro de secuencias terapéuticas a células específicas, ya sea para aportar funciones génicas que se encuentran naturalmente ausentes o defectuosas, o para provocar la muerte de una célula enferma. Existen diferentes aproximaciones para llevar adelante estos procedimientos. En primer lugar, es necesario decidir si la terapia será in vivo o ex vivo. Esto implica resolver si las secuencias deseadas serán direccionadas dentro del cuerpo del paciente, o bien, si se tomarán células del mismo, se las modificará in vitro, y luego se las reimplantará. En el caso de las terapias génicas

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in vivo, es importante también identificar el vehículo que transportará a los genes terapéuticos. En vista de ello, se han evaluado diferentes estrategias entre las que sobresale el uso de los virus, por ser excelentes candidatos para contener, transportar y direccionar genes terapéuticos. Esto es así dado que los virus poseen genoma (y allí puede insertarse la secuencia de interés), y una cápside que protege a los ácidos nucleicos, pero que también contiene los factores adecuados para el reconocimiento e ingreso del material genético a las células diana. Algo así como una jeringa génica que solamente inyectará la secuencia terapéutica, en los tejidos afectados. En general, los virus utilizados como transportadores de genes no completan ciclos de infección en las células donde ingresan, solo son capaces de direccionar los ácidos nucleicos. Por ello, no se habla de infección, sino de transducción. En dicho contexto, se está empezando a reconocer el potencial de los baculovirus para la transferencia de genes a células de mamíferos (gene delivery), gracias a sus particulares características respecto de la bioseguridad (no infectan a humanos), y a la facilidad y bajo costo de su producción. Contrariamente al conocimiento convencional sobre la importancia de los receptores en el reconocimiento virus-célula hospedadora, se ha encontrado que el baculovirus acmnpv es capaz de ingresar en un gran número de células de mamíferos, y expresar genes controlados por promotores tempranos. Este hallazgo indica que los receptores de la superficie celular no son la única vía de ingreso, y que la ausencia de replicación de un baculovirus en ciertas células y organismos (no susceptibles) puede deberse a la falta de expresión de factores virales, en las etapas posteriores correspondientes a los procesos de activación de genes tardíos o muy tardíos. En 1995, Hofmann y sus colaboradores demostraron que los baculovirus pueden ingresar eficientemente en cultivos de hepatocitos (Hofmann et al., 1995). En trabajos posteriores, diferentes autores han demostrado que estas entidades pueden ser utilizadas como vectores eficientes, para la transferencia de genes en varios tipos celulares de mamíferos (Boyce y Bucher, 1996; Shoji et al., 1997; Condreay et al., 1999; Kost y Condreay, 1999; Sarkis et al., 2000; Ma et al., 2000; Matilainen et al., 2005, Dong et al., 2010). Por otra parte, los baculovirus no solo son capaces de ingresar eficientemente por vía endosomal, sino que también las nucleocápsides son correctamente transportadas al núcleo celular al ingresar a través de los poros nucleares (Van Loo et al., 2001). Además, en diferentes trabajos se ha demostrado la capacidad de los baculovirus para expresar proteínas recombinantes, generadas a partir de la fusión entre distintos tipos de péptidos con la proteína de la envoltura membranosa viral gp64 (Ernst et al., 1998). Estas proteínas quiméricas se localizan en el exterior del virión, permitiendo, en consecuencia, la exposición en superficie de las secuencias aminoacídicas heterólogas. De este modo, si estos péptidos poseen afinidad en mamíferos, por receptores específicos de tipo celular, su presencia puede ser aprovechada para direccionar los baculovirus

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recombinantes a determinados tejidos diana. Solo restaría incorporar en sus genomas la secuencia del gen terapéutico y así, la “jeringa” ya estaría completa y a la espera de su administración. Si bien es cierto que la terapia génica es una aproximación muy prometedora, todavía restan muchas investigaciones para que sea una tecnología de amplia aplicación médica.

Conclusiones En nuestro planeta existe una gran cantidad de virus. Algunos de ellos nos afectan, porque les aportamos el ambiente adecuado para su correcta multiplicación. Sin embargo, existen otros para los cuales nuestros cuerpos no resultan apropiados como suministro de insumos y energía. ¿Por qué estudiarlos si no nos enferman? ¿Para qué podría servir este conocimiento? Comprender los mecanismos biológicos que posibilitan la vida en todas sus peculiares formas resulta útil por sí mismo, ya que permite un mejor entendimiento de la naturaleza. Pero también, esa información puede ser aplicada en el diseño de nuevas tecnologías que impacten favorablemente en alguna actividad humana. El ejemplo de los baculovirus es suficiente para justificar los porqués involucrados en su estudio y caracterización. Aprovechando que estas entidades infectan insectos, y que estos invertebrados son plagas de nuestros cultivos, se han desarrollado estrategias de biocontrol que mejoran los procesos agrícolas. Los baculovirus son, también, excelentes plataformas para la expresión y producción de proteínas en contextos eucariotas. De hecho, muchas vacunas y agentes terapéuticos son generados mediante su uso. Y además, se estudian para proponerlos como vehículo para la terapia génica, entre otras tantas e interesantes aplicaciones. Un virus puede ser un problema para la humanidad, pero quizá otro termine aportando soluciones. La virología actual trata de conocerlos, entenderlos y utilizarlos. En este terreno, el área de investigación que se focaliza en los patógenos que afectan a los insectos promete ser una usina generadora de nuevas y múltiples tecnologías. Posiblemente, algunas de ellas ni siquiera hoy seamos capaces de imaginarlas.

Bibliografía Adams, J. R. y J. T. McClintock (1991), “Chapter 6: Baculoviridae nuclear polyhedrosis viruses, Part I: Nuclear polyhedrosis viruses of insects”, en Adams, J. R. y J. R. Bonami (ed.), Atlas of invertebrate viruses, San Diego, Academic Press, pp. 87-180.

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Autora Solange Ana Belén Miele: Licenciada en Biotecnología. Estudiante de Doctorado (unq, Conicet). Desempeña su trabajo de investigación en el área de la virología molecular (Laboratorio de Ingeniería genética y biología celular y molecular, área de virosis de insectos). Docente de la Universidad Nacional de Quilmes (asignatura: Física i). Realizó el seminario de investigación en el año 2009.

Codirectores Mariano Nicolás Belaich: Licenciado en Biotecnología. Doctor unq Mención Ciencias Básicas y Aplicadas. Docente-investigador de la Universidad Nacional de Quilmes (asignatura: Ingeniería genética; Laboratorio de Ingeniería genética y biología celular y molecular, área de virosis de insectos). Codirector de la carrera de doctorado de Solange A. B. Miele. Pablo Daniel Ghiringhelli: Profesor de Biología. Doctor de la unlp (Universidad Nacional de La Plata). Docente-investigador de la Universidad Nacional de Quilmes (asignatura: Bioinformática; Laboratorio de Ingeniería genética y biología celular y molecular, área de virosis de insectos). Director del seminario de investigación y de la carrera de doctorado de Solange A. B. Miele. Marcela Gabriela Pilloff: Licenciada en Biotecnología. Estudiante de Doctorado (unq, Conicet). Desempeña su trabajo de investigación en el área de la virología molecular (Laboratorio de Ingeniería genética y biología celular y molecular, área de virosis de insectos). Docente de la Universidad Nacional de Quilmes (asignatura: Ingeniería genética aplicada). Codirectora del seminario de investigación de Solange A. B. Miele.

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